Microfluidic प्रवाह कक्षों पुनर्गठन रक्त का उपयोग Hemostasis और प्लेटलेट ट्रांसफ्यूजन मॉडल

Bioengineering

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Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823, doi:10.3791/53823 (2016).

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Abstract

Introduction

रक्तस्तम्भन एक प्रतिबंधित spatiotemporal संदर्भ 1 में कोशिकाओं, प्रोटीन, आयनों और ऊतकों के संयुक्त और विनियमित गतिविधि की आवश्यकता है। अनियंत्रित गतिविधि रक्त जमावट से संबंधित विकारों की एक स्पेक्ट्रम में रक्तस्राव या घनास्त्रता और रुग्णता या मृत्यु दर को जन्म दे सकता है। एक microfluidic प्रवाह कक्ष प्रयोग एक चुनौतीपूर्ण तकनीक है कि इन विट्रो में रक्तस्तम्भन mimics है। यह दृष्टिकोण प्रक्रियाओं है कि ब्लड प्लेटलेट्स के लिए एक प्रमुख भूमिका के साथ रक्तस्तम्भन में भाग लेने के जटिल परस्पर क्रिया की जांच की अनुमति देता है।

संवहनी चोट के बाद, प्लेटलेट्स खून की कमी को रोकने के लिए अवगत कराया subendothelial मैट्रिक्स (glyco) प्रोटीन का पालन करें। आसंजन के बाद, प्लेटलेट्स को सक्रिय करने और जवाबी कार्रवाई में कुल ऑटो और पैराक्राइन संकेतन जो अंत में एक प्लेटलेट नेटवर्क के गठन, आतंच द्वारा स्थिर और एक फर्म में जिसके परिणामस्वरूप की ओर जाता है, सील thrombus 2 घाव। अधिकांश अन्य प्लेटलेट समारोह परीक्षण, अनुभव के विपरीतप्रवाह कक्षों के साथ बयान खाते में रक्त के प्रवाह के भौतिक पैरामीटर और इसलिए भाग लेने कोशिकाओं और biomolecules 3,4 पर rheology के प्रभाव ले।

प्रवाह कक्ष प्रयोगों मुख्य मापदंडों को प्रभावित hemostatic (उप) चिपकने वाला मैट्रिक्स, rheology और प्रवाह प्रोफाइल, सेलुलर संरचना, जहर या ड्रग्स, आयनिक शक्ति और बहुत से अधिक की उपस्थिति सहित प्रक्रियाओं अलग से रक्तस्तम्भन और घनास्त्रता में मील का पत्थर अंतर्दृष्टि उत्पन्न किया है। पिछले दो दशकों में, कम throughput प्रवाह कक्ष बड़ा नमूना संस्करणों (10-100 एमएल) की आवश्यकता होती है प्रयोगों अक्सर छोटे समानांतर प्लेट कक्षों से मिलकर और नियंत्रित दीवार कतरनी की स्थिति 5 पर पूरे रक्त perfusing के लिए आधुनिक प्रौद्योगिकी सहित microfluidic कक्षों को विकसित किया है। Microscaling काफी परख throughput बढ़ गया है, क्योंकि ज्यादातर हार्डवेयर सेटअप को सरल बनाया गया है और कम (खून) की मात्रा की आवश्यकता होती है, प्रयोग और अधिक सुलभ और Versati प्रतिपादनle। उदाहरण के लिए, छोटी प्रयोगशाला जानवरों से खून अब जानवरों को बलिदान करने के लिए आवश्यकता के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के रक्त के नमूने इस प्रकार को बढ़ावा देने या रक्तस्तम्भन बाधा कुंजी अणुओं की पहचान करने में और उपन्यास बुनियादी अंतर्दृष्टि 6 में हुई है।

विशेष अनुसंधान प्रयोगशालाओं अक्सर अभी भी polydimethylsiloxane (PDMS) 7 कि lithographed नए नए साँचे जो सॉफ्टवेयर द्वारा blueprinted जा सकता है पर polymerizes से उदाहरण के लिए कस्टम मेड प्रवाह कक्षों का उपयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप कक्ष, सस्ती डिस्पोजेबल है और आसानी से पोस्ट अस्थायी विश्लेषण के लिए disassembled किया जा सकता है। इसके अलावा, मूल रूप से जहाजों, bifurcations सहित या तेज बदल जाता है की किसी भी डिजाइन आदेश पर बनाया जा सकता है। यह लाभ भी इसके नकारात्मक पहलू के बाद से पहले से ही मानकीकरण प्रवाह कक्ष प्रयोगों के साथ प्राथमिक समस्या थी, और PDMS कस्टम कक्षों इस सहायता प्राप्त नहीं किया है बनाया है। इस विशेष मुद्दे के शीर्ष पर, कोटिंग (स्थिति), फ्लोरोसेंट जांच, थक्कारोधी, अस्थायी परerature और नमूना और विश्लेषण के बीच के समय सभी खराब 8 मानकीकृत कर रहे हैं। इन चर के मानकीकरण चुनौती दे रहा है, लेकिन फिर भी प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना की अनुमति के लिए जरूरी है। इस विषय को Biorheology 9,10 पर वैज्ञानिक और मानकीकरण उपसमिति में घनास्त्रता और Haemostasis पर इंटरनेशनल सोसायटी के प्रमुख विषय है।

प्लेटलेट ध्यान केंद्रित (पीसी) विभिन्न रोगों कि थ्रोम्बोसाइटोपेनिया और / या रक्तस्राव का कारण से पीड़ित रोगियों में चढ़ाया जाता है। लेकिन पीसी में प्लेटलेट्स, असंवेदनशील करने के लिए जाना जाता है, विशेष रूप से भंडारण समय 11 के समारोह में गिरावट उम्र बढ़ने की प्रक्रिया है और आमतौर पर प्लेटलेट भंडारण घाव के रूप में संदर्भित करने के लिए जुड़ा हुआ है। यह कभी कभी दावा किया है कि इस तरह के प्लेटलेट्स प्रचलन एक बार चढ़ाया 12 में बहाल है, लेकिन इस के लिए सबूत दुर्लभ है। इसके अलावा, एक पीसी बनाने प्लेटलेट्स की कार्यक्षमता नियमित रूप से परीक्षण नहीं किया गया है क्योंकि इस तरह के assays और बीच के रिश्तेचिकित्सीय या रोगनिरोधी प्रभावकारिता स्पष्ट नहीं 13 है। Microfluidic प्रवाह कक्षों पीसी में प्लेटलेट समारोह की जांच करने के लिए संग्रह और जारी करने के बीच जोड़तोड़ की श्रृंखला अनुकूलन करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं। यह प्रत्यक्ष (बनती) पीसी की तुलना में हम पहले 14,15 प्रकाशित किया है और यहाँ वर्णित है के लिए एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल मानव नमूनों पर अनुसंधान के लिए संस्थागत नैतिक दिशा निर्देशों के बाद और सूचित सहमति शामिल सभी दानदाताओं से प्राप्त हुई थी। यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए स्वीकृति एंटवर्प विश्वविद्यालय अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड से प्राप्त हुई थी।

नोट: तापमान संकेत हमेशा कमरे के तापमान, जब तक निर्दिष्ट कर रहे हैं।

1. तैयारी फ्लो चैंबर सेटअप

  1. तैयारी लेन, ट्यूबिंग और पिंस
    1. भंवर कोलेजन निलंबन सख्ती और isotonic ग्लूकोज समाधान 50 ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रदाता द्वारा आपूर्ति में 1/20 पतला।
      नोट: हम घोड़े का पट्टा कोलेजन का उपयोग मुख्य रूप से के प्रकार मैं तंतुओं बना हुआ है। घोड़े का कोलेजन प्रकार मैं अक्सर "Horm" कोलेजन के लिए भेजा और दोनों ऐतिहासिक रूप में अच्छी तरह के रूप में जैविक कारणों के लिए परख 9 के इस प्रकार के लिए स्वर्ण मानक है। मानव प्रकार III कोलेजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन वेंई कोट तंतुओं कम अच्छी तरह से और प्लेटलेट प्रतिक्रिया के रूप में मजबूत नहीं है। अन्य कोटिंग सतहों भी उदाहरण वॉन Willebrand फैक्टर (VWF), फाइब्रिनोजेन, फ़ाइब्रोनेक्टिन, laminin, vitronectin, thrombospondin -1 या इन 16 के संयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. प्रदाता के कंटेनर से एक नया डिस्पोजेबल biochip ले लो। यहां इस्तेमाल biochips के आयामों 0.4W x 0.1H मिमी 3 में एक्स 20L हैं।
    3. Pipet चिप और दुकान के रूप में मार्क के एक छोर पर लेन (s) microfluidic biochip के में 0.8 μl। सुनिश्चित करें कि लेन कोटिंग समाधान 1.1.1 में तैयार युक्त कोलेजन के साथ 5/6 भर जाता है सुनिश्चित करें। सुनिश्चित करें कोई हवाई बुलबुले देखते हैं कि।
      नोट: चैनल आंशिक रूप से चैनल के प्रवेश द्वार पर कोलेजन फाइबर के संचय से बचने के लिए (चर्चा देखें) लेपित हैं।
    4. 4 घंटा या रात एक humidified और बंद कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. बफर अवरुद्ध (1.0% (pipetting w / v) गोजातीय सीरम एक एल्बुमिन से लेपित चैनलों ब्लॉकदूसरे छोर और निशान पर; 10 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) खारा बफर (0.9% (w / v) NaCl, पीएच 7.4 एचबीएस) में डी 0.1% (w / v) ग्लूकोज प्रवेश के रूप में। सुनिश्चित करें कि लेन पूरी तरह से अवरुद्ध बफर हवा के बुलबुले से बचने से भर जाता है।
    6. समान लंबाई (12 सेमी) पर ट्यूबिंग कट। लेन प्रति एक का उपयोग करें और एक पिन के साथ प्रत्येक ट्यूबिंग कनेक्ट। उदाहरण के लिए, एक प्रयोग के दो स्थितियों की तुलना, दो प्रतियों में चलाने की आवश्यकता होगी चार ट्यूबिंग फैला है और चार पिन के लिए तैयार रहना।
    7. एक सिरिंज और एक 26 जी सुई या साथ कनेक्टर्स का उपयोग आसुत जल के साथ ट्यूबिंग कुल्ला।
    8. बफर अवरुद्ध साथ ट्यूबिंग तर। 1 घंटा की एक न्यूनतम के लिए एक बंद और humidified कंटेनर में स्टोर।
  2. पम्प और कई गुना तैयारी
    1. पंप कुल्ला और आसुत जल से कई गुना, हवा के बुलबुले को हटा दें।
    2. biochip लेन (एस) के आउटलेट पर तय 10 μl टिप का उपयोग कर से बाहर अवरुद्ध बफर aspirate। की सतह को साफएक सटीक धूल मुक्त पोंछे और denaturated शराब के साथ biochip प्रिंट और धूल हटाने के लिए।
    3. एक स्वचालित खुर्दबीन मंच पर biochip को ठीक करें। एक से अधिक लेन एक समय में एक साथ इस्तेमाल किया जाता है, biochip आउटलेट के लिए आठ लेन कई गुना फाड़नेवाला कनेक्ट।
      नोट: आठ लेन कई गुना फाड़नेवाला हार्डवेयर का एक टुकड़ा है (चित्रा एस 1) पंप और biochip से जुड़ा है। यह एक biochip या गलियों जो ऑपरेटर से परिभाषित साथ सॉफ्टवेयर में किया जा सकता का एक संयोजन पर सभी उपलब्ध (आठ) गलियों के संचालन की अनुमति देता है।
    4. ट्यूबिंग में पिन का प्रयोग biochip इनलेट में उन्हें ठीक करने के लिए। एक 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार टेस्ट ट्यूब एचबीएस के साथ भर में ट्यूबिंग (पिन के बिना) के दूसरे छोर रखें। सभी ट्यूबिंग और पंप का उपयोग कर 1 मिलीलीटर एचबीएस के साथ उनके जुड़ा गलियों कुल्ला, तो के रूप में शेष बफर अवरुद्ध और खराब कोलेजन पालन हटा दें।

2. रक्त के नमूनों की तैयारी

  1. संग्रह और की जुदाईएक स्वस्थ स्वयंसेवक से ताजा पूरे रक्त। 17
    1. एक खाली ट्यूब एक anticoagulant के रूप ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त रक्त की पहली मिलीलीटर लीजिए और विशेष रूप से एक स्वचालित रुधिर विश्लेषक के साथ पूर्ण रक्त गणना (सीबीसी) के लिए इस नमूने का उपयोग करें।
    2. एक उपयुक्त थक्कारोधी खाली ट्यूब का उपयोग करने में खून की एक मात्रा ले लीजिए। प्रवाह कक्ष प्रयोगों के लिए मानक anticoagulants हेपरिन या Hirudin हैं जब आतंच गठन का अध्ययन प्रोटोकॉल और सोडियम साइट्रेट जब यह है का हिस्सा नहीं है।
      नोट: हेपरिन सभी परिणामों में वर्णित प्रयोगों के लिए एक anticoagulant के रूप में इस्तेमाल किया गया था।
      नोट: रक्त की मात्रा प्रयोगों की संख्या पर निर्भर प्रदर्शन किया जाएगा। लगभग 1 से 3 गलियों के लिए ट्यूब (7 मिलीलीटर)।
    3. एक रोटेटर लंबित रक्त पुनर्गठन पर ट्यूबों रखें।
      नोट: परख शिराछदन के 3 घंटा के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।
    4. 250 ग्राम पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा तैयार करने के लिए (पीआरपी)। शिथिल पैक गोली की अशांति को रोकने के लिए सेंट्रीफ्यूज को तोड़ने का प्रयोग न करें।
      1. जब एक से अधिक ट्यूब एकत्र किया गया था, एक भी शंक्वाकार centrifugation ट्यूब में रक्त पूल।
        नोट: केन्द्रापसारण अधिक धीरे धीरे कम या ज्यादा लंबे समय तक किया जा सकता है, पीआरपी उपज और अंतर सेल "संदूषण" के आधार पर प्राथमिकता दी।
    5. निकालें और पीआरपी और बफी कोट कुछ प्लेटलेट्स के साथ पैक लाल रक्त कोशिकाओं को बेदखल त्यागें।
      नोट: पैक लाल सेल अंश में प्लेटलेट काउंट 13 ± 5 एक्स 10 3 μl प्रति (± एसडी मतलब है, एन = 12) हमारे हाथ में औसत पर।
  2. रक्त पुनर्गठन
    1. पिघलना रक्त समूह एबी (रीसस डी नकारात्मक) 5 मिनट और 4 मिलीलीटर प्रति 20 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा।
    2. एक स्वचालित रुधिर विश्लेषक का उपयोग 2.1.5 में तैयार पैक लाल रक्त कोशिकाओं के hematocrit निर्धारित करते हैं।
    3. ब्लड बैंक में प्लेटलेट एकाग्रता का निर्धारण तैयार प्लेटलेट ध्यान केंद्रित Thaटी के ऊपर लाल सेल अंश को पुनर्गठित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    4. खचाखच भरे लाल रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट ध्यान केंद्रित है कि एक 1 मिलीलीटर नमूने में 40% hematocrit और 250 x 10³ प्लेटलेट्स / μl निकलेगा की मात्रा की गणना।
      नोट: कोशिकाओं के अन्य लक्ष्य titers मनमाने ढंग से अध्ययन प्रोटोकॉल के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है।
    5. स्थानांतरण एक काटा pipet टिप का उपयोग और जब तक 1 मिलीलीटर की एक नमूना मात्रा तक पहुँच जाता है प्लेटलेट ध्यान केंद्रित जोड़ने के लिए एक ताजा ट्यूब में लाल रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा पैक।
      नोट: क्योंकि प्लाज्मा thrombus गठन दर पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है चर का अध्ययन के आधार पर, प्लाज्मा अंश सभी पुनर्गठन के नमूनों में बराबर होना चाहिए। उदाहरण के लिए, दोहराया फ्रीज विगलन या प्लाज्मा परिणाम को प्रभावित कर सकते विभिन्न दानदाताओं से या अलग anticoagulants पर ले लिया।
    6. धीरे inverting द्वारा पुनर्गठित रक्त मिलाएं और एक सीबीसी प्रदर्शन करते हैं।
    7. एक "रिक्त" नियंत्रण नमूना है जिसमें प्लेटलेट की मात्रा अंश बदल दिया है तैयार0.9% (एम / वी) पानी में सोडियम क्लोराइड का एक ही मात्रा द्वारा पुनर्गठित रक्त एक सीबीसी का उपयोग करने में अंतर्जात प्लेटलेट्स की एकाग्रता (यानी गैर-ब्लड बैंक प्लेटलेट्स) निर्धारित करने के लिए।
  3. लेबलिंग
    1. Pipet 1 मिलीलीटर 1 μl 5 मिमी Calcein AM (5 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) युक्त एक टेस्ट ट्यूब में रक्त का पुनर्गठन किया।
      नोट: अन्य सेल रंगों 14 में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. inverting द्वारा धीरे मिलाएं।
    3. उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।

3. छिड़काव परख

  1. गलियों के तल पर पालन कोलेजन तंतुओं पर उद्देश्य ध्यान दें। आदर्श रूप में, यह ध्यान केंद्रित रणनीति के लिए चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) सेटिंग्स का उपयोग करें। डिजिटल चयन किया जेड पदों को ठीक करने के लिए प्रयोग सॉफ्टवेयर में 'चयनित टाइल क्षेत्रों के लिए वर्तमान जेड सेट' का चयन करें।
  2. मीटर के प्रयोग सॉफ्टवेयर में लेन (XY) में ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन करेंicroscope कि प्रयोग के दौरान दर्ज किया जाएगा।
    नोट: रॉय किसी भी सतह क्षेत्र मनमाने ढंग से एक छिड़काव लेन के भीतर चुना जा सकता है। यह thrombus गठन का विश्लेषण करने के लिए नहीं में और एक गली के आउटलेट को बंद इतना है कि इस क्षेत्र में चर प्रवाह प्रोफ़ाइल के दुष्प्रभाव से बचने के लिए, भले ही यह अपेक्षाकृत छोटा है की सलाह दी जाती है। रॉय सतह क्षेत्र प्लेटलेट्स की एक महत्वपूर्ण संख्या में होते हैं या संकेत को समतल करने के लिए अनुमति देते हैं thrombi चाहिए। इस प्रोटोकॉल में रॉय तीन समान रूप से आकार पक्ष द्वारा साइड 2 सेमी लंबी गली के बीच में 0.62 मिमी 2 में जिसके परिणामस्वरूप छवियों का एक डिजिटल सिले समुच्चय है।
  3. धीरे inverting से नमूने मिश्रण और स्वचालित मंच पर biochip करने के लिए इन अगले स्थिति।
  4. ट्यूबिंग कि पुनर्गठन रक्त के नमूने से युक्त टेस्ट ट्यूब में biochip के प्रवेश के साथ जुड़ा हुआ है रखें।
  5. नलियों का परीक्षण से जुड़े उन चैनलों के लिए (के रूप में वांछित या अन्य कतरनी तनाव) 50 डाएन / 2 सेमी पर पंप लॉन्चपंप के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पुनर्गठित रक्त के नमूने हैं।
    नोट: अन्य कतरनी तनाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. रिकॉर्ड छवियों माइक्रोस्कोप के अधिग्रहण और प्रयोग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वास्तविक समय में 5 मिनट के लिए हर 15 सेकंड।
    नोट: अन्य समय श्रृंखला प्रयोगात्मक सेट अप के आधार पर किया जा सकता है।
    नोट: हम आम तौर पर एक 100X बढ़ाई (10X उद्देश्य और 10X लेंस) का उपयोग करें, लेकिन उच्च (या कम) बढ़ाई आसानी से एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

4. धो बाहर

  1. सभी ट्यूबिंग आउटलेट से जुड़ी है और आसुत जल का उपयोग कर मल्टीचैनल कई गुना या पंप से जुड़ा है, सोडियम हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) 0.5% द्वारा पीछा बाहर धो (वी / वी) और पानी में अंत में 0.1 एम NaOH। ट्यूबिंग खतरनाक अपशिष्ट के रूप में biochip इनलेट पर टिकी त्यागें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ thrombus विकास कैनेटीक्स निर्धारित करते हैं। निम्न आदेश ZEN2012 के लिए विशिष्ट हैं। प्लेटलेट्स की सतह कवरेज का निर्धारण करने के लिए प्लगइन छवि विश्लेषण खोलें।
  2. एक पालन प्लेटलेट या पालन प्लेटलेट्स पिक्सेल तीव्रता है कि एक सकारात्मक संकेत के साथ संबद्ध परिभाषित करने के लिए इंटरएक्टिव टैब का विश्लेषण करें, अर्थात् में प्रतिदीप्ति सीमा निर्धारित करें।
  3. टेबल बनाने के लिए स्वचालित रूप से एक स्प्रेडशीट कि उन "वस्तुओं" चयनित थ्रेसहोल्ड के बीच एक संकेत के साथ पिक्सल युक्त के अलग-अलग क्षेत्रों सतह (माइक्रोन 2 में) में शामिल होंगे उत्पन्न करने के लिए प्रयोग करें। यह हर समय बिंदु के लिए किया जाता है।
    नोट: एक बार प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड किया गया है चुना है, विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से दृश्य क्षेत्र में 'वस्तुओं' है कि मानदंड को पूरा पता लगाता है। इन वस्तुओं thrombi, छोटे प्लेटलेट समुच्चय या एकल प्लेटलेट्स होते हैं और पिक्सल के एक नंबर को कवर किया। हर वस्तु स्प्रेडशीट में अलग से सूचीबद्ध है।
  4. एक्सएमएल फॉर्मेट में इन स्प्रेडशीट सहेजें और एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में उन्हें खुलाआगे की गणना के लिए।
  5. योग द्वारा चयनित वस्तुओं की कुल सतह क्षेत्रों और माप क्षेत्र (माइक्रोन 2) के कुल क्षेत्रफल से परिणाम विभाजित। इस रिश्तेदार सतह कवरेज (%) निकलेगा। हर समय बिंदु के लिए ऐसा करते हैं।
  6. छिड़काव समय के समारोह में इन सतह कवरेज प्लॉट और रेखीय प्रतिगमन से ढलान की गणना, कि विशेष स्थिति का थक्का विकास गतिज उपज।

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Representative Results

इंट्रा-परख भिन्नता प्रदर्शित करने के लिए, तीन समान पुनर्गठन पूरे रक्त के नमूने पर कोलेजन लेपित सतहों (चित्रा 1) एक साथ भरकर रखा गया था। यह 8.7% की भिन्नता के गुणांक में हुई। इससे पता चलता है संबंधित नमूनों के बीच विश्वसनीय तुलना की अनुमति देने का सुझाव स्वीकार्य इंट्रा-परख और intralaboratory भिन्नता।

वाणिज्यिक प्रवाह कक्ष के प्रवेश हम यहाँ वर्णन माप चैम्बर को सीधा है और यह थोड़ा उस बिंदु पर लामिना का प्रवाह के बजाय अशांत हो सकता है। विशेष रूप से anticoagulation बिना प्रयोगों में यह रक्त और स्थिर एगोनिस्ट के बीच संपर्क समय में वृद्धि हुई है, क्योंकि clogging का कारण बन सकता है। भरा हुआ इनलेट readout कक्ष में नीचे की ओर उलझाना कर सकते हैं। इसलिए, सेटअप आंशिक रूप से प्रवाह कक्ष (चित्रा 2) छोड़ने कोटिंग से अनुकूलित किया गया थाप्लेटलेट एगोनिस्ट से रहित inlets, जिससे प्राथमिक और माध्यमिक रक्तस्तम्भन की असामयिक सक्रियण से परहेज। चिपकने वाली सतहों के आंशिक कोटिंग इसके अलावा सफलतापूर्वक क्षेत्र में 16 अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा किया जाता है। इसके अलावा, इस व्यावहारिक सीधी चाल "परिवर्तन" क्षेत्र का अध्ययन करने के लिए जहां रक्त गैर प्रतिक्रियाशील (Uncoated) सतह पर बहने प्रतिक्रियाशील (लेपित) हिस्से पर जारी है एक परिसंपत्ति है।

ट्रांसफ्यूजन की कमी घटक के साथ खून पुनर्गठन द्वारा नकली था। इस उद्देश्य के लिए, पूरे रक्त से एक स्वस्थ दाता अंतर centrifugation और पीसी प्लेटलेट्स द्वारा thrombocytopenic गाया था प्लेटलेट गिनती बढ़ाने के लिए जोड़ा गया था anticoagulated। यहाँ एक महत्वपूर्ण सवाल यह है कि प्लेटलेट लिए उद्देश्य के लिए गिनती की गई थी? ज्यादातर मामलों में, वास्तविक जीवन संचारण thrombocytopenic रोगी में प्लेटलेट गिनती को सामान्य बनाने में परिणाम नहीं है। बल्कि एक निश्चित सीमा से ऊपर एक मूल्य के लिए उद्देश्य से है,हालांकि सटीक लक्ष्य मूल्य है बीमार परिभाषित 19। रक्त पुनर्गठन के संदर्भ में microfluidic प्रवाह कक्षों परिणामों पर प्लेटलेट गिनती बदलती के प्रभाव को समझने के लिए कई reconstitutions प्लेटलेट सांद्रता कम (चित्रा 3) के साथ प्रदर्शन किया गया। जैसी कि उम्मीद थी, कम प्लेटलेट गिनती छिड़काव समय के समारोह में कम आसंजन में हुई। इसलिए, एक अध्ययन के भीतर दी, प्लेटलेट गिनती नमूना शर्तों 20 के बीच तुलना की अनुमति के लिए मानकीकृत किया जाना चाहिए। मात्र तथ्य कम आसंजन जब प्लेटलेट गिनती कम हालांकि मतलब ये नहीं कि परख thrombocytopenic नमूनों में प्लेटलेट बयान मापने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता क्योंकि माइक्रोस्कोपी और कैमरा सेटिंग्स संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि वहाँ है। अंत में, ज्यादातर मामलों में, thrombocytopenic पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल नमूना शेष ऑटोलॉगस प्लेटलेट्स जो रोगियों की मांग 19 सबसे आधान में स्थिति के जैसा होता है। यह curr हैently स्पष्ट नहीं है, तो और क्या ऑटोलॉगस प्लेटलेट्स की भूमिका एलोजेनिक प्लेटलेट्स के साथ आधान के संदर्भ में है, लेकिन भविष्य के अनुसंधान के लिए एक दिलचस्प सवाल है।

स्वस्थ स्वैच्छिक दाताओं से रक्त का संग्रह के बाद, पूरे रक्त अक्सर ठंडा करने के लिए और घटक तैयारी करने से पहले लगातार कमरे के तापमान पर रखा जाता है। प्लेटलेट्स हालांकि तापमान में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं। चित्रा 4 रक्त संग्रह के बाद और छिड़काव के दौरान कमी आई तापमान के प्रभाव को दर्शाता है। Thrombi और धीरे धीरे एक समान (बनती) नमूना की तुलना में निर्माण करने के लिए जब रक्त कमरे के तापमान (चित्रा -4 ए) के लिए ठंडा हो गया था पाए गए अध्ययन (चित्रा 4 बी) के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा।

संचलन में, प्लेटलेट्स बुलंद दीवार कतरनी तनाव की स्थिति में पोत चोट साइट्स के लिए बाध्य है। microfluidic प्रवाह कक्षों ग में बदलती कतरनी दरोंVWF साथ oated / फाइब्रिनोजेन अंत बिंदु पर कुल प्लेटलेट आसंजन (चित्रा 5 ए) के लिए मतभेदों में और thrombus विकास कैनेटीक्स (चित्रा 5 ब) के लिए हुई।

अंत में, कैसे प्रदर्शित करने microfluidic प्रवाह कक्षों आधान के लिए इस्तेमाल किया पीसी जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, पीसी संग्रहण के समारोह में थक्का विकास कैनेटीक्स जांच की गई। नमूना तैयार करने और प्रयोगात्मक सेट अप में सभी चर अध्ययन की अवधि में मानकीकृत किया गया। इसलिए, एकमात्र चर पैरामीटर था पीसी भंडारण समय। चित्रा 6 विट्रो में रक्तस्तम्भन पर प्लेटलेट भंडारण घाव के प्रभाव का प्रदर्शन भंडारण समय के समारोह में थक्का वृद्धि में कमी को दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। Microfluidic प्रवाह कक्ष प्रयोगों में इंट्रा-परख भिन्नता Microfluidic Flo डब्ल्यू चैम्बर प्रयोगों 50 dynes / सेमी ² पर स्थिर कोलेजन पर प्रदर्शन किया गया। सभी तीन समान पुनर्गठन पूरे रक्त के नमूने समानांतर में और एक ही समय में भरकर रखा गया था। परिणाम रेंज (मूंछ) छिड़काव समय के समारोह में सतह के कवरेज के लिए के रूप में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। आंशिक रूप से लेपित चैनल (ए) कोलेजन फाइबर चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना केवल लेपित क्षेत्र में पाए गए। (बी), 50 डाइन पर पंप एक Calcein AM पुनर्गठन लेबल पूरे रक्त नमूने के साथ छिड़काव के 5 मिनट के बाद एक स्नैपशॉट / 2 सेमी दिखाया गया है। दोनों छवियों को एक 100X बढ़ाई पर ले जाया गया। ig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: thrombus विकास कैनेटीक्स पुनर्गठन रक्त में प्लेटलेट गिनती पर निर्भर करती है (ए) रक्त एक रक्त बैंक प्लेटलेट का उपयोग कर पुनर्गठन किया गया था विभिन्न प्लेटलेट सांद्रता उपज ध्यान केंद्रित:। 245 x 10³ / μl (●), 42 x 10³ / μl (■) और 12 एक्स 10³ / μl (▲)। कोलेजन लेपित चैनलों के साथ Microfluidic प्रवाह कक्ष प्रयोगों 50 dynes / सेमी ² का एक कतरनी तनाव में सभी तीन नमूने के लिए एक साथ प्रदर्शन किया गया। (बी) ढलानों पैनल में कच्चे डेटा चित्रित कर रहे हैं के रेखीय प्रतिगमन द्वारा गणना की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ontent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 4
चित्रा 4:। तापमान और microfluidic प्रवाह कक्षों पूरे रक्त हेपरिन वैक्यूटेनर में एकत्र कमरे के तापमान (ए) में या 37 डिग्री सेल्सियस (बी) पर एक पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए संरक्षित किया गया था। 50 डाइन की एक कतरनी तनाव में स्थिर कोलेजन पर Microfluidic छिड़काव / 2 सेमी प्रदर्शन किया गया था। अंत बिंदु (5 मिनट के छिड़काव) चित्रित कर रहे हैं पर स्नैप शॉट्स। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: स्थिर VWF / फाइब्रिनोजेन को प्लेटलेट आसंजन पर कतरनी तनाव की भूमिका (ए)। चार समान, calcein, लेबल AM पूरे रक्त का पुनर्गठन4.5 dynes / सेमी ² (●), 50 dynes / सेमी ² (■), 90 dynes / सेमी ² (▲) और 225 dynes / सेमी ² (♦): नमूने चर कतरनी तनाव के साथ एक VWF / फाइब्रिनोजेन लेपित सतह पर भरकर रखा गया था। छिड़काव के 3 मिनट के बाद, एक स्नैप शॉट सभी चार चैनलों के लिए लिया गया था। (ए) में वर्णित नमूने के समय के समारोह में (बी) सतह कवरेज thrombus विकास कैनेटीक्स में मतभेद को दर्शाता हुआ दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। प्लेटलेट की thrombus गठन भंडारण समय के समारोह में केंद्रित सभी microfluidic प्रवाह कक्ष प्रयोगों 50 dynes / 2 सेमी की एक कतरनी दर पर कोलेजन लेपित सतहों मानकीकृत शर्तों के तहत किया गया था। रक्त reconsti थाएक ही दिन में तीन सांद्र (●) पर दो प्रतियों में परीक्षण किया प्लेटलेट नमूने, सात (■) और दस (▲) के बाद दान के साथ tuted। में छिड़काव समय के समारोह में चित्रित कर रहे हैं सतह कवरेज। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एस चित्रा 1

चित्रा एस 1:। Microfluidic प्रवाह कक्ष हार्डवेयर सेटअप (ए) एक रग 8 फ्लोरो + biochip माइक्रोस्कोप के स्वचालित मंच पर मुहिम शुरू की है और आठ अलग चैनलों में पम्पिंग समारोह विभाजित करने के लिए कई गुना के साथ एक सिरिंज पंप करने के लिए लचीला टयूबिंग के माध्यम से जुड़ा हुआ है। (बी) के पुनर्गठन रक्त biochip (प्रवेश) के चयनित चैनलों में सही पक्ष पर डिस्पोजेबल ट्यूबिंग के माध्यम से बहती है। डिस्पोजेबल ट्यूबिंग एक stainl के माध्यम से प्रवेश में तय हो गई हैईएसएस स्टील डिस्पोजेबल पिन सेटअप के साथ आपूर्ति की। (बी) में रक्त के प्रवाह दाईं से बाईं ओर से है और लंबे समय तक लचीला tubings में एकत्र किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Microfluidic प्रवाह कक्ष प्रयोगों खून बहने में प्लेटलेट समारोह की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हैं और प्रयोगात्मक संदर्भों बदलती में इन विट्रो में रक्तस्तम्भन मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। गरीब interlaboratory मानकीकरण 9 के बावजूद, हम दिखाना है कि हमारी प्रयोगशाला के भीतर प्रयोगात्मक बदलाव स्वीकार्य है। यह मज़बूती से एक दिया अध्ययन के भीतर (बनती) नमूने की तुलना करने की अनुमति देता है। यह प्लेटलेट भंडारण घाव है, जो रक्त बैंक की स्थिति 11 में प्लेटलेट भंडारण की एक हानिकारक परिणाम है की अच्छी तरह से प्रलेखित घटना का उपयोग कर मान्य किया गया था। इसके अलावा, हम हाल ही में रक्त 14,15 के पुनर्गठन के बाद microfluidic प्रवाह कक्षों में पीसी प्लेटलेट समारोह पर तीन उपलब्ध रोगज़नक़ निष्क्रियता प्रौद्योगिकियों के प्रभाव को प्रकाशित किया।

प्लेटलेट्स अलग प्रतिक्रिया जब biophysical और -chemical मापदंडों के विविध 20 कर रहे हैं। इसलिए, कतरनी तनाव, सेल नंबर और सेलुलर composiमोर्चे, तापमान, कोटिंग, थक्कारोधी और कई और अधिक कारकों इस प्रोटोकॉल अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है के भीतर संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हार्ड और सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग करता है, अन्य प्रयोगशालाओं के लिए एक समान परख प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। बुनियादी अनुसंधान प्रयोजनों के लिए इस एक नुकसान हो सकता है, खासकर इसलिए कि उपलब्ध हार्डवेयर कस्टम बनाया setups की तुलना में कम बहुमुखी है। अपने आप में परख मजबूत है लेकिन reproducibility जैविक और लौकिक भिन्नता से ग्रस्त है। इसलिए, परख नमूने के रूप में बहुत संभव के रूप में बनती है और आकार का अध्ययन पर्याप्त बड़ी होना चाहिए की जरूरत है। नमूने भी समय में बनती हो सकता है क्योंकि पुनर्गठन रक्त केवल एक कम समय के लिए भंडारित किया जा सकता है की जरूरत है।

हालांकि प्लेटलेट समारोह के अध्ययन के लिए microfluidic प्रवाह कक्षों अनुसंधान के क्षेत्र को बढ़ाया है, सावधानी रक्त rheology पर प्लेटलेट निर्भरता overinterpret करने के लिए लिया जाना चाहिए। सबसे पहले, प्रवाह कक्ष के आयताकार आकार शारीरिक नहीं है, बूसबसे अच्छा टी हम बढ़ thrombi पर ध्यान केंद्रित ऑप्टिकल अनुमति है। दूसरा, रक्त वाहिकाओं इसलिए इस प्रोटोकॉल में अध्ययन नहीं किया जा सकता है प्लास्टिक और प्लेटलेट समारोह पर रक्त वाहिनियों की लोच के प्रभाव के नहीं बने हैं। तीसरा, दिल, गुणवाला प्रवाह का कारण बनता है, जबकि सिरिंज पंप अधिक रैखिक (हालांकि यह भी थोड़ा गुणवाला) कर रहे हैं। अंत में, तंतुमय प्रकार मैं कोलेजन मानक प्रवाह के तहत प्लेटलेट अध्ययन के लिए इस्तेमाल सामग्री, जानवर मूल के है जो है। ध्यान से हालांकि, तंतुमय प्रकार मैं कोलेजन और के रूप में (प्रकाश संचरण) में दशकों के अनुभव के द्वारा दिखाया प्लेटलेट समारोह के लिए नैदानिक ​​परिणामों कई मामलों में अच्छी तरह से सहसंबंधी aggregometry 21,22।

वहाँ प्लेटलेट समारोह 23 अध्ययन करने के लिए कई assays हैं। इन पता एक या प्लेटलेट सुविधाओं के एक जोड़े के सबसे डाल प्लेटलेट्स रक्तस्तम्भन (के मॉडल) में काम करने के लिए है। thrombus गठन के वास्तविक समय इमेजिंग के रूप में यहाँ का प्रदर्शन तिथि करने के लिए, सबसे समावेशी है। यह पीएलए के सबसे पहलुओं का मतलबपोत की चोट के telet की प्रतिक्रिया शामिल किए गए हैं। अद्वितीय फायदे रक्त के प्रवाह के शामिल किए जाने और सभी रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति रहे हैं। परख antiplatelet चिकित्सा 24 के लिए के रूप में अच्छी तरह से आनुवंशिक न्यायपालिका प्लेटलेट समारोह 25 में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन करने के लिए वर्तमान में इस्तेमाल किया दवाओं के प्रति संवेदनशील है। यह प्लेटलेट समारोह के एक प्रासंगिक संकेतक के रूप में अपने मूल्य को दर्शाता है। इस परख की व्यापक प्रकृति फिर भी संकेत मिलता है कि यह उन प्लेटलेट की प्रतिक्रिया के विशिष्ट सुविधाओं को मापने assays से कम विश्लेषणात्मक है। प्लेटलेट केंद्रित पर रक्त बैंकिंग जोड़तोड़ के प्रभाव इसलिए द्वारा प्रवाह कक्ष assays के द्वारा उठाया जा सकता है, लेकिन क्या उन कारणों की व्याख्या करने के लिए, अतिरिक्त विश्लेषण की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, हमारे डेटा है कि तापमान में काफी microfluidic प्रवाह कक्षों में प्लेटलेट आसंजन प्रभावित करती संकेत मिलता है। लेकिन अतिरिक्त विस्तृत विश्लेषण से पता चला है कि प्रशीतित प्लेटलेट्स बदलने के आकार और क्लस्टर GPIbα रिसेप्टर्स 26।

एट अल। 16 से हाल ही में काम सिस्टम्स बायोलॉजी प्लेटलेट सब्सट्रेट परिभाषा की प्रासंगिकता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, सब्सट्रेट के समारोह में कतरनी दरों बदलती के संयोजन क्योंकि स्थिर VWF को प्लेटलेट्स के बंधन, उच्च कतरनी दरों की आवश्यकता होगी, जबकि इस कोलेजन के लिए बाध्य करने के लिए कम महत्वपूर्ण नहीं है महत्वपूर्ण है। इसलिए, अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है, विकल्प क्या substrates पर बनाया जा सकता है और उनके संबंधित प्रवाह दरों शामिल हो रहे हैं।

अंत में, हम microfluidic प्रवाह कक्ष प्रयोगों रक्त बैंकिंग और ट्रांसफ्यूजन मेडिसिन के संदर्भ में प्लेटलेट समारोह का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मानकीकरण के प्रयासों चल रहे 9,10,28-30 कर रहे हैं और इन सिफारिशों के सबसे प्रस्तुत प्रोटोकॉल में शामिल किए गए हैं। खून के पुनर्गठन के लिए एक मॉडल हैआधान लेकिन अतिरिक्त सत्यापन के काम नैदानिक ​​परिणामों को प्रासंगिकता का संकेत चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Heparin Becton, Dickinson and Company 368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Hirudin Blood tube Roche 6675751 001
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Tube 5 ml Simport 11691380
Conical tube 15 ml Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 ml Greiner bio-one 227261
10 ml Syringe BD 309604
Precision wipes Kimtech 5511
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect Cellix MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Software microfluidic pump Cellix N/A Venaflux Assay
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Bleach 10% in house preparation in house preparation
0.1 M NaOH in house preparation in house preparation
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Hematology analyzer Sysmex N/A
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Platelet incubater Helmer PF-48i
Incubation water bath GFL 1013
Pipette Brand A03429
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vortex VWR 58816-121

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References

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