रिकॉर्डिंग माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations सामाजिक संचार मूल्यांकन करने के लिए

1Human Genetics and Cognitive Functions, University Paris Diderot, CNRS UMR 3571, Institut Pasteur, 2Neurophysiology and Behavior, University Pierre et Marie Curie Paris 6, CNRS UMR 7102, 3Bio Image Analysis, CNRS URA 2582, Institut Pasteur
Published 6/05/2016
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Ferhat, A. T., Torquet, N., Le Sourd, A. M., de Chaumont, F., Olivo-Marin, J. C., Faure, P., et al. Recording Mouse Ultrasonic Vocalizations to Evaluate Social Communication. J. Vis. Exp. (112), e53871, doi:10.3791/53871 (2016).

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Abstract

Introduction

Neuropsychiatric विकारों के साथ मरीजों को आमतौर पर सामाजिक संचार में घाटा प्रदर्शित (जैसे, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार, मानसिक असंतुलन, या अल्जाइमर रोग के साथ रोगियों) 1। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों रहे हैं और अधिक से अधिक बार इन विकारों 2 के आनुवंशिक कारणों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया। इन माउस मॉडल में सामाजिक संचार के अध्ययन के आनुवंशिक परिवर्तन असामान्य सामाजिक रोग के लिए अग्रणी के तंत्र को समझने के लिए और नए उपचारों के परीक्षण के लिए उच्च ब्याज की है। चूंकि चूहों सामाजिक जानवर हैं और घ्राण, स्पर्श, दृश्य और ध्वनिक संकेतों का उपयोग एक दूसरे के साथ संवाद, वे उपयुक्त मॉडल सामाजिक संचार मूल्यांकन करने के लिए कर रहे हैं।

माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations अब वर्तमान में, मुखर संचार घाटा 3,4 (लेकिन इस प्रजाति अभी भी बहस हो रही है 5,6 में मुखर सीखने के अस्तित्व के आनुवंशिक ठिकानों मॉडलिंग के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, भले ही सबसे हाल ही के अध्ययन arguमुखर सीखने 7) की अनुपस्थिति के लिए ई। प्रयोगशाला के चूहों मां-शिशु रिश्तों में अल्ट्रासोनिक vocalizations फेंकना, पुरुष-महिला सामाजिक-यौन संबंधों में, एक ही लिंग के सामाजिक संबंधों में पाया गया है (संदर्भ में समीक्षा की 8) और किशोर-किशोर सामाजिक संबंधों 9 में। माउस पिल्ले अपने जीवन के पहले दो हफ्तों के दौरान अलगाव कॉल फेंकना जब बांध और littermates 10 से पृथक। नर जब (से उसे या मूत्र संकेतों) 11,12 एक मद महिला की उपस्थिति में अल्ट्रासोनिक vocalizations फेंकना। पुरुषों और महिलाओं अल्ट्रासोनिक वोकलिज़ेशन फेंकना जब एक ही लिंग 13,14 के एक अज्ञात सजातीय के साथ बातचीत। संगठन और इन स्वरों के उच्चारण के कार्यों को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं और आगे की जांच की जरूरत है। कार्यात्मक पहलू पर वर्तमान ज्ञान पिल्ला अलगाव कॉल, वयस्क पुरुष vocalizat की ओर वयस्क महिलाओं की निकटता की सुविधा सुनवाई माताओं में पुनः प्राप्ति के व्यवहार के निकालना तक सीमित हैआयनों 15 और वयस्क पुरुषों वयस्क महिला vocalizations 16 सुनवाई की वृद्धि की खोजपूर्ण व्यवहार।

neuropsychiatric विकारों के माउस मॉडल में मुखर संचार में असामान्यताएं निस्र्पक प्रयोगात्मक शर्तों का प्रमुख योगदान बाहर शासन करने के लिए मानकीकृत की स्थिति में आयोजित किया जाना चाहिए। इस तरह के अभिलक्षण, एक साथ सामाजिक संबंधों और neurobiological अध्ययन, विभिन्न आनुवंशिक मॉडल में मूल्यांकन के साथ संयुक्त माउस अल्ट्रासोनिक संचार के विभिन्न पहलुओं के लिए आनुवंशिक योगदान पर हमारे ज्ञान में सुधार करना चाहिए। एक लंबे समय में, यह मानव में सामाजिक संचार के कुछ neurobiological ठिकानों पर आगे प्रकाश देना चाहिए। हम वर्तमान में सरल प्रोटोकॉल उपलब्ध कराने मज़बूती से विकास के दौरान और प्रयोगशाला में दोनों नर और मादा चूहों के लिए वयस्कता में अल्ट्रासोनिक vocalizations प्रकाश में लाना करने के उद्देश्य। ऐसे प्रोटोकॉल रिकॉर्डिंग अधिक मज़बूती ultr की तुलना करने के मानकीकरण को कम करना चाहिएतनाव और प्रयोगशालाओं के बीच asonic वोकलिज़ेशन उत्सर्जन। यह भी माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations रिकॉर्डिंग के साथ कोई पूर्व अनुभव होने प्रयोगशालाओं में इस तरह की रिकॉर्डिंग की स्थापना की सुविधा चाहिए। हम यह भी वयस्क चूहों में सामाजिक संबंधों के दौरान एक साथ एकत्र, सामाजिक विकृतियों पर और साथ ही अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के उत्सर्जन के संदर्भ पर महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने के लिए विस्तृत व्यवहार डेटा के साथ अल्ट्रासोनिक vocalizations डेटा गठबंधन करने के लिए मौजूदा संभावना पर प्रकाश डाला। इस तरह के विश्लेषण संगठन और माउस अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के कार्यों पर नया प्रकाश डाला जाएगा। अंत में, हम भी mouseTube डेटाबेस (http://mousetube.pasteur.fr) पर पूरे वैज्ञानिक समुदाय के साथ अल्ट्रासोनिक वोकलिज़ेशन रिकॉर्डिंग साझा करने की संभावना को विज्ञापित। ऑडियो रिकॉर्डिंग डेटा के लिए खुला पहुँच वैज्ञानिकों अन्य LABO में दर्ज अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के साथ अपने स्वयं के डेटा की तुलना करने की अनुमति देकर माउस अल्ट्रासोनिक संचार पर ज्ञान को बढ़ावा देने चाहिएratories (समान या विभिन्न प्रकारों / प्रोटोकॉल के साथ), और / या अलग अलग परिस्थितियों में दर्ज की गई फ़ाइलों के साथ अपने विश्लेषण के तरीकों को चुनौती देने के लिए।

Protocol

आचार बयान: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं Comité डी Ethique एन प्रयोग ANIMALE (CETEA) एन ° 89 Institut पाश्चर, पेरिस में द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. पशु तैयारी

  1. पिल्ला अलगाव कॉल रिकॉर्ड करने के लिए, ब्याज की माउस तनाव से गर्भवती महिलाओं को प्राप्त करते हैं। नोट: विषमयुग्मजी पुरुषों और महिलाओं के जंगली प्रकार सहित कम से कम 10 litters प्राप्त करने के लिए नस्ल, विषमयुग्मजी और नाक आउट पिल्ले मजबूत नियंत्रण जानवरों प्राप्त करने के लिए।
  2. एक ही सेक्स बातचीत के दौरान स्वरों के उच्चारण रिकॉर्ड करने के लिए वयस्क चूहों की दो श्रेणियों प्राप्त करते हैं।
    1. कम से कम 12 पुरुषों या ब्याज के तनाव से परीक्षण चूहों के रूप में प्रत्येक जीनोटाइप के 12 महिलाओं प्राप्त (खाते अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता में लेने के लिए)। नोट: इस प्रोटोकॉल वयस्कों के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है, लेकिन यह प्रयोग 9 से पहले, किशोरों को समायोजित किया जा सकता है कम अलगाव समय के साथ। इस परीक्षा में पुरुषों या महिलाओं के लिए काम करता है। हालांकि, परीक्षण के पुरुष से बचनेमाउस उपभेदों कि पुरुष-पुरुष सामाजिक संपर्क की परीक्षा में एक स्पष्ट आक्रामक phenotype के प्रदर्शन से एस।
    2. affiliative बातचीत की राशि को अधिकतम करने के लिए, प्रयोगों से पहले परीक्षण पशुओं को अलग। हाउस 3 सप्ताह (एक न्यूनतम 14,17 करने के लिए आक्रामक बातचीत को कम करने के लिए) और महिलाओं के 3 दिन के लिए (ई ey, अप्रकाशित डेटा) के लिए व्यक्तिगत रूप से पुरुषों उनके सामाजिक प्रेरणा बढ़ाने के लिए।
    3. परीक्षा का तनाव उन्हें नए comers के रूप में उपयोग करने के लिए आनुवंशिक पृष्ठभूमि के तनाव प्रतिनिधि से पुरुषों या महिलाओं को प्राप्त करने के लिए (जैसे, बातचीत के दौरान चूहों के रूप में, 3.1.3 देखें)। उदाहरण के लिए, यदि उत्परिवर्ती तनाव अध्ययन किया जा रहा C57BL / 6J पृष्ठभूमि पर उत्पन्न किया गया है, C57BL / 6J नए comers के रूप में चूहों का उपयोग करें। जरूरत तो यह है कि इन चूहों के प्रत्येक नए आगंतुक के रूप में अधिक से अधिक 2 बार एक दिन में नहीं किया जाता है जानवरों की संख्या की गणना। उन्हें समूहों में घर।
  3. एक मद महिला की उपस्थिति में पुरुष स्वरों के उच्चारण रिकॉर्ड करने के लिए वयस्क चूहों की दो श्रेणियों प्राप्त करते हैं।
    1. एल में प्राप्त करते हैंपूर्व 12 हित के तनाव के प्रत्येक जीनोटाइप से यौन परिपक्व पुरुषों (खाते अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता में लेने के लिए)। नोट: पुरुषों से पहले महिलाओं के साथ अनुभव नहीं था, तो उन्हें अलग-अलग पिंजरों में डाल दिया है और उन्हें एक महिला दो दिनों के साथ एक रात बिताने के जाने से पहले परीक्षण अल्ट्रासोनिक vocalizations 6 फेंकना करने के लिए उनकी प्रेरणा बढ़ाने के लिए।
    2. दर्ज की गई पुरुषों की पृष्ठभूमि तनाव से यौन परिपक्व महिलाओं प्राप्त करते हैं। उदाहरण के लिए, यदि उत्परिवर्ती पुरुषों अध्ययन किया जा रहा C57BL / 6J पृष्ठभूमि पर उत्पन्न किया गया है, C57BL / 6J महिलाओं का उपयोग करें। जरूरत तो यह है कि इन चूहों के प्रत्येक अधिक से अधिक 3 बार एक दिन में नहीं किया जाता है महिलाओं की संख्या की गणना। उन्हें समूहों में घर।

2. पिल्ला अलगाव कॉल

  1. पिल्ला पहचान
    1. तीन दिनों के जन्म की भविष्यवाणी एक दिन पहले, गर्भवती महिलाओं को अलग।
    2. जन्म के लिए महिलाओं को हर सुबह और हर शाम की जाँच करें। P0 के रूप में जन्म के दिन पर ध्यान दें।
    3. P1 पर पिल्ले लंबे समय से स्थायी पंजा टैटू का उपयोग कर (हरी टैटू के चमड़े के नीचे इंजेक्शन एक 0.3 मिमी x 13 मिमी [30 जी साढ़े "] सुई के साथ पेस्ट) को पहचानें। चिह्नित एक, दो, तीन या चार पंजे के साथ एक कोड बनाएँ। के रूप में बनें जल्दी संभव हो, न्यूनतम पिल्ले परेशान है, और उन्हें जितनी जल्दी हो सके घोंसले में वापस डाल दिया।
  2. रिकार्ड पिल्ला अलगाव कॉल करने के लिए पिंजरे सेट करें।
    1. या तो एक स्वयं बनाया ध्वनिरहित कक्ष (चित्रा 1 ए) या ​​एक सरल स्टायरोफोम बॉक्स का उपयोग करें। बॉक्स के भीतर एक थर्मामीटर की जगह प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए तापमान पर नजर रखने के लिए। यकीन है कि तापमान 18 डिग्री सेल्सियस और 22 डिग्री सेल्सियस के बीच बना हुआ है कि सुनिश्चित करें।
    2. शीर्ष (बॉक्स के शीर्ष में एक छेद के माध्यम से) पर एक माइक्रोफोन रखें। माइक्रोफोन की ऊंचाई समायोजित इतना है कि माइक्रोफोन की झिल्ली बॉक्स जहां पिल्ला नीचे झूठ होगा के नीचे से ऊपर 12-15 सेमी है। साउंड कार्ड के लिए माइक्रोफोन, और कंप्यूटर के लिए साउंड कार्ड कनेक्ट करें।
    3. Sou के लाभ को समायोजित करने के लिएएन डी कार्ड, एक पिल्ला है कि प्रयोग में इस्तेमाल नहीं किया जाएगा के साथ एक रिकॉर्डिंग परीक्षण का संचालन। प्रयोग (2.3.1 देखें) के रूप में ही परिस्थितियों में पिल्ला रखो। दरवाज़ा बंद करो। साउंड कार्ड पर लाभ को समायोजित, इतना है कि यह अधिकतम मूल्य पर है, लेकिन अधिक भार के बिना (रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर पर लाइव spectrogram प्रदर्शन पर जाँच) (स्वरों के उच्चारण के लिए उच्चतम आयाम संभव है करने के लिए)।
      नोट: यदि कॉल के बहुमत के आयाम उच्चतम संभव स्तर पर रखा जाता है कुछ कॉल अतिभारित किया जा सकता है।
    4. प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र के लिए लाभ के स्तर रजिस्टर और पिल्ले / litters / सत्र के बीच में इसे बदल नहीं है। लाभ के स्तर में बदलाव गलत कॉल का पता लगाने और स्वत: पता लगाने और माप (5.4 करने के लिए 5.1 देखें) का उपयोग विश्लेषण में एक ही थ्रेसहोल्ड के साथ ध्वनिक चर उपायों के लिए नेतृत्व करेंगे।

आकृति 1
(ए) एक स्वयं बनाया साउंड प्रूफ कक्ष पिल्ला अलगाव कॉल रिकॉर्ड करने का उदाहरण माउस पिल्ले और अल्ट्रासोनिक vocalizations की spectrograms से कहता है।। (बी) के वर्तमान कॉल प्रकार वर्गीकरण में इस्तेमाल विभिन्न प्रकार के कॉल spectrograms; तालिका में विवरण देखने 1. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. आचरण पिल्ला अलगाव की रिकॉर्डिंग हर दो दिन कहता है। रात में पैदा पिल्ले के लिए सुबह में रिकॉर्डिंग आचरण, और दिन के दौरान पैदा हुए उम्र का अंतर के आधे से एक दिन के साथ एक ही उम्र वर्ग के पिल्ले में वर्गीकरण से बचने के लिए पिल्ले के लिए दोपहर में। यह बहुत युवा चरणों P2 और पी 4 के लिए सबसे अधिक ध्यान देने योग्य है।
    1. कूड़े में एक पिल्ला ले लो। यह रूप में जल्दी और धीरे संभव के रूप में एक प्लास्टिक इथेनॉल 10% के साथ धोया और सुखाया (व्यास प्राप्तकर्ता में जगह: 9से.मी; ऊंचाई: 10 सेमी माइक्रोफोन द्वारा कवर क्षेत्र) से भागने से पुराने पिल्ले को रोकने के लिए। सिर्फ माइक्रोफोन के तहत प्राप्तकर्ता रखो।
    2. के रूप में जल्दी और चुपचाप संभव के रूप में बॉक्स बंद करें। (16-बिट प्रारूप, 300 किलोहर्ट्ज़ नमूने आवृत्ति एक उच्च गुणवत्ता के साथ 150 kHz करने के लिए ध्वनि आयाम पर कब्जा करने के लिए) रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में पिल्ला अल्ट्रासोनिक vocalizations की रिकॉर्डिंग शुरू।
    3. रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक समय के बाद (5 मिनट तक) बीत गया है, रिकॉर्डिंग बंद करो। बॉक्स से बाहर पिल्ला ले लो। नीचे पिल्ला का पंजा टैटू लिखें।
    4. एक जांच-थर्मामीटर के साथ पिल्ला की कक्षा तापमान ले लो। मार्क एक गंध-कम कलम (पानी स्याही), पहचान करने के साथ एक छोटे से बिंदु के साथ अपनी पीठ पर पिल्ला और अधिक आसानी से घोंसले में पहले से ही दर्ज पिल्ले जब अगले एक चुना जाता है और सभी पिल्ले हर बार एक नया एक है जोड़ तोड़ से बचने के लिए चुना। घोंसले में पिल्ला वापस रखो।
    5. प्लास्टिक प्राप्तकर्ता और उसके नीचे को कवर प्लास्टिक 10% इथेनॉल के साथ धो लें और इसे अच्छी तरह से सूखेअगले पिल्ला अंदर डालने से पहले।
    6. कूड़े में अगले पिल्ला चुनते हैं और 2.3 दोहराएँ।
  2. (कम परीक्षण बैटरी की जानकारी के लिए कृपया Schmeisser एट अल। 18 में और Ey एट अल। 19 में विधि अनुभाग देखें) शरीर के वजन, मोटर समन्वय, नकारात्मक geotaxis, और विकास के निशान की जाँच 1 घंटा की बाकी की अवधि के बाद अनुमति देने के लिए पिल्ले अल्ट्रासोनिक vocalizations की थकाऊ उत्सर्जन के बाद ठीक करने के लिए। जानवरों का एक और पलटन का प्रयोग इस तरह Chadman एट अल। 20 और Scattoni एट अल। 21 में ही पूरा विकासात्मक परीक्षण बैटरी का आयोजन किया जाता है।
  3. अपने जीवन के पहले दो हफ्तों के दौरान ये रिकॉर्डिंग p2 और P12 के बीच हर दो दिन पिल्ला मुखर व्यवहार और विकास को चिह्नित करने को दोहराएँ।

3. एक ही लिंग के सामाजिक बातचीत के दौरान अल्ट्रासोनिक vocalizations

  1. वोकलिज़ेशन रिकॉर्डिंग
    1. एक परीक्षण पिंजरे तैयार (50 x 25 सेमी x 30 गएम 3; Plexiglas, 100 लक्स [कम तीव्रता सफेद रोशनी]), साबुन पानी से साफ सूखे और ध्वनिरहित कक्ष में 2 सेमी ताजा बिस्तर के साथ भर दिया।
      1. माइक्रोफोन इतना है कि पिंजरे के सभी कोनों से उत्सर्जित vocalizations दर्ज किया जा सकता रखें। परीक्षण पिंजरे के एक कोने में माइक्रोफोन (या तो एक तिपाई पिंजरे पर या पर) फिक्स और पिंजरे की पूरी सतह को कवर करने के कोण माइक्रोफोन पिंजरे नीचे समायोजित करें।
        नोट: अल्ट्रासाउंड बहुत दिशात्मक हैं।
      2. ध्वनिरहित चैम्बर के शीर्ष पर एक वीडियो कैमरा की जगह परीक्षा पिंजरे की पूरी सतह पर कब्जा करने के लिए।
        नोट: जाँच करें कि माइक्रोफोन वीडियो पर परीक्षण पिंजरे के एक कोने में छुपा नहीं है।
      3. परीक्षण से पहले, एक स्पेयर नर और मादा एक स्पेयर कि प्रयोग में बाद में उपयोग नहीं किया जाएगा साथ soundcard के लाभ को समायोजित। रिकॉर्डिंग कक्ष में परीक्षण के पिंजरे में इन जानवरों रखो। दर्ज की गई स्वरों के उच्चारण के आयाम को अधिकतम करने के लिए साउंड कार्ड पर लाभ के स्तर को समायोजित बूटी अधिक भार रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर पर लाइव spectrogram प्रदर्शन के रूप में देखा कम से कम।
        नोट: लाभ माइक्रोफोन और vocalizing जानवरों के बीच की दूरी पर निर्भर करता है।
    2. पशु परिचय का परीक्षण करने के लिए किया जा (पुरुष या महिला, यह "निवासी" कहा जाएगा) ताजा बिस्तर पर परीक्षण पिंजरे में। यह 20 मिनट के लिए ध्वनिरहित कक्ष में परीक्षण पिंजरे के लिए अभ्यस्त अज्ञात सजातीय 3.1.3 में पेश करने के लिए अपनी ब्याज अधिकतम करने के लिए छोड़ दें।
    3. इस आदी होना समय के बाद, बातचीत के लिए 2 एन डी पशु परिचय (पुरुष या महिला, निवासी के रूप में एक ही लिंग, लेकिन विभिन्न कान के निशान / पंजा टैटू बाद में उन्हें पहचान करने के लिए, यह "नए आनेवाला" कहा जाएगा)।
      1. अल्ट्रासोनिक vocalizations रिकॉर्डिंग और वीडियो (16-बिट प्रारूप, 300 किलोहर्ट्ज़ नमूने आवृत्ति एक उच्च गुणवत्ता के साथ 150 kHz करने के लिए ध्वनि आयाम पर कब्जा करने के लिए) की परीक्षा पिंजरे में नया आनेवाला की शुरूआत पर कब्जा करने के लिए शुरू करो। यू रिकॉर्डिंग शुरूआदी होना (अकेले निवासी) यदि पिंजरे अन्वेषण और सामाजिक बातचीत के दौरान वोकलिज़ेशन उत्सर्जन के आधारभूत स्तर के बीच तुलना की जरूरत है के दौरान ltrasonic vocalizations।
      2. समय घड़ी पर दबाव वास्तव में जब नया आनेवाला माउस के हिंद पंजे जमीन को छूने ( "बीप" माइक्रोफोन के पास ध्वनि) द्वारा मैन्युअल / नेत्रहीन ऑडियो और वीडियो रिकॉर्डिंग सिंक्रनाइज़ करें।
      3. दो जानवरों (उदाहरण के 4 मिनट, एक अवधि के लिए पर्याप्त अल्ट्रासोनिक vocalizations इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त के लिए) वांछित समय के लिए बातचीत छोड़ दें।
    4. ठेकेदार और नए आनेवाला उनके संबंधित घर पिंजरों में वापस डाल दिया। परीक्षण पिंजरे से इस्तेमाल किया बिस्तर खाली, साबुन पानी से धो लें और कागज तौलिये के साथ सूखी। ताजा बिस्तर रखो और अगले टेस्ट के लिए ध्वनिरहित कक्ष में इसे वापस जगह है।

4. पुरुष स्वरों के उच्चारण के साथ एक मद महिला बातचीत के दौरान

  1. सुबह जल्दी परीक्षण के दिनपुरुषों, मद चक्र के भीतर उनके यौन स्थिति का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक महिला से योनि स्मीयरों ले।
    1. पूंछ से महिला पकड़ो और पिंजरे ग्रिड पर उसे बनाए रखें। (यानी, इंजेक्षन और एक ही 20 μl पीबीएस कई बार स्मरण) 20 μl पीबीएस के साथ योनि में कई बार कुल्ला करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें। एक ही विंदुक टिप के साथ 20 μl पीबीएस याद। बाँझ पीबीएस का प्रयोग करें, किसी भी संक्रमण से बचने के लिए यदि महिलाओं कई लगातार दिनों के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं।
    2. पीबीएस एक स्लाइड पर योनि की कोशिकाओं के निलंबन युक्त बिखरा हुआ है। एक स्लाइड (एक पेंसिल के साथ स्लाइड के पक्ष में व्यक्तियों की पहचान) पर चार नमूने रखो। स्लाइड धुंधला आयोजित करने से पहले सूखे हैं।
    3. प्रयोगशाला धूआं हुड के तहत काम करते हैं।
      1. शुद्ध मई-Grunwald के एक स्नान, फॉस्फेट बफर समाधान (0.1 एम) और Giemsa आर के एक स्नान (1/20 फॉस्फेट बफर समाधान में) में से एक स्नान तैयार करें।
      2. 3 मिनट के लिए शुद्ध मई-Grunwald के स्नान में स्लाइड्स रखो, तोउन्हें 1 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर समाधान के स्नान में कुल्ला और अंत में (फॉस्फेट बफर समाधान में 1/20) Giemsa आर के स्नान में 10 मिनट के लिए उन्हें स्थानांतरित।
      3. उसके बाद, 10 सेकंड के लिए फॉस्फेट बफर समाधान के स्नान में फिर स्लाइड कुल्ला और उन्हें सूखी।
    4. खुर्दबीन के नीचे दाग स्लाइड जांच करते हैं। महिलाओं है कि दिन के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता उन जिनके नमूने वर्तमान केवल बड़े श्रृंगित उपकला कोशिकाओं (नाभिक के बिना, नीले रंग में दाग, पूर्ण मद) कर रहे हैं।
  2. उन्हें परीक्षण से पहले मिनट परीक्षा कक्ष में कम से कम 30 पुरुषों रखो।
  3. वोकलिज़ेशन रिकॉर्डिंग
    1. 3.1 दोहराएँ यदि आवश्यक है।
    2. परीक्षण किया जा के लिए पुरुष (ताजा बिस्तर पर) का परिचय। छोड़ दो उसे 10 मिनट के लिए ध्वनिरहित कक्ष में परीक्षण पिंजरे के लिए अभ्यस्त।
    3. इस आदी होना समय के बाद, (धुंधला से चयनित लोगों के बीच) मद में एक महिला का परिचय।
      1. अल्ट्रासोनिक vocalizations और वीडियो रिकॉर्डिंग शुरूपरीक्षण पिंजरे में महिला की शुरूआत पर कब्जा। आदी होना (पुरुष अकेले) यदि पिंजरे अन्वेषण और सामाजिक बातचीत के दौरान वोकलिज़ेशन उत्सर्जन के आधारभूत स्तर के बीच तुलना की जरूरत है के दौरान अल्ट्रासोनिक vocalizations रिकॉर्डिंग शुरू।
      2. समय घड़ी पर दबाव वास्तव में जब महिला माउस की हिंद पंजे जमीन को छूने ( "बीप" माइक्रोफोन के पास ध्वनि) द्वारा मैन्युअल / नेत्रहीन ऑडियो और वीडियो रिकॉर्डिंग सिंक्रनाइज़ करें।
      3. दो जानवरों (उदाहरण के 4 मिनट, एक अवधि के लिए पर्याप्त अल्ट्रासोनिक vocalizations इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त के लिए) वांछित समय के लिए बातचीत छोड़ दें।
    4. उनके संबंधित घर पिंजरों में पुरुष और महिला वापस रखो। परीक्षण पिंजरे से इस्तेमाल किया बिस्तर खाली, साबुन पानी से धो लें और कागज तौलिये के साथ सूखी। ताजा बिस्तर रखो और अगले टेस्ट के लिए ध्वनिरहित कक्ष में इसे वापस जगह है।
      नोट: यह प्रत्येक मद महिला प्रत्येक दिन केवल एक समय का उपयोग करने के लिए इष्टतम है (लेकिन यदि आवश्यक हो तो यह कर सकते हैंएक ही दिन में, लेकिन एक पंक्ति में नहीं) 3 गुना तक इस्तेमाल किया जाएगा।

5. चर निकाले जाने की

  1. विश्लेषण के लिए ऑडियो फाइलों को तैयार करें। नोट: नीचे प्रक्रिया एक visoft SASLab प्रो के लिए विशिष्ट है और इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के अनुसार बदल सकते हैं।
    1. फ़ाइलों कट इतना है कि वे समय घड़ी की "बीप" पर बिल्कुल शुरू, और वांछित अवधि (पिल्ला रिकॉर्डिंग के लिए 5 मिनट, वयस्क रिकॉर्डिंग के लिए 4 मिनट) के बाद खत्म होता है।
    2. (; 30 kHz आवृत्ति के साथ उच्च पास काट संपादित करें> फ़िल्टर> प्राथमिकी टाइम डोमेन फ़िल्टर) एक उच्च पास फिल्टर का उपयोग करके 30 किलोहर्ट्ज़ के तहत आयाम फिल्टर। ब्याज (प्रक्रिया> बैच प्रोसेसिंग> एफआईआर फिल्टर) के सभी फाइलों को फिल्टर करने के लिए बैच संसाधन का प्रयोग करें।
    3. उन्हें सॉफ्टवेयर के साथ लेबल करके प्रत्येक अल्ट्रासोनिक वोकलिज़ेशन को पहचानें।
      1. पिल्ला रिकॉर्डिंग के लिए स्वत: पता लगाने का उपयोग करें (उपकरण> लेबल> तरंग घटनाओं से खंड लेबल बनाएँ)। , सीमा समायोजित समय और मार्जिन च पकड़या सबसे सटीक पता लगाने। मैन्युअल का पता लगाने की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो (अनुशंसित) लेबल समायोजित करें।
      2. पृष्ठभूमि शोर के साथ वयस्क रिकॉर्डिंग के लिए दृश्य का पता लगाने (लेबल के मैनुअल प्रविष्टि) का उपयोग करें (स्वरों के उच्चारण का चयन करें, ठीक क्लिक करें, और मार्कर से खंड लेबल डालें)।
    4. spectrogram बनाएँ। स्वत: पैरामीटर माप (उपकरण> स्वचालित पैरामीटर माप> स्वचालित पैरामीटर माप सेट अप) को सक्रिय करें।
    5. "सक्षम स्वत: माप", "पूरे spectrogram से कंप्यूट पैरामीटर", और "स्वत: अद्यतन" बॉक्स चेक करें। interactively (धारा लेबल): "तत्व जुदाई" का चयन करें।
    6. बक्से की जाँच वांछित अस्थायी मापदंडों और स्पेक्ट्रम आधारित मानकों (पीक आवृत्ति) (तत्व, अंतराल, शुरू / अंत समय की अवधि), और माप का स्थान (तत्व का प्रारंभ, तत्व का अंत, मतलब, मैक्स, मिन) की गणना करने के लिए ।
    7. माप कॉपी और पेस्टएक स्प्रेडशीट में हूँ।
      नोट: वयस्कों के साथ आयोजित रिकॉर्डिंग के लिए, स्पेक्ट्रम-आधारित मानकों के मापन पृष्ठभूमि शोर की वजह से असंभव हो सकता है। spectrogram पर सीधे अलग आवृत्ति मूल्यों पर क्लिक करके और एक तालिका में मैन्युअल मूल्यों चिपकाने से शिखर आवृत्ति के मैनुअल माप का प्रयोग करें।
  2. पहले उत्सर्जित स्वरों के उच्चारण की संख्या (लेबल की कुल संख्या) के निर्धारण से कॉल दर, यानी, प्रति मिनट कॉल की संख्या निर्धारित करते हैं। फिर, फाइल की अवधि (मिनट में) द्वारा दर्ज स्वरों के उच्चारण की कुल संख्या से विभाजित करके कॉल दर की गणना।
  3. अस्थायी संगठन, यानी, अनुक्रम संगठन का निर्धारण करने के लिए कॉल के बीच समय अंतराल के वितरण के निर्धारित करते हैं।
    1. वोकलिज़ेशन n के अंत और प्रत्येक लेबल के आरंभ / अंत समय का उपयोग वोकलिज़ेशन एन 1 की शुरुआत के बीच समय अंतराल की गणना।
    2. Ultrason के बीच समय अंतराल के वितरण के घनत्व की स्थापना करेंआईसी vocalizations।
  4. कॉल प्रदर्शनों की सूची का निर्धारण करते हैं, यानी, कॉल रिकॉर्डिंग प्रकार में मौजूद परिभाषित करते हैं। 1 टेबल और चित्रा 1 बी में प्रस्तुत वर्गीकरण के उदाहरण का प्रयोग करें।
    1. जब 5.1.3 में प्रत्येक वोकलिज़ेशन लेबलिंग, लेबल में कॉल प्रकार का नाम लिखें।
    2. सही संख्या और मुखर प्रदर्शनों की सूची का निर्माण करने के लिए प्रत्येक कॉल प्रकार के अनुपात की गणना।
  5. प्रत्येक वोकलिज़ेशन, यानी, अवधि, शिखर आवृत्ति के लिए ध्वनिक विशेषताओं का निर्धारण (यानी, उच्चतम आयाम के साथ आवृत्ति) शुरुआत में और कॉल, अधिकतम और न्यूनतम शिखर आवृत्ति के अंत में, और आवृत्ति मतलब है अगर स्वत: माप संभव है (चित्रा 1 बी)
    1. स्वचालित रूप से अवधि, शिखर आवृत्ति विशेषताओं को मापने के लिए सॉफ्टवेयर में स्वत: पैरामीटर माप समारोह का प्रयोग करें पिल्ला रिकॉर्डिंग में (जैसे, शुरू, अंत, मतलब, अधिकतम, न्यूनतम)। वयस्क रिकॉर्डिंग के लिए स्वरों की अवधि के रूप में लेबल की अवधि का प्रयोग करें। Spectrogram खिड़की शिखर आवृत्ति विशेषताओं (जैसे, शुरू, अंत में, अधिकतम, न्यूनतम) पर मैन्युअल उपाय।
  6. युगल अल्ट्रासोनिक वोकलिज़ेशन डेटा और सामाजिक संपर्क डेटा (बर्फीले मंच 22 से MiceProfiler प्लगइन)।
    1. ऑडियो और वीडियो रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संभव के रूप में के रूप में ठीक सिंक्रनाइज़ करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. । De Chaumont एट अल 22 में वर्णित के रूप में बर्फीले मंच के चूहे प्रोफाइलर ट्रैकर प्लगइन का उपयोग सामाजिक बातचीत के वीडियो सांकेतिक शब्दों में बदलना। ट्रैकिंग शुरू वास्तव में जब पेश किया जानवर की हिंद पंजे जमीन को छूने।
    3. De Chaumont एट में वर्णित के रूप में इनकोडिंग वीडियो फ़ाइल और अपनी इसी एक्सएमएल फ़ाइल बर्फीले मंच के चूहे प्रोफाइलर वीडियो लेबल निर्माता प्लगइन में (चूहे प्रोफाइलर ट्रैकर द्वारा उत्पन्न) शब्दअल। 22।
      नोट: चूहे प्रोफाइलर वीडियो लेबल निर्माता प्लगइन स्वचालित रूप से वीडियो फ़ाइल और ऑडियो फाइल के विश्लेषण से उत्पन्न करता है, तो वे एक ही नाम पाठ फ़ाइल कड़ी होगी (देखें: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) ।
    4. जाँच है कि माउस पैमाने सही है के बाद, पर नंबर और एक अलग फ़ाइल में प्रत्येक सामाजिक समारोह के दौरान उत्सर्जित स्वरों के उच्चारण के अनुपात में प्राप्त करने के लिए प्रत्येक फ़ाइल के लिए "बनाएँ USV आँकड़े" पर क्लिक करें।

6. mouseTube डाटाबेस पर अपलोड फ़ाइलें

  1. सुनिश्चित करें कि फ़ाइलें जो संस्था बाहर से पहुँचा जा सकता है एक भंडारण सर्वर पर कर रहे हैं।
    नोट: उच्च सुरक्षा के स्तर के साथ कुछ संस्थानों में मेजबानी सर्वर एक विशिष्ट विन्यास की आवश्यकता होगी संस्था बाहर से लोगों को जोड़ने के द्वारा सुलभ हो।
  2. MouseTube वेबसाइट (http://mousetube.pasteur.fr) के पास जाओ। लॉग-इन (लॉगिन एकएन डी पासवर्ड प्रशासकों द्वारा प्रत्येक उपयोगकर्ता के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है)।
  3. जाँच करें कि क्या माउस तनाव पहले से ही दर्ज "खींच" बटन पर क्लिक करके mouseTube डेटाबेस में मौजूद है। यदि नहीं, तो इसे बनाने के लिए प्रशासकों से पूछो।
  4. का उपयोग करते हुए विषयों बनाएं "विषयों> बनाएँ" बटन। दर्ज की गई जानवरों की पहचान कोड दर्ज करें। उन्हें समूहों में इकट्ठा डेटा की बाद में पुनः प्राप्ति कम करने के लिए।
  5. "> प्रोटोकॉल बनाएँ" का उपयोग कर अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण रिकॉर्ड बटन के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का विवरण दर्ज करें।
  6. प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र प्रयोग करने के लिए एक प्रयोग बनाएँ "प्रयोगों> बनाएँ" बटन। प्रोटोकॉल, व्यक्तियों का समूह है जो दर्ज किया गया है, हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया और उनकी विशिष्टताओं को निर्दिष्ट करें।
    नोट: प्रयोग बटोरता सभी मेटाडाटा वोकलिज़ेशन फाइल करने के लिए इसी।
  7. "स्वरोच्चारण का उपयोग कर वोकलिज़ेशन फाइल करने के लिए लिंक बनाएँ> बनाएं & #34; बटन। सूची के भीतर प्रयोग का चयन करें। कॉपी और वोकलिज़ेशन फ़ाइल का URL पेस्ट (इस लिंक http: // से शुरू ...) के इसी क्षेत्र में "फ़ाइलों को लिंक करने के लिए" कॉलम। बटन पर क्लिक करके प्रविष्टियों मान्य "mouseTube और फ़ाइलों के बीच एक कड़ी बनाएँ"।
    नोट: यह एक ही समय में प्रत्येक फ़ाइल के लिए प्रत्येक बॉक्स को भरने के लिए आवश्यक नहीं है।
  8. यदि आवश्यक हो, किसी भी क्षण में प्रवेश किया लिंक संशोधित करने, और "नोट" खंड में विवरण जोड़ें। नीचे नोट लिखने के लिए और अधिक जानकारी देने के लिए संकोच न करें। उदाहरण के लिए, अगर एक वीडियो फ़ाइल है कि ऑडियो फाइल के साथ एक साथ दर्ज किया गया था ओर एक लिंक दर्ज किया गया है, इस 'नोट्स' में निर्दिष्ट किया जा सकता है।

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, हम ProSAP1 / Shank2, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार (एएसडी) 23-25 ​​के साथ जुड़े एक जीन की कमी चूहों के व्यवहार मुखर होती है। एएसडी सामाजिक संचार में घाटे और टकसाली व्यवहार 1 की विशेषता है। हमारे Shank2 - / - चूहों सक्रियता, चिंता बढ़ गई है और असामान्य मुखर संचार 18,26 प्रदर्शन किया। दरअसल, हम ने कहा कि Shank2 - / - चूहों उनकी जंगली प्रकार littermates में ठेठ उल्टे यू के आकार की अवस्था के साथ तुलना में पिल्ला अलगाव कॉल के अपने उत्सर्जन की दर में एक असामान्य विकास प्रोफ़ाइल प्रदर्शित किया Shank2 -। / - चूहों एक वृद्धि की कॉल दर प्रदर्शित किया पी 4 पर और उनके जंगली प्रकार littermates (चित्रा 2) के साथ तुलना में पी 6 पर कॉल दर में कमी आई। / - - Compariso में महिला हम भी एक Shank2 शामिल महिला बातचीत में एक कम कॉल दर मनायाn एक जंगली प्रकार littermate (चित्रा 2) को शामिल बातचीत के साथ। हम 5 अलग अलग श्रेणियों के कॉल के प्रदर्शनों की सूची की जांच की। यह और वयस्कों (चित्रा 3) (उदाहरण के यहाँ p2, पी 6 और P10 के लिए) पिल्ले के बीच अलग हो दिखाई दिया। जीनोटाइप से संबंधित मतभेदों ज्यादातर वयस्कता में महत्वपूर्ण थे। / - - वयस्क Shank2 से जुड़े सामाजिक बातचीत के दौरान एक C57BL / 6N महिला के साथ पुरुषों या महिलाओं, अधिक कम कॉल और असंरचित कहते हैं, उनके जंगली प्रकार littermates (चित्रा 3 डी और ई) को शामिल बातचीत के साथ तुलना में दर्ज किए गए। कम जटिल कॉल और आवृत्ति कूदता कॉल भी एक C57BL / 6N वयस्क Shank2 शामिल महिला के साथ बातचीत के दौरान दर्ज किए गए - Shank2 + + / महिलाओं (चित्रा 3E) को शामिल बातचीत के साथ तुलना में महिलाओं - /। अंत में, हम भी मैन्युअल ध्वनिक चर मापा। कोई महत्वपूर्ण जीनोटाइप संबंधी अंतर डु थारिंग विकास। इसके विपरीत, वयस्क Shank2 को शामिल बातचीत के दौरान दर्ज की गई कॉल की अवधि - / - महिलाओं को उनके जंगली प्रकार littermates (चित्रा 4 ए) को शामिल बातचीत के दौरान दर्ज की गई है उन लोगों की तुलना में कम थे। हम यह भी प्रकाश डाला है कि अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के शिखर आवृत्ति के बिना महत्वपूर्ण जीनोटाइप संबंधी अंतर 26 पिल्ला विकास के दौरान वृद्धि हुई है। Shank2 को शामिल बातचीत के दौरान - / - पुरुषों या एक C57BL / 6N महिला के साथ महिलाओं, अल्ट्रासोनिक vocalizations एक कम चोटी आवृत्ति उनकी जंगली प्रकार littermates (चित्रा 4 बी) को शामिल बातचीत के दौरान दर्ज की कॉल के साथ तुलना में था।

इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल भी MiceProfiler (बर्फीले सॉफ्टवेयर, संस्थान अतीत से निकाले व्यवहार डेटा के लिए ऑडियो रिकॉर्डिंग से डेटा के संयोजन से अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के उत्सर्जन के संदर्भ में अध्ययन करने के लिए अनुमति दीयूरो, पेरिस)। उदाहरण के लिए, महिला-महिला बातचीत में, सबसे अल्ट्रासोनिक vocalizations उत्सर्जित थे जब जानवरों के संपर्क और अधिक विशेष निवासी नई आनेवाला के Ano-जननांग क्षेत्र सूँघने में थे, या कम से कम निवासी नई आनेवाला पीछे जा रहा है। चूहे भी कई अल्ट्रासोनिक vocalizations उत्सर्जित जब निवासी नई आनेवाला (चित्रा 5, ऊपरी पैनल) से संपर्क किया। कम vocalizations दर्ज किया गया जब निवासी Shank2 - / - चूहों नए आगंतुक के साथ शारीरिक संपर्क में थे (जैसे, नई आनेवाला की Ano-जननांग क्षेत्र सूँघने) की तुलना में जब निवासी एक जंगली प्रकार माउस था। कम vocalizations शुरू हो रहा है जब नई आनेवाला पीछे निवासी एक Shank2 था रहे थे - / - जब यह एक जंगली प्रकार माउस था की तुलना में माउस। जब नए आनेवाला निवासी माउस के दृश्य क्षेत्र में अधिक था vocalizations भी दर्ज किया गया है, और तो और अधिक (चित्रा 5, कम पैनल) म्यूटेंट की तुलना में जंगली प्रकार में।

एस = "jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "1"> चित्र 2
चित्रा 2:। विकास के दौरान और वयस्क पुरुष और महिला Shank2 में अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के उत्सर्जन की दर - / - चूहों और जंगली प्रकार littermates कॉल पिल्ले की दर (हर दो दिन p2 से P12 के लिए, एन = 18-19 Shank2 + / +, एन = 15-16 Shank2 - / -) और पुरुष-महिला मद बातचीत के दौरान वयस्कों (एन = 15 Shank2 + + / n = 16 Shank2 - / -) और महिला-महिला बातचीत (एन = 15 Shank2 + / +, एन = 13 Shank2 - / -) जंगली प्रकार चूहों (बाएं पैनल) और Shank2 में - / - चूहों (सही पैनल)। डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब +/- SEM और अलग-अलग अंक (गैर बनती Wilcoxon परीक्षण करती है: * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001)।ge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Shank2 के मुखर प्रदर्शनों की सूची - / - चूहों और जंगली प्रकार littermates पाँच अलग अलग प्रकार के कॉल p2 के पिल्ले द्वारा उत्सर्जित के अनुपात में (ए, एन = 20 Shank2 + + / n = 18 Shank2 - / -), पी 6 पिल्ले (बी, एन = 19 Shank2 + + / n = 18 Shank2 - / -), P10 पिल्ले (सी, एन = 20 Shank2 + + / n = 18 Shank2 - / -), एक मद महिला के साथ वयस्क पुरुषों (डी ; n = 16 Shank2 + + / n = 16 Shank2 - / - एक और महिला (ई) के साथ और वयस्क महिलाओं, एन = 15 Shank2 + + / n = 13 Shank2 - / -) जंगली प्रकार चूहों (बाएं पैनल) और Shank2 में - / - चूहों (सही पैनल)। डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब +/- SEM और अलग-अलग अंक (ची चुकता परीक्षण: * पी ​​<0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। ध्वनिक चर Shank2 में अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण से निकाला - / - चूहों और जंगली प्रकार littermates (ए) सभी कॉल प्रकार की अवधि के p2 पिल्ले द्वारा उत्सर्जित मुंह काला (एन = 20 Shank2 + + / n = 18 Shank2 - / - ), पी 6 पिल्ले (एन = 19 Shank2 + + / n = 18 Shank2 - / -), P10 पिल्ले (एन = 20 Shank2 + + / Shank2 - / -), एक मद महिला के साथ वयस्क पुरुषों (एन = 16 Shank2 + + / n = 16 Shank2 - / - एक और महिला के साथ) और वयस्क महिलाओं (एन = 15 Shank2 + / +, एन = 13 Shank2 - / -) जंगली प्रकार चूहों में (बाएं पैनल) और Shank2 - / - चूहों (सही पैनल)। (बी) अधिकतम चोटी आवृत्ति सभी कॉल प्रकार पर मापा एक मद महिला और वयस्क मादा एक और महिला (ऊपर के रूप में ही एन एस) के साथ के साथ p2 पिल्ले, पी 6 पिल्ले, P10 पिल्ले, वयस्क पुरुषों में मुंह काला। डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब +/- SEM और अलग-अलग अंक (गैर बनती Wilcoxon परीक्षण करती है: * पी ​​<0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: प्रसंग। से जुड़े जोड़े द्वारा उत्सर्जित अल्ट्रासोनिक vocalizations की महिला-महिला वयस्क सामाजिक संबंधों में माउस अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के उत्सर्जन के एस अनुपात एक Shank2 + + / एक C57BL / 6N माउस (एन = 16, ए) और एक Shank2 शामिल जोड़े के साथ - / - साथ एक C57BL / 6N माउस (एन = 13, बी) के व्यवहार की घटनाओं के निम्नलिखित प्रकार के दौरान (लाल: निवासी, ग्रीन: नए आनेवाला): सामाजिक संपर्क, ओरो-मौखिक संपर्क, निवासी माउस से Ano-जननांग सूँघने, ano- जननांग नई आनेवाला माउस से सूँघने, नए आनेवाला, निवासी पीछे नई आनेवाला, निवासी की गतिहीनता, नए आनेवाला की गतिहीनता, दृष्टिकोण निवासी और से पीछे निवासी नई आनेवाला से, नए आनेवाला से बचने के दृष्टिकोण और ठेकेदार, दृष्टिकोण से बचने व ठेकेदार, दृष्टिकोण से बचने और नए आनेवाला से बचने, निवासी नई आनेवाला, निवासी, निवासी की दृष्टि क्षेत्र में नए आनेवाला की दृष्टि क्षेत्र में नए आनेवाला निम्नलिखित। डेटा पी रहे हैंविरोध के रूप में मतलब +/- SEM और अलग-अलग अंक (गैर बनती Wilcoxon परीक्षण: * पी <0.05, ** पी <0.01)। अप्रकाशित डेटा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कॉल प्रकार विवरण
कम अवधि ≤5 मिसे और आवृत्ति रेंज ≤6.25 किलोहर्ट्ज़
सरल अवधि> 5 मिसे और आवृत्ति रेंज ≤6.25 किलोहर्ट्ज़ (फ्लैट), या आवृत्ति रेंज> 6.25 किलोहर्ट्ज़ के साथ केवल एक ही दिशा (ऊपर या नीचे) में आवृत्ति मॉडुलन
जटिल एक से अधिक की दिशा और आवृत्ति रेंज> 6.25 किलोहर्ट्ज़ में आवृत्ति modulations (संग्राहक), या एक या एक से अधिक अतिरिक्त आवृत्ति ग का समावेशomponent (हार्मोनिक या गैर रेखीय घटना है, लेकिन कोई संतृप्ति), लेकिन आवृत्ति रेंज पर कोई बाधा (जटिल)
आवृत्ति कूदता लगातार आवृत्ति घटकों के साथ के बीच समय अंतराल के बिना एक कूद (एक आवृत्ति कूद) या आवृत्ति में अधिक कूदता (आवृत्ति कूदता है, अन्य) का समावेश (मिश्रित) या शुद्ध स्वर कॉल के भीतर किसी भी शोर हिस्सा बिना
असंरचित कोई शुद्ध स्वर घटक पहचान योग्य; "शोर" कॉल

तालिका 1:। माउस अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के पांच प्रकार के लक्षण माउस अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के भीतर 5 अलग कॉल प्रकार का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल की अवधि, आवृत्ति रेंज, आवृत्ति modulations और आवृत्ति कूदता के मापदंड के उदाहरण हैं।

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगशाला में माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations इकट्ठा करने के लिए मानकीकृत और विश्वसनीय तरीके सुझाता है। ये बहुत ही विवश स्थितियों मानकीकरण का लाभ प्रस्तुत करते हैं। वे उपभेदों 18,19,26,27 भीतर उपभेदों या जीनोटाइप तुलना करने के लिए सफलता के साथ इस्तेमाल कर रहे हैं। जैसा प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत किया है, इन तरीकों Shank2, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों के साथ जुड़े एक जीन के लिए उत्परिवर्तित चूहों में असामान्य सामाजिक संचार की पहचान की अनुमति। माउस उपभेदों, प्रयोगशालाओं अलग संदर्भों के बीच या यहां तक कि बीच बीच तुलना mouseTube डेटाबेस पर बड़े डेटासेट की उपलब्धता से शुरू हो जाएगा। यह उपकरण बहुभिन्नरूपी विश्लेषण की अनुमति देकर माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations पर अध्ययन को बढ़ावा देने चाहिए।

के रूप में यह मॉडलिंग आनुवंशिक सी अध्ययन के बहुमत में किया जाता है प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, एक तनाव के भीतर अलग जीनोटाइप के चूहों का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैंneuropsychiatric विकारों को ontribution। यह प्रयोगात्मक प्रत्येक अध्ययन डिजाइन करने के लिए सबसे अच्छा संभव नियंत्रण करने के लिए सिफारिश की है। दरअसल, कूड़े प्रभाव नकाब या कृत्रिम रूप से आनुवंशिक प्रभाव 28,29 बढ़ सकता है। यह इसलिए प्रत्येक जीनोटाइप के लिए littermate नियंत्रण शामिल करने की सलाह दी जाती है। प्रजनन विषमयुग्मजी माता-पिता इसलिए, इष्ट किया जाना चाहिए, क्योंकि यह एक कूड़े के भीतर उत्परिवर्ती और नियंत्रण चूहों का सही मिलान की अनुमति देगा। यह पंजा टैटू सभी पिल्ले के अंकन (जीनोटाइप को अंधा) रिकॉर्डिंग के दौरान हर दो दिन व्यक्तियों को ट्रैक करने के लिए सही ठहराते हैं। जीनोटाइपिंग प्रातः पर किया जाता है, पूंछ के नमूने लेने के द्वारा। जब पिल्ला पर अलगाव कॉल की रिकॉर्डिंग p2 से, हम पिल्ले में पहले से ही पूंछ के नमूने लेने के बाद से इस आपरेशन अनुपूरक हेरफेर और तनाव एक रिकॉर्डिंग सत्र के लिए समय में बहुत करीबी शामिल सिफारिश नहीं होगा।

प्रोटोकॉल यहाँ का सुझाव दिया वयस्कों में अल्ट्रासोनिक vocalizations बटोर ईएमआई की स्पष्ट पहचान की अनुमति नहीं हैस्वरों के उच्चारण के tter। यह बताते हैं कि क्यों हम परीक्षण जानवर की प्रेरणा हेरफेर। दरअसल, परीक्षण चूहों अलग कर रहे हैं और न नया आनेवाला और परीक्षण जानवरों ही सेक्स बातचीत के दौरान परीक्षण पिंजरे में एक लंबे समय के लिए अभ्यस्त। पुरुष-महिला बातचीत में पेश किया महिला से अलग-थलग नहीं है और परीक्षण पुरुष कम समय प्रेरणा इस यौन संदर्भ में अधिक हो सकता है, क्योंकि लिए habituates। प्रेरणा के इन जोड़तोड़ परीक्षण माउस स्वरों के उच्चारण और नहीं शुरू की गई एक उत्सर्जन की संभावना को अधिकतम करना चाहिए। एक यौन संदर्भ में पुरुष अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण रिकॉर्ड करने के लिए, ताजा (यानी, जमे हुए नहीं) एक मद महिला के मूत्र के साथ एक सरल कपास झाड़ू भी पिंजरे 30 में पेश किया जा सकता है। इस विधि 100% निश्चितता के साथ परीक्षण के पुरुष के लिए अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के काम की अनुमति देता है, लेकिन यह इन स्वरों के उच्चारण के उत्सर्जन की वास्तविक सामाजिक संदर्भ के बारे में कोई विशेष जानकारी इकट्ठा करने से रोकता है। इसलिए, हम protoco के पक्ष मेंएल यहाँ वर्णित (एक स्वतंत्र रूप से चलती मद महिला के साथ)। हम भी जब एक उत्परिवर्ती तनाव से चूहों का परीक्षण हमेशा ही तनाव से शुरू चूहों का उपयोग करने के लिए और vocalizing चूहों की एक जोड़ी के रूप में डेटा का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं। एक ताजा अध्ययन में triangulation का उपयोग emitter 31 स्थानीयकरण करने के लिए बढ़ावा देता है। इस अध्ययन में, महिलाओं को भी एक पुरुष के साथ मुठभेड़ों के दौरान अल्ट्रासोनिक vocalizations फेंकना करने के लिए पाए गए। यह सच है कि वे रिकॉर्डिंग सत्र से पहले कम से कम दो सप्ताह के लिए अलग थे द्वारा समझाया जा सकता है। triangulation इस अध्ययन में प्रस्तावित के उपयोग के सामान्यीकरण फिर भी ज्यादातर मामलों में स्वरों के उच्चारण के emitter की पहचान की अनुमति चाहिए अगर वीडियो रिकॉर्डिंग ठीक से सिंक हो जाती हैं।

विकास के दौरान दर्ज की गई पिल्ले से अलगाव कॉल बिस्तर से पृष्ठभूमि शोर से परेशान नहीं हैं। आमतौर पर एक स्वचालित विश्लेषण बहुत अच्छी तरह से काम करता है मुख्य चर निकालने के लिए। इसके विपरीत, वयस्कों से दर्ज vocalizations घबिस्तर में चलती जानवरों से पृष्ठभूमि शोर से isturbed। स्वचालित विश्लेषण असफल हो सकता है, और इसलिए मैनुअल विश्लेषण किया जाना चाहिए। फिर भी, परीक्षण पिंजरे में बिस्तर जोड़ने की स्थिति है कि नंगे मिट्टी से जानवरों के लिए कम तनावपूर्ण (कि चूहों की तरह नहीं है) कर रहे हैं प्रदान करना चाहिए। समुदाय में इसके अतिरिक्त प्रयास, यहां तक ​​कि उन जिसका अर्थ पृष्ठभूमि शोर विभिन्न शर्तों के तहत अल्ट्रासोनिक vocalizations का स्वत: पता लगाने में सुधार लाने पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, आवाज सॉफ्टवेयर vocalizations कि मैन्युअल पृष्ठभूमि शोर 32 की अनुपस्थिति के लिए चयनित किया गया था विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है। इस सॉफ्टवेयर में, ध्वनिक चर की निकासी स्वचालित है लेकिन प्रारंभिक मैनुअल चयन की जरूरत है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता चूहों के मुखर व्यवहार में बहुत महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, एक मद महिला की उपस्थिति में वयस्क पुरुषों की कॉल दर बहुत (चित्रा 1) वितरित किया जाता है। हम सुइन मानकीकृत प्रोटोकॉल GGEST प्रयोगात्मक संदर्भ से संबंधित परिवर्तनशीलता को सीमित करने का पहले से ही अल्ट्रासोनिक vocalizations प्रकाश में लाना। फिर भी, हम छोटे आकार 33 के नमूनों में अलग-अलग अंक डेटा के लिए न केवल मतलब और SEM पेश करने के महत्व को बाहर बात करना चाहते हैं, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात। यदि आवश्यक हो तो नहीं - - यह भी बहुत प्रासंगिक है प्रतिनिधि डेटा इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक समूह / जीनोटाइप के कम से कम 12 व्यक्तियों रिकॉर्ड करने के लिए। कई मामलों में, अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता (आमतौर पर यह नहीं हो सकता है) छिपा हुआ नहीं होना चाहिए, और यह व्यक्तियों आनुवंशिक उत्परिवर्तन का अध्ययन ले जा रहा है, लेकिन किसी भी असामान्य लक्षण प्रारूप प्रदर्शित नहीं की पहचान करने के लिए उच्च महत्व का हो सकता है। ऐसे व्यक्तियों को मुआवजा, जो आनुवांशिक विकारों के उपचार के लिए नए रास्ते खोल सकती है के बारे में सुराग दे सकती है।

neuropsychiatric विकारों, मुखर व्यवहार और सामाजिक संपर्क के लिए माउस मॉडल की सबसे व्यवहार अभिलक्षण में विचार कर रहे हैंएड के अलावा (जैसे, 19,27,34,35)। हाल के विश्लेषण के तरीकों अब एक बातचीत (उदाहरण के लिए MiceProfiler उपयोग करते हुए) 36, साथ ही ऑडियो रिकॉर्डिंग से डेटा के साथ इस विश्लेषण गठबंधन की संभावना के दौरान सामाजिक घटनाओं और घटनाओं के दृश्यों की एक अर्द्ध स्वचालित विस्तृत लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं। इस विधि का मुख्य लाभ एएसडी के माउस मॉडल में सामाजिक संचार के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए, और अधिक ठीक पहचान करने के लिए जो सामाजिक संचार के पहलुओं को प्रभावित कर रहे हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में तुल्यकालन अभी भी मैनुअल है, लेकिन इस ऑडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से वीडियो रिकॉर्डिंग ट्रिगर द्वारा सुधार किया जा सकता है। विश्लेषण के इस प्रकार के neuropsychiatric विकारों के माउस मॉडल में सामाजिक संचार घाटे के एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए मानक बन जाना चाहिए। इसके अलावा, अब, मुखर संकेतों ज्यादातर emitter तरफ से विश्लेषण कर रहे हैं (यानी, परीक्षण vo के उत्सर्जन के पक्ष में करने के लिए निर्मित कर रहे हैंपरीक्षण किया माउस द्वारा कैलोरी का संकेत है, वर्तमान प्रोटोकॉल के रूप में)। ध्यान अब भी बेहतर इन ध्वनिक संकेतों के कार्यों की पहचान करने के लिए इन संकेतों के रिसीवर पर स्थापित किया जाना चाहिए। यह भी वयस्कों में मौजूद प्रोटोकॉल में नए आनेवाला चूहों के व्यवहार (उदाहरण के लिए MiceProfiler उपयोग करते हुए) 36 मूल्यांकन, प्लेबैक प्रयोगों 16 का उपयोग करके द्वारा किया जाना चाहिए, या नए प्रोटोकॉल की स्थापना करके। दरअसल, वर्तमान प्रोटोकॉल बहुत विवश स्थितियों है कि चूहों में वोकलिज़ेशन उत्सर्जन की सटीक ethological की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है प्रदान करते हैं। अल्ट्रासोनिक vocalizations की सहज उत्सर्जन लगातार ऑडियो और वीडियो रिकॉर्डिंग का उपयोग चूहों की सहज मुखर व्यवहार पर और अधिक प्रकाश डाला बेहतर होती जा करना होगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"] BD Microlance 304000 -
green tattoo paste Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada 329AA -
thermometer Fisherbrand, Waltham, USA 4126 (W255NA) -
self-made soundproof chamber (pups) Institut Pasteur, Paris - acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple Harvard Apparatus 599814 + 601956 -
smell-less pen for instance: Giotto - ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%) Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France 24103 diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #40011 furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #34163 sound card
Avisoft Recorder USGH Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10301; #10302 recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, 10111; #10102, 10112;  Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp - - running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings) Lock & Lock, Chatswood, USA HPL932D Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4) Gibco (Life Technologies) 10010-023 -
slides Menzel-Gläser, Thermo Scientific J1800AMNZ Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml RAL Réactifs, Martillac, France 320070-0500 -
Giemsa R 500 ml RAL Réactifs, Martillac, France 720-1107 diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made) - - pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage Institut Pasteur, Paris - 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings) Institut Pasteur, Paris - acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video camera From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands - high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps 
EthoVision XT Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker tracking software to analyse behavioral events during social interactions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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