Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d'embryons de poisson zèbre

1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill
Published 3/12/2016
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Developmental Biology

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Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53877, doi:10.3791/53877 (2016).

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Abstract

Introduction

La plupart des études actuelles de biologie cellulaire et moléculaire sont basées sur des moyennes de la population. Cependant, les événements biologiques importants peuvent être masqués par ces analyses basées sur la population traditionnelle puisque les populations mineures peuvent jouer un rôle majeur dans les processus biologiques et les résultats de la maladie. Comprendre l' expression des gènes dans les populations hétérogènes au niveau de la cellule unique peut (et a) conduire à des idées biologiques et cliniques pertinentes 1,2. Une préoccupation pour les études de développement embryonnaire, dans une plus grande population de cellules, les cellules progénitrices sont souvent sous - représentées, ce qui rend difficile de détecter les changements subtils dans l' expression des gènes qui déclenchent finalement les décisions du destin cellulaire 3. De même, un seul type de cellule peuvent avoir des profils d'expression différents en réponse au microenvironnement 4. Par exemple, les cellules endothéliales résidentes dans le même organe ou dans différents organes (par exemple., De l' aorte ou des reins) présentent une hétérogénéité significative malgré le partage MORP communhological caractéristiques fonctionnelles et 5. En outre, les cellules cancéreuses qui peuplent la même tumeur peuvent également avoir des profils variés ou des mutations moléculaires au niveau cellulaire unique 6.

Dans des systèmes modèles, transcriptomique dans des cellules individuelles a réussi à identifier de nouvelles populations de cellules, caractérisé par des états intermédiaires qui se produisent au cours de la différenciation cellulaire, et ont révélé des réponses cellulaires à des stimuli différentielles 7,8,9. Ces idées auraient été masqués dans des études basées sur la population classiques. embryons de poisson zèbre sont une source extrêmement sous-utilisées de la tige, progéniteurs et la différenciation des cellules pour explorer des questions d'hétérogénéité cellulaire unique et la régulation moléculaire des identités cellulaires au cours du développement. Leur très stéréotypée, ex vivo le développement et la facilité de manipulation génétique font un excellent système modèle pour cette approche 10,11. Plus précisément, une limitation majeure à l'interprétation de la cellule unique genles données e d'expression est que l' identification fiable des nouveaux états de cellules intermédiaires au cours du développement exige une synchronisation très prudent de la collecte des tissus 9. Cela est nécessaire pour assurer que l'hétérogénéité entre les cellules capturées représente l'hétérogénéité au sein d'un tissu à un seul point du temps plutôt que de l'hétérogénéité dans l'expression des gènes présenté par la différenciation des cellules dépendant de l'âge. Par rapport à des souris, le développement de l' embryon de poisson zèbre peut être précisément synchronisée à travers un grand nombre d'embryons 12. En outre, avec les grandes tailles d'embrayage, les embryons de poisson zèbre peuvent être utilisés comme une source abondante de cellules souches et progénitrices.

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules à partir d'embryons de poisson zèbre et de capturer des cellules individuelles en utilisant un circuit de microfluidique intégré (IFC) puce et autoprep système disponible dans le commerce pour qRT-PCR analyse de l'expression génique. Ce protocole peut être rapidement cessible à tous les essais à haut débit de multiplexage, y compris touteséquençage du transcriptome qui permet une analyse plus complète de l' hétérogénéité cellulaire 13. Il offre également plusieurs avantages aux essais traditionnels d'expression génique. Le protocole d'isolement d'une cellule unique donne une viabilité élevée après FACS, ce qui diminue la proportion de cellules compromis qui sont inclus dans les applications en aval. En utilisant un CFI, les cellules capturées peuvent être directement observées pour évaluer les taux de capture et d'évaluer la santé des cellules morphologiquement. En outre, ce protocole est largement applicable à la communauté de recherche zebrafish, exigeant seulement une ligne de poissons transgéniques étiquetés et l'accès aux technologies de capture de cellules microfluidiques.

Comme preuve de principe, des cellules individuelles dérivées de progéniteurs cardiaques ont été isolés et capturés sur une puce IFC, puis l'abondance relative des marqueurs de différenciation cardiaque a été mesurée par qRT-PCR. l'analyse de l'expression génique au niveau de la cellule unique démontre que progéniteurs cardiaques coexistent avec leur différeprogéniture ntiating. L'idée tirée de profilage à cellule unique de progéniteurs cardiaques peut faire la lumière sur l'hétérogénéité des profils d'expression génique entre les cellules progénitrices cardiaques au cours du développement des vertébrés, qui peuvent avoir été masqués dans les analyses basées sur la population traditionnelle.

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Protocol

Ce protocole nécessite l'utilisation de direct, le poisson zèbre adulte pour produire des embryons. Les embryons sont récoltés pour la collecte des tissus. Il est essentiel d'obtenir l'approbation de l'éthique appropriées commissions d'examen pour mener cette expérience.

1. Obtenir Embryons étagées

  1. La veille de l'expérience, la préparation, le poisson zèbre adulte en bonne santé pour la reproduction. Placez un mâle et une femelle sur les côtés opposés d'un diviseur clair dans un réservoir d'élevage.
  2. Répétez 1.1 pour autant de réservoirs que nécessaire pour la production d'embryons suffisante pour l'application en aval de reproduction. Obtenir des embryons de deux poissons sauvages de type et les poissons transgéniques qui expriment des protéines fluorescentes dans le type cellulaire d'intérêt.
    NOTE: Le nombre d'embryons nécessaires pour les applications en aval dans les étapes 2-8 dépend de l'abondance relative des cellules d'intérêt au point d'intérêt de temps. Bien que cela puisse varier selon le type de cellules, 200 embryons produisent 2000-5000 cellules triées lorsque le caunes d'intérêt représentent <1,0% des cellules totales à 24 HPF (heures après la fécondation).
  3. Le lendemain matin, changer l'eau dans le réservoir de panure en transférant les poissons à un réservoir d'élevage frais et retirez le diviseur. Inclinez le réservoir à un angle afin d'encourager l'élevage.
  4. Recueillir des embryons mis en scène.
    1. Toutes les 15 min, recueillir des embryons en transférant les adultes à un réservoir d'élevage frais et en passant les œufs qui sont laissés à travers une passoire à thé.
      NOTE: embryons de poisson zèbre se développent de manière synchrone lorsqu'il est maintenu à des densités et des températures comparables.
    2. Rincer les oeufs avec des oeufs de l'eau (0,21 g / L instantanée des sels de l'océan dans 1 L d'eau distillée deux fois) et transfert à une boîte de Pétri. Transférer la boîte de Pétri à un incubateur humide à 28,5 ° C avec une circulation d'air.
  5. Deux heures après la dernière collecte, tri fécondé, les embryons multicellulaires en 10 cm des boîtes de Pétri et de réduire la densité à 50 embryons par boîte. Sélectionnez des embryons provenant d'une seule, 15fenêtre de temps min de la collecte pour l'application en aval. Incuber embryons à 28,5 ° C.
    NOTE: Par exemple, la collecte d'embryons à 8:30, 08h45, 09h00, 09h15, 09h30, 09h45, 10h00 et 10h15. La comparaison entre les points de temps, si le plus grand nombre d'embryons fécondés sont des embrayages collectées à 9:00, puis utilisez seulement ces embryons pour des applications en aval.

2. Set Up pour cellule unique Dissociation

  1. Environ 30 minutes avant le point d'intérêt (18 HPF) de temps supprimer les embryons de leur chorion manuellement à l'aide de pinces fines.
  2. Recueillir et étiqueter pour chaque condition qui suit: deux 2 ml microtubes, un 40 um crépine cellulaire, une boîte de 35 mm de culture cellulaire, et deux FACS tubes surmontés avec un tamis cellulaire de 35 pm.
  3. Refroidir les réactifs suivants sur la glace: Egg eau contenant 0,21 g / L sels de l'océan instantanée dans 1L d'eau distillée deux fois; De-yolking tampon contenant NaCl 55 mM , KCl 1,8, et 1,25 mM NaHCO 3; et le tampon FACS contenant de Leibovitz L-15 milieux additionnés de sérum bovin fœtal 5% inactivé à la chaleur.
  4. Apportez 1 ml par échantillon de Cell Dissociation Réactif 1 à RT Thaw 1 ml de cellules Dissociation Réactif 2 par échantillon sur la glace. Porter à TA, immédiatement avant utilisation.

3. cellule unique Dissociation

  1. À l'aide d'une pipette en verre large de l'alésage, le transfert d'embryons 100-300 dans un tube de centrifugeuse de 2 ml de micro dans un volume minimum d'eau oeuf.
  2. Euthanasier embryons en remplaçant l'eau avec l'eau Oeuf 1 ml glacée et submergeant tube dans la glace pendant 20 min.
    ATTENTION! Il est essentiel d'obtenir l' approbation du comité de surveillance appropriée de protection des animaux pour cette méthode d'euthanasie (refroidissement sur ​​la glace suivie par la dissociation cellulaire comme l' euthanasie secondaire). l'euthanasie norme exige généralement que les embryons <3 jours après la fécondation sont blanchis après qu'ils sont refroidis, ce qui ne convient pas pour l'obtention de cellules viables.
  3. Laver les embryons deux fois avec 1 ml Egg eau glacée. Pour laver, utiliser une grande pipette en verre d'alésage pour enlever Egg eau et un P1000 pour ajouter Egg eau.
  4. Retirer le jaune en remplaçant l'eau de l'embryon avec 1 ml Deyolking Buffer et triturant 8-12 fois avec une pointe de P1000, ou jusqu'à ce que le jaune est dissous et que les corps des embryons sont visibles.
  5. Recueillir le tissu par centrifugation à 300 g pendant 1 min. Utiliser une pipette pour enlever délicatement le surnageant sans perturber le culot de tissu. Re-suspendre Egg Water 1.
  6. Répétez l'étape 3.5 pour un total de trois lavages, mais sur le lavage final, remettre en suspension dans 1 ml RT cellulaire Dissociation Réactif 1.
  7. Incuber dans la cellule de dissociation de réactif 1 pendant 10 min à température ambiante avec des tubes placés à l'horizontale. Chaque 2-3 min, triturer doucement avec une pipette P1000 pour empêcher l'agglutination.
    REMARQUE: Manipuler les échantillons doucement au cours des étapes de trituration. Parfois, une seule grande touffe formera dans le tube à partir d'un enchevêtrement de corps d'embryon. Cette volontédisperser la digestion supplémentaire assistée par trituration douce. NE PAS VORTEX.
  8. Recueillir le tissu par centrifugation à 300 g pendant 3 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de cellules Dissociation Réactif 2.
  9. Incuber pendant 5-15 min à température ambiante. Placer les tubes horizontalement. Chaque 2-3 min, triturer doucement pour empêcher l'agglutination. Toutes les 5 min, d'évaluer les progrès de la digestion.
    1. Pour évaluer les progrès de la digestion, diluer 2 ul surnageant dans 18 pi de tampon FACS et pipette comme une goutte sur une boîte de culture cellulaire.
    2. Placez une lamelle sur l'échantillon et observer sous un microscope de culture tissulaire à 10X et 20X grossissements.
      NOTE: La préparation doit apparaître comme un mélange de cellules individuelles, de petits groupes, de grandes grappes, et le corps de l'embryon essentiellement intacte occasionnelle.
    3. évaluer visuellement la proportion de la préparation qui est des cellules individuelles et de petits agrégats.
      REMARQUE: Over-digestion permettra de réduire la viabilité; sous-digestion va réduire le rendement de la cellule unique. </ Li>
  10. Recueillir la préparation cellulaire par centrifugation à 300 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de tampon FACS froid.
  11. Humidifiez un tamis cellulaire de 40 pm avec FACS Buffer. Passer la suspension cellulaire à travers le tamis cellulaire de 40 pm sur une boîte de culture cellulaire de 35 mm. Laver le tamis cellulaire une fois avec 1 ml FACS tampon de tri.
  12. Transférer le flux continu dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min et remettre en suspension dans 100 pi FACS Buffer.
  13. Comptez le rendement cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Diluer les échantillons à 5x10 6 cellules par ml, ou la concentration optimale recommandée pour FACS la machine de choix. Facultatif: Lors du comptage rendement des cellules sur le hémocytomètre, les cellules mortes Counterstain avec du bleu trypan pour confirmer la viabilité de la préparation cellulaire avant tri FACS.
    NOTE: Les préparations sont trop diluées prendra quantité excessive de temps à trier. Les préparatifs qui sont trop concentrated ont tendance à agglomérer en multimères et sont suboptimale pour trier une population pure.
  14. Réserve 10-20% de chaque échantillon à utiliser comme témoins non colorées. Pour les échantillons restants, les cellules mortes de la tache en ajoutant un live fluorescent / morts (L / D) la discrimination colorant dans chaque échantillon. Ne pas laver.
    REMARQUE: Tout colorant fluorescent qui pénètre dans les cellules avec des membranes cellulaires compromises et les taches acides nucléiques peuvent être utilisés comme colorant L / D, à condition que les spectres de fluorescence est compatible avec la machine FACS de choix et d'étiquetage fluorophore cellules d'intérêt.
    1. Ne pas laver la préparation après l'ajout du colorant comme certaines cellules meurent en transit vers la purification FACS et devraient être exclues de la population triée.
  15. Humidifiez la crépine 35 um cellulaire plafonné FACS tube avec un tampon FACS de 20 pi. Ajouter les cellules à la crépine et de recueillir par gravité. Stocker sur la glace.

4. FACS Enrichissement

  1. Utilisez FACS pour enrichir unique, Des cellules vivantes exprimant le marqueur fluorescent.
    1. Définir une porte de distinguer les cellules des débris sur un nuage de points de diffusion vers l'avant (FSC-A) amplitude vs diffusion latérale amplitude (SSC-A), les deux avec mise à l'échelle linéaire.
      Attention! Cellules Zebrafish sont généralement plus petits que la souris ou des cellules humaines. Cela se traduit par une séparation de base plus faible entre les cellules et les débris.
    2. De la porte définie dans 4.1.1, définir une grille pour enrichir des cellules individuelles et d'exclure multimères l'aide d'un diagramme de dispersion de la hauteur avant de dispersion (FSC-H) et une faible hauteur de diffusion latérale (SSC-H), les deux avec mise à l'échelle linéaire.
      NOTE: Les cellules avec disproportionné FSC-H et une faible SSC-H sont multimères probables et sont exclus du tri.
    3. De l'ensemble de grille dans 4.1.2, en utilisant des commandes de couleur unique, définir une grille pour inclure uniquement les cellules vivantes en utilisant un diagramme de dispersion de FSA-A avec mise à l'échelle linéaire et l'amplitude du canal utilisé pour détecter L / D tache avec journal mise à l'échelle. Inclure les cellules L / D négatives.
    4. Dela porte définie dans 4.1.3, en utilisant les commandes de couleur unique, définir une grille pour inclure uniquement les cellules vivantes avec une fluorescence positive en utilisant un diagramme de dispersion de la FSA-A avec mise à l'échelle linéaire et l'amplitude du canal utilisé pour détecter le marqueur de cellule de la protéine fluorescente avec log échelle . Inclure des cellules positives.
    5. Définissez les contrôles de compensation, le cas échéant, pour tenir compte des interférences entre le L / tache D et le spectre de la protéine fluorescente.
  2. Ensemble logique de tri à des cellules qui entrent dans toutes les portes prévues à l'étape 4.1.
    1. En utilisant des cellules à double marquées, vérifier gating pour le tri cellulaire.
      NOTE: Les cellules de tri seront des cellules plutôt que des débris, des cellules individuelles plutôt que des multimères, L / cellules positives et négatives fluorescence D.
  3. Trier 2,000-4,000 cellules de la population d'intérêt dans 5 pi de tampon FACS à froid dans un tube à centrifuger sur la glace. Pour réduire au minimum le cisaillement et la tension sur les cellules pendant le tri, utiliser les pressions les plus bas possible pour la celluletrieur.
    NOTE: La gouttelette 5 pi de tampon FACS sert de coussin pour les cellules sortant de la machine FACS. La collecte 2,000-4,000 cellules directement dans le tampon FACS élimine la nécessité d'une centrifugation avant de charger sur les puces IFC. Cette stratégie est recommandée, car la centrifugation peut conduire à la formation de multimères si les cellules adhèrent les unes aux autres dans le culot.
  4. Évaluer l'analyse de la viabilité post-tri.
    1. Transfert 1 pl triées cellules à un tube FACS frais avec 100 pi FACS tampon et 1 tri: 1000 dilution de L / D tache. Passez les cellules à travers le trieur FACS avec la stratégie de déclenchement à l'étape 4.1. Utilisez la proportion de L / D négatif au positif pour estimer la viabilité des cellules triées.

5. Charger des cellules sur la microfluidique Chip

  1. L'utilisation d'un hémocytomètre, mesurer à la fois la concentration et la taille des cellules triées.
    1. Diluer les cellules triées à au moins 10 pi. Diluer une aliquote de 5 μ; L cellules avec 5 ul bleu trypan. Chargez sur hémocytomètre et appliquer la lamelle.
    2. Collecter des images lumineuses de toutes les cellules de terrain en 4 x 4 grilles de hémocytomètre. Compter le nombre de cellules vivantes et calculer vivantes cellules / ml. Les cellules vivantes ne prennent pas en bleu trypan.
      REMARQUE: Utiliser un logiciel d'analyse d'image standard pour mesurer le diamètre de toutes les cellules vivantes. Calculer la moyenne et l'écart-type de la taille de la cellule, puis sélectionnez une plaque d'IFC adapté à la gamme de taille de cellule d'intérêt. Si gamme de taille de la cellule chevauche une plaque IFC gamme de la taille des cellules, utiliser plusieurs plaques pour capturer la gamme complète des cellules d'intérêt.
  2. Les cellules de charge sur la plaque IFC selon les instructions du fabricant (voir Matériaux).
    1. Diluer cellules à 1x10 6 cellules / ml et effectuer l' optimisation de la flottabilité selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE: l'optimisation de la flottabilité assure que les cellules ne coulent au fond, ni flottent à la surface de l'wel de chargementl pour le chargement optimal sur puce IFC. Le rapport du tampon à des cellules peut varier selon le type de cellule, mais se situe typiquement 6: 4-7: 3 de cellules: tampon.
    2. Ajouter les cellules à apprêté-IFC plaque. Plaque de chargement dans fluidics machine compatible, et exécuter un script cellule de charge pour pousser les cellules à travers le circuit de microfluidique et en voies de capture.
  3. Confirmer que les cellules sont déposées dans des sites de capture sur plaque IFC.
    1. Retirer la plaque IFC de fluidics machine. Monter la plaque IFC sur un microscope équipé d'un adaptateur de plaque.
    2. Recueillir des instantanés de champ lumineux et la fluorescence pour chaque site de capture à un grossissement de 10X.
      REMARQUE: Les temps Brightfield de capture peuvent varier de 10-50 ms, en fonction de l'intensité de la lampe. fois la fluorescence de capture peuvent varier de 250-750 ms, en fonction de la luminosité fluorophore. Évitez surexposer cellules pour prévenir le photovieillissement.

6. Synthèse d'ADNc

  1. Effectuer la lyse des cellules in situ selon Iles instructions du FC fabricant de plaque.
    1. Ajouter des tampons de lyse aux puits sur la plaque IFC. Plaque de chargement sur fluidiques compatibles machine et script de lyse cellulaire d'exécution selon les instructions du fabricant.
  2. Effectuer la transcription inverse selon les instructions de l'IFC fabricant de plaque.
    1. Ajouter les réactifs de transcription inverse à la plaque IFC. Plaque de chargement sur fluidiques compatibles machine. Exécutez le script de transcription inverse. Exemples de conditions de cyclisme: 1 cycle à 25 ° C pendant 10 min, 1 cycle à 42 ° C pendant 1 heure, puis 1 cycle à 85 ° C pendant 5 min.
  3. Effectuer pré-amplification avec des sondes spécifiques du gène selon les instructions de l'IFC fabricant de plaque.
    NOTE: En raison de leur plus grande spécificité avec un nombre faible nombre de copies, utiliser des sondes fluorogènes marqués plutôt que des sondes optimisées pour une utilisation avec des colorants intercalants.
    1. amorces Piscine et diluer à la finale de 180 nM chacune. Ajouter amorces regroupées à la plaque IFC. plaque de charge sur FLUIDI compatibleMachine cs. script préamplification Exécuter.
  4. Effectuer le pré-amplification avec les conditions de cycle suivantes: 1 cycle à 95 ° C pendant 10 min, puis 18 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 15 secondes, puis recuit et extension à 60 ° C pendant 4 min. Magasin de pré-amplifié l'ADNc à 4 ° C jusqu'à la récolte. Récolte d'ADNc de la plaque microfluidique selon les instructions du fabricant et magasin à -20 ° C jusqu'à utilisation.

7. Sélectionnez l'ADNc à partir de cellules uniques pour cible unique qRT-PCR

  1. Diluer ADNc dans 25 ul de réactif de dilution selon les instructions du fabricant.
    NOTE: le rendement final approximatif est de 28 pi d'ADNc pré-amplifiée par cellule. Réserver une partie aliquote du diluant destiné à être utilisé en tant que témoin sans matrice dans la qRT-PCR.
    1. Se référant au champ lumineux et des images fluorescentes enregistrées à l'étape 5.3.2, marquer chaque site de capture. compter manuellement et enregistrer le nombre de cellules. Évaluer et enregistrer si chaque cellule est la grippeorescent.
      NOTE: Chaque site individuel peut contenir 0, 1, ou> 1 cellule, où> 1 cellule comprend des sites de capture qui contiennent des cellules multiples et / ou des débris non identifiables. Si les images sont de qualité suffisante, une valeur de pixel peut aussi être affectée à quantifier l'intensité du signal de fluorescence.
  2. Sélectionnez échantillons pour analyse qRT-PCR.
    1. Sélectionnez échantillons d'ADNc à partir de sites de capture identifiés à l'étape 7.2 qui contiennent exactement 1 cellule avec une fluorescence positive. Piscine 1 ul aliquotes de l'ADNc à partir de chaque échantillon.
      NOTE: Ceci est le "Pool" contrôle positif utilisé pour déterminer si les gènes d'intérêt sont exprimés dans l'une des cellules sélectionnées.
    2. Sélectionner un ADNc à partir d'au moins un site de capture qui contient exactement 0 cellules en tant que témoin négatif. Utilisez le diluant de l'étape 7.1.2 comme témoin sans matrice.
  3. Exécutez dosage qRT-PCR.
    1. Utilisez uniquement des sondes utilisées pour la pré-amplification à l'étape 6.4.1. Charger tous les échantillons en triplicate. Les conditions de cyclage pour une réaction de 10 pl sur une plaque à 384 puits: 1 cycle 50 ° C 2 min, 1 cycle de 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles avec une dénaturation à 95 ° C 15 sec, puis recuit et extension à 60 ° C pendant 1 min.

Analyse 8. Données

  1. Validez produits qRT-PCR par électrophorèse sur gel standard. Confirmer produit est une bande unique à poids moléculaire attendu (varie pour chaque sonde).
    NOTE: Si une sonde produit de multiples bandes ou une seule bande à une taille inappropriée, alors la spécificité est discutable, ce qui exclut le gène de l'analyse.
  2. Examinez toutes les courbes d'amplification et compte pour d' éventuelles anomalies 14. Calculer la valeur CT moyenne pour chaque combinaison échantillon / gène 15.
    NOTE: Les valeurs de CT pour les contrôles positifs varient généralement de 10 à 30. valeurs CT pour les contrôles négatifs varient généralement de 35 à 40 (pas d'amplification). Valeurs CT 30-35 sont considérés comme très faible expressionet doivent être interprétées avec prudence 14.
  3. Rapport de données
    1. Si les échantillons tombent dans la CT = 10-30, les données peuvent également être signalés comme facteur de changement de l'abondance des transcrits par rapport à un échantillon témoin.
      REMARQUE: Plier le changement est égal à 2 ^ (- ΔΔCT) où ACt est relative à un gène de ménage en soustrayant la CT moyenne de l'échantillon à partir du gène de ménage et ΔΔCT est les différences de ACt entre l'échantillon et un contrôle positif 15.

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Representative Results

Comme preuve de principe, l'expression des gènes a été évaluée pour explorer la dynamique de différenciation au cours du développement cardiaque. Chez le poisson zèbre, les progéniteurs cardiaques proviennent d'une population mésodermique de cellules qui migrent vers la plaque latérale mésoderme antérieure où ils fusionnent pour former le tube cardiaque linéaire. Avant la fusion, les progéniteurs cardiaques commencent à exprimer le Nkx2.5 facteur de transcription (NK2 homéoboîte 5), qui est considéré comme le premier marqueur spécifique des progéniteurs cardiaques 16,17. Ici, un taux d' alcoolémie décrit précédemment poissons transgéniques Tg (Nkx2.5: ZsYellow) 18, Nkx2.5 abrégé: ZSY a été utilisé pour examiner les marqueurs de différenciation cardiaques dans des cellules individuelles au stade 18 somites, 18 heures après la fécondation (HPF) 12. Ce fut le premier point de temps auquel le signal ZsYellow était détectable visuellement. Comme décrit précédemment pour cette lignée transgénique, ZsYellow étiquettes progéniteurs cardiaques, comme nousll en quelques cellules extra-cardiaque qui donnent lieu à l'arc pharyngé cellules endothéliales à 28 HPF 19 (figure 1A-B, les données non présentées). A 18 HPF, Nkx2.5: embryons ZSY ont été dissociées en une seule suspension cellulaire puis colorées avec Sytox bleu pour exclure les cellules mortes. Direct, ZsYellow positif, les cellules bleues Sytox négatives ont été triées par FACS à l' aide soit d' un trieur MoFloXDP ou Sony SH800Z équipé de buse de 100 um (figure 1C-F). Pour évaluer la pureté de la population et de post-tri viabilité triés, une aliquote de cellules triées ont été colorées avec Sytox bleu et évalué le pourcentage d'événements qui relevait de la porte de tri d' origine (Figure 1G-J).

Après le tri, les cellules ont été introduites dans un circuit intégré microfluidique (IFC) Flux de travail à puce (figure 2A) selon les instructions du fabricant. Un hémocytomètre, combiné avec exclusio bleu trypann a été utilisé pour mesurer le diamètre de la cellule, la concentration et la viabilité (figure 2B, et les données non représentées). Cellule de flottabilité a été optimisée (6,5: 3,5: cellules tampons) selon les instructions du fabricant, et les cellules ont été chargés sur un CFI pour capturer 5-10 pm cellules de diamètre. Pour évaluer l'efficacité de la capture, la fluorescence et / ou des signaux lumineux sur le terrain ont été imagées sur tous les sites de capture, une fonction de carrelage dans FIDJI a été utilisé pour assembler une seule image de la plaque de la microfluidique. Chaque site de capture contient 0, 1, ou> 1 cellules individuelles (Figure 2C-F). Comme prévu de l' enrichissement FACS, les cellules capturées exprimées ZsYellow (Figure 2G). L' efficacité de capture a dépassé 90% dans les 5 expériences individuelles à l' aide Nkx2.5: ZSY cellules triées, et au moins 70% des sites de capture a été occupée par une seule cellule (données non présentées). Les cellules ont été lysées, l'ARN isolé, l'ADNc synthétisé et les gènes cibles spécifiques ont été amplifiés, le tout selon les instructions du fabricant.

Un sous-ensemble de sites de capture de cellules ont été sélectionnées pour une analyse qRT-PCR comme décrit dans le protocole ci-dessus. Plus précisément, le facteur d'élongation 1a (efl1a) 20 et de la glycéraldéhyde-3 phosphate (GAPDH) 21 ont été testés en tant que gènes d'entretien devraient être exprimés dans toutes les cellules; GATA protéine de liaison 4 (GATA4) 22 et NK2 homeobox 5 (Nkx2.5) comme marqueurs précoces progénitrices cardiaques; ISL LIM homeobox 1 boîte de 1 (Isl1) comme un champ deuxième marqueur cardiaque 23,24; et de la chaîne légère de myosine (de myl7) et la myosine ventriculaire chaîne lourde (vmhc) 25 pour marquer cardiomyocytes ventriculaires. Sondes spécifiques de gènes ont été validés à l' aide d' ADNc à partir de 48 embryons HPF (figure 3). qRT-PCR a été utilisée pour évaluer l'expression génique relative de ces gènes dans 45 cellules isolées à partir de 18 HPF embryons, un contrôle sans matrice négative, et une population groupée containi témoins positifsng d'ADNc à partir de l'ensemble des 96 sites de capture. Les valeurs brutes CT pour 40 cellules et des contrôles représentatifs sont présentés dans le tableau 1. En particulier, à partir du pool de 46 cellules examinées, 6 cellules ont été exclus de l'analyse parce que toutes les valeurs de CT d'expression génique dépassé CT = 35,0, et on ignore si ces hauts CT les valeurs sont attribuables à de vrais niveaux, d'expression très faible ou la dégradation de l'échantillon. Depuis la plage de valeurs CT pour le gène de ménage, EF1A, était trop large pour comparer l' expression des gènes entre les échantillons, et de nombreuses valeurs CT dépassé 30, les valeurs CT ont été visualisées sous forme de carte de chaleur (Figure 3). La comparaison entre les échantillons, l' hétérogénéité substantielle de l'expression génique a été observée, et les cellules sont des cellules que le type 1-5 sur la base de modèle d'expression (figure 3) classé.

Figure 1
Figure 1. Un seul isolement cellulaire de zebrafish cellules positives ZSY à 18 HPF images de montage entières de représentant Tg (Nkx2.5: ZsYellow). embryon à 18 HPF avec (A) ZsYellow fluorescence seul ou (B) a fusionné image lumineuse sur le terrain avec. Stratégie de déclenchement (CF) représentant FACS pour enrichir des cellules positives ZsYellow et (GJ) Analyse post-tri avec (C, G) FSC / SSC taille gating, (D, H) la discrimination doublet, (E, I) en direct gating / Dead et (F, J) , de préférence la population. La barre d'échelle est de 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Single de capture cellulaire de Nkx2.5 zebrafish: ZSY ong> cellules positives (A) Flux de travail.. (B) la distribution de taille de la cellule pour les cellules triées de Tg (Nkx2.5: ZsYellow) embryons isolés à 18 HPF. (CF) représentatifs Les événements de capture de cellules sur la plaque IFC où (C) est un puits vide, (D) contient deux cellules, (E) a une seule cellule logée dans le canal fluidique comme une «capture de canal», et (F) est une seule cellule capturée. boîtes pourpres marquent encart pour une vue agrandie de sites de capture. (G) de capture cellulaire simple avec fond clair, ZsYellow et a fusionné les images. (CF) White barre d'échelle est de 50 um; jaune barre d'échelle est de 10 um. (G) La barre d'échelle est de 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Gene analyse de l' expression de la capture unique Nkx2.5 zebrafish:. ZSY cellules positives expression génique par qRT-PCR dans les contrôles positifs (embryons à 2 jours post-fécondation, regroupés ADNc à partir de cellules individuelles), témoin négatif (sans matrice ) et 40 cellules individuelles (Cell 01-40). Les valeurs brutes de CT ont été codés par couleur sur la base comme décrit dans la clé. EF1A = facteur d' allongement 1a, GATA4 = protéine GATA liaison 4, Nkx2.5 = NK2 homeobox 5, chaîne myl7 = myosine de lumière 7, vmhc = myosine ventriculaire chaîne lourde, GAPDH = glycéraldéhyde-3 phosphate et Isl1 = ISL LIM homeobox 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Seuil de cycle (CT)
EF1A GATA4 nkx25 myl7 vmhc GAPDH Isl1
Embryon 20.69 20.92 28.59 32.87 26.30 27.00 33.57
Piscine 26,4 22,4 27,7 27,4 24,5 29.2 40,0
NTC 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Type 1 Cell-01 25.1 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-02 25.4 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-03 26,3 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-04 27,4 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-05 28,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-06 28.2 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-07 29,3 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40.0
Cell-08 30,7 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-09 34,3 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
type 2 Cell-10 23,5 28,0 40,0 40,0 40,0 26,3 40,0
Cell-11 23,5 27.2 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-12 23,7 17,9 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-13 24.1 32,4 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-14 24.9 27,5 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-15 25,9 28,6 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-16 26,0 28.1 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-17 27,0 27,7 40,0 40,0 40,0 38,5 40,0
Cell-18 27,0 27,4 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-19 27,0 30.2 40,0 40,0 40,0 38.2 40,0
Cell-20 27,0 28.2 40,0 40,0 40.0 39.2 40,0
Cell-21 27,7 30,3 40,0 40,0 40,0 38,6 40,0
Cell-22 30,4 26,2 40,0 40,0 40,0 38,3 40,0
Cell-23 31,3 22,4 40,0 40,0 40,0 39,7 40,0
Cell-24 31,5 28,8 40,0 40,0 40,0 39,5 40,0
Cell-25 33,8 27,4 40,0 40,0 40,0 37,3 40,0
Cell-26 40,0 27,4 40,0 40,0 40,0 36,6 40,0
Type 3 Cell-27 24.7 19,9 28,8 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-28 24.8 28.4 26,3 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-29 25.1 23,5 27,6 40,0 40,0 32,5 40,0
Cell-30 26,3 21,4 27,5 40,0 40,0 39,9 40,0
Cell-31 26,9 24.8 28.2 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-32 27,0 22.5 23,8 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-33 27,8 27,6 27.7 40,0 40,0 40,0 40,0
Cell-34 28.1 21.9 26.6 40,0 40,0 37,7 40,0
Cell-35 29,3 26,5 28.1 40,0 40,0 38,3 40,0
Type 4 Cell-36 24.8 20,3 26,0 27,4 26.6 40,0 40,0
Cell-37 28,7 22.3 25,9 28,9 22,9 38,5 40,0
Type 5 Cell-38 25,5 20,0 29,3 23,0 19,9 25,9 40,0
Cell-39 25,9 21,8 28,6 25.1 21,7 25,7 40,0
Cell-40 28,9 22,0 27,0 23,0 21.3 27,6 40,0

Tableau 1. Valeurs brutes CT.

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Discussion

Le procédé décrit ici utilise l'expression d'une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur spécifique de type cellulaire pour enrichir une population de cellules souches cardiaques à partir d'embryons de poisson zèbre pour une utilisation dans microfluidique système assisté de capture de cellule unique pour évaluer l'expression d'un sous-ensemble de gènes cardiaques en simple cellules. À condition que FACS excitation laser et d'émission de capacités sont compatibles avec le fluorophore (s) de choix, cette méthode peut être utilisée pour toute ligne indicatrice fluorescente. De nombreuses lignes de reporters de poisson zèbre sont déjà en existence, et les poissons transgéniques portant de nouveaux reporters peuvent être générés en aussi peu que 3 mois. En outre, ce flux de travail peut être adapté pour produire de l'ADNc de l'ensemble transcriptome pour un seul séquençage cellulaire ARN. Pour ce faire, les étapes 5-7 devront être légèrement modifiées pour une utilisation avec des chimies optimisés pour la préparation d'ADNc pour générer des bibliothèques appropriées pour le séquençage de l'ARN. Cependant, il est souhaitable de valider l'hétérogénéité de la populationen utilisant le procédé décrit ci-avant pour pinçant applications de séquençage à haut débit.

Il est important de noter qu'il existe certaines limites à la méthode décrite. Tout d'abord, l'utilisation de plaques intégrées circuit microfluidique (IFC) exige, des équipements coûteux spécialisés. Cependant, les puces microfluidiques offrent des avantages substantiels par rapport aux traditionnels 96 puits et 384 formats de plaques et pour tester des cellules individuelles. Par cellules et réactifs par micromètre voies à grande échelle qui coule, des cellules individuelles sont positionnées dans des sites de capture unique où ils peuvent être observés directement pour confirmer qu'ils sont des cellules uniques en bonne santé. Extraction d'ARN et synthèse d' ADNc se produire in situ sur la puce SFI en utilisant de très faibles volumes pour chaque cellule. puces fluidiques intégrés, au moment de la rédaction de ce document, sont disponibles dans le commerce par le biais d'une seule source. Bien que la fabrication non commerciale a été réalisée par plusieurs groupes, il est en dehors de la capacité de la plupart des laboratoires. Les étapes 5-7 peuventdoivent être modifiées pour les plates-formes produites par d'autres sociétés ou en interne fabrications. Deuxièmement, bien que disponibles dans le commerce des plaques IFC peuvent accueillir jusqu'à 96 gènes, les gènes sélectionnés sont limités par la disponibilité des sondes génétiques fluorogènes marqués validés pour une utilisation chez le poisson zèbre. Troisièmement, les cellules sont généralement plus petits poissons zèbres que les cellules de mammifères, et cette petite taille présente des défis de traitement des échantillons. Une petite variation du diamètre de la cellule se traduit par une variation importante du volume de la cellule, ce qui réduit le matériel disponible et en réduisant la probabilité de détection de l'expression de gènes faible.

Il y a plusieurs considérations supplémentaires pour ce protocole. A l'étape 1, il est important que des embryons fertilisés d'utilisation dans un laps de temps court. température Garder constante et sans limiter les conditions d'oxygène, les embryons de poisson zèbre se développent de manière synchrone. La lecture ultime de ce protocole (expression des gènes par rapport à partir des cellules individuelles) ne peut pas discriminer la source de héténéité entre les cellules individuelles. Pour cette raison, l'interprétation de l'hétérogénéité intercellulaire repose sur des embryons soigneusement mis en scène et le développement synchrone. Dans les étapes 2-3, il existe un compromis entre la dissociation et sa viabilité. Bien que l'étape 4 sélectionne pour les cellules viables, et l'étape 3 contient plusieurs étapes de filtrage qui permettent d'exclure multimères, sur-digestion permettra de réduire le matériel viable disponible pour FACS et potentiellement réduire le rendement des cellules triées. Étapes à suivre pour dépanner une faible viabilité comprennent la réduction du temps de digestion, de réduire l'intensité de trituration, et l'optimisation du nombre d'embryons dans le matériau de départ. FACS l'enrichissement de la population cellulaire d'intérêt (étape 4) est sans doute l'étape la plus critique dans ce protocole. les critères de tri stringentes sont essentiels pour produire une préparation d'une cellule unique ne contenant que des cellules exprimant la protéine fluorescente d'intérêt à vivre. Contaminer cellules provenant d'autres populations pourrait conduire à la fausse représentation de l'hétérogénéité intercellulaire. notamment,FACS enrichissement d'une population d'intérêt ne se limite pas à la stratégie à deux couleurs montré dans ce protocole. Plus de stratégies complexes peuvent produire des populations de cellules plus fines et sont un moyen rapide d'étendre la méthodologie rapportée dans la preuve de l'étude de principe. Dans l'étape 5, les cellules peuvent être observées directement pour confirmer le nombre de cellules capturées, la santé cellulaire et l'expression de la protéine de fluorescence. Mais, selon la taille de la cellule et de la luminosité, le fluorophore d'intérêt peut ne pas être détectable visuellement et n'est pas une lecture fiable. La réussite des étapes 6-8 nécessite le respect attentif aux protocoles du fabricant.

Comme preuve de principe, le niveau d'un sous - ensemble de marqueurs cardiaques connus d'expression ont été évalués en simple dérivé d'un BAC transgénique Nkx2.5 ligne zebrafish décrit précédemment: ZSY pour examiner les marqueurs de différenciation cardiaque en Nkx2.5 individuelle: cellules positives ZSY à 18 heures après fécondation (hPF). Pour explorer le heterogeneity de marqueurs de différenciation exprimés en Nkx2.5 capturé: les cellules exprimant ZSY, une série de gènes ont été analysés , y compris des gènes domestiques (EF1A, GAPDH), des facteurs de transcription connus pour être mis en marche au début de la spécification cardiaque (GATA4, Nkx2.5), un deuxième champ cardiaque marqueur progéniteur (de Isl1), et des gènes connus pour être activés plus tard lors de la différenciation cardiaque (myl7, vmhc). L'abondance relative de chaque gène a été mesurée par qRT-PCR en calculant le seuil de cycle (CT). La plus basse valeur CT calculée était de 17,9 et la plus élevée était de 40, ce qui représente aucune amplification (tableau 1). Valeurs CT de> 35,0 ont été examinées ci-après détection.

Sur les 46 cellules dans l'ensemble de données, 6 ont été exclus en raison de l'amplification a échoué de tous les gènes. Cellules Les cellules restantes ont été sous-classés en 5 types basés sur l' expression de GATA4, Nkx2.5, myl7 et vmhc et were triés par valeur EF1A au sein des groupes. Bien que GAPDH a été initialement inclus dans un gène de ménage possible, l' expression était très variable à travers les cellules, ce qui rend impropre à un gène de ménage. Expression Gapdh probablement représente mieux les changements du métabolisme énergétique associés à la différenciation cardiaque dans ce type de cellule. Fait intéressant, il y avait une cellule dans laquelle EF1A était non détectable , mais un autre gène était détectable (GATA1 dans les cellules 26). Cela donne à penser que , si EF1A est généralement un gène de ménage suffisant pour différencier les réactions cellulaire inverse transcription simples réussies ou non, il peut ne pas être idéal pour toutes les applications. Le manque d'expression de EF1A dans la cellule 26 pourrait être due à la dynamique de la transcription de la cellule unique. De récentes études de cellules-simples montrent que la transcription du gène est fondamentalement stochastique, en alternance entre les phases de l' activité transcriptionnelle rapide et négligeable 26. Tson modèle d'éclatement de la transcription suggère que l'utilisation d'un gène de ménage pour des comparaisons quantitatives entre les cellules individuelles peut être tout à fait inapproprié.

Dans le groupe de type 1, EF1A est le seul gène détectable. Ces cellules peuvent comprendre soit Nkx2.5: ZSY cellules négatives ou des cellules avec une très faible expression d'autres gènes d'intérêt. Les cellules de type 2, à l'exception de la cellule-26, exprimée à la fois EF1A et GATA4 sans corrélation avec les niveaux d'expression relatifs de ces gènes. Notamment, l' expression de Nkx2.5 dans les cellules de type 1 et de type 2 peut être due à la sous-optimale stringence FACS, l' éclatement de la transcription, transgène leakiness, ou les niveaux d'expression sous-seuil. Les cellules de type 3 ont exprimé des niveaux détectables de EF1A, GATA4 et NKX-2,5. Ces cellules sont des cellules souches cardiaques probables et peuvent comprendre la différenciation des cardiomyocytes auriculaires. Cellules de type 4 ont exprimé des niveaux détectables de EF1A, GATA4, Nkx2.5, myl7 </ em> et vmhc et sont des cellules susceptibles de différenciation en cardiomyocytes ventriculaires. Cellules de type 5 exprimé EF1A, GATA4, Nkx2.5, myl7, vmhc et GAPDH. L'ajout de niveaux détectables de GAPDH suggère que ces cellules ont la capacité pour le métabolisme glycolytique amélioré trouvé dans les cardiomyocytes différenciés. Il était intéressant que, malgré le tri des cellules positives ZsYellow de Tg. (Nkx2.5: ZsYellow), les embryons, les cellules 21/40 avaient des niveaux de Nkx2.5 dans notre analyse qRT-PCR sous-seuil Cela pourrait être dû à l' éclatement de la transcription ou pourrait refléter des différences dans le traitement de la transcription entre Nkx2.5 endogène et ZsYellow. Fait important, le deuxième champ cardiaque marqueur Isl1 était indétectable dans les cellules ou l' ADNc mis en commun de tous nos sites de capture. En somme, la comparaison entre les échantillons, l' hétérogénéité substantielle était évident au niveau de la cellule unique, ce qui suggère que , à 18 HPF, Nkx2.5: ZSY + celcl comprennent des progéniteurs cardiaques ainsi que la descendance à différents stades de différenciation.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20 For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 ml GeneMate C-3261-1
40 um cell strainer Biobasic SP104151
35 mm culture dish Falcon 351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer Falcon 352235
P1000 and tips Rainin 17005089
P20 and tips Rainin 17005091
IFC chip manufacturer's protocol Fluidigm 100-6117 Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette VWR 14673-010 For transferring embryos
Adult wild type zebrafish N/A We used AB line
Adult transgenic zebrafish N/A We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water N/A
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
NaCl FisherScientific S271-3 make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl Sigma Aldrich P5405 make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3 Sigma Aldrich S6014 make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15 Gibco 21083-027
FBS FisherScientific 03-600-511 Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE Life Technologies 12605-010 Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax Genlantis T200100 Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional) Sigma P5147
L/D Dye - Sytox Blue Life Technologies S34857 Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue Gibco 15250-061
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4 Life Technologies Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5 Life Technologies Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7 Life Technologies Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc Life Technologies Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1 Life Technologies Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit Fluidigm 100-5319 Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM Life Technologies 4458237 Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water Corning 46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) Fluidigm 100-5757 IFC plate for small cells
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine Fluidigm 100-5477 For IFC plate use
Hemocytometer  Sigma Aldrich Z359629 For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope For assessing single cell digestion
FACS machine For isolating cells of interest

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References

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

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