Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lunelli, L., Bernabò, P., Bolner, A., Vaghi, V., Marchioretto, M., Viero, G. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (109), e53851, doi:10.3791/53851 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A maquinaria de tradução, ou seja, o polysome ou polyribosome, é uma das maiores e mais complexas máquinas citoplasmáticos nas células. Polissomos, formadas por ribossomas, mRNAs, várias proteínas e RNAs não-codificantes, representam plataformas onde os controles de translação ocorrem integrado. No entanto, enquanto o ribossomo tem sido amplamente estudada, a organização do polissomos carece ainda de compreensão abrangente. Assim, muito esforço é necessário, a fim de elucidar a organização polissoma e qualquer novo mecanismo de controlo de tradução que pode ser incorporado. microscopia de força atômica (AFM) é um tipo de microscopia de varredura por sonda que permite a aquisição de imagens 3D em resolução nanoescala. Em comparação com técnicas de microscopia electrónica (ME), uma das principais vantagens da AFM é que ele pode adquirir milhares de imagens, tanto no ar e em solução, permitindo que a amostra a ser mantida sob condições fisiológicas próximo, sem qualquer necessidade de coloração e fixação próprocedimentos. Aqui, um protocolo detalhado para a purificação precisa da polissomos de cérebro do rato e sua deposição em substratos de mica é descrito. Este protocolo permite a imagiologia polissoma no ar e líquido com a AFM e a sua reconstrução de objectos tridimensionais. Complementar ao microscópio crio-elétron (crio-EM), o método proposto pode ser convenientemente utilizado para analisar sistematicamente polissomos e estudar sua organização.

Introduction

A síntese de proteínas é o processo que consome mais energia nas células 1,2. Por isso, não surpreende que a abundância de proteína são controladas principalmente para a translação em vez de 3,4,5 nível da transcrição. O polissoma é o componente macromolecular fundamental que converte a informação em leituras de ARNm proteicos funcionais. Os polissomas são até agora reconhecida como complexos macromoleculares, onde vários controlos traducionais convergem 6-13. Apesar das centenas de estudos sobre a estrutura do ribossoma 14- 16, os insights moleculares detalhados sobre a dinâmica da tradução e da topologia da polissomos encontrou um interesse limitado. Como consequência, a organização do complexo polissomal ribonucleoprote�a nativa e seu efeito potencial sobre a tradução ainda são questões bastante obscura. Polissomos pode esconder organizações ordenadas e funcionais ainda desconhecidos, potencialmente um reflexo do que nucleossomos e contro epigenéticals ter representado para o campo de transcrição. Na verdade, a investigação desta hipótese intrigante requer estudos adicionais e novas abordagens técnicas. Nesta linha, as técnicas estruturais e de microscopia de força atômica pode proveitosamente colaboram para desvendar novos mecanismos para controlar a expressão do gene, à semelhança do que foi conseguido para a nucleossomo 17,18.

Desde a descoberta do ribossoma 14-16, a sua estrutura foi extensivamente caracterizado em procariotas, levedura 19,20 21 e, mais recentemente, em 22 humana, proporcionando a descrição molecular dos mecanismos na base da síntese de proteínas. Polissomas foram reconhecidos inicialmente na membrana do retículo endoplasmático, formando organizações geométricas 2D típicos 14. Como mencionado antes, polissoma montagem não tenha sido o objecto de interesse constante à medida que a estrutura do ribossoma. No passado, têm sido estudados polissomas essencialmente por trtécnicas ansmission EM-base. Só recentemente, técnicas de crio-EM permitiu a reconstrução 3D do polissomos purificados a partir in vitro sistemas de tradução 23-26, lisados ​​celulares humanos 27 ou em células 28. Estas técnicas ofereceu informações mais refinado sobre a organização ribossomo-ribossomo em polissomos 23, 26-28 e uma descrição molecular preliminar das superfícies de contato dos ribossomas adjacentes em polissomos gérmen de trigo 24. Assim, a tomografia crio-EM permite a divulgação de interações ribossomas-ribossomo com detalhes molecular, mas é sobrecarregado por extensa pós-processamento e análise de reconstrução que exigem recursos computacionais pesadas para a manipulação de dados. Além disso, para obter os detalhes moleculares das interacções ribossoma ao ribossoma, um mapa altamente resolvidas do ribossoma é necessário, e este tipo de ribossoma de referência está disponível apenas para algumas espécies. É importante ressaltar que a tomografia crio-EM não é capaz de detectar RNA livre. Therefminério, novas técnicas são necessárias para compreender plenamente a organização da maquinaria de tradução.

Ao lado de crio-EM, AFM foi também empregado como uma ferramenta útil para a imagem latente direta de polissomos em eucariotos inferiores 29-33 e humanos 27. Em comparação com EM, AFM não requer a fixação da amostra ou rotulagem. Além disso, as medições podem ser efectuadas em condições fisiológicas próximo e com a possibilidade única de identificar claramente ambos os ribossomas e cadeias de ARN nus 27. Imagiologia de polissomos individuais podem ser realizadas de forma relativamente rápida, a obtenção de milhares de imagens em nano-resolução com pouco esforço pós-processamento em comparação com a extensa e pesada de pós-processamento e análises de reconstrução exigida por microscopia crio-EM. Consequentemente, AFM manipulação e análise de dados não precisa de estações de trabalho caras e poder de computação de alta. Como tal, esta técnica recolhe informação sobre formas polissomal, características morfológicas (tais comoaltura, comprimento e largura), densidades de ribossomas, a presença de RNA livre eo número de ribossomas por polysome 27 com um caudal superior a crio-EM. Em tal forma, AFM representa uma abordagem poderosa e complementar às técnicas de EM para retratar polissomos 27.

Aqui nós apresentamos um gasoduto completa de purificação para análise de dados, onde AFM é aplicado à imagem e analisar polissomos cérebro do rato. O protocolo proposto concentra-se em problemas de purificação e na deposição precisa de polissomas em substratos de mica que são usados ​​para imagiologia AFM. Além da análise convencional de partícula que pode ser facilmente realizada com o software comum utilizado pela comunidade AFM, um plug-in ImageJ 34, chamado RiboPick, é apresentado para a contagem do número de ribossomas por polissoma 27, 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

As práticas utilizadas para obter os tecidos de camundongos foram aprovadas pelo corpo para a Protecção dos Animais (OPBA) da Universidade de Trento (Itália), o Protocolo n. 04-2015, o Decreto conforme art.31 Legislativo n. 26/2014. Todos os ratos foram mantidos no Centro Organismo Modelo do Centro de Biologia Integrativa (CIBIO), da Universidade de Trento, Itália.

Cuidado: Para evitar qualquer degradação RNA das amostras, preparar todos os buffers que utilizam água tratada com DEPC para minimizar a contaminação RNase.

1. Preparação de polissomas a partir de cérebros inteiros

  1. Reunindo tecidos cerebrais (15 min)
    1. Eutanásia de tipo selvagem estirpe de murganho C57BL / 6 com asfixia com CO2 durante 5 min 36. Cuidadosamente dissecar o cérebro para fora a partir do crânio 36, colocar o tecido em um tubo de 1,5 ml e colocá-lo imediatamente em azoto líquido. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
  2. Preparação de lisado (30 min)
    1. Pulverizar todo o tecido cerebral usandoum almofariz e pilão em azoto líquido.
    2. Transferir cerca de 25 mg de pó para um tubo de microcentrífuga e imediatamente a frio (para evitar o descongelamento do tecido pulverizado) adicionar 0,8 ml de tampão de lise (ver Tabela 1) e interromper a célula por pipetagem para cima e para baixo 25 vezes rapidamente.
    3. Centrifuga-se o tubo a 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares.
    4. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação e manter o tubo em gelo durante 15 min.
    5. Centrifuga-se o tubo a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar os núcleos e as mitocôndrias.
    6. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação.
    7. Armazenar o sobrenadante a -80 ° C durante um máximo de 6 meses ou utilizá-lo imediatamente.
  3. preparação em gradiente de sacarose e centrifugação (2 horas e 30 min)
    1. Lavagem de ultracentrífuga tubos extensivamente com RNase água (dietilpirocarbonato água tratada (DEPC-água) ou comercial) umd 3% de H 2 O 2 / DEPC H2O solução.
    2. Colocar os tubos em gelo e adiciona-se 5,5 ml de solução fria de 50% de sacarose na parte inferior de cada tubo (ver Tabela 1 para as soluções de sacarose). Adiciona-se cuidadosamente a 15% gota a gota uma solução de sacarose, permanecendo perto da interfase, a fim de preservar uma interfase afiado, até que o tubo está completamente cheia. Quando o tubo está completamente cheia, a fechar com uma tampa de borracha para evitar a formação de bolhas de ar.
    3. Em uma sala fria suavemente fixar os tubos na horizontal e mantê-lo nessa posição durante 2 horas. Após este tempo, os tubos de endireitar-se lentamente de volta para a posição vertical e colocá-los em gelo. Os gradientes está agora pronto para ser usado. Em alternativa, preparar o gradiente de sacarose de 15-50%, utilizando um gradiente convencional ex.
    4. Em um quarto frio remover cuidadosamente 1,0 ml a partir do topo do gradiente e sobrepor a gota sacarose a gota, com o lisado citosólica (isto é, o sobrenadante obtido no step 1,2).
    5. Cuidadosamente abaixe as para dentro dos baldes de rotor basculante. Centrifugar os gradientes de 100 min a 180000 xg, a 4 ° C usando uma ultracentrífuga.
    6. Depois da centrifugação, os tubos em deixar os baldes durante 20 min a 4 ° C para permitir que os gradientes de estabilizar.
  4. fraccionamento em gradiente de sacarose (2 h)
    1. Remova cuidadosamente um tubo de ultracentrífuga do rotor de ultracentrífuga e montá-la no dispositivo coletor de um gradiente de densidade Fracionamento do sistema. Recolher fracções de 1 ml monitorizando a absorvância a 260 nm com um detector de UV / VIS (Ver Figura 1 Painel superior). Mantenha as fracções recolhidas em gelo.
    2. Preparar alíquotas de 30-40 uL das fracções de interesse, mantê-los em gelo antes de as armazenar a -80 ° C até utilização. Não use alíquotas ou fracções de sacarose que foram submetidos a mais de dois ciclos de congelamento-descongelamento (ver Figura 1 painel inferior).
    </ Li>

2. Preparação de Amostras para Microscopia de Força Atômica (3 horas)

  1. Usando a fita, retire as folhas de mica.
  2. Lave as folhas de mica 3-4 vezes com DEPC-água e colocá-lo em uma pequena placa de Petri. Em seguida, seque a superfície com o ar.
  3. Cobrir a mica com 200 ul de 1 mM de 4 Niso e incubar durante 3 min a RT.
  4. Remover a solução de níquel e, em seguida, seca-se a superfície utilizando ar. Realizar todos os passos futuros, a 4 ° C através da colocação da placa de Petri com a mica em gelo.
  5. Descongelar uma aliquota obtida em 1.4.2 em gelo e cuidadosamente adicionar toda a amostra gota a gota na mica. Utilizando uma ponta de pi 100-200, espalhar a amostra em toda a superfície da mica. Incubar a amostra em gelo durante 3 min.
  6. Cobrir a gota folha de mica a gota com 200 ul de Tampão de frio-AFM (ver Tabela 1) e incubar durante 1 hora em gelo.
  7. Imaging no líquido
    1. Retire cuidadosamente o tampão de-AFM e lavar as folhas de mica 3-4 vezs com 200 ul fria Tampão-AFM para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lavar as folhas de mica 3 vezes com solução de lavagem frio (ver Tabela 1), deixando a superfície mica coberta por alguns microlitros de solução.
    2. Ir ao ponto 3 (aquisição de imagem).
  8. Imaging no ar
    1. Cuidadosamente remover o tampão e lava-se a AFM mica 3-4 vezes com 200 ul de Tampão de frio-AFM para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lava-se a mica 3 vezes com solução de lavagem frio (ver Tabela 1) e drenar o excesso de água, utilizando papel.
    2. Deixar a secagem da amostra sob o capô química com a parte superior da placa de Petri parcialmente aberta. Após 2 horas, feche a placa de Petri e armazenar a RT. Medir a amostra depois de 2-3 horas, à medida que eles são estáveis ​​durante anos.

3. Aquisição de Imagem (15 min por imagem após estabilização térmica)

Nota: polissomos imobilizadas em mica podem ser visualizados no ar ou no estado líquido, usando o modo AC.

  1. Fixe a mica ao titular da amostra usando fita dupla face.
  2. Insira o suporte da amostra na fase AFM seguindo as instruções do fabricante. Quando imagiologia no estado líquido, se possível, para tentar manter a amostra a uma temperatura inferior a 25 ° C para aumentar a estabilidade no tempo polissoma.
  3. Selecione um cantilever adequado para imagiologia AC e montá-la no suporte a ponta seguindo as instruções do fabricante. Aqui, o uso de consolas com força constante entre 2-20 N / m para a imagem latente do ar e cerca de 0,1 N / m para a imagem latente líquida.
  4. Ajustar o ponto de laser sobre o braço de suporte e zero os sinais de detector de quadrante.
  5. Selecione uma frequência de condução oportuno e conduzir o cantilever com uma amplitude de 10-20 nm.
  6. Aproxime-se da amostra até a ponta engata na superfície.
  7. Selecione uma área de digitalização de mm 2x2, adquirir pelo menos 512x512 pixel imagens (pixels de largura <4 nm), seleccionar um modo de subtração de fundo ao vivo e uma escala Z de 20-25 nm.
  8. Inspecione tele imagem procurando a presença de objectos redondos, caracterizado por a altura entre 10 e 15 nm, quando a aquisição de ar e 25 e 30 nm, quando no estado líquido e a largura na gama de 25-30 nm. Ajustar os parâmetros de referência e de opinião até objetos pontiagudos são visualizados. O fundo deve aparecer relativamente plana em boas amostras, com alguns objetos de altura 2-4 nm (ver Figura 2A e B).
  9. Se a imagem parece ser bom (como indicado no ponto 3.8), adquirir vários (pelo menos dez) scans 2x2 mícron em diferentes áreas de amostra.
  10. (opcional). Se necessário, adquirir imagens de alta resolução de polissomos selecionadas (veja a Figura 2C).
  11. Aplicar correções de software (subtração de avião e linha por linha de algoritmos de correção) para corrigir as imagens de AFM remoção de inclinação arbitrário e efeitos à deriva.

4. Análise de Dados (30 min por imagem)

  1. Exportar imagens em ImageJ (opcional: aplicar um fator de escala) preferentei ra me usando um formato de compressão sem perdas, por exemplo, o formato TIFF (ver Figura 3A).
  2. Use a macro RiboPick.ijm conjunto de ferramentas ImageJ (a ser copiado no ImageJ macro / conjunto de ferramentas subdiretório) para contar ribossomos em polissomos (ver Figura 3B) e calcular propriedades estatísticas da amostra (ver Figura 3C).
    1. Começar a carregar uma imagem usando o <image Leia> ferramenta que inicializa o programa.
    2. Escolha os centros de ribossomas com o padrão <selecção Point> ImageJ ferramenta (Shift + clique esquerdo permite que o multi-seleção de ribossomas). Marque os ribossomos selecionados com o <Marcos ribossomos> ferramenta. coordenadas ribossomas aparecerá em uma janela de texto personalizado.
    3. Adicionar mais ribossomos ao mesmo polysome repetindo o procedimento indicado no ponto 4.2.2.
    4. Remover ribossomos erroneamente marcados usando o <Undo última escolha> ferramenta (começa a remover a partir do último ribossomo adicionado ao primeiro212; na polysome atual).
    5. Quando o polysome for concluída, use o <polysome Novo> ferramenta. Como o número polysome é adicionado como uma sobreposição à imagem, a janela de texto é atualizado.
    6. Use o <Guardar resultados e perto> para escrever o ribossomo coordena uma imagem PNG que resume ribossomas e polissomos o escolhido arquivo (as unidades padrão da imagem são usados) e. A imagem original é fechado sem ser salvo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sacarose profiling gradiente polissomal de cérebro inteiro de rato

É possível purificar polissomas a partir de um ligado celular por perfis polissomal, que separa as macromoléculas de acordo com o seu peso e tamanho. Com perfis polissomal, lisados ​​citoplasmáticos obtidos a partir de células ou tecidos em cultura, tal como neste exemplo, são carregados sobre um gradiente de sacarose linear e processadas por ultracentrifugação para separar RNA isento de 40S e 60S subunidades, ribossomas 80S e polissomas de acordo com os seus coeficientes de sedimentação ( Figura 1 painel superior). A absorvância da amostra a 254 nm e a recolha de fracções permitir o isolamento da fracção de sacarose enriquecida em ribossomas ou polissomas com diferente número de ribossomas por transcrição. As fracções podem ser recolhidas, aliquotadas para imagiologia de AFM e armazenado a -80 ° C (Figura 1painel inferior).

Polissomos nativas do cérebro do rato observada por AFM no ar revelam interações ribossomas apertados

aquisição de imagem é realizada usando o modo AC (também conhecido como modo de tocar). Esta modalidade é particularmente adequada para a imagiologia de amostras macios (tais como os polissomas) porque a interacção ponta-amostra e as correspondentes forças de cisalhamento são grandemente reduzidas. Desta forma, tanto a ponta e a amostra são preservadas. AFM de imagem permite que a aquisição de dados em alta resolução, com valores exactos que dependem de vários factores, tais como as condições de medição, o tipo de ponta, e as propriedades da amostra. Nas condições descritas neste documento uma resolução lateral de cerca de 4-6 nm e uma resolução vertical de 0,1-0,2 nm são atingíveis. Após a deposição de aliquotas de sacarose em mica, AFM fornece descrições de polissomas que individuaisaparece como agregados de ribossomas embaladas apertadamente (Figura 2A, C e C). Por análise de secção transversal (Figura 2D), a altura dos picos ribossomais é de cerca de 14 nm, em conformidade com o que foi anteriormente observado para ribossomas humanos em polissomas após secagem ao ar 27. O centro de distância do centro de ribossomos identificadas pelo perfil de linha é de 23 nm, o que está de acordo com a dimensão dos ribossomos em solução 37, 38.

O número de ribossomas por polissoma a partir de uma fracção única mostra uma distribuição mono-dispersa

Figura 3A relata uma imagem AFM típicos obtidos através da aquisição de uma amostra absorvida em mica a partir de uma fracção do gradiente de sacarose. A inserção mostra um zoom digital de um único polissoma, com um factor de ampliação adequados para a identificação de ribosOMES na polissoma. O painel B mostra a mesma imagem após a identificação do ribossoma com a macro RiboPick. círculos vermelhos (ver a inserção) marcar os ribossomas, e um número progressivo (ciano) é usado para ajudar a associação do ribossoma coordena com uma polysome específico. A distribuição do número de ribossomas por polissoma frequência foi analisada por fracção # 10 (Ver Figura 1, painel inferior, correspondente a polissomas Médio do Peso Molecular (MEM)), o que mostra claramente um pico único (painel C, barras cinzentas). A distribuição experimental foi montado com uma curva de Gauss (linha preta), que foi centrada em 5,8 ribossomas / polysome, com um desvio padrão de 1,3 ribossomas / polissomas.

figura 1
Figura 1. Perfil absorção Representante para a sedimentação em gradiente de sacarose de todo o cérebro do rato. (Superior pAnel) Um polissomal ligado citoplasmática foi obtido a partir de cérebro de rato P27 e carregou-se um gradiente linear de sacarose (15-50% de sacarose [w / v]). É possível observar picos claros correspondentes a absorvância a 254 nm de RiboNucleoParticles (RNP), subunidades ribossomais (40S e 60S), ribossomas (80S) e polissomos. Para evitar repetidos de congelação e descongelação de amostras de ciclos antes da deposição de AFM em mica, é conveniente dividir em alíquotas tanto fracção de ribossoma e fracções polissomal (painel inferior) com um número diferente de ribossomas por transcrição (isto é, baixa, média e alta polissomos peso -molecular (LMW, MMW e HMW, respectivamente)). As aliquotas podem ser guardadas a -80 ° C durante até dois anos.

Figura 2
Figura 2. Imagens de polissomos cerebrais por toque Mode-Microscopia. (A) Exemplo de Força Atômica imagem AFM da MMW poli cérebrosomes após a absorção em mica utilizando uma escala de cor cinza linear. (B) A mesma imagem mostrada em (A) é representado usando um diferentes Z-intervalos para a escala de cores: 0-0,5 nm cinzento para o fundo, 0,5-2 nm, e 2-10 nm amarelas dos ribossomas. Neste caso, um contraste visual melhor é obtido em ambos os objectos de baixa e alta Z-gama. (C) Ampliação de um polysome típica MMW com perfil transversal (linha branca pontilhada). Perfil (D) Altura de dois ribossomas definidos pelo perfil de secção transversal em (C) mostra a altura de ribossoma de 14 nm. Este valor é compatível com o observado anteriormente em AFM dos ribossomas humanos em polissomos 27.

Figura 3
Figura 3. Exemplo de contagem do número de ribossomas por polissoma MMW em polissomas cerebrais. (A) imagem de AFM que represenSents a entrada da macro ImageJ, RiboPick. (B) Depois de escolher manualmente cada ribossomas por polissoma, marcas RiboPick na imagem da posição de cada um dos ribossomas (círculos vermelhos). (C) O número de ribossomas obtido por polissomas pode ser representada graficamente como uma distribuição que pode ser equipado com uma curva de Gauss. O número de polissomas considerados neste exemplo é de 164, obtido a partir de 9 imagens independentes. O encaixe com a curva de Gauss devolve o valor médio da população de polissomas na fracção MMW (# ribossomas / polissomas 5,8 ± 1,3, R 2 = 0,99).

<tr>
Amortecedor Composição Aplicação
Tampão de lise mM de Tris-HCl a 10, pH 7,5 Preparação de lisado (1,1)
10 mM de NaCl
10 mM de MgCl2
1% de Triton-X100
1% de Na-desoxicolato
0,4 U / ml de ARNase Inibidor
1 mM de DTT
0,2 mg / ml de ciclo-heximida
5 U / ml de ADNase I
50% de solução de sacarose 50% (w / v) de sacarose em preparação em gradiente de sacarose (1,2)
100 mM de NaCl
10 mM de MgCl2
Tris 10 mM / HCl pH 7,5
15% de solução de sacarose 15% (w / v) de sacarose em preparação em gradiente de sacarose (1,2)
100 mM de NaCl
10 mM de MgCl2
Tris 10 mM / HCl pH 7,5
solução de níquel 1 mM NiSO4 preparação de amostras para AFM (2)
Tampão-AFM 100 mM de NaCl preparação de amostras para AFM (2)
10 mM de MgCl2
100 ug / ml de cicloheximida
Hepes 10 mM
3% (w / v) de sacarose, pH = 7.4
Solução de lavagem DEPC-água preparação de amostras para AFM (2)
100 ug / ml de cicloheximida

Tabela 1. Tampões.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Como a estrutura do DNA foi provado ser de suma importância para descrever o processo de transcrição e como a organização da cromatina avançado nossa compreensão do controle transcricional da expressão do gene, é essencial analisar a organização e estrutura do polissomos para melhorar a compreensão verdadeiras da tradução e da sua regulação.

Com o protocolo descrito, uma densidade óptima de polissomas suavemente imobilizados sobre uma superfície plana, adequados para imagiologia de AFM é obtido. Usando estas condições com amostras convenientemente preparados, quase 50 polissomos por hora podem ser adquiridos, pronto para mais análises e caracterização. Além disso, as amostras secas armazenadas à TA provaram ser adequados para imagiologia após mais de um ano.

Para obter êxito imagens polissomas com nosso protocolo, existem alguns passos fundamentais: a utilização de tecidos que tenha sido devidamente congelados rapidamente imediatamente após dissection e armazenado a -80 ° C para minimizar a degradação de ARN; usar o tampão de lise contendo inibidores de cicloheximida e RNase para evitar a dissociação do ribossoma de ARNm; para executar todas as incubações sobre gelo durante a deposição da amostra em mica; e quando da preparação da amostra para geração de imagens AFM no ar, para lavar extensivamente a amostra na mica com tampões de RNase água livre na presença de cicloheximida. O último ponto é particularmente importante. Se a imagem parece conter superfícies lisas aproximadamente na altura certa, mas 100-1.000 nm de largura, esta é uma indicação clara de uma amostra mal lavado (muitas vezes ribossomas / polissomos pode ser ainda observado como, objetos incorporados fracos). Um método para resolver este problema é repetir o procedimento de lavagem, mas isso não costuma mitigar o problema em uma amostra já secou. Neste caso vale a pena começar de novo com uma nova aliquota.

Dada a resolução de AFM, este método para polissomos estudando não pode resolver o strucdetalhes turais de interfaces de ribossomais em polissomos. Na verdade, AFM é uma abordagem complementar e mais simples de Cryo-EM, representando uma técnica eficaz e robusto, para adquirir e analisar milhares de polissomos, e entender melhor a organização geral ribossomo em polissomos. Importante, este protocolo tem a vantagem única de identificação de filamentos compatíveis com RNA 27. Isto muito mesmo procedimento pode ser usado para qualquer amostra obtida a partir de qualquer polissomal tecido biológico ou linha celular. Mais importante que também pode ser empregue com sucesso para obter informação específica-transcrição utilizando sistemas de tradução in vitro, tal como foi recentemente demonstrado pela Lauria e colegas de trabalho 35. Esta metodologia irá pavimentar o caminho para várias experiências, para ganhar a compreensão da cinética de polysome formação ou mudanças na organização polysome sob diferentes condições de celulares ou do tecido.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cycloheximide Sigma 01810 Prepararation of lysate
DNAseI Thermo Scientific 89836 Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor Life technologies EO-0381 Prepararation of lysate
DEPC Sigma 40718 Prepararation of lysate
Triton X100 Sigma T8532 Prepararation of lysate
DTT Sigma 43815 Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate Sigma D6750 Prepararation of lysate
Microcentrifuge  Eppendorf 5417R Prepararation of lysate
Sucrose Sigma S5016 Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima LE-80K Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter SW 41 Ti Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube Beckman Coulter 331372 Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System  Teledyne Isco 67-9000-176 Sucrose gradient fractionation
AFM Asylum Research Cypher Polysome visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  2. Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59, (1), 48-62 (1995).
  3. Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
  4. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  5. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
  6. Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145, (3), 383-397 (2011).
  7. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
  8. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  9. Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54, (1), 147-155 (2014).
  10. Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9, (4), 1256-1264 (2014).
  11. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (36), E3815-E3824 (2014).
  12. van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15, (1), R6 (2014).
  13. Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34, (14), 1905-1924 (2015).
  14. Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1, (1), 59-68 (1955).
  15. McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45, (9), 1437-1447 (1959).
  16. Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2, (197), 430-435 (1963).
  17. Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (47), 20317-20322 (2010).
  18. Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32, (33), 8390-8396 (1993).
  19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, (5481), 905-920 (2000).
  20. Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102, (5), 615-623 (2000).
  21. Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334, (6062), 1524-1529 (2011).
  22. Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497, (7447), 80-85 (2013).
  23. Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
  24. Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
  25. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42, (14), 9461-9469 (2014).
  26. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43, (1), 618-628 (2015).
  27. Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208, (5), 581-596 (2015).
  28. Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
  29. Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378, (5), 363-372 (1997).
  30. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46, (6), 503-506 (1997).
  31. Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
  32. Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
  33. Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  35. Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. (2015).
  36. Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
  37. Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
  38. Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics