Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Developmental Biology

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Summary

Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

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Jebeniani, I., Leschik, J., Puceat, M. Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (112), e53874, doi:10.3791/53874 (2016).

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Abstract

a transcrição do gene específico é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. O processo biológico é mediada por factores de transcrição que se ligam a regiões reguladoras genómicas incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvido em torno histonas que são sujeitas a modificações químicas. Modificações das histonas ainda levar a transcrição de genes reprimida, activado ou equilibrado, trazendo assim mais um nível de regulamentação sintonia fina da transcrição de genes. As células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ou seja, agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco. Eles fornecem material suficiente em princípio para imunoprecipitação da cromatina (ChIP), uma tecnologia amplamente utilizada para identificar regiões reguladoras de genes. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano de cardiogenesis. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitirinvestigando paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou chip-sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.

Introduction

O coração é o primeiro órgão a ser formada e para se tornar funcional no embrião. O coração é construído a partir de muitas linhagens de células que surgem a partir dos primeiro e segundo campos cardíaco embrionário 1. A partir do blastocisto pós-fertilização organizar-se para o coração em forma, as células embrionárias têm, assim que tomar muitas decisões destino celular. Gene transcrição é regulada de forma tempo e dependente do espaço e é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. Um tal processo é mediada por factores de transcrição específicos que se ligam a regiões reguladoras dentro do genoma incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvida em torno de histonas, que são sujeitos a modificações tais como acetilação, metilação, ubiquitinação, e / ou fosforilação. Histona modificação conduz a transcrição do gene reprimida, activado ou preparada dependendo de qual o resíduo de lisina de histona é modificado 2.

jove_content "> ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP), foi criado anos atrás 3 e é atualmente a tecnologia mais amplamente utilizada, a fim de identificar alvos, tanto de histonas modificadas ou fatores de transcrição 4. Após imunoprecipitação de histonas ou fatores de transcrição, o DNA ligado pode ser quer amplificado por reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou sequenciados. chip tem tecnicamente superar mais desafiantes ensaios de retardamento em gel 5. no entanto chip não implica a ligação directa de um factor de transcrição de ADN, uma vantagem do ensaio de retardamento em gel. por outro lado, Chip combinados para sequenciamento de DNA, abriu uma nova perspectiva de todo o genoma na regulação dos genes.

Células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ie., Agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco 6 e fornecer material suficiente em princípio para o chip. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano da cardiogenesis embora o seu potencial cardiogênico depende da sua assinatura epigenética 7. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitir investigar paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. No entanto, o genoma é transcrita em um tempo e modo específico de células do tipo 8. regulação epigenética da transcrição de genes tem que ser estudado dentro de regiões localizadas. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.

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Protocol

1. ADN-proteína de reticulação

  1. Fixam em 15 ml tubos de células-ES colhidas (2 x 10 6 células para Chip regulares, 2 x 10 5 células para Microchip), corpos embrióides (EBS) gerados a partir de células-tronco embrionárias e tecidos cardíacos embrionárias dissecados de embriões de rato E9.5 (atrioventricular canal, via de saída e ventrículo), utilizando 1% de formaldeído em PBS para as células ou em tampão PB2 permeabilização de tecidos embrionários. Colocar os tubos num agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm à temperatura ambiente durante exactamente 10 min.
  2. Parar a reacção de reticulação por adição de glicina para uma concentração final de 125 mM e incuba-se durante 5 min à temperatura ambiente no agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm.

2. Lise celular e fragmentação da cromatina

  1. Lavar duas vezes as células com ligações cruzadas ressuspensas em 10 ml de PBS 1x ou tecidos embrionários ressuspensas em 1 ml de PB2. Centrifugar a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </ Li>
  2. Adicionar inibidores da protease para tamponar PB1 ou PB2 (2 ug / mL de leupeptina, 1 ug / mL de aprotinina, e PMSF 0,1 mM) (Tabela 1). Ressuspender o sedimento celular ou de tecido embrionário a partir do passo 2.1 em 1 ml de tampão ou PB1 PB2 respectivamente. Pipeta cima e para baixo e voltar a suspender as células ou tecidos. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 21 para homogeneizar células ou tecido. Incubar a 4 ° C (em uma roda) durante 10 min.
  3. Girar a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
  4. Ressuspender o sedimento em 300 ul de tampão respectivas SB (Quadro 1) suplementado com inibidores de protease num tubo limpo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios) para evitar qualquer degradação de ADN. Incubar durante 15 a 30 min em gelo.
  5. Sonicar as amostras a 4 ° C para cortar a cromatina utilizando um sonicador de acordo com programas listados na Tabela 2 para cada material. Ajustar a duração de sonicação dependendo da próxima aplicação (<em> ou seja, PCR ou sequenciação). tamanho DNA cortado deve ser em torno de 500 pb para PCR e 300 pb para o sequenciamento.
  6. Centrifugar o lisado celular sonicada durante 10 min a 6000 xg, a 4 ° C, transferir o sobrenadante (cromatina) em um tubo de 1,5 ml limpo e rejeitar o sedimento.
  7. Dilui-se a cromatina em solução (sobrenadante tampão B) por 10 vezes com água e avaliar a densidade óptica utilizando 1,5 uL de uma nano-espectrofotómetro. Obter a concentração de proteínas em ug / ul usando a seguinte fórmula: 1,55 x OD 280-0,76 X OD 260.
Amortecedor Utilização Composição materiais
UMA permeabilização PB1: TUBOS 5 mM pH 8; 85 mM KCl; 0,5% de NP40 Todos
PB2: 15 mM de HEPES pH 7,6, 15 mM de NaCl, mM de MgCl2 4 mM de KCl 60, 0,5% de Triton X-100 tecido embrionário
B Lise / sonicação SB1: 1% de SDS; EDTA 10 mM; Tris-HCl 50 mM pH 8 ESC
SB2: 50 mM HEPES-KOH pH 7,9; 140 mm; EDTA 1 mM; 0,1% de desoxicolato; 0,1% de SDS EBs
SB3: 15 mM de HEPES pH 7,6, 15 mM de NaCl; KCl 60 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM; 1% de Triton-X100, 0 0,1% de SDS, 0,5% laurilsarcosina tecido embrionário
C tampão ChIP NaCl 150 mM; Tris-HCl 50 mM pH 7,5; EDTA 5 mM; 0,5% de NP40; 1% de Triton-X100. Todos
D DNA / proteína A eluição D1: 1% de SDS; 100de NaHCO 3 mM
D2: Tris 50 mM pH 7,6 / EDTA 5 mM, DTT 15 mM, SDS a 2%
E DNA preparação esferas de ligação E: 20% de PEG 8000; NaCl 2,5 M; Tris-HCl 10 mM pH 8; EDTA 1mM

Tabela 1. Os tampões de chip.

Material programa de sonicação
Células-tronco embrionárias 15 ciclos de 30 segundos ligado e 30 segundos OFF
corpos embrióides 30 ciclos de 30 seg ON e 30 segundos OFF
tecidos embrionários 21 ciclos de 30 segundos ligado e 30 segundos OFF

Tabela 2. Programas sonicação.

3. A imunoprecipitação eLavagens

  1. Lavar as pérolas A-3 vezes conjugado de proteína com tampão C. Tome 100 ul de pérolas num tubo limpo de 1,5 ml e adicionar 1 mL de tampão C (Tabela 1). O tubo é em seguida transferida para um íman; esperar durante 1 minuto e aspirar o sobrenadante. Repita duas vezes o passo de lavagem.
  2. Incubar anticorpo criado contra histonas modificados ou factor de transcrição (as concentrações listadas na Tabela 3), com 20 ul de proteína lavado grânulos conjugados e 1 ml de tampão C suplementado com inibidores de protease em um tubo de 1,5 ml limpo. Definir as amostras num rotor a 40 rpm durante pelo menos 2 horas a 4 ° C.
  3. Lavar de anticorpo-complexos esferas 3 vezes com 1 ml de tampão C (manipulação descrito em 3.1).
  4. Prepare a 2 tubos, um contendo 150 ^ g de complexos de cromatina e anticorpo de grânulos e o outro tubo contendo 150 ug de cromatina e 20 ul de pérolas lavadas; Adicionar 1 mL de tampão C suplementado com inibidores da protease a cada tuboe incuba-se as amostras sobre uma roda a rodar a 40 rpm, durante a noite a 4 ° C.
    NOTA: A concentração de cromatina deve ser de pelo menos 300 ug de imunoprecipitar um factor de transcrição ou para o chip sequencial.
Padrão concentração (ng / mL) Volume (uL) Concentração total de ADN (ng)
UMA 10.0 1 10.0
B 5.00 1 5.00
C 2.50 1 2.50
D 1,25 1 1,25
E 0,625 1 0,625
F 0,3125 1 00,3125
G 0,156 1 0,156
H 0.0 1 0.0

Tabela concentrações 3. Normas.

4. DNA eluição,-link Cruz Reversão e Proteinase K Digestão

  1. Definir as amostras na cremalheira magnética. Recuperar o sobrenadante contendo cromatina anticorpo não ligado.
    NOTA: As amostras pode ser rapidamente congelada em azoto líquido a essa etapa e armazenado a -80 ° C. Cromatina pode ser utilizado em outros ensaios de imunoprecipi tacão com outro anticorpo. Lava-se cada amostra de 3 vezes com 1 ml de tampão C (descrito antes) de manipulação.
  2. Elui-se a proteína ligada ao anticorpo pela adição de 150 ul de tampão de D1 ou D2 se ChIP sequencial tem de ser feito (Tabela 1) para materiais ChIP lavadas e incubar as amostras durante 20 min a 50 ° C num bloco de aquecimento.
  3. Retirar os tubos deo bloco de aquecimento e colocar as amostras no rack magnético, recuperar o sobrenadante em um tubo de 1,5 ml limpo (certificada RNase-, DNase e livre de pirogénios) e descartar as contas.
  4. Use sobrenadante para um chip sequencial adicionando 1 a 3 ug do segundo anticorpo, em 2 volumes de tampão C ou reverter a reticulação por adição de NaCl 5 M para se obter uma concentração final de 200 mM.
  5. Prepara-se uma amostra de entrada de cromatina em um tubo de 1,5 ml limpo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios) tendo a mesma quantidade de cromatina que o da amostra IP (150 ug) num volume final de 150 ul de água (RNase DNase água livre). Adicionar NaCl 5M para uma concentração final de 200 mM. Incubar as amostras durante a noite a 65 ° C.
  6. No dia seguinte, recolher amostras a partir do bloco de aquecimento, adicionar EDTA 250 mM para se obter uma concentração final de 12,5 mM e proteinase K para se obter uma concentração final de 250 ug / ml no material de aparas e digerir a 55 ° C durante 2 horas na bloco de aquecimento.

  1. Preparação dos grânulos
    1. Comece a trazer os grânulos à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min, vortex os grânulos muito cuidadosamente. Beads se estabelecer, por isso o trabalho rápido quando pipetagem. Transferir 1 ml de contas no limpo tubo de 1,5 ml (certificado RNase-, DNase e livre de pirogénios).
    2. Ajuste no ímã, esperar por 2-3 min para a solução de esclarecer, sobrenadante de descarte. Retire do ímã, adicionar 1 ml de EDTA 0,5 M e misture por vórtex breve.
    3. Repetir o passo 5.1.2, duas vezes e descartar o sobrenadante no final.
    4. Retire do ímã, adicionar 1 ml de tampão E e lentamente voltar a suspender as esferas. Transferir toda a mistura de grânulos (em tampão E) em 50 ml de tampão E. Coloque, num agitador e deixar misturar lentamente à temperatura ambiente durante 1 h.
    5. grânulos de teste de ligação de ADN seguindo o protocolo de purificação descrito a seguir, utilizando condições experimentais 3: 50 ul de contas / 50 uL de ADN (1 volume / volume de 1), 100 ul de pérolas/ 50 uL de ADN (2 volumes / 1 volume) e 125 ul de contas / 50 uL de ADN (2,5 volumes / 1 em volume). Vamos migrar ADN purificado num gel de agarose a 1,5% para verificar o tamanho dos fragmentos (Figura 1A).
  2. purificação de DNA
    1. Adicionar 425 ul (2,5 volumes) de ADN de ligação esferas magnéticas para cada amostra de ADN (cerca de 170 uL). Ressuspender lentamente por pipetagem para cima e para baixo (cerca de 10 vezes) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    2. Coloque em ímã para 5 min, em seguida, aspirar o sobrenadante e descartar (no ímã).
    3. Adicionar 600 mL de etanol acabado de fazer 80% ao tubo no ímã, aguarde 1 min, aspirar o sobrenadante e descartar e, em seguida, repita o passo anterior mais uma vez.
    4. Dê um giro rápido, por 5 s (microcentrífuga), colocar o tubo no ímã e remover as últimas gotas de etanol. Deixar secar durante 1 min a RT
    5. Elui-se o DNA pela adição de 20 ul de DNase RNase água livre. Retire do ímã e vortex a amostra.
    6. Incuba-se durante 3 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, colocar as amostras no íman. Aspirar o DNA eluído para um novo tubo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios).
    7. Executar o ADN a partir da fracção de entrada num gel de agarose a 1,5% para verificar o tamanho dos fragmentos de DNA (Figura 1B).

6. DNA quantificação utilizando um instrumento de detecção de fluorescência

  1. Serialmente diluídas em água 1 ug de ADN (uma escada KB) para dar um total de 7 diluições além de um ponto de não-ADN (diluições reunidos na Tabela 3).
  2. Prepara-se uma solução de PCR Green I corante, suficiente para todas as amostras de ADN purificado (e diluições padrão AH): 10.000x diluir o corante verde em 1x tampão TE.
  3. Adicionar 1 mL de cada amostra de DNA (DNA purificado e diluições padrão AH) a 10 ul de 1x mistura corante verde em capilares cuvetes para ser lido num fluorímetro a 488 nm de comprimento de onda. Para o ensaio não-ADN, usar 1 ul do tampão TE 1X.
  4. Construiruma curva de calibração usando um software gráfico e determinar as concentrações relativas para a gama de amostras de ADN em ng / mL. O ADN é então pronto para PCR ou para fazer bibliotecas de sequenciação.

7. PCR

  1. Selecção dos iniciadores
    1. Projeto iniciadores de interesse para interrogar as regiões genômicas de interesse. Conceber iniciadores para amplificar as regiões potenciadoras de genes utilizando o navegador genoma UCSC. Potenciadores são ainda previsto usando H3K4me1 ou p300 ChIP-seq 9 dados disponíveis no conjunto de dados GEO.
  2. PCR
    1. reacções Executar PCR para 45 ciclos (8 seg 95 ° C, 8 s 60 ° C, 8 seg 72 ° C) utilizando um tempo real termociclador de PCR em 25 ul de mistura de corante verde, DNA 2 ng e 0,5 ul de mistura de iniciadores (20 solução estoque uM) 10.
  3. Análise de enriquecimento
    1. Calcular enriquecimento absoluto supondo que, no máximo, 1% de nucleossoma foram imunoprecipitados 11.
    2. consider o genómico como enriquecida se 10 amostras IP ng mostrar um maior enriquecimento, quando comparado com 0,1 ng de ADN de entrada.
    3. Expresso de resultados como as vezes de aumento no enriquecimento sobre uma região não enriquecido após a normalização para o ajuste de entrada e com uma amostra de controlo não específico.
    4. Considere o ADN de entrada para ser diluído por 100 (factor de diluição ou DF).
    5. Normalizar a entrada usando a seguinte equação 2 -ΔCt x 100%, onde -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Entrada x DF].
    6. Ajuste de controlo utilizando a seguinte equação (ΔCt [PI] -ΔCt [NS]) em que NS é a amostra não-específico (sem anticorpo IP, IP ou IgG).
    7. Calcular o enriquecimento dobra da amostra, tal como 2 -ΔΔCt. Um arquivo incluindo todas as etapas de cálculos com fórmulas em que apenas cada amostra de PCR podem ser inseridos irá facilitar a análise dos resultados.

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Representative Results

A Figura 1A ilustra a preparação em primeiro lugar de grânulos de ligação de ADN e de controlo de qualidade utilizando ADN de tamanhos diferentes (escada de 1 kb). 0ne, 2 e 2,5 volumes (1 a 3) de grânulos foi adicionada a um volume de amostra a purificar fragmentos de DNA de alto e baixo peso molecular.

As Figuras 1 B, C, D são exemplos típicos de géis de DNA a partir de DNA sonicado todo extraído a partir de células ES do rato, corpos embrióides ou uma região embrionário cardíaca (25 reunidas E9.5 ventrículos), respectivamente.

Quando as células ES diferenciar em direção a um destino célula cardíaca, transitam primeiro através de um mesendodermal e, em seguida, um estado mesodermal. Tal jornada de desenvolvimento inclui um passo pelo qual as células epiteliais que se submeter a uma transição epithelio-mesenquimal

Figura 2

Genes de diferenciação apresentam bivalente domínios em células ES 12. Seus 5 'regiões UTR perto de seus promotores estão realmente ocupado por ambos H3K4me3 uma marca de activação da cromatina e H3K27me3, uma marca reprimida. Estas marcas são modificadas quando as células são desafiados por morphogens tais como BMP-2 7. Estas marcas são, porém, variável dependendo do ES linha de células humanass provavelmente por causa de o blastocisto inicial eles derivam de, mesmo quando indiferenciado (Figura 3).

Os protocolos descritos acima são adequados para a sequenciação de ChIP mesmo a partir de uma baixa quantidade de material; Experimentos ChIP foram realizadas a partir da cromatina extraído de AVC, OFT e ventrículos de embriões de camundongos E9.5 a fim de descobrir novos genes e potenciadores desempenhando um papel na definição da identidade destas regiões cardíacas específicas. A Figura 4 mostra 2 regiões genômicas de genes do miocárdio em ventrículo rato E9.5 enriquecida por uma H3K27 acetilada e de um pacemaker-específica (isto é., não ventricular) gene não enriquecido por H3K27 acetilado.

figura 1
Figura 1. Eletroforese de dados: Contas de ligação a DNA Verificação e sonicação Validation. (A) de ADN purificado por meio de esferas de ligação de ADN, um volume de esferas de 1 volume / de ADN (1) e 2 volumes de grânulos de 1 volume / de ADN (2) e 2,5 volume de esferas de 1 volume / de DNA (3). Tamanho dos fragmentos de ADN obtidos após reticulação inversa das fracções de entrada do rato ES células (B), de corpos embrióides (C), e o tecido cardíaco embrionário (D). As amostras foram executados em 2% géis de electroforese de agarose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. chip de dados de análise. (A) Enriquecimento de H3K27ac marca epigenética no E-caderina potenciadores / promotor (A - regiões E) (b) O enriquecimento de H3K4me1, H3K36me3 e H3K9me2 épigé.marcas magnética sobre torção potenciadores / promotor (regiões AC). regiões genômicas são amplificados por qPCR para medir o enriquecimento histona vs a entrada seguinte Chip. Os resultados são médias ± SEM de 3 experiências. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Sequential Chip. A cromatina foi extraído a partir de 4 linhas de células embrionárias humanas e chip foi realizada sequencialmente usando anti H3K4me3 e, em seguida, os anticorpos anti-H3K27me3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. genes cardíacos Nkx2.5 e TBX5 enriquecidos na histona modificado e uma região genômica do gene específico do pacemaker Shox2 não enriquecido e não expressa no ventrículo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Epigenética tornou-se um importante campo de pesquisa em biologia do desenvolvimento. Como um programa genético é activada em células embrionárias para permitir que as células a adquirir uma identidade específica dentro de uma linhagem embrionário tem sido por muito tempo uma questão essencial para biólogos do desenvolvimento.

Chip tem sido amplamente utilizada nos últimos anos e combinados para sequenciamento de DNA seguinte melhoria na resolução de sequenciamento. Isto tornou-se uma técnica poderosa para investigar num genoma de largura modo dependente da paisagem epigenética de células ou tecidos embrionários e adultos específicos. Os tampões de ensaio chip e condições de sonicação foram melhoradas para permitir que os ensaios de pequena quantidade de material biológico. Isto inclui a regiões específicas de corações embrionárias obtidos por microdissecação ou por células FACS-ordenadas que expressam uma proteína repórter fluorescente. Com efeito ChIP realizada em populações de células heterogéneas 13 14 podelevar a resultados enganadores que são difíceis de interpretar. As marcas de assinatura epigenética celular muito exacta populações. Que a assinatura confere-lhes um potencial específico de diferenciação e determina seu destino. Assim, é importante trabalhar com populações de células (ordenadas) purificadas ou tecidos embrionários dissecados.

Nós descrevemos acima protocolos robustos, a fim de atingir essas metas. Temos usado esses protocolos para Chip-PCR, Chip on Chip 7, 10 ou chip de sequenciamento (Figura 4, manuscrito em preparação). A razão para a robustez estabelece sobre os buffers permeabilização e lise celular que foram otimizados para garantir uma célula completa e lise nuclear e sonicação cromatina eficiente. Os protocolos podem, assim, ser utilizado para pequena quantidade de tecidos embrionários.

Limitações desses protocolos são inerentes a Chip. Mais especificamente, a resolução espacial não é muito alta, com tamanhos de ADN de cerca de 500 pb. Comonunca, que nos permite investigar a dinâmica da bivalente domínios na diferenciação de células ES 7 e revelar diferenças de enriquecimento de histonas modificadas em regiões reguladoras de genes EMT em tipo selvagem ou células mutantes do gene. (Figura 2). Sequenciação de ADN imunoprecipitado profunda (Figura 4) ultrapassa esta limitação parcialmente.

Enriquecimento de uma região genómica após imunoprecipitação específica de um factor de transcrição não indica a certeza de que o factor se liga directamente o ADN. Ele só poderia ser parte da fábrica complexo ligado ao DNA. Este é um ponto importante a estar ciente sobre. Em contraste, o ensaio de retardamento em gel pode ser utilizado para abordar a questão.

Tendo a tecnologia em mãos cruzadas com seqüenciamento profunda permite monitorar genoma ampla as regiões genômicas ocupada por um fatores de transcrição ou uma marca de histona específica. A tecnologia está melhorando e permite interrogar única smapopulações de células ll 15. Abre-se, assim, novos caminhos na dinâmica de paisagens epigenéticas específicas durante o desenvolvimento embrionário.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde  Sigma F8775 Cell Fixation 
Glycine Sigma G8898 Cross-link stop
Aprotinin Fluka 10820 Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate Sigma L2882 Proteases inhibitor
PMSF Sigma P7626 Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads  Life technologies 10001D Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads Thermo Scientific 15002-01 DNA purification
Proteinase K Life technologies 25530-015 Protein digestion 
DNA BR standard  Life technologies Q32850 Calibration range 
Syber green Molecular Probes S-11484 DNA quantification
TE buffer  Invitrogen P7589 DNA quantification
PBX 1x Life technologies 14190-094 Washing
DNase RNase free water Life technologies 10977-035 Dilution
Axygen tube Axygen MCT-175-C ChIP purifiction
Antibody  Company Reference ChIP concentration
H3K27ac Abcam ab4729 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1 Diagenode C15410194 (pAb-194-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3 Diagenode C15410058 (pAb-058-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2 Diagenode C15410060 (pAb-060-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3 Diagenode C15410030 (pAb-030-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3 Diagenode C15410069 (pAb-069-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues

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References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).

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