Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lunelli, L., Bernabò, P., Bolner, A., Vaghi, V., Marchioretto, M., Viero, G. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (109), e53851, doi:10.3791/53851 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Translasyonel makine, yani, polisom ya polyribosome hücrelerde büyük ve en karmaşık sitoplazmik makine biridir. Ribozomlar, mRNA, çeşitli proteinlerin ve kodlayıcı olmayan RNA'lar tarafından oluşturulan Polisomlar, translasyonel kontrol gerçekleşecek platformlar entegre temsil eder. Ribozom yaygın çalışılmıştır Ancak, polizom organizasyonu hala kapsamlı bir anlayış yoktur. Bu nedenle çok çaba polisom organizasyon ve gömülebilir translasyonel kontrol herhangi bir yeni etki mekanizmasını açıklamak için gereklidir. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) nano çözünürlükte 3D görüntülerin elde edilmesine izin verir tarama prob mikroskobu türüdür. Elektron mikroskopisi (EM) teknikleri ile karşılaştırıldığında, AFM ana avantajlarından biri, hava ve çözelti, iki görüntü binlerce elde örnek sağlayan olmasıdır boyama ve pro sabitlenmesi için herhangi bir gerek olmaksızın, yaklaşık olarak fizyolojik koşullar altında muhafaza edilmesiprosedürlerinin. Burada, fare beyin ve mika alt tabakalar üzerine birikmesinden polizom doğru saflaştırılması için detaylı bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, AFM ve üç boyutlu nesne olarak yeniden sahip hava ve sıvı içinde polisom görüntüleme sağlar. cryo-elektron mikroskopisi (cryo-EM) Tamamlayıcı, önerilen yöntemin uygun sistematik Polisomlar analiz ve organizasyon eğitimi için kullanılabilir.

Introduction

Protein sentezi hücrelerinde 1,2 en çok enerji tüketen bir süreçtir. Bu nedenle, protein bolluğu ağırlıklı öteleme ziyade transkripsiyonel seviyede 3,4,5 kontrol edilir şaşırtıcı değildir. Polizom fonksiyonel proteinli okumalarla içine mRNA bilgiyi dönüştüren temel makromoleküler bileşenidir. Polisomlar şimdiye kadar birkaç öteleme kontroller 6-13 yakınsama makromoleküler kompleksleri olarak kabul edilmektedir. Ribozom yapısı 14- 16 çalışmaların yüzlerce rağmen, çeviri dinamikleri hakkında detaylı moleküler anlayışlar ve polizom topoloji sınırlı bir ilgi ile karşılaştı. Bunun bir sonucu olarak, yerli polysomal ribonükleoprotein kompleksinin organizasyonu ve tercüme üzerindeki potansiyel etkisi hala oldukça belirsiz sorunlardır. Polisomlar potansiyel neler nükleozom ve epigenetik contro yansıtma, henüz bilinmeyen sipariş ve işlevsel organizasyonları gizleyebilirls transkripsiyon alanı için temsil etmişlerdir. Nitekim, bu ilginç hipotezin araştırılması ek çalışmalar ve yeni teknik yaklaşımlar gerektirir. Bu doğrultuda, yapısal teknikler ve atomik kuvvet mikroskopisi fruitfully benzer nükleozom 17,18 için elde ne kadar, gen ifadesini kontrol etmek için yeni mekanizmalar çözülmeye işbirliği olabilir.

Ribozom 14-16 keşfinden beri yapısı yoğun protein sentezi tabanında mekanizmaların moleküler bir açıklama temin prokaryotlarda 19,20, daha yakın zamanda, insan 22 maya 21 ve karakterize edilmiştir. Polisomlar başlangıçta tipik 2B geometrik örgütleri 14 oluşturan, endoplazmik retikulum zarı üzerinde kabul edildi. Daha önce belirtildiği gibi, Polizom montaj ribozom yapısı olarak sürekli ilgi nesnesi olmamıştır. Geçmişte, Polisomlar tr esasen çalışılmıştıransmission teknikleri EM-tabanlı. Ancak son zamanlarda, kriyo-EM teknikleri in vitro çeviri sistemleri 23-26 saflaştırılmış polizom 3D rekonstrüksiyonu, insan hücre lizatları 27 veya hücre 28 sağladı. Bu teknikler polizom 23, 26-28 ve buğday tohumu polizom 24 bitişik ribozom temas yüzeylerinin bir ön moleküler tanımındaki ribozom-ribozom organizasyon hakkında daha rafine bilgi sundu. Böylece, cryo-EM tomografi moleküler detaylı ribozom-ribozom etkileşimlerin açıklanmasını sağlar, ancak kapsamlı post-processing ile yatar ve rekonstrüksiyon verileri işlemek için ağır hesaplama kaynakları gerektiren analiz eder. Ayrıca, ribozom ribozom etkileşimlerinin moleküler detay elde etmek üzere, ribozom yüksek ölçüde çözülmesi harita gereklidir, ve referans ribozom bu tür bir kaç tür için kullanılabilir. Önemlisi, cryo-EM tomografi serbest RNA tespit etmek mümkün değildir. therefCevher, yeni teknikler tamamen çeviri makine organizasyonunu anlamak için gereklidir.

Cryo-EM yanında, AFM de düşük ökaryotlar 29-33 ve insanlarda 27 polizom doğrudan görüntüleme için yararlı bir araç olarak kullanılmıştır. EM ile karşılaştırıldığında, AFM hiçbir örnek tespit veya etiketleme gerektirir. Buna ek olarak, ölçümler, yaklaşık olarak fizyolojik koşullar altında ve açıkça ribozomlar çıplak RNA şeritleri 27, her iki belirleme benzersiz olasılığı ile gerçekleştirilebilir. Tek polizom görüntüleme geniş ve ağır post-processing ve yeniden cryo-EM mikroskobu ile gerekli analizleri karşılaştırıldığında küçük post-processing çabayla nano çözünürlükte görüntülerin binlerce elde edilmesi, nispeten hızlı bir şekilde yapılabilir. Sonuç olarak, AFM veri işleme ve analiz pahalı iş istasyonları ve yüksek işlem gücü ihtiyacı yoktur. Bu nedenle, bu teknik polysomal şekilleri hakkında bilgi, morfolojik özellikleri (örneğin toplaryükseklik, uzunluk ve genişlik), ribozom yoğunlukları, serbest RNA'nın varlığını ve kriyo-EM daha yüksek bir verimle polisom 27 ortalama ribozom sayısı. Bu şekilde, AFM Polisomlar 27 canlandıracak EM tekniklerine güçlü ve tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Burada arınma gelen AFM görüntüye uygulanan ve fare beyin Polisomlar analiz veri analizi için tam bir boru hattı mevcut. önerilen protokol arıtma konularında ve AFM görüntüleme için kullanılan mika yüzeylerde polizom doğru birikimi üzerinde duruluyor. Kolayca AFM topluluğu tarafından kullanılan ortak yazılım ile gerçekleştirilebilir geleneksel parçacık analizine ek olarak, RiboPick adlı bir ImageJ 34 eklentisi, polisom 27 35 ortalama ribozom sayısını saymak için sunulmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fare dokuları elde etmek için kullanılan uygulamalar Trento Üniversitesi Hayvanları Koruma (OPBA) (İtalya) için Vücut tarafından kabul edildi, protokol yok. 04-2015 olarak Madde.31 başına Kanun Hükmünde Kararname no. 26/2014. Tüm fareler Bütünleştirici Biyoloji Merkezi'nin (CIBIO), Trento Üniversitesi, İtalya Model Organizma Tesisleri'nde tutuldu.

Dikkat: numunelerin herhangi RNA bozulmasını önlemek RNaz kontaminasyonu en aza indirmek için DEPC arıtılmış su kullanılarak tüm tamponları hazırlamak.

Tüm beyinlerinden polizom hazırlanması 1.

  1. beyin dokularında toplama (15 dk)
    1. 5 dakika 36 için CO2 ile boğularak vahşi tip fare suşu C57BL / 6 öldürülür. Dikkatle, kafatası 36 beyin teşrih 1.5 ml tüp içine doku yerleştirin ve hemen sıvı nitrojen içinde yerleştirin. kullanılıncaya kadar -80 ° C'de saklayın.
  2. lizatının hazırlanması (30 dakika)
    1. kullanarak tüm beyin dokusu toz halineSıvı azot altında bir havan.
    2. Soğuk mikrosantrifüj tüpüne yaklaşık 25 mg toz aktarın ve hemen hemen aşağı yukarı pipetleme 25 kez ile Lizis Tamponu (bakınız Tablo 1) 0.8 ml ekleyin ve hücre bozabilir (pulverize doku çözülme önlemek için).
    3. hücre yıkıntıları pelet haline 4 ° C de 1 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin tüpü.
    4. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın ve 15 dakika süreyle buz üzerinde tüp tutun.
    5. çekirdek ve mitokondri pelet 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin tüpü.
    6. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
    7. 6 aylık bir süre için -80 ° C 'de süpernatan saklayın veya hemen kullanın.
  3. Sukroz gradyanlı hazırlanması ve santrifüj (2 saat ve 30 dakika)
    1. RNaz içermeyen su (dietilpirokarbonat muamele edilmiş, su (DEPC su) ya da ticari) ile iyice yıkayın ultrasantrifüj tüplerid% 3 H 2 O 2 / DEPC H2O çözüm.
    2. Buz üzerinde tüpler yerleştirin ve her bir tüp (sakaroz çözeltileri için Tablo 1 'e bakınız) altındaki soğuk% 50 sukroz çözeltisi 5.5 ml. Dikkatle tüpü tamamen dolana kadar keskin bir interfaz korumak için interfaz yakın kalmak, damla% 15 sakaroz çözeltisini damla ekleyin. Tüp tamamen dolduğunda, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için bir lastik tıpa ile kapatın.
    3. Soğuk bir odada yavaşça yatay tüpler bırakmaya ve 2 saat boyunca bu konumda tutun. Bu süreden sonra, yavaşça geri dik konuma getirin tüpleri düzeltin ve buz üzerine koydu. geçişlerini şimdi kullanılmaya hazırdır. Seçenek olarak ise, önceki bilinen bir gradyanı kullanılarak% 15-50 sakroz gradyanı hazırlar.
    4. Soğuk bir odada degrade üstünden dikkatlice 1.0 ml kaldırmak ve sitozolik lizat ile damla sakaroz damla (yani, yüzen ste elde bindirmeks 1.2).
    5. Dikkatle sallanan bir kova rotor kova içine tüpler indirin. Ultrasantrifüj işlemi kullanılarak 4 ° C'de 180,000 x g'de 100 dakika boyunca geçişlerini santrifüjleyin.
    6. Santrifüj işleminden sonra, gradyanlar stabilize izin 4 ° C'de 20 dakika boyunca kendi kova tüpler bırakın.
  4. Sükroz Gradyan Bölünmesi (2 saat)
    1. Dikkatle ultrasantrifüjdeki rotor bir ultrasantrifüjdeki tüp kaldırmak ve bir Yoğunluk Gradient Fraksiyonu Sistemi toplayıcı cihaz üzerinde monte edin. UV / VIS detektörü (bakınız Şekil 1, üst panel) 260 nm'deki soğurma gücü izlenerek, 1 ml'lik fraksiyonların toplayın. Buz üzerinde toplanan fraksiyonlar tutun.
    2. Ilgi kesirler 30-40 ul hacimde hazırlayın kullanımı kadar -80 ° C saklamadan önce buz üzerinde saklayın. İkiden fazla donma-çözülme döngüleri uygulanan alikotları veya sakaroz kesirler kullanmayın (Şekil 1 alt paneline bakın).
    </ Li>

Atomik Kuvvet Mikroskobu 2. Numune Hazırlama (3 saat)

  1. mika levhalar soyulabilir, bant kullanarak.
  2. DEPC su ile mika levhaları 3-4 kez yıkayın ve küçük bir Petri kabı içine yerleştirin. Sonra hava ile yüzey kurutun.
  3. 1 mM N'nin 4 200 ul mika kapağı ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin.
  4. nikel çözüm çıkarın ve sonra hava kullanarak yüzeyini kurulayın. buz üzerinde mika ile Petri kabı koyarak 4 ° C'de gelecekteki tüm adımları uygulayın.
  5. buz üzerinde 1.4.2 elde edilen bir kısım Çözülme ve yavaşça mika damla örnek damla tüm ekleyin. 100-200 ul ucu kullanarak, mika tüm yüzeye örnek yayıldı. 3 dakika boyunca buz üzerinde örnek inkübe edin.
  6. 200 ul soğuk tampon-AFM ile damla mika levha damla Kapak (Tablo 1 e bakınız) ve buz üzerinde 1 saat süre ile inkübe edilir.
  7. sıvı Görüntüleme
    1. dikkatle Tampon-AFM çıkarın ve mika levhaları 3-4 defa yıkayın200 ul soğuk Tampon-AFM ile s aşırı sukroz kaldırın. Sonra mika levhaları soğuk Yıkama Çözeltisi ile 3 kere yıkayın çözümün bazı mikrolitre kapsadığı mika yüzeyi bırakarak, (bakınız Tablo 1).
    2. 3 (Görüntü edinimi) işaret gidin.
  8. Havada görüntüleme
    1. Dikkatle Tampon-AFM kaldırmak ve aşırı sukroz çıkarmak için 200 ul soğuk Tampon-AFM ile mika 3-4 kez yıkayın. Ardından, mika, soğuk Yıkama Çözeltisi ile 3 kere yıkayın (Tablo 1) ve kağıt kullanarak fazla suyu boşaltın.
    2. kısmen açık Petri kabı üst kimyasal kaputun altında kurumaya örnek bırakın. 2 saat sonra, oda sıcaklığında Petri kabı ve mağaza kapatın. bu uzun bir süre stabil olarak 2-3 saat sonra örnek ölçün.

3. Image Acquisition (termal stabilizasyon sonra resim başına 15 dk)

Not: mika üzerinde hareketsiz Polisomlar AC modunu kullanarak, havada ya da sıvı olarak görüntülenebilir.

  1. çift ​​taraflı bant kullanarak numune tutucu için mika takın.
  2. üreticinin talimatlarına aşağıdaki AFM aşamasında numune tutucu yerleştirin. Mümkünse görüntüleme sıvı içinde, zaman içinde Polizom istikrarı artırmak için bir sıcaklıkta daha düşük 25 ° C örnek korumak çalıştığınızda.
  3. AC görüntüleme için uygun bir konsol seçin ve üreticinin yönergeleri izleyerek uç tutucuya monte edilir. Burada, hava görüntüleme için 2-20 N / m ve sıvı görüntüleme için yaklaşık 0.1 N / m arasında sürekli bir güçle kullanım dirsekleri.
  4. konsol üzerinde lazer nokta ayarlayın ve kadran detektör sinyallerini sıfır.
  5. bir fırsat sürüş frekansı seçin ve 10-20 nm bir genlik ile konsol sürücü.
  6. ucu yüzeyine oturana kadar örnek yaklaşın.
  7. En az 512x512 piksel görüntüleri (piksel genişlik <4 nm) elde, 2x2 um tarama alanı seçin canlı arka plan çıkarma modu ve 20-25 nm Z ölçeğini seçin.
  8. t inceleyino görüntü aralığı 25-30 nm hava ve 25 ve sıvı 30 nm genişliğinde satın alırken 10 ve 15 nm arasındaki yükseklik ile karakterize yuvarlak nesnelerin varlığına arıyor. keskin nesneler görüntülenmiştir kadar set değeri ve geri besleme parametrelerini ayarlayın. Arka plan bazı 2-4 nm yüksekliği nesneleri (Şekil 2A ve B) ile, iyi örneklerinde nispeten düz görünmelidir.
  9. (Nokta 3.8 de belirtildiği gibi) görüntü iyi görünüyorsa, farklı örnek alanlarda birkaç (en az on) 2x2 mikron taramaları kazanır.
  10. (Isteğe bağlı). Gerekirse, seçilen polizom yüksek çözünürlüklü görüntü elde (Şekil 2C bakınız).
  11. AFM görüntüleri keyfi eğimini kaldırma ve etkileri sürüklenen düzeltmek için yazılım düzeltmeleri (düzlem çıkarma ve hat-by-line düzeltme algoritmaları) uygulayın.

4. Veri Analizi (resim başına 30 dk)

  1. preferent: ImageJ (bir ölçek faktörü uygulamak opsiyonel) İhracat görüntüleriially örneğin, bir kayıpsız sıkıştırma biçimini kullanarak, TIFF formatında (Şekil 3A bakınız).
  2. Örneklemin istatistiksel özelliklerini polizom içinde ribozomlar (Şekil 3B) saymak ve hesaplamak için (ImageJ makro / araç seti alt dizininde kopyalanacak) ImageJ makro araç seti RiboPick.ijm kullanın (Şekil 3C).
    1. programı başlatır <Okuma görüntü> aracını kullanarak bir görüntü yükleme başlayın.
    2. Standart ImageJ <Nokta seçimi> aracı (shift + sol klik ribozomların çok seçimini sağlar) ile ribozom merkezleri seçin. <Mark ribozomlar> aracıyla seçilen ribozomlar işaretleyin. Ribozom koordinatlar özel bir metin penceresinde görüntülenir.
    3. noktasında 4.2.2 de belirtilen prosedür tekrar aynı Polizom daha fazla ribozomlar ekleyin.
    4. birinciye Son eklenen ribozom kaldırma <Geri Al son çekme> aracını (başlar kullanarak yanlış işaretlenmiş ribozomlar kaldır212; Geçerli Polizom sadece).
    5. Polizom tamamlandığında, <Yeni Polizom> aracını kullanın. Polizom numarası görüntüye bir kaplama olarak eklenir olarak, metin penceresi güncellenir.
    6. Kullan Ribozom dosyası (görüntü varsayılan birimlerinin kullanıldığı) ve aldı ribozomlar ve Polisomlar özetleyen bir PNG resmi koordinatlarını yazmak için <sonuçları ve yakın Kaydet>. orijinal görüntü kaydedildi olmadan kapanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bütün fare beyninin sukroz gradyanlı polysomal profil

Kendi ağırlığı ve büyüklüğü uygun bir şekilde makromolekülleri ayıran polysomal profil ile bir selüler lizat polizom arıtmak mümkündür. polysomal profil ile, bu örnekteki gibi kültürlenen hücreler ya da dokulardan elde edilen sitoplazmik lizatları (çökelme katsayılarına göre 40S ve 60S alt birimleri, 80S ribozom ve polizom serbest RNA ayırmak için ultra-santrifüj ile doğrusal sakroz gradyanı üzerine yüklendi ve işlenir Şekil 1 üst panel). 254 nm numune ve fraksiyon toplama absorbans transkript başına ribozomların farklı sayıda ribozom veya polizom zenginleştirilmiş sakaroz fraksiyon izolasyonunu sağlar. Fraksiyonlar AFM görüntüleme için numune alınır ve -80 ° C'de (Şekil 1 C'de saklandı, toplanabiliralt panel).

Havada AFM tarafından gözlemlenen fare beyin Yerli Polisomlar sıkı ribozom etkileşimleri ortaya

Görüntü edinimi (aynı zamanda dokunarak modu olarak da bilinir), AC modu kullanılarak yapılır. Bu yöntem ucu numune etkileşimi ve karşılık gelen kesme kuvvetleri büyük ölçüde azalır, çünkü (örneğin polizom gibi) yumuşak örnekleri görüntüleme için uygundur. Bu şekilde uç ve örnek hem de korunur. AFM görüntüleme gibi ölçüm koşulları ucun tür ve numunesinin özelliklerini gibi çeşitli faktörlere bağlıdır tam değerleri, yüksek çözünürlükte verilerin elde edilmesine izin verir. Bu yazıda anlatılan koşullarda yaklaşık 4-6 nm yanal çözünürlük ve 0.1-0.2 nm dikey çözünürlük ulaşılabilir. mika sakaroz alikotları birikimi sonra, AFM tek polizom açıklamalarını sağlayansıkıca paketlenmiş Ribozomlar (Şekil 2A, C ve C) kümeleri gibi görünür. Kesit analizi (Şekil 2D) ile, ribozomal tepe yüksekliği, daha önce hava ile kurutma sonra 27 polizom insan ribozomlar için gözlendi ne uygun olarak yaklaşık 14 nm'dir. Hat profili tarafından belirlenen ribozomların merkezi mesafeye merkezi çözümü 37, 38 ribozom boyut ile uyum içindedir 23 nm vardır.

Tek bir kısmından Polizom başına ribozom sayısı bir mono-dağınık dağılım göstermektedir

Şekil 3A, sukroz gradyanı bir fraksiyondan mika üzerine emdirilmiş bir örnek elde elde edilen tipik bir AFM görüntü bildirir. ilave ribos tanımlanması için uygun olan bir büyütme faktörü, tek polisom bir dijital zum göstermektediromes Polizom içinde. B Paneli RiboPick makro ile ribozom tespit edilmesinden sonra, aynı görüntüyü gösterir. Kırmızı çevreler (inset bakınız) ribozomlar işaretleyin ve ilerici bir sayı (camgöbeği) ribozomun dernek, belirli bir Polizom koordinatlarını yardımcı olmak için kullanılır. Polizom başına ribozom sayısının frekans dağılımı, tek bir tepe noktası gösterir (Panel C, gri çubuklar) (orta moleküler ağırlıklı polizom (MMW) karşılık gelen, Şekil 1, alt panel bakınız), kısım # 10 için analiz edildi. Deneysel dağıtım / Polizom 1.3 ribozomların bir standart sapma ile, 5.8 ribozomlar / Polizom merkezli bir Gauss eğrisi (siyah çizgi) ile monte edilmiştir.

Şekil 1
Bütün fare beyninin sukroz gradyan sedimantasyon için Şekil 1. Temsilcisi absorbans profili. (Üst sanel) bir polysomal sitoplazmik lizat doğrusal sakroz gradyanı (% 15-50 sakroz üzerinde P27 fare beyin elde edilmiş ve yüklendi [ağırlık / hacim]). RiboNucleoParticles 254 nm (RNP) absorbans karşılık gelen açık zirveleri, ribozomal alt birimleri (40S ve 60S), ribozomlar (80S) ve Polisomlar gözlemlemek mümkündür. Tekrarlanan dondurma önlemek ve mika AFM birikimi önce numunelerin döngüsünü çözülme için, kısma bölmek uygundur ribozom kesir ve farklı transkript başına ribozomların sayısı (yani, düşük, orta ve yüksek olan polysomal fraksiyonlar (alt panel) hem -Moleküler ağırlıklı Polisomlar (sırasıyla LMW, MMW ve HMW)). alikotları, söz konusu iki yıllar boyunca -80 ° C'de saklanabilir.

şekil 2
MMW beyin poli AFM görüntü dokunulduğunda-Mod Atomik Kuvvet Mikroskobu. (A) Örnek ile Şekil beyin polizom 2. Görüntülersomes mika emildikten sonra doğrusal gri renk skalası kullanılarak. Arka plan 0-0.5 nm gri, 0.5-2 nm ve ribozomlar için 2-10 nm sarı: (B), (A) gösterilen aynı görüntü renk skalası için farklı bir Z-aralıkları kullanılarak tasvir edilmiştir. Bu durumda, daha iyi bir görsel kontrast düşük ve yüksek Z aralığı nesneleri hem de elde edilir. Kesit profilinin (noktalı beyaz bir çizgi) ile tipik bir MMW polisom (C) büyütme. (C) 'de enine kesit profili ile tanımlanan iki ribozomlar (D) Yükseklik profili 14 nm ribozom yüksekliğini gösterir. Bu değer, daha önce polizom 27 insan ribozomlar için AFM gözlenen ne uyumludur.

Şekil 3,
MMW beyin polizom içinde Polizom başına ribozomların sayısını sayma Şekil 3. Örnek. Repre (A) AFM görüntüImageJ makro, RiboPick girişi yaratabilecek. Elle görüntüdeki her ribozom (kırmızı daireler) konumunu her Polizom başına ribozomlar, RiboPick işaretleri seçmek sonra (B). (C) polizom başına ribozomların elde edilen sayı Gauss eğrisi takılabilir bir dağılım olarak çizilebilir. Bu örnekte göz önünde polizom sayısı 9 bağımsız görüntü elde edilen 164 olduğunu. Gauss eğrisi ile uydurma (# ribozomlar / 5.8 ± 1.3 = 0.99 R 2 Polizom) MMW fraksiyonunda polizom nüfusunun ortalama değerini döndürür.

<tr>
Tampon kompozisyon Uygulama
Liziz Tamponu 10 mM Tris-HCI, pH 7.5 lizatının hazırlanması (1.1)
10 mM NaCI
10 mM MgCl2
% 1 Triton-X100
% 1 Na-deoksikolat
0.4 U / ml RNaz inhibitör
1 mM DTT
0.2 mg / ml siklohegzimid
5 U / ml Dnaz I
% 50 sukroz çözeltisi % 50 sakaroz (w / v) Sukroz gradyanlı hazırlanması (1.2)
100 mM NaCI
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl, pH 7.5
% 15 sukroz çözeltisi % 15 sakaroz (w / v) Sukroz gradyanlı hazırlanması (1.2)
100 mM NaCI
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl, pH 7.5
nikel solüsyonu 1 mM Niso 4 AFM için örnek hazırlama (2)
Tampon-AFM 100 mM NaCI AFM için örnek hazırlama (2)
10 mM MgCl2
/ Ml siklohegzimid 100 ug
10 mM Hepes
% 3 (ağ / hac) sakroz, pH = 7.4
Yıkama Çözeltisi DEPC su AFM için örnek hazırlama (2)
/ Ml siklohegzimid 100 ug

Tablo 1. tamponlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA'nın yapısı transkripsiyon ve kromatin organizasyonu gen ifadesinin transkripsiyonel kontrolü anlayışımızı ilerledikçe süreci tanımlamak için büyük önem olduğu kanıtlanmış gibi, doğru anlama geliştirmek için polizom organizasyonunu ve yapısını analiz etmek esastır çeviri ve düzenleme.

tarif edilen protokol ile hafifçe düz bir yüzey üzerinde immobilize polizom optimal yoğunluğu, AFM görüntüleme için uygun elde edilir. uygun hazırlanan numuneler ile bu şartları kullanarak, saatte yaklaşık 50 Polisomlar ileri analiz ve karakterizasyon için hazır, elde edilebilir. Ayrıca, oda sıcaklığında muhafaza kurutuldu örnekleri fazla bir yıl sonra görüntüleme için uygun olduğu kanıtlanmıştır.

başarıyla protokol ile Polizom görüntüler elde etmek için, bazı önemli adımlar vardır: düzgün dissectio hemen sonra flaş dondurulmuş olan dokuları kullanmak içinn ve RNA bozulmasını en aza indirmek için -80 ° C'de saklandı; mRNA'dan ribozom ayrışmasını önlemek için sikloheksimid ve RNaz inhibitörleri içeren lizis tamponu kullanmak için; mika örnek depolanması sırasında buz üzerinde tüm inkubasyon gerçekleştirmek için; ve yoğun Siklohekzimidsiz varlığında tamponlar ve RNaz ücretsiz su ile mika örnek yıkamak için, hava AFM görüntüleme için örnek hazırlarken. son nokta özellikle önemlidir. Görüntü yaklaşık doğru yükseklikte ama nm 100-1,000 geniş düz yüzeyler içeren görünüyorsa, bu bir kötü yıkanmış numunenin açık bir göstergesidir (genellikle ribozomlar / Polisomlar hala soluk, gömülü nesneler olarak görülebilir). Bu sorunu çözmek için bir yöntem yıkama işlemi tekrarlamak için, ama bu genellikle zaten kurutulmuş numune üzerinde sorunu gidermek değildir. Bu durumda, yeni bir kısım ile yeniden başlıyor değer.

AFM çözünürlüğü göz önüne alındığında, eğitim polizom için bu yöntem rın yapısını çözemezsepolizom ribozomal arayüzlerin yapısal detayları. Aslında, AFM kazanmak ve polizom binlerce analiz ve daha iyi polizom genel ribozom organizasyonunu anlamak için, etkili ve güçlü bir tekniği temsil-EM kriyo tamamlayıcı ve basit bir yaklaşımdır. Daha da önemlisi, bu protokol RNA 27 ile uyumlu filamentler tanımlamanın benzersiz bir avantaja sahiptir. Bu aynı işlem, herhangi bir biyolojik doku veya hücre hattından elde edilen herhangi bir polysomal numune için kullanılabilir. En son Lauria ve iş 35 ile gösterildiği gibi daha önemlisi, başarılı bir şekilde, nitro yapıldı sistemleri kullanılarak transkript özgü bilgileri elde etmek için de kullanılabilir. Bu metodoloji Polizom oluşumu veya farklı hücresel veya doku şartlarında Polizom organizasyonda değişikliklerin kinetik anlayış kazanmak için, çeşitli deneyler önünü açacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cycloheximide Sigma 01810 Prepararation of lysate
DNAseI Thermo Scientific 89836 Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor Life technologies EO-0381 Prepararation of lysate
DEPC Sigma 40718 Prepararation of lysate
Triton X100 Sigma T8532 Prepararation of lysate
DTT Sigma 43815 Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate Sigma D6750 Prepararation of lysate
Microcentrifuge  Eppendorf 5417R Prepararation of lysate
Sucrose Sigma S5016 Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima LE-80K Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter SW 41 Ti Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube Beckman Coulter 331372 Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System  Teledyne Isco 67-9000-176 Sucrose gradient fractionation
AFM Asylum Research Cypher Polysome visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  2. Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59, (1), 48-62 (1995).
  3. Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
  4. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  5. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
  6. Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145, (3), 383-397 (2011).
  7. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
  8. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  9. Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54, (1), 147-155 (2014).
  10. Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9, (4), 1256-1264 (2014).
  11. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (36), E3815-E3824 (2014).
  12. van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15, (1), R6 (2014).
  13. Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34, (14), 1905-1924 (2015).
  14. Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1, (1), 59-68 (1955).
  15. McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45, (9), 1437-1447 (1959).
  16. Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2, (197), 430-435 (1963).
  17. Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (47), 20317-20322 (2010).
  18. Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32, (33), 8390-8396 (1993).
  19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, (5481), 905-920 (2000).
  20. Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102, (5), 615-623 (2000).
  21. Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334, (6062), 1524-1529 (2011).
  22. Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497, (7447), 80-85 (2013).
  23. Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
  24. Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
  25. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42, (14), 9461-9469 (2014).
  26. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43, (1), 618-628 (2015).
  27. Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208, (5), 581-596 (2015).
  28. Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
  29. Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378, (5), 363-372 (1997).
  30. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46, (6), 503-506 (1997).
  31. Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
  32. Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
  33. Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  35. Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. (2015).
  36. Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
  37. Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
  38. Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics