Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill
Published 3/12/2016
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Developmental Biology

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Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53877, doi:10.3791/53877 (2016).

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Abstract

Introduction

A maioria dos estudos atuais de biologia celular e molecular são baseados em médias populacionais. No entanto, os eventos biológicos importantes podem ser mascaradas por estas análises tradicionais de base populacional já que as populações menores podem desempenhar papéis importantes em processos biológicos e evolução da doença. Compreendendo a expressão do gene em populações heterogéneas ao nível da célula individual podem (e têm) levar a insights biológicos e clínicos relevantes 1,2. Motivo de preocupação para estudos de desenvolvimento embrionário, em uma população maior de células, as células progenitoras são muitas vezes sub-representados, tornando-o difícil de detectar mudanças sutis na expressão gênica que em última análise, propor decisões destino celular 3. De modo semelhante, um único tipo de célula pode ter diferentes perfis de expressão, em resposta ao microambiente 4. Por exemplo, células endoteliais residentes no mesmo órgão ou em diferentes órgãos (por exemplo., Aorta ou renal) exibem uma heterogeneidade significativa apesar de compartilhar MORP comumhological e funcionais características 5. Além disso, as células cancerosas que povoam o mesmo tumor também podem ter diferentes perfis moleculares ou mutações ao nível da célula individual 6.

Em sistemas modelo, transcriptomics em células individuais identificou com sucesso novas populações de células, caracterizado estados intermediários que ocorrem durante a diferenciação celular, e revelou respostas celulares diferenciais aos estímulos 7,8,9. Tais percepções teriam sido detectáveis ​​em estudos de base populacional convencionais. embriões de peixe-zebra são uma fonte tremendamente subutilizado do caule, progenitor, e as células de diferenciação para explorar questões de heterogeneidade célula única e regulação molecular de identidades celulares durante o desenvolvimento. Sua, ex vivo desenvolvimento e facilidade de manipulação genética altamente estereotipados torná-los um sistema modelo excelente para esta abordagem 10,11. Especificamente, uma grande limitação para a interpretação de uma única célula gendados e expressão é que a identificação fiável de novos estados de células intermediárias durante o desenvolvimento exige um timing muito cuidado de coleta de tecido 9. Isto é necessário para assegurar que a heterogeneidade entre as células capturadas representa heterogeneidade dentro de um tecido a um único ponto de tempo, em vez de heterogeneidade na expressão de genes apresentada pela diferenciação celular dependente da idade. Em comparação com ratos, o desenvolvimento do embrião de peixe-zebra podem ser precisamente sincronizados através de um grande número de embriões 12. Além disso, com os tamanhos grandes de embraiagem, os embriões de peixe-zebra pode ser usado como uma fonte abundante de células estaminais e progenitoras.

Este protocolo descreve um método para isolar a partir de embriões de peixe-zebra células e capturar as células individuais utilizando um sistema de chip e Autoprep disponível comercialmente circuito microfluidos integrado (IFC) para análise da expressão do gene qRT-PCR. Este protocolo pode ser rapidamente transferível para quaisquer ensaios de alto rendimento de multiplexagem, incluindo todasequenciamento do transcriptoma que permite a análise mais abrangente da heterogeneidade celular 13. Também oferece várias vantagens para ensaios de expressão de gene tradicionais. O protocolo de isolamento de células individuais produz alta viabilidade depois de FACS, o que diminui a proporção de células comprometidas que são incluídos em aplicações a jusante. Usando um IFC, as células capturadas pode ser observado diretamente para avaliar as taxas de captura e avaliar a saúde das células morfologicamente. Além disso, este protocolo é amplamente aplicável para a comunidade científica peixe-zebra, necessitando apenas de uma linha de peixes transgénicos marcado e acesso às tecnologias de captura de células microfluídicos.

Como prova de princípio, células únicas derivadas de progenitores cardíacas foram isoladas e capturado num chip IFC, e, em seguida, a abundância relativa de marcadores de diferenciação cardíaca foi medida por qRT-PCR. Análise da expressão de genes ao nível da célula individual demonstra que células progenitoras cardíacas coexistir com a sua diferenprogênie ntiating. O conhecimento adquirido a partir de perfis de uma única célula de células progenitoras cardíacas podem lançar luz sobre a heterogeneidade nos padrões de expressão gênica entre células progenitoras cardíacas durante o desenvolvimento dos vertebrados, que pode ter sido mascarado nas análises tradicionais de base populacional.

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Protocol

Este protocolo requer o uso de ao vivo, peixe-zebra adulto para produzir embriões. Os embriões são colhidos para a recolha de tecido. É essencial para obter a aprovação de ética apropriadas conselhos de revisão para realizar esta experiência.

1. Obter Embriões Staged

  1. Um dia antes do experimento, preparar saudável, peixe-zebra adulto para reprodução. Coloque um macho e uma fêmea em lados opostos de uma divisória clara em um tanque de criação.
  2. Repetir para 1,1 como muitos tanques de criação como necessários para a produção de embrião suficiente para a aplicação a jusante. Obter embriões de ambos os tipos de peixe selvagem e peixes transgénicos que expressam proteínas fluorescentes no tipo de célula de interesse.
    NOTA: O número de embriões necessários para aplicações a jusante nos Passos 2-8 depende da abundância relativa das células de interesse no ponto de tempo de interesse. Embora isso possa variar conforme o tipo de célula, 200 embriões produzir 2.000-5.000 células ordenadas quando o cells de interesse representam <1,0% do total de células em 24 hpf (horas após a fecundação).
  3. Na manhã seguinte, mudar a água no tanque de cobertura com pão ralado, transferindo peixe para um tanque de criação fresco e eliminar o divisor. Inclinação do tanque a um ângulo para promover o acasalamento.
  4. Coletar embriões encenadas.
    1. A cada 15 minutos, recolher embriões transferindo os adultos a um tanque de criação fresca e passar os ovos que são deixados para trás através de um coador de chá.
      NOTA: embriões Zebrafish desenvolver de forma síncrona quando mantidas em densidades e temperaturas comparáveis.
    2. Lavar os ovos com o ovo de água (0,21 g / L sais Instant Ocean em 1 L de água destilada duas vezes) e transferir para um prato de petri. Transferir a placa de Petri para um incubador húmido a 28,5 ° C com circulação de ar.
  5. Duas horas após a última coleção, espécie fertilizados, embriões multicelulares em 10 cm placas de Petri e reduzir a densidade de 50 embriões por prato. Selecionar embriões de uma única, 15janela de tempo min de coleta para aplicação a jusante. Incubar em embriões de 28,5 ° C.
    NOTA: Por exemplo, recolher embriões às 8:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 e 10:15. Comparando através pontos de tempo, se o maior número de embriões fertilizados são das garras recolhidas às 9:00, em seguida, usar apenas estes embriões para aplicações a jusante.

2. Configurar para a dissociação única célula

  1. Cerca de 30 minutos antes do ponto de tempo de interesse (18 hpf) remover embriões a partir de sua córion manualmente com uma pinça fina.
  2. Recolha e rotular o seguinte para cada condição: dois 2 ml microtubos, um filtro de 40 um celular, um prato de cultura de células de 35 mm, e dois tubos de FACS coberto com um filtro de células 35 ^ m.
  3. Relaxar os seguintes reagentes no gelo: Ovo de água contendo 0,21 g / L sais Instant Ocean em 1L de água bidestilada; De yolking-tampão E contendo NaCl 55 mM, KCl 1,8 mM, e 1,25 mM de NaHCO 3; e FACS buffer contendo de Leibovitz L-15 meios suplementados com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 5%.
  4. Traga 1 ml por amostra de celular dissociação Reagente 1 a RT Thaw 1 ml celular dissociação Reagente 2 por amostra em gelo. Trazer para RT imediatamente antes da utilização.

3. A dissociação celular standard

  1. Usando uma pipeta de orifício larga de vidro, 100-300 embriões transferir para um tubo de centrífuga de 2 ml de micro num volume mínimo de água do ovo.
  2. Eutanásia embriões através da substituição da água com 1 ml de gelo-água fria ovo e submergindo tubo em gelo durante 20 min.
    CUIDADO! É crítico para obter a aprovação de um comitê institucional adequada supervisão cuidados com animais para este método de eutanásia (refrigeração em gelo seguido de dissociação celular como a eutanásia secundário). eutanásia padrão normalmente requer que os embriões <3 dias pós-fertilização são branqueadas depois de serem arrefecidas, o que não é adequado para a obtenção de células viáveis.
  3. Lavar os embriões duas vezes com 1 ml de gelo-água fria ovo. Para lavar, use uma ampla pipeta furo de vidro para remover Egg água e uma P1000 para adicionar Egg água.
  4. Remover a gema, substituindo a água embrião com 1 ml de tampão Deyolking e triturando 8-12 vezes com uma ponta de P1000, ou até que a gema é dissolvido e apenas os corpos dos embriões são visíveis.
  5. Recolhe-se o tecido por centrifugação a 300 xg durante 1 min. Usar uma pipeta para remover suavemente o sobrenadante sem perturbar o pelete de tecido. Re-suspender em 1 ml de água Egg.
  6. Repetir o passo 3.5 para um total de três lavagens, mas na lavagem final, re-suspender em 1 mL de RT dissociação celular Reagente 1.
  7. Incubar em dissociação celular Reagente 1 durante 10 min à temperatura ambiente com os tubos dispostos horizontalmente. Cada 2-3 minutos, tritura-se suavemente com uma pipeta P1000 para evitar aglomeração.
    NOTA: Punho amostras suavemente durante as etapas de trituração. Em algum momento um único grande grupo, irá formar no tubo a partir de um emaranhado de corpos de embriões. Isso vaidispersar a digestão adicional auxiliado por trituração suave. NÃO VORTEX.
  8. Recolha de tecido por centrifugação a 300 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de dissociação celular Reagente 2.
  9. Incubar durante 5-15 min à temperatura ambiente. Colocar os tubos horizontalmente. Cada 2-3 minutos, tritura-se suavemente para evitar aglomeração. Cada 5 min, avaliar o progresso digestão.
    1. Para avaliar o progresso de digestão, dilui-se 2 ul de sobrenadante em 18 ul de tampão de FACS e de pipeta, como uma gota sobre uma placa de cultura de células.
    2. Coloque uma lamela sobre a amostra e observar ao microscópio de cultura de tecidos em 10X e 20X ampliações.
      NOTA: A preparação deve aparecer como uma mistura de células individuais, pequenos grupos, grandes aglomerados e ocasional corpo embrião na maior parte intacta.
    3. Visualmente avaliar a proporção da preparação é que as células individuais e pequenos aglomerados.
      NOTA: Over-digestão irá reduzir a viabilidade; under-digestão reduzirá rendimento de célula única. </ Li>
  10. Recolha a preparação de células por centrifugação a 300 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e re-suspensão em 1 ml de frio tampão FACS.
  11. Umedeça um filtro de células 40 mM com tampão FACS. Passar a suspensão de células através do filtro celular de 40 um sobre uma placa de cultura celular de 35 mm. Lavar o filtro de células uma vez com 1 ml de FACS buffer de triagem.
  12. Transferir o fluxo através de um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Recolher as células por centrifugação a 300 xg durante 5 minutos e re-suspensão em 100 ul de FACS buffer.
  13. Contagem de rendimento das células utilizando um hemocitómetro. Diluir as amostras de 5x10 6 células por mL, ou concentração óptima recomendadas para máquina de FACS de escolha. Opcional-Ao contar rendimento celular no hemocitômetro, células mortas contracorante com azul trypan para confirmar a viabilidade da preparação de células antes da separação por FACS.
    NOTA: As preparações que são demasiado diluída terá quantidade excessiva de tempo para resolver. As preparações que são demasiado Concentrated tendem a se agrupar em multímeros e estão abaixo do ideal para classificar uma população pura.
  14. Reserve 10-20% de cada amostra de usar controles como não coradas. Para as amostras restantes, mancha as células mortas por adição de um / morto (L / D) a discriminação vivo corante fluorescente para cada amostra. Não lavar.
    NOTA: Qualquer corante fluorescente que penetra nas células com membranas celulares comprometidas e manchas de ácidos nucleicos podem ser utilizados como o corante de L / D, desde que os espectros de fluorescência é compatível com a máquina de FACS de células de escolha e de rotulagem fluoróforo de interesse.
    1. Não lavar a preparação após a adição do corante como algumas células morrerão em trânsito para a purificação de FACS e devem ser excluídos da população classificada.
  15. Umedeça o filtro 35 um celular tampado tubo de FACS com 20 ul de tampão FACS. Adicionar células para a peneira e recolher pela gravidade. Armazenar no gelo.

4. FACS Enriquecimento

  1. Use FACS para enriquecer única, Células vivas que expressam o marcador fluorescente.
    1. Defina uma porta para distinguir as células de detritos em um gráfico de dispersão de dispersão para a frente (FSC-A) amplitude vs amplitude dispersão lateral (SSC-A), ambos com escala linear.
      Cuidado! Células Zebrafish são geralmente menores do que células humanas mouse ou. Isto reflecte-se uma separação da base inferior entre as células e os detritos.
    2. Do portão definido em 4.1.1, defina um portão para enriquecer para células individuais e excluir multímeros usando um gráfico de dispersão de altura para a frente de dispersão (FSC-H) e baixa estatura dispersão lateral (SSC-H), ambos com escala linear.
      NOTA: As células com desproporcionalmente alta FSC-H e baixa SSC-H são prováveis ​​multímeros e são excluídos da classificação.
    3. A partir do conjunto portão no 4.1.2, usando os controles de cor única, definir um portão para incluir células vivas usando apenas um gráfico de dispersão da FSA-A com escala linear e amplitude do canal usado para detectar L mancha / D com escala log. Incluem células negativas L / D.
    4. A partir deo portão definido em 4.1.3, usando controles única cor, defina um portão para incluir células vivas apenas com fluorescência positiva usando um gráfico de dispersão da FSA-A com escala linear e amplitude do canal usado para detectar marcador de células proteína fluorescente com escala log . Incluem células positivas.
    5. Definir os controles de compensação, se necessário, para ter em conta a interferência entre o L mancha / D e espectro de proteína fluorescente.
  2. Set lógica tipo de células que caem em todos os portões definiu no passo 4.1.
    1. Usando células duplamente marcadas, verifique gating para separação de células.
      NOTA: As células de triagem será células, em vez de detritos, células individuais em vez de multímeros, L / células positivos e negativos de fluorescência d.
  3. Ordenação de 2.000-4.000 células da população de interesse em 5 mL de tampão de FACS frio num tubo de microcentrífuga em gelo. Para minimizar corte e pressão sobre as células durante a classificação, use as pressões mais baixas possíveis para a célulaclassificador.
    NOTA: A gota 5 mL de tampão de FACS serve como uma almofada para células que saem da máquina de FACS. 2.000-4.000 recolha de células directamente em tampão de SCAF elimina a necessidade de centrifugação antes do carregamento para os chips IFC. Esta estratégia é recomendado porque centrifugação pode levar à formação de multímeros se as células aderirem umas às outras no sedimento.
  4. Avaliar a análise de viabilidade pós-classificação.
    1. Transferir 1 ml de células classificadas para um tubo FACS fresco com 100 ul FACS buffer e uma triagem: 1.000 diluição da mancha L / D. Passar as células através do classificador de SCAF com a estratégia de propagação no passo 4.1. Utilizar a proporção de L / D de negativo para positivo para estimar a viabilidade de células separadas.

5. As células carga para microfluídica Chip

  1. Usando um hemocitómetro, medir a concentração e tamanho de células separadas.
    1. Diluir células separadas para, pelo menos, 10 ul. Dilui-se uma alíquota de 5 μ; Células L com 5 ul de azul de tripano. Carregar em hemocitômetro e aplicar lamela.
    2. Coletar imagens de campo claro de todas as células em 4 x 4 grades de hemocitômetro. Contar o número de células vivas e calcular células vivas / mL. células vivas não ocupam azul de tripano.
      NOTA: Use qualquer software de análise de imagem padrão para medir o diâmetro de todas as células vivas. Calcule a média eo desvio padrão do tamanho da célula, e selecione uma placa IFC apropriada para a faixa de tamanho de célula de interesse. Se gama de tamanho de célula atravessa uma faixa de tamanho de célula placa IFC, usar várias placas para capturar toda a gama de células de interesse.
  2. células de carga sobre a placa IFC de acordo com as instruções do fabricante (ver Materiais).
    1. Dilui-se as células a 1x10 6 culas / mL e realizar a optimização de flutuação de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: otimização flutuabilidade garante que as células não vão para o fundo, nem flutuar para o topo do wel de carregamentol para o carregamento ideal para chips IFC. A proporção de tampão às células pode variar em tipo de célula, mas geralmente varia de 6: 4-7: 3 de células: tampão.
    2. Adicionar células à placa-IFC ferrado. placa de carga em máquina de fluidos compatíveis, e executar um script de carregamento celular para empurrar as células através do circuito microfluídica e em faixas de captura.
  3. Confirmar que as células são alojados em locais de captura na placa IFC.
    1. Retire a placa IFC de máquina de fluidos. Monte a placa IFC em um microscópio equipado com um adaptador de placa.
    2. Colete instantâneos de campo brilhante e fluorescência para cada local de captura em aumento de 10x.
      NOTA: Brightfield horas de captura pode variar de 10-50 ms, dependendo da intensidade da lâmpada. horas de captura de fluorescência pode variar de 250-750 ms, dependendo do brilho fluoróforo. Evite células superexposição para evitar photodamage.

6. Síntese de ADNc

  1. Realizar a lise celular in situ, de acordo com Iinstruções do fabricante placa FC.
    1. Adicionar tampões de lise de poços na placa IFC. placa de carga na máquina de fluidos compatíveis e roteiro lise celular prazo, conforme as instruções do fabricante.
  2. Execute transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante da placa IFC.
    1. Adicionar reagentes de transcrição reversa para placa IFC. placa de carga na máquina de fluidos compatíveis. Executar script de transcrição reversa. Exemplos de condições de ciclo: 1 ciclo a 25 ° C durante 10 minutos, 1 ciclo a 42 ° C durante 1 h, depois 1 ciclo a 85 ° C durante 5 min.
  3. Realizar pré-amplificação com as sondas específicas de genes de acordo com as instruções do fabricante placa IFC.
    NOTA: Devido à sua maior especificidade com os números de baixo número de cópias, utilize sondas fluorogênicos marcado ao invés de sondas otimizados para uso com tintas intercalator.
    1. primers para a piscina e diluir até final de 180 nM cada. Adicionar primers combinados com placa IFC. placa de carga para fluidi compatívelmáquina de cs. script de pré-amplificação executado.
  4. Realizar pré-amplificação com as seguintes condições de ciclos: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, em seguida 18 ciclos com desnaturação a 95 ° C durante 15 s, em seguida, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 4 min. Loja pré-amplificado de ADNc a 4 ° C até à colheita. cDNA colheita a partir de chapa de microfluidos de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a -20 ° C até o uso.

7. Selecione cDNA a partir de células individuais para único alvo qRT-PCR

  1. Dilui-se ADNc em 25 uL de reagente de diluição de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: rendimento final aproximado é de 28 l de cDNA pré-amplificada por célula. Reserva-se uma alíquota de diluente para utilização como um controlo sem modelo no qRT-PCR.
    1. Referindo-se ao campo claro e imagens fluorescentes gravadas na etapa 5.3.2, marcar cada local de captura. contar manualmente e registrar o número de células. Avaliar e registrar se cada célula é a gripeorescent.
      NOTA: Cada site individual pode conter 0, 1, ou> 1 célula, onde> 1 célula inclui locais de captura que contêm várias células e / ou detritos não identificável. Se as imagens são de qualidade suficiente, um valor de pixel podem também ser designado para quantificar a intensidade do sinal de fluorescência.
  2. Seleccione amostras para análise qRT-PCR.
    1. Selecione amostras de cDNA a partir de locais de captura identificados na etapa 7.2 que contêm exatamente uma célula com fluorescência positiva. Piscina alíquotas de 1 ul de cDNA de cada amostra.
      NOTA: Este é o "pool" de controlo positivo utilizado para determinar se os genes de interesse são expressos em qualquer uma das células seleccionadas.
    2. Escolha de ADNc a partir de pelo menos um local de captura que contém exactamente 0 células como um controlo negativo. Use diluente do passo 7.1.2 como um controle não-modelo.
  3. Executar ensaio de qRT-PCR.
    1. Use apenas sondas utilizadas para a pré-amplificação no passo 6.4.1. Carregar todas as amostras em triplicate. As condições de amplificação para uma reacção de 10 ul numa placa de 384 bem: um ciclo de 50 ° C 2 min, um ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos com desnaturação a 95 ° C 15 s, em seguida, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 1 min.

Análise 8. Dados

  1. Validar produtos qRT-PCR por electroforese em gel padrão. produto confirmar é uma única banda no peso molecular esperado (varia para cada sonda).
    NOTA: Se uma sonda produz múltiplas faixas ou uma única banda com um tamanho impróprio, em seguida, a especificidade é questionável, e isso exclui o gene da análise.
  2. Examinar todas as curvas de amplificação e são responsáveis ​​por quaisquer anormalidades 14. Calcule o valor médio CT para cada combinação de amostra / gene 15.
    NOTA: Os valores de CT para controlos positivos normalmente variam de 10-30. valores CT para controlos negativos variam tipicamente 35-40 (sem amplificação). valores CT 30-35 são consideradas muito baixa expressãoe devem ser interpretados com cautela 14.
  3. Os dados do relatório
    1. Se as amostras caem no CT = 10-30, os dados podem ser também relatados como a mudança vezes na transcrição abundância relativa a uma amostra de controlo.
      NOTA: Fold mudança é igual a 2 ^ (- ΔΔCT) onde ΔCT é relativo a um gene de manutenção por subtracção da média CT da amostra a partir do gene de manutenção e é ΔΔCT as diferenças em ΔCT entre a amostra e um controlo positivo 15.

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Representative Results

Como prova de princípio, a expressão do gene foi avaliada para explorar a dinâmica de diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco. No peixe-zebra, progenitores cardíacos surgir a partir de uma população de células da mesoderme que migram para a mesoderme lateral anterior onde elas se fundem para formar o tubo de coração linear. Antes da fusão, progenitores cardíacos começam a expressar o factor de transcrição Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), que se pensa ser a mais antiga marcador específico de células progenitoras cardíacas 16,17. Aqui, um anteriormente descrito BAC peixe transgénico Tg (Nkx2.5: ZsYellow) 18, Nkx2.5 abreviado: ZSY foi usada para analisar marcadores de diferenciação em células cardíacas individuais na fase de 18 somito, 18 horas após a fertilização (HPF) 12. Este foi o ponto de tempo mais próxima em que o sinal ZsYellow era perceptível à vista. Como descrito anteriormente para esta linhagem transgênica, ZsYellow etiquetas progenitores cardíacos, como nósLL como algumas células extra-cardíacos que dão origem às células endoteliais da faringe em arco 28 HPF 19 (Figura 1A-B, dados não mostrados). Aos 18 hpf, Nkx2.5: ZSY embriões foram dissociadas numa suspensão de células individuais, em seguida, corado com Azul Sytox para excluir as células mortas. Vivo, ZsYellow positivo, as células negativas Sytox azuis foram separadas por FACS usando um classificador de MoFloXDP ou Sony SH800Z equipado com bico de 100 uM (Figura 1C-F). Para avaliar a pureza da viabilidade populacional e pós-espécie classificada, uma alíquota de células classificadas foram coradas com Sytox azul e avaliada a porcentagem de eventos que caiu dentro do portão de classificação original (Figura 1G-J).

Após a triagem, as células foram inseridos em um circuito microfluídico (IFC) fluxo de trabalho chip (Figura 2A) integrado de acordo com as instruções do fabricante. Um hemocitómetro, combinada com azul de tripano exclusioN foi utilizado para medir o diâmetro da célula, concentração, e viabilidade (Figura 2B, e dados não mostrados). flutuabilidade celular foi otimizado (6,5: 3,5 células: tampão) de acordo com as instruções do fabricante, e as células foram carregadas em um IFC para capturar 5-10 mm de diâmetro células. Para avaliar a eficiência de captura, fluorescência e / ou sinais de campo brilhantes foram fotografadas em todos os locais de captura, uma função de azulejos em Fiji foi usada para costurar uma única imagem da placa de microfluídica. Cada local de captura continha 0, 1, ou> 1 células individuais (Figura 2C-F). Como esperado a partir de enriquecimento de FACS, as células capturadas expressa ZsYellow (Figura 2G). Eficiência de captura excedeu 90% em 5 experiências individuais usando Nkx2.5: ZSY células classificadas, e, pelo menos, 70% de locais de captura foram ocupadas por uma única célula (dados não mostrados). As células foram lisadas, o ARN isolado, o ADNc sintetizado e genes alvo específicos foram amplificados, tudo de acordo com as instruções do fabricante.

Um subconjunto de locais de captura de células foram selecionados para análise de qRT-PCR como descrito no protocolo acima. Especificamente, o factor de alongamento 1-A (efl1a) 20 e gliceraldeído-3 fosfato (GAPDH) de 21 foram ensaiadas quanto genes housekeeping esperados para ser expressa em todas as células; Proteína GATA ligação 4 (GATA4) 22 e NK2 homeobox 5 (Nkx2.5) como marcadores precoces progenitoras cardíacas; ISL LIM homeobox 1 caixa 1 (ISL1) como um campo segundo coração marcador 23,24; e da cadeia leve da miosina (myl7) e miosina ventricular cadeia pesada (vmhc) 25 para marcar cardiomiócitos ventriculares. As sondas específicas para o gene foram validados utilizando ADNc a partir de 48 embriões HPF (Figura 3). qRT-PCR foi utilizado para avaliar a expressão do gene em relação destes genes em células individuais 45 a partir de 18 embriões HPF, um controlo negativo não-molde, e uma população de controlo positivas reunidas containicDNA ng de todos os locais de captura 96. valores brutos de CT de 40 células e os controles representativos são mostrados no Quadro 1. Nomeadamente, a partir da piscina de 46 células examinados, 6 células foram excluídos da análise porque todos os valores de TC de expressão de genes excedeu CT = 35,0, e desconhece-se se estes alta CT Os valores são atribuíveis aos verdadeiros, os níveis de expressão muito baixos ou degradação da amostra. Uma vez que o intervalo de valores de CT para o gene housekeeping, ef1a, era demasiado ampla para comparar a expressão gênica entre as amostras, e muitos valores CT excedido 30, valores de CT foram visualizados como um mapa de calor (Figura 3). Comparando entre amostras, foi observada heterogeneidade significativa na expressão de genes, e as células foram células como Tipo 1-5 com base no padrão de expressão (Figura 3) classificado.

figura 1
Figura 1. O isolamento de células individuais de peixe-zebra células positivas ZSY em 18 hpf Montar imagens inteiras de representante Tg (Nkx2.5: ZsYellow). embrião aos 18 hpf com (A) ZsYellow fluorescência sozinho ou (B) fundiram imagem Campo brilhante com. Estratégia de gating (CF) Representante FACS para enriquecer células positivas ZsYellow e (GJ) análise pós-tipo com (C, G) FSC / SSC gating tamanho, (D, H) discriminação gibão, (E, I) Live / Morto gating , e (F, J) classificados população. Barra de escala é de 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. captura de células individuais de Nkx2.5 peixe-zebra: ZSY ong> células positivas. (A) O fluxo de trabalho. (B) distribuição de tamanho de célula para células classificadas de Tg (Nkx2.5: ZsYellow) embriões isolados aos 18 hpf. (CF) eventos de captura de células representativas na placa IFC em que (C) é um bem vazio, (D) contém duas células, (E) tem uma única célula alojada no canal de fluidos como uma "captura de canal", e (F) é uma única célula capturado. caixas roxas marcar margem interna para a visualização ampliada de locais de captura. (G) de captura de célula individual com campo claro, ZsYellow e fundiu imagens. (CF) barra de escala branca é de 50 mm; barra de escala amarela é de 10 mm. (G) Barra de escala é de 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Gene análise de expressão de captura única Nkx2.5 peixe-zebra:. ZSY células positivas de expressão gênica por qRT-PCR em controlos positivos (embriões em 2 dias-pós-fertilização, agrupados cDNA a partir de células individuais), controle negativo (não-template ) e 40 células individuais (Cell 01-40). Valores Raw TC foram codificados por cores com base conforme descrito no Key. Ef1a = alongamento fator 1a, GATA4 = proteína GATA ligação 4, Nkx2.5 = NK2 homeobox 5, cadeia myl7 = miosina luz 7, vmhc = miosina ventricular cadeia pesada, GAPDH = gliceraldeído-3 fosfato e ISL1 = ISL LIM homeobox 1. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Threshold Cycle (CT)
ef1a GATA4 nkx25 myl7 vmhc GAPDH ISL1
Embrião 20,69 20.92 28.59 32,87 26,30 27.00 33,57
Piscina 26,4 22.4 27,7 27,4 24,5 29,2 40,0
NTC 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Tipo 1 Cell-01 25.1 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-02 25,4 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-03 26,3 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-04 27,4 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-05 28,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-06 28,2 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-07 29,3 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 400,0
Cell-08 30,7 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-09 34,3 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
tipo 2 Cell-10 23,5 28,0 40,0 40,0 40,0 26,3 40,0
Cell-11 23,5 27,2 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-12 23,7 17,9 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-13 24.1 32,4 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-14 24.9 27,5 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-15 25,9 28,6 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-16 26,0 28.1 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-17 27,0 27,7 40,0 40,0 40,0 38,5 40,0
Cell-18 27,0 27,4 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-19 27,0 30,2 40,0 40,0 40,0 38.2 40,0
Cell-20 27,0 28,2 40,0 40,0 400,0 39.2 40,0
Cell-21 27,7 30,3 40,0 40,0 40,0 38,6 40,0
Cell-22 30,4 26,2 40,0 40,0 40,0 38,3 40,0
Cell-23 31,3 22.4 40,0 40,0 40,0 39,7 40,0
Cell-24 31,5 28,8 40,0 40,0 40,0 39,5 40,0
Cell-25 33,8 27,4 40,0 40,0 40,0 37,3 40,0
Cell-26 40,0 27,4 40,0 40,0 40,0 36,6 40,0
tipo 3 Cell-27 24,7 19.9 28,8 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-28 24,8 28,4 26,3 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-29 25.1 23,5 27,6 40,0 40,0 32,5 40,0
Cell-30 26,3 21,4 27,5 40,0 40,0 39,9 40,0
Cell-31 26,9 24,8 28,2 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-32 27,0 22,5 23,8 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-33 27,8 27,6 27.7 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-34 28.1 21,9 26,6 40,0 40,0 37,7 40,0
Cell-35 29,3 26,5 28.1 40,0 40,0 38,3 40,0
tipo 4 Cell-36 24,8 20.3 26,0 27,4 26,6 40,0 40,0
Cell-37 28,7 22.3 25,9 28,9 22,9 38,5 40,0
tipo 5 Cell-38 25,5 20,0 29,3 23,0 19.9 25,9 40,0
Cell-39 25,9 21,8 28,6 25.1 21,7 25,7 40,0
Cell-40 28,9 22,0 27,0 23,0 21.3 27,6 40,0

Tabela 1. Valores Raw CT.

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Discussion

O processo aqui descrito utiliza, a expressão de uma proteína fluorescente sob o controlo de um promotor específico do tipo de célula para enriquecer uma população de células progenitoras cardíacas a partir de embriões de peixes-zebra para o uso no sistema de captura de uma única célula assistida de microfluidos para avaliar a expressão de um subconjunto de genes cardíacos em única células. Desde que FACS de excitação e de emissão de laser capacidades são compatíveis com o fluoróforo (s) de escolha, este método pode ser usado para qualquer linha repórter fluorescente. Muitas linhas de repórter de peixe-zebra já existem, e peixes transgénicos levando novos repórteres podem ser gerados em menos de 3 meses. Além disso, este fluxo de trabalho pode ser adaptado para produzir ADNc a partir de todo o transcriptoma para a sequenciação de ARN de célula única. Para fazê-lo, os passos 5-7 terá de ser ligeiramente modificada para utilização com produtos químicos optimizados para a preparação de ADNc para gerar bibliotecas adequadas para a sequenciação de ARN. No entanto, é aconselhável para validar heterogeneidade da populaçãoutilizando o método descrito aqui antes franzindo aplicações de sequenciação de alto rendimento.

É importante notar que existem algumas limitações ao método descrito. Primeiro, o uso de placas de circuito integrado microfluídicos (IFC) exige equipamento especializado, dispendioso. No entanto, chips microfluídicos oferecem vantagens substanciais sobre tradicional de 96 poços e 384 formatos de placa bem para ensaiar as células individuais. Por células e reagentes através de pistas escala micrométrica fluindo, células individuais são posicionados em locais de captura única, onde podem ser observadas diretamente para confirmar que eles são células isoladas em boa saúde. Extracção de ARN e a síntese de ADNc ocorrer in situ sobre o chip a IFC utilizando volumes muito baixos para cada célula. fritas integrados de fluídica, no momento da redação deste texto, estão disponíveis comercialmente através de uma única fonte. Embora fabricação não comercial tem sido realizada por vários grupos, que se encontra fora da capacidade da maioria dos laboratórios. Passos 5-7 podeprecisam ser modificados para plataformas produzidas por outras empresas ou em casa fabricações. Em segundo lugar, embora placas IFC comercialmente disponíveis podem acomodar até 96 genes, os genes seleccionados são limitados pela disponibilidade de sondas de genes fluorogénicos marcado validados para uso em peixes-zebra. Em terceiro lugar, as células de peixe-zebra são geralmente menores do que as células de mamífero, e este pequeno tamanho apresenta desafios para o processamento da amostra. Uma pequena mudança no diâmetro da célula traduz-se numa grande variação de volume da célula, reduzindo o material disponível e diminuindo a probabilidade de detecção de baixa expressão de genes.

Há várias considerações adicionais para este protocolo. No passo 1, é importante apenas os embriões fertilizados de uso dentro de uma janela de tempo curto. Mantendo a temperatura constante e sem limitar condições de oxigénio, os embriões de peixe-zebra desenvolver de forma síncrona. A leitura final deste protocolo (expressão gênica relativa a partir de células individuais) não pode discriminar a fonte de heterogeneidade entre as células individuais. Por esta razão, a interpretação de heterogeneidade intercelular baseia-se cuidadosamente os embriões em estágios de desenvolvimento e síncrona. Nos passos 2-3, existe uma troca entre a dissociação e a viabilidade. Embora a etapa 4 seleciona para células viáveis, e passo 3 contém várias etapas de filtragem que ajudem excluir multímeros, o excesso de digestão reduzirá o material viável disponível para FACS e potencialmente reduzir o rendimento das células de classificação. Etapas para solucionar baixa viabilidade incluem redução do tempo de digestão, reduzir a intensidade de trituração, e otimizar o número de embriões no material de partida. FACS enriquecimento da população de células de interesse (passo 4) é sem dúvida a etapa mais crítica neste protocolo. rigorosos critérios de ordenação são essenciais para gerar uma preparação de células única contendo apenas células vivas que expressam a proteína fluorescente de interesse. células de outras populações contaminante pode levar a falsa representação de heterogeneidade intercelular. Notavelmente,FACS enriquecimento de uma população de interesse não se restringe à estratégia de duas cores mostrado neste protocolo. Mais estratégias complexas pode produzir populações de células mais refinadas e são uma maneira rápida para estender a metodologia relatado no estudo de prova de princípio. No passo 5, as células podem ser directamente observada para confirmar o número de células capturadas, a saúde das células, e a expressão da proteína de fluorescência. Mas, dependendo do tamanho da célula e o brilho, o fluoróforo de interesse pode não ser visualmente detectável e não é uma leitura fiável. A conclusão bem sucedida de passos 6-8 exige a adesão cuidado para os protocolos do fabricante.

Como prova do princípio, os níveis de um subconjunto dos marcadores cardíacos conhecidos de expressão foram avaliados em único derivado de um BAC transgénico de peixe-zebra Nkx2.5 linha previamente descrito: ZSY para analisar marcadores de diferenciação cardíacas em Nkx2.5 indivíduo: As células positivas em ZSY pós 18 h fertilização (HPF). Para explorar a heterogeneiTy de marcadores de diferenciação expressos em Nkx2.5 capturado: células que expressam ZSY, um conjunto de genes foram testadas, incluindo genes de manutenção (ef1a, GAPDH), factores de transcrição que se sabe ser activada no início da especificação cardíaca (GATA4, Nkx2.5), uma segundo campo coração marcador progenitor (ISL1) e genes conhecidos para ser ligado mais tarde durante a diferenciação cardíaca (myl7, vmhc). A abundância relativa de cada gene foi medida por qRT-PCR por meio do cálculo limiar de ciclo (CT). O valor CT menor calculada foi de 17,9 eo mais alto foi de 40, representando nenhuma amplificação (Tabela 1). valores CT de> 35,0 foram consideradas abaixo de detecção.

Das células 46 no conjunto de dados, 6 foram excluídos devido à amplificação não de quaisquer genes. As restantes células eram células sub-categorizados em 5 tipos com base na expressão de GATA4, Nkx2.5, myl7, e vmhc, e were classificadas por valor ef1a dentro dos grupos. Embora GAPDH foi originalmente incluído como um possível gene housekeeping, expressão era altamente variável através das células, tornando-o inadequado como um gene de manutenção. Expressão GAPDH provavelmente melhor representa alterações ao metabolismo energético associadas com a diferenciação cardíaca neste tipo de célula. Curiosamente, havia uma célula na qual foi un-ef1a detectável mas um outro gene foi detectável (GATA1 em células 26). Isto sugere que, enquanto ef1a é geralmente um gene de manutenção adequada para diferenciar entre as reacções de transcrição reversa de células individuais bem e mal sucedidas, pode não ser ideal para todas as aplicações. A falta de expressão ef1a na célula 26 pode ser devido à dinâmica de transcrição única célula. Recentes estudos de células individuais demonstram que a transcrição do gene é fundamentalmente estocástica, alternando entre as fases de rápida e desprezível atividade transcricional 26. Tseu modelo de rebentamento transcricional sugere que o uso de um gene de manutenção para comparações quantitativas entre as células individuais podem ser completamente inadequado.

No grupo de Tipo 1, ef1a é o único gene detectável. Estas células podem compreender quer Nkx2.5: ZSY células negativas ou células com muito baixa expressão dos outros genes de interesse. Tipo 2 células, com a excepção de 26-celular, expressas tanto ef1a e GATA4 sem correlação nos níveis de expressão relativa destes genes. Notavelmente, expressão Nkx2.5 em células de Tipo 1 e Tipo 2 pode ser devido ao rigor sub-óptima FACS, rebentamento de transcrição, leakiness transgene, ou níveis de expressão sub-limite. Tipo 3 células expressaram níveis detectáveis ​​de ef1a, GATA4, e NKX-2.5. Estas células são células progenitoras cardíaca prováveis ​​e podem incluir diferenciação cardiomiócitos atriais. Tipo 4 células expressaram níveis detectáveis ​​de ef1a, GATA4, Nkx2.5, myl7 </ em> e vmhc e são células susceptíveis de diferenciação em cardiomiócitos ventriculares. Tipo 5 células expressaram ef1a, GATA4, Nkx2.5, myl7, vmhc e GAPDH. A adição de níveis detectáveis ​​de GAPDH sugere que estas células têm a capacidade para o metabolismo glicolítica aumentada encontrada em cardiomiócitos diferenciadas. Foi interessante que, apesar de triagem para as células positivas ZsYellow da Tg. (Nkx2.5: ZsYellow), embriões, 21/40 células tinham níveis sub-limiar de Nkx2.5 na nossa análise de qRT-PCR Isto poderia ser devido ao rebentamento da transcrição ou poderia refletir diferenças no processamento transcrição entre Nkx2.5 endógeno e ZsYellow. É importante ressaltar que o segundo campo do coração marcador ISL1 não foi detectada em qualquer célula ou cDNA reunidos a partir de todos os nossos locais de captura. Em suma, comparando através amostras, heterogeneidade substancial foi evidente no nível da célula única, sugerindo que aos 18 hpf, Nkx2.5: ZSY + celLS compreendem células progenitoras cardíacas, bem como da descendência, em diferentes estágios de diferenciação.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20 For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 ml GeneMate C-3261-1
40 um cell strainer Biobasic SP104151
35 mm culture dish Falcon 351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer Falcon 352235
P1000 and tips Rainin 17005089
P20 and tips Rainin 17005091
IFC chip manufacturer's protocol Fluidigm 100-6117 Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette VWR 14673-010 For transferring embryos
Adult wild type zebrafish N/A We used AB line
Adult transgenic zebrafish N/A We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water N/A
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
NaCl FisherScientific S271-3 make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl Sigma Aldrich P5405 make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3 Sigma Aldrich S6014 make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15 Gibco 21083-027
FBS FisherScientific 03-600-511 Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE Life Technologies 12605-010 Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax Genlantis T200100 Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional) Sigma P5147
L/D Dye - Sytox Blue Life Technologies S34857 Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue Gibco 15250-061
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4 Life Technologies Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5 Life Technologies Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7 Life Technologies Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc Life Technologies Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1 Life Technologies Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit Fluidigm 100-5319 Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM Life Technologies 4458237 Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water Corning 46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) Fluidigm 100-5757 IFC plate for small cells
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine Fluidigm 100-5477 For IFC plate use
Hemocytometer  Sigma Aldrich Z359629 For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope For assessing single cell digestion
FACS machine For isolating cells of interest

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References

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