Peering på Brain polysomer med atomkraftsmikroskopi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lunelli, L., Bernabò, P., Bolner, A., Vaghi, V., Marchioretto, M., Viero, G. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (109), e53851, doi:10.3791/53851 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Translations maskiner, dvs polysom ​​eller polyribosome, är en av de största och mest komplexa cytoplasmiska maskinerier i celler. Polysomer, som bildas av ribosomer, mRNA, flera proteiner och icke-kodande RNA, representerar integrerade plattformar där translationella kontroller sker. Men medan ribosomen har studerats ingående, anordnande av polysomer saknas fortfarande omfattande förståelse. mycket arbete krävs således för att belysa polysom ​​organisation och någon ny mekanism för translationell kontroll som kan bäddas in. Atomkraftsmikroskopi (AFM) är en typ av svepspetsmikroskopi som gör förvärvet av 3D-bilder i nanoskala upplösning. Jämfört med elektronmikroskopi (EM) tekniker, är en av de främsta fördelarna med AFM att det kan få tusentals bilder både i luft och i lösning, vilket gör att provet som skall hållas under nära fysiologiska förhållanden utan behov av färgning och fastställande proförfaranden. Här är ett detaljerat protokoll för noggrann rening av polysomer från mushjärna och deras avsättning på glimmersubstrat beskrivs. Detta protokoll möjliggör polysom ​​avbildning i luft och vätska med AFM och deras rekonstruktion som tredimensionella objekt. Som komplement till Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), kan den föreslagna metoden lämpligen användas för att systematiskt analysera polysomer och studera deras organisation.

Introduction

Syntesen av protein är det mest energikrävande process i celler 1,2. Därför är det inte förvånande att protein abundances styrs främst på translationell snarare än transkriptionsnivå 3,4,5. Den polysom ​​är den fundamentala makromolekylära komponent som omvandlar mRNA informationen till funktionella protein avläsning. Polysomer är hittills erkänts som makromolekylära komplex där flera translationella kontroller konvergerar 6-13. Trots hundratals studier på ribosomen struktur 14- 16, har de detaljerade molekylära insikter dynamiken i översättning och topologi polysomer stött på ett begränsat intresse. Som en följd av organisationen av den infödda polysomal ribonukleoprotein komplex och dess potentiella inverkan på översättning är fortfarande ganska dunkla frågor. Polysomer kan dölja fortfarande okända beställt och funktionella organisationer, potentiellt spegling vad nukleosomer och epigenetiska controls har representerat för transkriptionen fältet. Faktum är att undersökningen av denna spännande hypotes kräver ytterligare studier och nya tekniska metoder. I denna linje, kan strukturella tekniker och atomkraftsmikroskopi fruktbart samarbeta för att riva upp nya mekanismer för att kontrollera genuttryck, i likhet med det som uppnåddes för nukleosomen 17,18.

Sedan upptäckten av ribosomen 14-16, har dess struktur i stor utsträckning präglas i prokaryoter 19,20, jäst 21 och mer nyligen i mänsklig 22, vilket ger molekylär beskrivning av mekanismerna vid basen av proteinsyntes. Polysomer var initialt på membranet i det endoplasmatiska nätverket och bildar typiska 2D geometriska organisationer 14. Som tidigare nämnts har polysom ​​monteringen inte varit föremål för konstant intresse som ribosomen struktur. I det förflutna, har polysomer studerats i huvudsak av transmission EM-baserade tekniker. Först nyligen, Cryo-EM teknik gjort det möjligt för 3D-rekonstruktion av renade polysomer från in vitro translationssystem 23-26, mänskliga cellulära lysat 27 eller i cellerna 28. Dessa tekniker erbjuds mer raffinerad information om ribosomen-ribosomen organisation i polysomer 23, 26-28 och en preliminär molekylär beskrivning av kontaktytorna på intilliggande ribosomer i vetegroddar polysomer 24. Således kan Cryo-EM tomografi utlämnandet av ribosomen-ribosomen interaktion med molekylär detalj, men det belastas av omfattande efterbearbetning och återuppbyggnad analyser som kräver tunga beräkningsresurser för datahanteringen. Dessutom, för att erhålla molekyl detalj av ribosomen-ribosomen interaktion, är en mycket löst karta av ribosomen som krävs, och denna typ av referens ribosomen är endast tillgänglig för ett fåtal arter. Viktigt är Cryo-EM tomografi inte kunna upptäcka fri RNA. Therefmalm, är nya tekniker som krävs för att till fullo förstå organisationen av översättnings maskiner.

Bredvid Cryo-EM, har AFM varit också som ett användbart verktyg för direkt avbildning av polysomer i lägre eukaryoter 29-33 och människor 27. Jämfört med EM kräver AFM inget prov fixering eller märkning. Dessutom kan mätningar utföras i nära fysiologiska förhållanden och med den unika möjligheten att tydligt identifiera både ribosomer och nakna RNA-strängar 27. Avbildning av enstaka polysomer kan utföras relativt snabbt, få tusentals bilder på nano upplösning med lite efterbearbetning ansträngning jämfört med den omfattande och tung efterbearbetning och rekonstruktion analyser som krävs av Cryo-EM mikroskopi. Följaktligen AFM hantering och analys av data inte behöver dyra arbetsstationer och hög datorkraft. Som sådan, samlar denna teknik information om polysomal former, morfologiska egenskaper (såsomhöjd, längd och bredd), ribosom-densiteter, närvaro av fritt RNA och antalet ribosomer per polysom ​​27 med en högre genomströmning än Cryo-EM. På ett sådant sätt, AFM utgör ett kraftfullt och komplement till EM tekniker för att framställa polysomer 27.

Här presenterar vi en komplett pipeline från rening till dataanalys där AFM tillämpas på bilden och analysera mus hjärnan polysomer. Det föreslagna protokollet fokuserar på reningsfrågor och korrekt avsättning av polysomer på glimmer substrat som används för AFM avbildning. Förutom konventionell partikelanalys som lätt kan genomföras med gemensam programvara som används av AFM gemenskap, en ImageJ 34 plugin, kallad RiboPick, presenteras för att räkna antalet ribosomer per polysom ​​27, 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De metoder som används för att erhålla musvävnader godkändes av organet för skydd av djur (OPBA) vid universitetet i Trento (Italien), protokoll nr. 04-2015, enligt artikel 31 i lagdekret nr. 26/2014. Alla möss hölls på modellorganism Facility för Centrum för integrativ biologi (CIBIO), University of Trento, Italien.

Varning: För att undvika RNA nedbrytning av proverna, förbereda alla buffertar använder DEPC-behandlat vatten för att minimera RNas kontamination.

1. Beredning av polysomer från hela hjärnor

  1. Samla hjärnvävnad (15 min)
    1. Avliva vildtyp musstam C57BL / 6 med CO2-kvävning under 5 min 36. Noggrant dissekera hjärnan ut från skallen 36, placera vävnaden i ett 1,5 ml rör och omedelbart placera den i flytande kväve. Förvara vid -80 ° C fram till användning.
  2. Framställning av lysat (30 min)
    1. Pulverisera hela hjärnvävnaden med hjälp aven mortel och mortelstöt under flytande kväve.
    2. Överföra cirka 25 mg pulver till en kall mikrocentrifugrör och omedelbart (för att undvika upptining av det pulveriserade vävnaden) tillsätt 0,8 ml lyseringsbuffert (se tabell 1) och störa cellen genom att pipettera upp och ner 25 gånger snabbare.
    3. Centrifugera röret vid 12.000 xg i 1 min vid 4 ° C för att pelletera cellrester.
    4. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör och hålla röret på is under 15 min.
    5. Centrifugera röret vid 12.000 xg under 5 min vid 4 ° C för att pelletera kärnor och mitokondrier.
    6. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
    7. Förvara supernatanten vid -80 ° C i högst 6 månader eller använda den direkt.
  3. Sackarosgradient förberedelse och centrifugering (2 h och 30 min)
    1. Tvätta ultracentrifugrör omfattande med RNas-fritt vatten (dietylpyrokarbonat-behandlat vatten (DEPC-vatten) eller kommersiell) end 3% H2O 2 / DEPC H2O-lösning.
    2. Sätta rören på is och tillsätt 5,5 ml kall 50% sackaroslösning vid botten av varje rör (se tabell 1 för sackaroslösningar). Försiktigt 15% sackaroslösning droppe för droppe, vistas nära till inter i syfte att bevara en skarp mellanfas, tills röret är helt fylld. När röret fylls stänga den med en gummipropp för att undvika luftbubbelbildning.
    3. I ett kallt rum försiktigt lägga ner rören horisontellt och hålla den i detta läge under 2 timmar. Efter denna tid, långsamt räta rören tillbaka till vertikalt läge och sätta dem på is. De gradienter är nu redo att användas. Alternativt förbereda 15-50% sackarosgradient med användning av en konventionell gradient förra.
    4. I ett kylrum Ta försiktigt 1,0 ml från toppen av gradienten och överlagra sackaros droppe för droppe med den cytosoliska lysat (dvs supernatanten som erhållits i step 1,2).
    5. Sänk försiktigt ned rören i hinkar svängande hink rotor. Centrifugera gradienterna för 100 min vid 180.000 xg vid 4 ° C med användning av en ultracentrifug.
    6. Efter centrifugering, lämnar rören i sina hinkar under 20 min vid 4 ° C för att låta de gradienter stabiliseras.
  4. Sackarosgradient fraktionering (2 h)
    1. Försiktigt bort ett ultracentrifugrör från ultracentrifug rötor och montera den på uppsamlingsanordning av en densitetsgradient fraktioneringssystem. Samla in 1 ml fraktioner övervakning av absorbansen vid 260 nm med en UV / VIS detektor (Se figur 1 övre panelen). Håll de uppsamlade fraktionerna på is.
    2. Förbered alikvoter av 30-40 pl av fraktionerna av intresse, hålla dem på is innan de lagras vid -80 ° C tills användning. Använd inte portioner eller sackaros fraktioner som genomgick mer än två frysupptiningscykler (se figur 1 undre panelen).
    </ Li>

2. Provberedning för atomkraftsmikroskopi (3 h)

  1. Med hjälp av tejp, lossna glimmerblad.
  2. Tvätta glimmerblad 3-4 gånger med DEPC-vatten och placera den i en liten petriskål. Torka sedan ytan med hjälp av luft.
  3. Täck glimmer med 200 pl 1 mM niso 4 och inkubera i 3 min vid RT.
  4. Ta nickel lösning och sedan torka ytan med luft. Utföra alla framtida steg vid 4 ° C genom att placera petriskål med glimmer på is.
  5. Tina en alikvot som erhållits i 1.4.2 på is och försiktigt lägga till alla prov droppe för droppe på glimmer. Med hjälp av en 100-200 l spets, sprida provet på hela ytan av glimmer. Inkubera provet på is under 3 min.
  6. Täck glimmerarket droppe för droppe med 200 ul kall Buffert-AFM (se tabell 1) och inkubera under 1 timme på is.
  7. Avbildning i flytande
    1. Ta försiktigt buffert-AFM och tvätta glimmerblad 3-4 tids med 200 pl kall buffert-AFM för att avlägsna överskott sackaros. Tvätta sedan glimmerblad 3 gånger med kall tvättlösning (se tabell 1), som lämnar glimmer yta täckt av några mikroliter av lösning.
    2. Gå till punkt 3 (Bild förvärv).
  8. Avbildning i luft
    1. Försiktigt bort buffert-AFM och tvätta glimmer 3-4 gånger med 200 ul kall buffert-AFM för att avlägsna överskottet sackaros. Sedan, tvätta glimmer 3 gånger med kall tvättlösning (se tabell 1) och dränera överskottsvatten med papper.
    2. Lämna provet torka under den kemiska huva med toppen av Petri-skålen delvis öppen. Efter 2 timmar, stäng petriskål och förvara vid rumstemperatur. Mät provet efter 2-3 timmar, eftersom de är stabila i år.

3. Image Acquisition (15 min per bild efter termisk stabilisering)

Obs: polysomer immobiliserade på glimmer kan avbildas i luften eller i flytande form, med hjälp av AC-läge.

  1. Fäst glimmer till provhållaren med hjälp av dubbelhäftande tejp.
  2. Sätt provhållaren i AFM scenen efter tillverkarens anvisningar. När avbildning i flytande form, om möjligt, försöka behålla provet vid en temperatur lägre än 25 ° C för att öka polysom ​​stabiliteten i tid.
  3. Välj en fribärande lämplig för AC avbildning och montera den på spetshållaren i enlighet med tillverkarens anvisningar. Här använder utliggare med kraft konstant mellan 2-20 N / m för luft avbildning och cirka 0,1 N / m för flytande avbildning.
  4. Justera laserpunkten på konsolen och nollställa kvadrant detektorsignalerna.
  5. Välja ett lämpligt drivfrekvens och driva den fribärande med en amplitud av 10-20 nm.
  6. Närma provet tills spetsen greppar ytan.
  7. Välj ett skanningsområde 2x2 um, förvärva åtminstone 512x512 pixel bilder (pixel bredd <4 nm), välj en levande bakgrund subtraktion läge och en Z skala 20-25 nm.
  8. inspektera than bild efter förekomsten av runda föremål kännetecknas av höjd mellan 10 och 15 nm vid förvärv i luft och 25 och 30 nm när vätskan och bredd i intervallet 25-30 nm. Justera börvärdet och återkopplingsparametrarna tills vassa föremål visualiseras. Bakgrunden ska visas relativt platt i goda prover, med vissa 2-4 nm höjd objekt (se figur 2A och B).
  9. Om bilden ser bra ut (som anges i punkt 3.8), förvärva flera (åtminstone tio) 2x2 mikron skannar på olika provområdena.
  10. (frivillig). Om det behövs, skaffa högupplösta bilder av utvalda polysomer (se figur 2C).
  11. Applicera programvaru korrigeringar (plan subtraktion och line-by-line korrektionsalgoritmer) för att korrigera AFM-bilder avlägsna godtycklig lutning och drivande effekter.

4. Dataanalys (30 min per bild)

  1. Exportera bilder i ImageJ (tillval: tillämpa en skalfaktor) preferentially använder en förlustfri komprimeringsformat, till exempel, TIFF-format (se figur 3A).
  2. Använd ImageJ makro verktygen RiboPick.ijm (som ska kopieras i ImageJ makro / verktygen katalogen) att räkna ribosomer i polysomer (se figur 3B) och beräkna statistiska egenskaper hos provet (se figur 3C).
    1. Börja ladda en bild med <Läs bild> verktyg som initierar programmet.
    2. Plocka ribosom centra med standard ImageJ <punkt> verktyg (shift + vänsterklicka tillåter flera val av ribosomer). Markera de valda ribosomer med <Mark ribosomer> verktyg. Ribosom koordinater visas i en anpassad textfönster.
    3. Lägg till fler ribosomer till samma polysom ​​upprepa förfarande som anges i punkt 4.2.2.
    4. Ta bort felaktigt märkta ribosomer med hjälp av <Ångra sista plocka> verktyg (börjar att ta bort från den senast tillagda ribosomen till den första212; i den aktuella polysom ​​endast).
    5. När polysom ​​är klar, använd <Ny polysom> verktyg. När polysom ​​numret läggs som ett överlägg på bilden, är textfönstret uppdateras.
    6. Använd <Spara resultat och nära> att skriva ribosomen samordnar fil (standardenheterna i bilden används) och en PNG-bild som sammanfattar plockade ribosomer och polysomer. Originalbilden är stängd utan att sparas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sackarosgradient polysomal profilering av hela mushjärna

Det är möjligt att rena polysomer från en cellulär lysatet genom polysomal profilering, som separerar makromolekyler i enlighet med deras vikt och storlek. Med polysomal profilering, cytoplasmiska lysat erhållna från odlade celler eller vävnader, såsom i detta exempel, lastas på en linjär sackarosgradient och behandlas av ultracentrifugering för att separera fri RNA från 40S och 60S-subenheter, 80S ribosomer och polysomer enligt deras sedimenteringskoefficienterna ( Figur 1 övre panelen). Absorbansen hos provet vid 254 nm och den fraktionsuppsamling möjliggöra isolering av den sackaros fraktion anrikad i ribosomer eller polysomer med olika antal ribosomer per transkript. Fraktionerna kan samlas in, alikvoterades för AFM avbildning och lagrades vid -80 ° C (figur 1undre panelen).

Native polysomer från mushjärna observerats av AFM i luft avslöja snäva ribosomen interaktioner

Bild förvärv utförs med hjälp av AC-läge (kallas även knacka läge). Denna modalitet är speciellt lämplig för avbildning av mjuka prover (såsom de polysomer) eftersom spetsen-provet interaktion och de motsvarande skjuvkrafterna minskas i hög grad. På detta sätt både spetsen och provet bevaras. AFM avbildning tillåter förvärv av data med hög upplösning, med exakta värden som beror på olika faktorer, såsom mätförhållanden, den typ av spetsen, och egenskaperna hos provet. Under de förhållanden som beskrivs i detta dokument en lateral upplösning på ca 4-6 nm och en vertikal upplösning på 0,1-0,2 nm kan uppnås. Efter avsättningen av sackaros portioner på glimmer, AFM innehåller beskrivningar av enskilda polysomer somvisas som kluster av tätt packade ribosomer (Figur 2A, C och C). Genom tvärsnitt analys (Figur 2D), är höjden av ribosomala toppar runt 14 nm i enlighet med vad som tidigare observerats för mänskliga ribosomer i polysomer efter lufttorkning 27. Centrum till centrum avstånd av ribosomer som identifierats av linjeprofilen är 23 nm, vilket är i överensstämmelse med den dimension av ribosomer i lösning 37, 38.

Antalet ribosomer per polysom ​​från en enda fraktion visar en monodispergerade fördelning

Figur 3A rapporterar en typisk AFM bild erhållen genom att förvärva ett prov absorberades på glimmer från en bråkdel av sackarosgradient. Den infällda bilden visar en digital zoom av en enda polysom, med en förstoringsfaktor lämpliga för identifiering av ribosOmes i polysom. Panel B visar samma bild efter ribosomen identifiering med RiboPick makrot. Röda cirklar (se infälld) markerar ribosomerna, och ett progressivt nummer (cyan) används för att hjälpa föreningen av ribosomen koordinerar med en specifik polysom. Fördelningen av antalet ribosomer per polysom ​​frekvensanalyserades med avseende fraktion # 10 (Se figur 1, nedre panelen, motsvarande med medelhög molekylvikt polysomer (MMW)), som tydligt visar en enda topp (Panel C, grå staplar). Den experimentella utgåvan försågs med en Gauss kurva (svart linje) som centrerades på 5,8 ribosomer / polysom, med en standardavvikelse på 1,3 ribosomer / polysom.

Figur 1
Figur 1. Representant absorbansprofilen för sackarosgradient sedimentering av hela mushjärna. (Övre panel) En polysomal cytoplasmiska lysat erhölls från P27 mushjärna och satsades på en linjär sackarosgradient (15-50% sackaros [w / v]). Det är möjligt att observera tydliga toppar motsvarande absorbans vid 254 nm av RiboNucleoParticles (RNP), ribosomala subenheter (40S och 60S), ribosomer (80S) och polysomer. För att undvika upprepad frysning och upptining av prover före AFM avsättning på glimmer, är det lämpligt att dela upp i alikvoter både ribosomen fraktion och polysomal fraktioner (lägre panel) med olika antal ribosomer per utskrift (dvs låg-, medel- och hög -molecular vikt polysomer (LMW, MMW och HMW respektive)). Alikvotema kan lagras vid -80 ° C under så lång tid som två år.

figur 2
Figur 2. Bilder av hjärn polysomer genom att man pekar på-läge atomkraftsmikroskopi (A) Exempel på AFM bild av MMW hjärn poly.somes efter absorption på glimmer med hjälp av en linjär grå färgskala. (B) Samma bild visas i (A) avbildas med en annan Z-intervall för färgskala: 0-0,5 nm grå för bakgrunden, 0,5-2 nm, och 2-10 nm gult för ribosomer. I detta fall en bättre visuell kontrast erhålls för både låga och höga Z-range objekt. (C) Förstoring av en typisk MMW polysom ​​med tvärsnittsprofil (prickade vit linje). (D) Höjd profilen för två ribosomer som definieras av tvärsnittsprofil i (C) visar ribosom höjd av 14 nm. Detta värde är kompatibel med vad som tidigare observerats i AFM för mänskliga ribosomer i polysomer 27.

Figur 3
Figur 3. Exempel på att räkna antalet ribosomer per polysom ​​i MMW hjärn polysomer. (A) AFM bild som representerar ingången på ImageJ makro, RiboPick. (B) Efter manuellt plocka varje ribosomer per polysom, RiboPick märken i bilden positionen för varje ribosomen (röda cirklar). (C) Den erhållna antalet ribosomer per polysomer kan ritas som en fördelning som kan förses med en Gauss kurva. Antalet polysomer anses i detta exempel är 164, som erhållits från 9 oberoende bilder. Beslaget med Gauss kurva returnerar medelvärdet av befolkningen i polysomer i MMW fraktion (# ribosomer / polysom ​​5,8 ± 1,3, R2 = 0,99).

<tr>
Buffert Sammansättning Ansökan
lysis Buffer 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 Framställning av lysat (1,1)
10 mM NaCl
10 mM MgCl2
1% Triton-X100
1% Na-deoxicholat
0,4 U / ml RNas-inhibitor
1 mM DTT
0,2 mg / ml cykloheximid
5 U / ml DNas I
50% sackaroslösning 50% (vikt / volym) sackaros i Sackaros förberedelse gradient (1,2)
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl pH 7,5
15% sackaroslösning 15% (vikt / volym) sackaros i Sackaros förberedelse gradient (1,2)
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris / HCl pH 7,5
nickellösning 1 mM Niso 4 Provberedning för AFM (2)
Buffert-AFM 100 mM NaCl Provberedning för AFM (2)
10 mM MgCl2
100 | ig / ml cykloheximid
10 mM Hepes
3% (vikt / volym) sackaros, pH = 7,4
Washing Solution DEPC-vatten Provberedning för AFM (2)
100 | ig / ml cykloheximid

Tabell 1. Buffertar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom strukturen av DNA visat sig vara av avgörande betydelse för att beskriva processen av transkription och som organisationen av kromatin avancerade vår förståelse av transkriptionskontroll av genuttryck, är det viktigt att analysera organisation och struktur polysomer att förbättra sanningsenlig förståelse översättning och dess reglering.

Med det beskrivna protokollet, en optimal täthet av polysomer försiktigt immobiliserade på en plan yta, lämplig för AFM avbildning erhålles. Med hjälp av dessa förhållanden med bra förberedda prover, kan nästan 50 polysomer per timme förvärvas, redo för ytterligare analyser och karakterisering. Dessutom har torkade proverna lagrade vid RT visat sig vara lämplig för avbildning efter mer än ett år.

För att framgångsrikt få polysom ​​bilder med våra protokoll, finns det några viktiga steg: att använda vävnader som har rätt flash-frysta omedelbart efter dissection och lagrades vid -80 ° C för att minimera RNA nedbrytning; att använda lysbuffert innehållande cykloheximid och RNas-hämmare för att undvika ribosomen dissociation från mRNA; att utföra alla inkubationer på is under prov avsättningen på glimmer; och vid upprättandet av provet för AFM avbildning på luft, för att i stor utsträckning tvätta provet på glimmer med buffertar och RNas fritt vatten i närvaro av cykloheximid. Den sista punkten är särskilt viktig. Om bilden verkar innehålla släta ytor på ungefär rätt höjd men 100-1000 nm bred, är detta en tydlig indikation på en dåligt tvättade prov (ofta ribosomer / polysomer kan fortfarande observeras som svag, inbäddade objekt). En metod för att lösa problemet är att upprepa tvättproceduren, men det brukar inte lindra problemet på ett redan torkat prov. I detta fall är det värt att starta igen med en ny alikvot.

Med tanke på upplösningen av AFM, kan denna metod för att studera polysomer inte lösa strukbruks uppgifter om ribosomala gränssnitt i polysomer. I själva verket är AFM en kompletterande och enklare metod för att kryo-EM, vilket motsvarar en effektiv och robust teknik, att förvärva och analysera tusentals polysomer, och bättre förstå den övergripande ribosomen organisationen polysomer. Viktigt, har detta protokoll den unika fördelen att identifiera trådar kompatibla med RNA 27. Denna mycket Samma procedur kan användas för något polysomal prov erhållet från varje biologisk vävnad eller cellinje. Ännu viktigare det kan också med framgång användas för att erhålla transkript specifik information med användning av in vitro-translationssystem, vilket nyligen demonstrerats av Lauria och medarbetare 35. Denna metod kommer att bana väg för flera experiment för att få förståelse för kinetiken av polysom ​​bildning eller förändringar i polysom ​​organisation under olika cellulära eller vävnadsförhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cycloheximide Sigma 01810 Prepararation of lysate
DNAseI Thermo Scientific 89836 Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor Life technologies EO-0381 Prepararation of lysate
DEPC Sigma 40718 Prepararation of lysate
Triton X100 Sigma T8532 Prepararation of lysate
DTT Sigma 43815 Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate Sigma D6750 Prepararation of lysate
Microcentrifuge  Eppendorf 5417R Prepararation of lysate
Sucrose Sigma S5016 Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima LE-80K Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter SW 41 Ti Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube Beckman Coulter 331372 Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System  Teledyne Isco 67-9000-176 Sucrose gradient fractionation
AFM Asylum Research Cypher Polysome visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  2. Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59, (1), 48-62 (1995).
  3. Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
  4. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  5. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
  6. Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145, (3), 383-397 (2011).
  7. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
  8. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  9. Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54, (1), 147-155 (2014).
  10. Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9, (4), 1256-1264 (2014).
  11. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (36), E3815-E3824 (2014).
  12. van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15, (1), R6 (2014).
  13. Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34, (14), 1905-1924 (2015).
  14. Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1, (1), 59-68 (1955).
  15. McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45, (9), 1437-1447 (1959).
  16. Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2, (197), 430-435 (1963).
  17. Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (47), 20317-20322 (2010).
  18. Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32, (33), 8390-8396 (1993).
  19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, (5481), 905-920 (2000).
  20. Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102, (5), 615-623 (2000).
  21. Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334, (6062), 1524-1529 (2011).
  22. Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497, (7447), 80-85 (2013).
  23. Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
  24. Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
  25. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42, (14), 9461-9469 (2014).
  26. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43, (1), 618-628 (2015).
  27. Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208, (5), 581-596 (2015).
  28. Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
  29. Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378, (5), 363-372 (1997).
  30. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46, (6), 503-506 (1997).
  31. Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
  32. Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
  33. Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  35. Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. (2015).
  36. Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
  37. Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
  38. Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics