Microfluidic זרימה צ'יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823, doi:10.3791/53823 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

המוסטאסיס מחייב פעילות המשולבת ומוסדר של תאים, חלבונים, יונים ורקמות בהקשר spatiotemporal הוגבל 1. פעילות מבוקרת עלולה להוביל לדימום או פקקת ותחלואה או תמותה בתוך הספקטרום של הפרעות הקשורות לקרישת דם. ניסוי תא זרימת microfluidic הוא טכניקה מאתגרת מחקה המוסטאסיס במבחנה. גישה זו מאפשרת חקירה של יחסי הגומלין המורכבים של תהליכים להשתתף המוסטאסיס עם תפקיד מוביל עבור טסיות דם.

בעקבות פציעה של כלי דם, טסיות לדבוק מטריקס subendothelial החשוף (glyco) חלבונים על מנת למנוע אובדן דם. בעקבות הידבקות, טסיות להפעיל המצרפי בתגובה אוטומטית ואיתות paracrine אשר בסופו של דבר מוביל להיווצרות של רשת טסיות, על מנת לייצב את הפיברין וכתוצאה מכך משרד, פצע איטום פקיק 2. בניגוד לרוב בדיקות תפקוד טסיות אחרות, התנסותמפעלים עם תאי זרימה לקחת בחשבון את הפרמטר הפיזי של זרימת הדם ולכן השפעת rheology על תאים המשתתפים ביומולקולות 3,4.

ניסויי תא זרימה יצרו תובנות ציון דרך המוסטאסיס ופקק על ידי שינוי פרמטרים מרכזיים משפיעים (תת) עוצר דמום תהליכים, כולל מטריצה ​​הדבקה, פרופילי rheology וזרימה, הרכב הסלולר, הנוכחות של רעלים או סמים, כוח יוני ועוד רבים. בשני העשורים האחרונים, ניסויי תא זרימה נמוכה תפוקה מחייבת כרכי מדגם גדולים (10-100 מיליליטר) התפתחו תאי microfluidic לעתים קרובות מורכב של תאי לוחות מקבילים קטנים וכוללים טכנולוגיה מודרנית עבור מרוססת דם מלא בתנאי גזירת קיר מבוקרים 5. Microscaling גדל באופן משמעותי את תפוקת assay בעיקר מפני התקנת החומרה פשטה ופחות נפח (דם) נדרש, טיוח הניסוי לנגיש יותר versatile. למשל, דם בחיות מעבדה קטנות כעת ניתן להשתמש ללא צורך להקריב בעלי חיים. דגימות דם של עכברים מהונדסים גנטית ובכך סייעו בזיהוי מולקולות מפתח קידום או עיכוב המוסטאסיס וב תובנות בסיסיות רומן 6.

מעבדות מחקר מיוחדים לעתים קרובות עדיין להשתמש בתאי לזרום בהתאמה אישית למשל מ polydimethylsiloxane (PDMS) 7 כי polymerizes על תבניות lithographed אשר ניתן blueprinted ידי התוכנה. התא וכתוצאה מכך הוא זול, חד פעמי יכול להיות מפורקים בקלות לניתוח פוסט הוק. יתר על כן, בעצם כל עיצוב של כלי, bifurcations כולל או פניות חדות יכול להיבנות על פי פקודה. יתרון זה הוא גם החסרון שלה מאז סטנדרטיזציה כבר הייתה הבעיה העיקרית עם ניסויי תא זרימה, ו PDMS בהתאמה אישית בתאים לא סייעו זה. נוסף על הנושא המסוים הזה, ציפוי (תנאים), בדיקות ניאון, נוגד קרישה, טמפ 'erature והזמן בין דיגום ואנליזה כולם גרוע טופלו 8. התקינה של משתנים אלה הוא מאתגר, אבל בכל זאת נדרש להתיר השוואה של התוצאות בין המעבדות. נושא זה הוא הנושא העיקרי של האגודה הבינלאומית על פקקת ו haemostasis ב ועדת משנה מדעי ותקינה על Biorheology 9,10.

תרכיזים טסיות (PC) הם בעירוי בחולים הסובלים ממחלות שונות הגורמות תרומבוציטופניה ו / או דימום. אבל טסיות PC ידועה להוריד את רמת רגישות, במיוחד פונקציה של זמן אחסון 11, תהליך הידרדרות צמוד הזדקנות המכונה גם נגע אחסון טסיות. לעתים הוא טען כי טסיות כגון לשחזר במחזור בעירוי פעם 12, אבל הראיות לכך הוא נדיר. יתר על כן, את הפונקציונליות של טסיות ממציא מחשב אינה נבחנה שיגרתית משום שהיחסים בין מבחנים כאלהיעילות טיפולית או מניעת מחלות היא 13 ברור. תאי זרימה microfluidic להציע אמצעי לחקור את תפקוד הטסיות במחשב כדי לייעל את שרשרת מניפולציות בין איסוף המנפיקה. זהו כלי מחקר רב עוצמה עבור השוואה ישירה (זיווג) של המחשב כפי שפרסמנו בעבר 14,15 והוא מתואר כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות אתיות המוסדיות למחקר על דגימות אנושיות והסכמתם התקבלה מכל התורמים מעורבים. אישור הניסויים שתוארו כאן הושג מלוח הסקירה המוסדי של בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן.

הערה: סימנים טמפרטורה הם תמיד בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין.

1. הגדרה קאמרית הכנת תזרים

  1. Lanes הכנה, Tubing סיכות
    1. וורטקס ההשעיה קולגן במרץ לדלל 1/20 בפתרון גלוקוז איזוטוני שקיבלת מספק לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
      הערה: אנו משתמשים קולגן גיד סוסים, בעיקר מורכבים מסוג I סיבים. אני קולגן מסוג הסוס הוא המכונה לעתים קרובות כמו "הורם" קולגן הוא תקן הזהב עבור סוג זה של assay 9 הם הסטוריות כמו גם סיבות ביולוגיות. סוג האדם III קולגן יכול לשמש גם, אבל הדואר הסיבים מעיל פחות טוב והתגובה טסיות אינה כה חזקה. משטחים ציפוי אחר יכול לשמש גם, למשל פון Willebrand Factor (VWF), פיברינוגן, פיברונקטין, laminin, vitronectin, thrombospondin-1 או שילובים של אלה 16.
    2. קח biochip הפנויה חדשה מהמכל של הספק. מידות biochips כאן הם השתמשו 0.4W x 0.1H 20L x במ"מ 3.
    3. Pipet 0.8 μl לנתיב (ים) של biochip microfluidic על קצה אחד של השבב ולסמן כמו לשקע. ודא כי השביל מלא 5/6 עם קולגן המכיל פתרון ציפוי ערוך 1.1.1. ודא שאין בועות אוויר.
      הערה: ערוצים הם מצופים חלקית כדי למנוע הצטברות של סיבי קולגן בכניסה של הערוץ (ראה דיון).
    4. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או לילה במכל humidified והסגור.
    5. חסום את ערוצי מצופה ידי pipetting חסימת חיץ (1.0% (w / v) בסרום שור אלבומיןד 0.1% (w / v) גלוקוז 10 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) שנאגרו מלוחים (HBS; 0.9% (w / v) NaCl, pH 7.4) בקצה השני ומארק כמו מפרצון. ודא כי השביל מלא לחלוטין עם למאגר חסימת הימנעות בועות אוויר.
    6. חותכים צינורות באריכות שווה (12 ס"מ). השתמש באחת לכל ליין ולהתחבר כל צינורות עם סיכה. לדוגמא, ניסוי השוואת שני תנאים, לרוץ בשני עותקים ידרוש מארבע רצועות צינורות וארבע סיכות כדי להיות מוכנות.
    7. שוטפים את צינורות עם מים מזוקקים באמצעות מזרק ומחט G 26 או המחברים המצורפים.
    8. להרוות את הצינורות עם חסימת חיץ. חנות במיכל סגור humidified למשך תקופה מינימלית של 1 שעה.
  2. הכנת שאיבת יריעה
    1. יש לשטוף את המשאבה ואת סעפת עם מים מזוקקים, להסיר בועות אוויר.
    2. לשאוב למאגר החסימה לרדת מנתיב biochip (ים) באמצעות קצה 10 μl קבועים במוצא. נקה את פני השטח שלbiochip עם אבק דיוק חינם לנגב ואלכוהול מפוגל טכנולוגיה להסרת טביעות ואבק.
    3. תקן את biochip על במת מיקרוסקופ אוטומטית. אם יותר נתיב אחד משמש בו זמנית בטווח אחד, לחבר את מפצל סעפת שמונה נתיבים לשקע biochip.
      הערה: מפצל שמונת נתיבי הסעפת הוא חתיכת החומרה (איור S1) מחובר למשאבה ואת biochip. היא מאפשרת הפעלת כל הכניסה (שמונה) הנתיבים על biochip או שילוב של נתיבים אשר יכול להיות מוגדר מפעיל התוכנה הנלווית.
    4. השתמש סיכות בצינור כדי לתקן אותם כניסת biochip. מניחים את הקצה השני של הצינור (ללא פינים) במבחנה חרוטי 1.5 מ"ל מלא HBS. יש לשטוף את כל צינורות נתיבי המחוברים שלהם עם 1 מיליליטר HBS באמצעות המשאבה, כדי להסיר שארית חיץ חסימה גרועה דבקה קולגן.

2. הכנת דגימות דם

  1. אוסף והפרדהדם מלא טרי מן מתנדב בריא. 17
    1. אסוף את מיליליטר דם הראשון בצינור פוניו המכיל חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כפי קרישה ובאופן בלעדי להשתמש מדגם זה עבור ספירת דם מלאה (CBC) עם נתח המטולוגיה אוטומטית.
    2. אסוף נפח של דם בתוך קרישה מתאימה באמצעות צינורות פונו. תרופות נגד קרישת דם סטנדרט לניסויי תא זרימה הם הפרין או הירודין כאשר הפיברין היווצרות אינו חלק מפרוטוקול הניסוי ו נתרן ציטרט כאשר הוא.
      הערה: הפרין שמש נוגד קרישה לכל הניסויים שתוארו בתוצאות.
      הערה: כמות הדם תלויה במספר ניסויים להתבצע. כ 1 צינור (7 מ"ל) במשך 3 נתיבים.
    3. מניח את הצינורות על כינון מחדש דם ממתינים מסובב.
      הערה: assay אמור להסתיים בתוך 3 שעות של phlebotomy.
    4. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 250 גרם להכין פלזמה עשירה בטסיות (PRP). אין להשתמש ההפסקה צנטריפוגות כדי למנוע הפרעה של הגלולה הארוזה בצורה רופפת.
      1. כאשר יותר מ צינור אחד נאסף, לרכז את הדם בתוך שפופרת צנטריפוגה חרוטי יחיד.
        הערה: צנטריפוגה יכול להיעשות לאט יותר או פחות זמן, בהתאם לתשואות PRP ו דיפרנציאלי תא "זיהום" עדיף.
    5. סר וזורק את PRP ומעייל באפי מניב תאי דם אדומים ארוזים עם כמה טסיות.
      הערה: ספירת הטסיות בשבריר התא האדום הארוז היא 13 ± 5 x 10 3 לכל μl (ממוצע ± סטיית התקן, n = 12) בממוצע בידינו.
  2. כינון דם
    1. קבוצת דם ההפשרה AB (רזוס D שלילי) פלזמה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -20 שניות לעמוד 4 מ"ל.
    2. קבע את ההמטוקריט של כדוריות הדם האדומות הארוזות ערוכות 2.1.5 באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטית.
    3. קבע את הריכוז של טסיות דם בבנק הדם מוכן tha תרכיז הטסיותt ישמש כדי לשקם את שבר התא האדום לעיל.
    4. חשב את נפח תאי הדם האדומים ארוז ותרכיז טסיות שיניבו 40 המטוקריט% ו -250 x 10³ טסיות / μl במדגם 1 מ"ל.
      הערה: כותרות יעד אחרות של תאים ניתן להגדיר באופן שרירותי, בהתאם לפרוטוקול המחקר.
    5. העברת ארוז כדוריות דם אדומות ופלזמה לתוך צינור טרי באמצעות קצה pipet מקוטע ולהוסיף תרכיז הטסיות עד נפח דגימה של 1 מיליליטר הוא הגיע.
      הערה: בהתאם המשתנים שנבחנו, חלק פלזמה צריך להיות שווה בכל דגימות מחדש כי יש פלזמה השפעה משמעותית על קצב היווצרות פקיק. למשל, חזר הפשרה הקפאה או פלזמה שנלקחו מתורמים שונים או על תרופות נגד קרישת דם שונים עשויים להשפיע על התוצאה.
    6. מערבבים את הדם מחדש בעדינות על ידי היפוך ולבצע CBC.
    7. כן מדגם שליטה "ריק", שבו היקף חלק טסיות מוחלףעל ידי אותו נפח של 0.9% (m / v) נתרן כלורי במים כדי לקבוע את הריכוז של טסיות אנדוגני (כלומר טסיות בנקאית בלתי דם) בדם מחדש באמצעות CBC.
  3. תִיוּג
    1. Pipet 1 מ"ל מחדש דם במבחנה המכילה 1 μl 5 מ"מ Calcein AM (5 מיקרומטר הריכוז הסופי).
      הערה: צבעי תאים אחרים יכולים לשמש 14.
    2. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
    3. דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

3. Assay זלוף

  1. פוקוס האובייקטיבי על סיבי הקולגן הדבקים בתחתית הנתיבים. באופן אידיאלי, להשתמש שלב בניגוד או התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) הגדרות עבור האסטרטגיה מתמקד הפעם. בחר 'גדר Z הנוכחי עבור אזורי אריח נבחרים' בתוכנת הניסוי כדי לתקן את העמדות-Z שנבחרו באופן דיגיטלי.
  2. בחר אזור של עניין (ROI) בנתיב (XY) בתוכנת הניסוי של מ 'icroscope שיירשמו במהלך הניסוי.
    הערה: ROI יכול להיות כל שטח הפנים נבחר באופן שרירותי בתוך סמטה זלוף. רצוי לא לנתח היווצרות פקיק קרוב in- ו לשקע של נתיב כך כדי למנוע תופעות לוואי של פרופיל הזרימה משתנה באזור זה, גם אם זה קטן יחסית. שטח הפנים ROI צריך להכיל מספר לא מבוטל של טסיות או thrombi לאפשר פילוס של האות. בפרוטוקול זה ההחזר על ההשקעה הוא המצרפי תפור דיגיטלית של שלוש תמונות שוות בגודלן Side-by-side וכתוצאה מכך 0.62 מ"מ 2 באמצע השביל 2 ס"מ.
  3. מערבב את הדגימות בעדינות על ידי היפוך ולמקם הבאים אלה אל biochip על הבמה האוטומטית.
  4. מניח את הצינורות שמחוברים כשהמפרצון של biochip ב המבחנות המכילות דגימות הדם מחדש.
  5. הפעל את משאבת סנטימטר / 50 דיין 2 (או מדגיש גזירה אחר כרצונך) לערוצים צמודים בקבוקוניםהמכיל את דגימות הדם מחדש באמצעות התוכנה של המשאבה.
    הערה: מאמצי גזירה אחרים יכולים לשמש.
  6. תמונות שיא כל 15 שניות למשך 5 דקות בזמן אמת באמצעות תוכנת הרכישה ולהתנסות של המיקרוסקופ.
    הערה: סדרות עתיות אחרות יכולות לשמש תלוי ניסוי ההגדרה.
    הערה: אנו משתמשים בדרך כלל בהגדלת 100X (אובייקטיבי 10X ו 10X עדשות), אך גבוהה (או נמוכה) גדלה יכולה לשמש בקלות כחלופה.

4. יש לשטוף היטב את

  1. יש לשטוף היטב את כל הצינורות מחוברים לשקע ומחובר הסעפת הרבה או משאבת שימוש במים מזוקקים, ואחריו חומצת נתרן (אקונומיקה) 0.5% (v / v) ולבסוף 0.1 M NaOH במים. מחק את הצינורות מוצמדים כניסת biochip כפסולת מסוכנת.

ניתוח 5. נתונים

  1. לקבוע קינטיקה צמיחה פקיק עם תוכנת ניתוח התמונה. הפקודות הבאות הן ספציפיות עבור ZEN2012. פתח את ניתוח תמונת תוסף כדי לקבוע את כיסוי השטח של טסיות.
  2. הגדר את סף הקרינה על כרטיסיית ניתוח אינטראקטיבית כדי להגדיר את עוצמת פיקסל כי בקורלציה עם איתות חיובית, כלומר טסיות דבקה או טסיות דבקות.
  3. השתמש צור שולחנות ליצור גיליון אלקטרוני באופן אוטומטי שיכיל את פני שטחים הנפרדים (ב מיקרומטר 2) של אלה "אובייקטים" המכילים פיקסלים עם אות בין הספים שנבחרו. זה מבוצע עבור כל נקודת זמן.
    הערה: לאחר ספי קרינה כבר בחרו, תוכנת הניתוח מזהה אוטומטית 'חפצים' בשדה הנוף אשר עונים על הקריטריונים. אובייקטים אלה הם thrombi, אגרגטים טסיות קטנים או טסיות אחת ולכסות מספר פיקסלים. כל אובייקט מופיע בגיליון האלקטרוני בנפרד.
  4. שמור לגיליונות אלו בפורמט XML ולפתוח אותם בתוכנית גיליון אלקטרוניעבור חישובים נוספים.
  5. תחומים סה"כ השטח של האובייקטים שנבחרו על ידי סיכום ולחלק את התוצאה על ידי השטח הכולל של השדה המדיד (מיקרומטר 2). זה יניב את כיסוי שטח היחסי (%). האם כך עבור כל נקודת זמן.
  6. מגרש כיסויי משטח אלה בתפקוד של זמן זלוף לחשב את השיפוע על ידי רגרסיה ליניארית, מניב את הקינטית הצמיחה פקיק של מצב מסוים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להדגים וריאצית תוך assay, שלוש דגימות דם כולו זהות מחדש היו perfused זמנית מעל משטחים מצופים קולגן (איור 1). זה הביא מקדם השונה של 8.7%. נתון זה מצביע על וריאצית תוך assay מקובל intralaboratory המתיר השוואה מהימנה בין דגימות קשורות.

המפרצון של תא הזרימה המסחרי אנו מתארים כאן הוא בניצב תא המדידה וזה יכול לגרום מעט סוער במקום זרימה למינרית בשלב זה. במיוחד בניסויים ללא קרישה זה עלול לגרום סתימה בגלל זמן המגע גדל בין דם אגוניסט המשותק. כניסת סתומים יכול לבלבל את ההודעה במורד הזרם בתא. לכן, את ההתקנה הייתה מותאמת באופן חלקי על ידי ציפוי תא הזרימה (איור 2) השארהצריכת אוויר נטול אגוניסט טסיות, ובכך למנוע הפעלה בטרם עת של המוסטאסיס ראשוני ומשניים. ציפוי חלקי של משטחים דבקים יתר על כן משמש בהצלחה על ידי קבוצות מחקר אחרות בתחום 16. בנוסף, טריק מעשי פשוט שמדובר בנכס ללמוד את האזור "המעבר" שבו דם זורם על פני השטח הלא מגיב (ללא ציפוי) ממשיך מעל החלק תגובתי (המצופה).

עירוי היה מדומה על ידי reconstituting דם עם הרכיב הלקוי. לשם כך, anticoagulated דם כל מתורם בריא ניתן thrombocytopenic ידי טסיות צנטריפוגה ו- PC הפרש נוסף להגדיל הטסיות. שאלה חשובה כאן היה מה טסיות לספור עד לשאוף? ברוב המקרים, עירויי חיים אמיתיים לא לגרום נורמליזציה של רמת טסיות אצל מטופל thrombocytopenic. במקום זאת ערך מעל לסף מסוים מיועד,למרות שערך היעד המדויק הוא 19 שהגדרתה. כדי להבין את ההשפעה של משתנים הטסיות על תוצאות בתאים לזרום microfluidic בהקשר של כינון מחדש דם, כמה reconstitutions בוצע עם ההפחתה ריכוזית טסיות (איור 3). כצפוי, רמת טסיות נמוכה הביאה הידבקות פחות פונקציה של זמן זלוף. לכן, בתוך לימודים שניתן, רמת טסיות צריכה להיות אחידה להתיר השוואה בין תנאי מדגם 20. עצם העובדה שיש הידבקות פחות כאשר רמת טסיות נמוכות עושה זאת לא לרמוז כי assay לא ניתן להשתמש כדי למדוד בתצהיר טסיות בדגימות thrombocytopenic בגלל הגדרות מיקרוסקופיה המצלמה ניתן להתאים להגביר את הרגישות. לבסוף, ברוב המקרים, מדגם thrombocytopenic המשמש כינון מחדש מכיל טסיות עצמיים ויתרה דומה למצב ברוב העירוי בדרישה חולה 19. זה currently ברור אם ומה תפקידו של טסיות עצמיים הוא בהקשר של עירוי עם טסיות אלוגנאית אבל שאלה מעניינת למחקר עתידי.

לאחר איסוף של דם מתורמים מרצון בריאים, דם מלא לעתים קרובות הוא מקורר והמשיך בטמפרטורת חדר קבועה לפני הכנת רכיב. Platelets הם לעומת זאת רגיש לשינויי טמפרטורה. איור 4 מראה את ההשפעה של טמפרטורות ירד לאחר איסוף הדם ובמהלך זלוף. Thrombi נמצא לבנות לאט יותר כאשר הדם קורר (איור 4 א) בטמפרטורת חדר לעומת מדגם זהה (זיווג) שומר על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל תקופת המחקר (איור 4).

שבמחזור, טסיות להיקשר לאתרי פציעת כלי בתנאים של מאמץ גזירת קיר מוגבה. שיעורי גזירה שונים ב ג תאי זרימה microfluidicoated עם VWF / פיברינוגן הביא הבדלי הידבקות טסיות הכוללת בשלב הסוף (איור 5 א) ו קינטיקה צמיחת פקיק (איור 5 ב).

לבסוף, כדי להדגים כיצד תאי הזרימה microfluidic יכול לשמש כדי לחקור PC המשמש עירוי, קינטיקה צמיחה פקיק בתפקוד של אחסון במחשב נחקר. כל משתני הכנת מדגם הגדרת ניסוי היו טופלו לאורך כל תקופת המחקר. לפיכך, הפרמטר המשתנה היחיד היה PC אחסון זמן. איור 6 מציין ירידה בצמיחה פקיק בתפקוד של זמן אחסון הוכחת השפעת נגע אחסון טסיות על המוסטאסיס במבחנה.

איור 1
איור 1:. Intra-assay וריאציה בניסויי זרימת תא microfluidic פלה Microfluidic ניסויי תא w בוצעו על קולגן משותק ב 50 dynes / cm². כל שלוש דגימות הדם כולו הזהות מחדש היו perfused במקביל ובאותו הזמן. התוצאות מוצגות כפי טווח (שפם) לכיסוי שטח כפונקציה של זמן זלוף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. ערוץ מצופה חלקית (א) סיבי קולגן מדמיינים ידי מיקרוסקופ לעומת שלב נמצא יחידה באזור המצופה. (ב) תמונת מצב לאחר 5 דקות של זלוף עם AM Calcein שכותרתו דגימת דם שלם מחדש ביניקה 50 dynes / 2 ס"מ מוצג. שתי התמונות צולמו בהגדלה 100X. ig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: קינטיקה צמיחה פקיק תלוי הטסיות בדם מחדש (א) דם מחדש באמצעות טסיות בנק הדם להתרכז מניב ריכוזים טסיות שונים:. 245 x 10³ / μl (●), 42 x 10³ / μl (■) ו -12 x 10³ / μl (▲). ניסויי תא זרימת microfluidic עם ערוצי קולגן מצופים בוצעו בו זמנית עבור כל שלוש דגימות בכל מאמץ גזירה של 50 dynes / cm². (ב) המדרונות מחושבים על ידי רגרסיה ליניארית של הנתונים הגולמיים בפנל מתוארים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ontent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 4
איור 4:. טמפרטורה ותאי זרימה microfluidic דם מלא שנאספו vacutainers הפרין נשמר במשך 15 דקות באמבט מים בטמפרטורת החדר (א) או על 37 מעלות צלזיוס (B). זלוף microfluidic על קולגן משותקת בכל מאמץ הגזירה של 50 dynes / 2 ס"מ בוצע. צמד יריות לעבר נקודת סיום (5 זלוף דקות) מתוארים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: תפקידה של מאמץ הגזירה על הידבקות טסיות כדי משותקת VWF / פיברינוגן (א). ארבעה זהה, calcein AM שכותרתו, מחדש כולו דםהדגימות היו perfused מעל משטח מצופה VWF / פיברינוגן עם מאמץ הגזירה משתנה: 4.5 dynes / cm² (●), 50 dynes / cm² (■), 90 dynes / cm² (▲) ו 225 dynes / cm² (♦). לאחר 3 דקות של זלוף, זריקת צמד נלקחת מכל ארבעת הערוצים. (ב) כיסויי Surface בתפקוד זמן של הדגימות מתוארות (א) מוצגי הממחישים הבדלי קינטיקה צמיחת פקיק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6:. היווצרות פקיק של טסיות מתרכז פונקציה של זמן אחסון כל הניסויים תא הזרימה microfluidic בוצעו בתנאים סטנדרטיים על משטחים מצופים קולגן בקצב גזירה של 50 dynes / 2 ס"מ. הדם היה reconstituted עם דגימות טסיות של אותו להתרכז נבדק בשני עותקים ביום שלוש (●), שבע (■) ועשרה (▲) תרומה פוסט. כיסויי Surface בתפקוד זמן זלוף מתואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

S איור 1

האיור S1:. התקנת חומרת תא זרימת Microfluidic (א) biochip נבוב 8 Fluoro + הוא רכוב על הבמה האוטומטית של המיקרוסקופ מחובר דרך צינורות גמישים כדי משאבת מזרק עם סעפת לפצל האחראים לפעולת השאיבה לשמונה ערוצים נפרדים. (ב) דם מחדש זורם דרך הצינורות הפנויים בצד ימין לתוך הערוצים שנבחרו של biochip (כניסה). הצינורות הפנויים מתוקן הכניסה באמצעות נירוסטה מזפלדת ESS סיכה פנויה שמצורפת ההתקנה. זרימת דם (B) הוא מימין לשמאל והוא נאסף ב וצינור ארוך וגמיש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניסויי תא זרימת microfluidic הם כלים מצוינים כדי לחקור את תפקוד הטסיות ב זורם דם משמשים כדי להעריך המוסטאסיס במבחנה בהקשרי ניסיוני. למרות סטנדרטיזציה עני מעבדתיות 9, אנו מראים כי בתוך המעבדה שלנו וריאצית ניסיוני מקובל. זה מאפשר להשוות באופן מהימן (זיווג) דגימות בתוך מחקר נתון. זו קבלה תוקף באמצעות התופעה מתועדת היטב של נגע אחסון טסיות, וזאת כפועל יוצא מזיק של אחסון טסיות בתנאי בנק דם 11. יתר על כן, פרסמנו את ההשפעה לאחרונה של שלוש טכנולוגיות איון הפתוגן נגישות תפקוד טסיות PC בתאי זרימת microfluidic הבאה כינון מחדש של 14,15 דם.

טסיות מגיבים באופן שונה כאשר פרמטרי biophysical ו -chemical הם מגוונים 20. לכן, מאמץ גזירה, מספר תא composi הסלולרtion, טמפרטורה, ציפוי, קרישה וגורמים רבים נוספים ניתן לשנות בתוך פרוטוקול זה תלוי שאלת המחקר. פרוטוקול זה משתמש רק זמין מסחרי כלים קשים ו תוכנה, המאפשר מעבדות אחרות כדי לבצע assay דומה. למטרות מחקר בסיסיות זה יכול להיות חסרון בעיקר בגלל החומרה הזמינה פחות וברבגוניותם setups מחוייט. את assay כשלעצמה הוא איתן אך שחזור סובל וריאציה ביולוגית זמנית. לכן, דגימות assay יש לזווג ככל האפשר וללמוד בגדלים צריך להיות גדול מספיק. דוגמאות גם יש לזווג בזמן, כי הדם מחדש ניתן לאחסן רק לזמן קצר.

למרות בתאי לזרום microfluidic ללימודי תפקוד טסיות שהגדילו את שדה המחקר, יש לנקוט זהירות כדי overinterpret התלות טסיות על rheology דם. ראשית, הצורה המלבנית של תא הזרימה אינה פיזיולוגית, but את הטוב ביותר שיש לנו כדי לאפשר אופטי התמקדות thrombi גדל. שנית, כלי הדם אינם עשויים פלסטיק השפעת גמישות כלי הדם על תפקוד טסיות יכול ולכן לא להיחקר בפרוטוקול זה. שלישית, בלב גורם זרימת pulsatile, בעוד משאבות מזרק יותר ליניארי (אך גם מעט pulsatile). לבסוף, סוג סיבי קולגן אני הוא החומר הסטנדרטי המשמש לימודי טסיות תחת זרם, שהוא מן החי. ראוי לציין עם זאת, סוג סיבי קולגן אני ותוצאות קליניות לתפקוד טסיות לתאם גם במקרים רבים כפי שמוצג על ידי עשרות שנות ניסיון (העברת אור) aggregometry 21,22.

ישנם מבחני רבים ללמוד טסיות פונקציה 23. רוב הכתובות אלה אחד או כמה תכונות טסיות תוך טסיות לשים לעבוד (מודלים של) המוסטאסיס. הדמיה בזמן אמת של היווצרות פקיק כפי שהודגמו כאן היא כוללת ביותר, עד כה. משמעות הדבר היא ברוב ההיבטים של PLA תגובת telet פציעת כולים כלולה. יתרונות ייחודיים הם הכללת זרימת הדם ואת הנוכחות של כל תאי הדם. Assay הוא רגיש תרופות המשמשות כיום לטיפול אנטי טסיות 24 כמו גם לשינויים גנטיים וכתוצאה מכך תפקוד טסיות סוטה 25. זו ממחישה הערך שלה כאינדיקטור רלוונטי של תפקוד הטסיות. האופי המקיף של assay זה בכל זאת גם מרמז שזה פחות אנליטיים מאלה מבחני מדידת תכונות ספציפיות של תגובת טסיות. השפעות של מניפולציות בנקאות דם על תרכיזים טסיות ולכן יכולות ידי נאספות על ידי מבחני תא זרימה, אך לפרש מה גורם להם, נדרש ניתוח נוסף. למשל, הנתונים שלנו מצביעים על כך טמפרטורה משפיעה הידבקות טסיות משמעותית בתאים לזרום microfluidic. אבל ניתוח מפורט נוסף הוכיח כי טסיות בקירור לשנות צורה אשכול GPIbα קולטני 26.

ילדה = "jove_content"> הרבגוניות של היתרי המשטח הדבק ללמוד מצעים או שילובים טסיות תגובתי שונים ממנו. מחקר שנערך לאחרונה על ידי דה ויט et al. 16 הוכיח את הרלוונטיות של הגדרת מצע טסיות ביולוגיה מערכתית. מעבר לכך, השילוב של משתנה שיעורי גזירה בתפקוד של המצע חשוב כי מחייב של טסיות משותק VWF ידרוש שיעורי גזירה גבוהים, גם אם זה פחות חשוב עבור מחייב קולגן. לכן, בהתאם לשאלת המחקר, בחירות יכולות להתבצע על מה מצעים והספיקות שלהם הן להיכלל.

לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול לניסויי תא זרימת microfluidic ללמוד תפקוד טסיות בהקשר של בנקאות דם ורפואת עירוי. מאמצי תקינה נמשכים 9,10,28-30 ואת רוב ההמלצות הללו כלולים בפרוטוקול שהוצג. את הכינון מחדש של דם הוא מודלעירוי אבל עבודת אימות נוספת צריך לציין את הרלוונטיות לתוצאות קליניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Heparin Becton, Dickinson and Company 368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Hirudin Blood tube Roche 6675751 001
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Tube 5 ml Simport 11691380
Conical tube 15 ml Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 ml Greiner bio-one 227261
10 ml Syringe BD 309604
Precision wipes Kimtech 5511
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect Cellix MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Software microfluidic pump Cellix N/A Venaflux Assay
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Bleach 10% in house preparation in house preparation
0.1 M NaOH in house preparation in house preparation
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Hematology analyzer Sysmex N/A
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Platelet incubater Helmer PF-48i
Incubation water bath GFL 1013
Pipette Brand A03429
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vortex VWR 58816-121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
  2. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
  3. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
  4. Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
  5. Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
  6. Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
  7. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. (2013).
  8. Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87, (Suppl 1), S51-S55 (2012).
  9. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
  10. Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
  11. Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
  12. Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
  13. Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
  14. Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
  15. Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. (2015).
  16. de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
  17. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  18. Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7, (Suppl 1), 17-20 (2009).
  19. Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
  20. Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
  21. Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
  22. Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
  23. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
  24. Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
  25. Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
  26. Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. (2012).
  27. Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
  28. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
  29. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
  30. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics