완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

Developmental Biology

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Lin, G. W., Chang, C. c. Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining. J. Vis. Exp. (108), e53883, doi:10.3791/53883 (2016).

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Abstract

완두콩 진딧물 Acyrthosiphon의 pisum는 시퀀스 된 게놈과 풍부한 표현형 소성으로, 게놈 및 개발 연구를위한 새로운 모델이되고있다. 다른 진딧물, 등을들 수있다. pisum은 배아가 ovariole의 조립 라인 방식으로 계란 챔버 내에서 개발 처녀 생식 태생 재생을 통해 빠르게 전파. 이전에 우리는 진딧물의 배아에서 mRNA 발현의 검출을 허용 현장 하이브리드의 전체 마운트의 강력한 플랫폼을 설립했다. 단백질의 발현을 분석하지만, 만족스러운 결과를 생성하지 않았다 무성 태생 진딧물의 ovarioles를 면역 염색을위한 프로토콜을 설립했다. 여기에서 우리는 조직 투과성을 증가 설립 방식을 적용 할 때 문제가 있었다 둘 배경 염색을 감소시키는 최적의 조건을보고합니다. 최적화는 다음과 같습니다 필수 F 발견 된 단백질 분해 효소 K (1 μg의 / ㎖, 10 분),의 (1) 배양중간 및 말기 진딧물 배아 또는 항체 침투; 디곡시 제닌 (DIG)에 의해 공급 차단 시약 정상 염소 혈청 / 소 혈청 알부민 (2) 여분 세트 버퍼와 내인성 퍼 옥시다아제 표백 메탄올 오히려 과산화수소 (H 2 O 2), (3)베이스 어플리케이션; 이는 크게 진딧물 조직에서 배경 염색을 감소시켰다. 면역 염색에 최적화 된이 중요한 조건은. pisum과 다른 진딧물의 배아에서 유전자 산물의 효율적인 검색을하실 수 있습니다.

Introduction

진딧물은 작은 (1-10mm) 소프트 기관과 hemipteran 곤충이다. 그들은 피어싱 구기와 체관부 수액을 빨아 식물을 먹고. 또한, 그들은 체관부 수액 다이어트 결핍 필수 아미노산을 합성, 의무적 endosymbiotic 세균 Buchnera의 aphidicola에 의존한다. 진딧물은 봄과 여름 긴 일 photoperiods 그들이 월동 계란 1, 2의 제한된 수의 누워있는 동안 짧은 일 photoperiods에 의해 트리거 성적 난생 재생시 처녀 생식 태생 재생을 포함하는 복잡한 삶의 역사를 가지고 있습니다. 봄이 계란 가을까지 처녀 생식 재생의 많은 라운드를 다음, 모든 여성 진딧물 (fundatrices)의 첫 번째 세대를 생산하기 위해 부화. 연간 라이프 사이클에 무성 성적 단계의 대체가 진화 참신 1,2로 간주 된 진딧물에 순환 처녀 생식. 처녀 생식 태생 진딧물에서, 배아는 난소 세관 (ovarioles)의 달걀 챔버 내에서 발생한다. 반면, 성적 난생 배아는 수정란에서 개발. 외에도 생식 소성에서, 진딧물은 transgenerational 날개 polyphenism를 표시 할 수 있습니다 과밀 신호와 포식자의 위협에 대한 응답으로, unwinged 성별이 여성은 viviparously 장거리 이동을위한 날개 자손을 생성 할 수 있습니다. 완두콩 진딧물의 게놈 시퀀스의 출판 Acyrthosiphon pisum 년 -에 대한 최초의 게놈 서열을 기초 hemimetabolous 곤충 - 수 생식 소성, 날개 polyphenism 및 분자에 진딧물 곤충 - 식물의 상호 작용, 바이러스 벡터링과 공생을 포함한 다른 기능의 추가 탐사 기준 3.

시퀀스 된 게놈 외에, 유전자 발현과 기능을 특성화 툴 성숙한 모델 생물로서 4 완두 진딧물을 촉진해야한다. 우리는 전체 마운트의 강력한 프로토콜을 설명했다 5-7에서의 mRNA의 발현을 검출하기위한 현장 하이브리드에. 이중 가닥 RNA 주입 및 이송을 통해 RNA 간섭 (RNAi) 진딧물 약충 및 성인에서 유전자 침묵에 사용되었지만, 배아 유전자 녹다운을위한 조건은 아직 안정 8-10보고되지 않았다. 면역 염색 및 RNAi의 최저 후, 완두콩 진딧물 배아 11-13에서 수행되기 전에 샘플에서 단백질 발현을 검출 할 수있는 항체 기반의 접근 방식. 그러나, 조직 투과성 및 배경 얼룩 제거의 증가는 완두콩 진딧물의 무성 태생 배아에서 면역 염색을위한 표준 프로토콜을 사용하여 아직 만족스럽지 못하다. 예를 들어, 우리는 조직에 대한 항체의 침투 gastrulating 배아 감소 발견 (8-10 스테이지)과 형태 학적으로 식별 사지 싹 (단계 13 ~ 14)와 배아 항체에 거의 투과 있다고. 또한, 배경 염색은 무성 viviparo에 가시화생식 세포 마커 바사뿐만 아니라 그에 대한 배아 세그먼트 (12, 13)로 표현 Engrailed / Invected 단백질에 대한 항체를 이용하여 염색 우리 완두콩 진딧물의 배아. 사실 배경 염색은 여전히​​ 혼자 차 항체로 염색 배아에서 분명히 볼 수 있었다.

진딧물 조직의 완전성을 손상시키지 않고 투과성을 증가시키기 위해, 우리는 신중 테 K의 농도를 적정하고 진딧물 배아 조직 분해를위한 최적의 조건을 결정 하였다. 완두 진딧물에 비특이적 염색을 방지하기 위해, 우리는 배아를 효과적으로 차단하고 내인성 퍼 옥시다아제 (POD)의 활성, 면역 동안 신호를 증폭하기 위해 사용되는 효소를 억제 할 수있는 화합물을 검색. 전통적으로 사용되는 표준 오히려 염소 혈청 (NGS), 디곡시 제닌 (DIG) 기반 버퍼 세트에 의해 제공되는 차단 시약 / 소 혈청 알부민 (BSA)을 크게 백그라운드 염색을 감소시켰다. 또한, 메탄올 INHI였다과산화수소보다 효과적으로 POD 내인성 활성 비트 (H 2 O 2). 배아에 대한 면역 염색에 대한 이러한 진딧물 특정 조건에 관한 세부 사항은 다음 절에서 설명한다.

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Protocol

진딧물 1. 문화

참고 :. 처녀 생식 태생 완두콩 진딧물의 실험실 변형 pisum는 원래 중앙 대만에서 수집 된 300 개 이상의 세대에 긴 일 광주에서 기주 식물 (정원 완두콩 Pisum의 속 sativum 또는 광범위 한 콩 잠두)에서 사육 된 (한 세대 : ~ 10 일).

  1. 씨앗의 발아
    1. RT 3-5 일 동안 수돗물에 기주 식물의 씨앗을 만끽 해보세요. 하루에 한 번 신선한 물을 채우십시오.
      참고 : 또는 직선 습한 토양에 기주 식물의 씨앗을 퍼팅뿐만 아니라 발아를 유도 할 수있다.
    2. 광주 16 시간 조명 / 20 ° C에서 8 시간의 어둠에서 성장 챔버에서 토양과 작은 냄비 (9cm 지름 X 7cm 높이) 10 발아 씨앗을 성장.
    3. 성장이 시작 약 10 일 후에, 그 높이보다 8cm입니다 식물에 진딧물을 전송합니다.
  2. 진딧물의 전송 , 1 리터 유리 비커 내에서 식물의 각각의 냄비를 유지 붓을 사용하여 식물에 8 성인 진딧물을 전송 한 다음 탈출 진딧물을 방지하기 위해 거즈 메쉬로 통기성 커​​버 비커를 밀봉.
  3. 광주 16 시간 조명 / 20 ° C에서 8 시간의 어둠에서 성장 챔버에서 진딧물을 품어. 매일 하루에 한 번 식물의 각 공장 냄비에 물을.
  4. 진딧물 차세대 얻는 단계 1.1.3-1.2.2 십일 차 전사 후 진딧물을 유지한다.

2. 해부 및 난소의 고정

  1. 갓 고정 버퍼로서 1X 인산 완충 식염수 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비한다.
  2. PFA (약 500 μL)에 자리 판 잘 하나 채우기, 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 접시를 놓고 해부에 대한 PFA 내 성인 진딧물 잠수함.
  3. , 포셉 한 세트와 머리와 복부를 유지하는 등의 오픈 절단하여 난소를 해부하다복부의 표피 및 복강에서 멀리 난소를 드래그.
  4. 20 분 동안 실온에서 PFA 1 ㎖를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 난소 세 쌍 수정.
  5. 전송 피펫 (유리 하나 또는 일회용) 1X PBS에서 0.2 % 트리톤-100 (PBST) 10 분 각 3 회와 난소를 세척 후와와 디 캔트 고정 버퍼입니다. 마일드 (회전 각도 : 60 ° (F60) / 회전 속도 : 8 RPM) 믹서 / 회전에 떨고하는 고정 및 세척을 모두 사용하는 것이 좋습니다.

3. 테 K (PK)과 치료는 배아 조직의 투과성을 증가

참고 : PK 처리 이후 세균 밴드 확장 (단계 개발의 11)에서 배아에 적용됩니다. 젊은 배아의 경우,이 단계는 선택 사항입니다.

  1. 직렬 작업 1 μg의 농도 / ㎖로 1X PBS와 PK의 스톡 용액 (10 ㎎ / ㎖)을 희석.
  2. 가벼운 흔들림과 함께 10 분 동안 PK (약 500 μL)의 1 μg의 / ㎖과 난소를 품어.
  3. 가만히 따르다 PK의 soluti다음 글리신의 700 μL (2 ㎎ / ㎖) 5 분마다 3 번과 난소를 씻어에.
  4. 10 분마다 두 번 0.2 % PBST로 난소를 씻으십시오.
  5. 가벼운 흔들림으로 실온에서 15 분 동안 고정 버퍼 다시 난소를 수정합니다.
  6. 뜨는을 취소하고 10 분마다 두 번 0.2 % PBST로 난소를 씻는다.

4. 메탄올 배양 내인성 과산화 효소를 억제 (POD) 활동에 대한

참고 : 메탄올 배양 메탄올 민감 Phalloidin의 염색 또는 항체 항원 결정기를 실시 배아에 적용되지 않습니다.

  1. 직렬 PBST 0.2 % 메탄올의 다른 비율로 난소 탈수 (3 : 1 : 1, 3 : V / V 1) 온화한 교반과 함께 10 분 동안 메탄올 용액의 각 농도에서 배양함으로써 난소.
  2. 온화한 교반과 함께 RT에서 1 시간 동안 100 % 메탄올로 난소 탈수.
    주 : 염색의 만족스러운 결과는 여전히 100 % 메탄올에 저장되었다 진딧물 조직으로부터 얻을 수 -20# 176; C 1 개월.
  3. 직렬 PBST 0.2 % 메탄올의 다른 비율로 난소 재수 (1 : 1 : 3 1, 1, V / V 3) 온화한 교반과 함께 10 분 동안 메탄올 용액의 각 농도에서 배양함으로써 난소.

5. 항체 염색

  1. DIG-기반의 버퍼 세트의 10 배 차단 솔루션을 희석 (DIG-B)는 1 배로.
    주 : 1X DIG-B 블록킹 용액 (BSA 표준 블로킹 5 %로 이루어지는 시약 (v / v)의 정상 염소 혈청 (NGS)와 0.5 % (v / v)의 소 혈청 알부민보다 염색 배경을 감소시키기위한보다 효과적인 ) 0.2 % PBST에.
  2. 가벼운 흔들림 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 2.5 시간 4의 1 배 DIG-B 차단 솔루션과 난소를 품어.
    참고 : 1.5 ML 튜브에서 난소 삼쌍를 들어, 200 μL 샘플 차단 및 항체 염색의 최소 볼륨입니다.
  3. 뜨는을 가만히 따르다하고 적절한 diluti에서 일차 항체를 포함하는 신선한 1X DIG-B 차단 솔루션으로 대체비에. 가벼운 흔들림 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 4 시간 동안 난소를 얼룩.
    주 : (1) ApVas1 항체 : 1 : 여기에 설명 된 실험, 일차 항체의 다음과 같은 최적의 희석 사용 발색 염색 500, 면역 형광 염색 1:50; (2) 항 - 튜 불린 α 항체 1 : 500; (3) 4D9 단일 클론 항체 : 1시 25분.
  4. 15 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 난소를 씻으십시오.
  5. 가벼운 흔들림으로 실온에서 1 시간 동안 1X DIG-B 차단 솔루션과 난소를 품어.
  6. 뜨는을 가만히 따르다 신선한 1X DIG-B 차단 솔루션은 적절한 희석 비율로 차 항체를 포함로 교체. 가벼운 흔들림 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 4 시간 동안 난소를 얼룩.
    1. 이차 항체의 다음 희석 비율을 사용하여 (1) 면역 염색의 경우 : 1 : 알렉사 플 루어 633 염소 항 - 토끼 IgG에 또는 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스 IgG 500; (2) 발색 염색 : 1 : 200 비오틴 염소 항 - 토끼 IgG를합니다.
      주 : 바이오틴 이차 항체 염색 신호가 크게 증폭되는 기판 계 (발색) 검출에 아비딘 - 비오틴 - 복합체 (ABC)와 상호 작용하기 위해 적용된다.
    2. 이차 항체가 민감한 빛 때문에 면역 형광 염색은, 어둠 속에서 염색을 실시하고 있습니다.
  7. 10 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 차 항체를 씻으십시오.

6. 원자력 및 F - 굴지 염색

참고 :이은 면역 형광 염색법에 대해 적용됩니다.

  1. 어둠 속에서 실온에서 DAPI (2 NG / μL), 2 시간 동안 Phalloidin의-TRITC (100 nm의)를 포함 0.2 % PBST로 난소를 얼룩.
  2. 10 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 난소를 씻으십시오.
  3. 가벼운 흔들림 4 ° C에서 설치 매체 O / N과 난소를 품어.

7. 신호 개발

참고 :이는 발색 염색 적용됩니다.

  1. 100 μl를 준비비오틴 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제와 접합 (시약 B 1 μL를, 0.2 % PBST 98 μL 시약 (아비딘) 1 μl를 첨가 부드러운 피펫을 통해 철저히 혼합하고, 추가로 신호를 향상 (ABC) 시약 아비딘 - 비오틴 - 복합체 ), 즉시 혼합 하였다. 온화한 교반과 함께 30 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다.
  2. 온화한 교반과 함께 30 분 동안 실온에서 시약 A 및 B의 혼합물에 (해리 달걀 챔버 포함) 난소 배양한다.
  3. 10 분간 각각 0.2 % PBST로 4 회 시약 및 B의 혼합물을 씻어.
  4. 플라스틱 적기에 현장 접시에 잘에 PBST에 잠긴 난소를 전송합니다.
  5. 3,3'- 디아 미노 (DAB)의 기질 용액을 제조 하였다 : 하나 DAB 태블릿 플러스 1 분 동안 격렬하게 볼 텍싱 통해 DDH 2 O 1 ㎖를 함유하는 또 하나의 우레아 과산화수소를 녹인다.
    참고 : DAB, 퍼 옥시 다제의 침전 기판, 면역 염색에 대한 인기 발색입니다. 그것은 BR를 생산과산화 효소에 의해 산화 된 후 자신의 불용성 침전물. 약한 신호는 기질 용액 (최종 농도 0.05부터 0.08까지 %)에 염화 니켈을 첨가함으로써 향상 될 수있다.
  6. 웰 내에 잔류 PBST 용액을 제거하고 신호 개발 DAB 기질 용액 100 ㎕와 리필.
  7. 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 신호의 강도를 모니터링합니다.
  8. 즉시 1X PBS로 재충전 하였다 DAB 용액을 제거하여 반응을 정지. 두 번 세척을 반복합니다.
  9. 1.5 ML 튜브로 다시 난소로 이동 한 다음 15 분마다 두 번 1X PBS 또는 PBST로 씻는다.
  10. 가벼운 흔들림 4 ° C에서 글리세롤 기반 설치 매체 (70 % 글리세롤) O / N에서 난소를 품어.

8. 진딧물 배아를 장착

참고 : 진딧물 배아의 두께는 개발 단계 사이에 다릅니다. 설치 전략 따라서 조기에 맞게 수정 (germaria 및 0-10 스테이지), 중간 (단된다그림 2B에서 설명된다 11-18), 늦은 배아 (단계 19 ~ 20) - D. 배아 준비는 미우라 등을 따랐다. (12)

  1. 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 샘플을 플라스틱 스포이드로 셀 트레이에 매체를 장착와 함께 난소를 전송하고 관찰한다.
  2. 곤충 핀을 사용하여 측면 난관과 관련된 꽃받침을 차단하고 적기에 잘 빈 유리에 고립 ovariole을 전송합니다. 설치 매체를 사용하여 50 ~ 100 μL에 최종 볼륨을 확인합니다.
  3. 유리 dropper으로 슬라이드에 ovariole을 전송 한 다음, 곤충, 핀을 사용하여 난자 챔버 해부.
    참고 : 개발의 단계 6 세 이상 배아를 들어, 계란 챔버의 분리를 제안한다; germaria 무대 6 세 미만의 처음 두 계란 챔버에 대한 분리는 선택 사항입니다.
  4. 유리 dropper를 사용하여 깨끗한 슬라이드에 해부 계란 챔버를 변경합니다.
  5. 커버 슬립 (크기를 넣어 : 22 X 22해부 germaria 또는 천천히 거품을 피하기 위해 달걀 챔버 (단계 개발의 1-10에서 배아를 포함) mm 이상).
    1. 마운트 달걀 챔버 일방적 coverslip에 다리와 슬라이드 (단계 개발의 11-18에서 배아를 포함) 및 다른 coverslip에 배치 : 샘플의 상단에 (크기 18 X 18mm)를.
    2. 마운트 달걀 챔버 양면 커버 슬립의 다리로 슬라이드 (개발의 단계 19 이전의 배아를 포함) 및 다른 coverslip에 배치 : 샘플의 상단에 (크기 18 X 18mm)를.
  6. 샘플을 건조 방지하기 위해 설치 매체를 사용하여 상단 커버 슬립 아래 공간을 채 웁니다.
  7. 온화하게 관찰에 대한 올바른 방향을 얻기 위해 커버 슬립을 밀어 배아를 굴립니다.
  8. 매니큐어와 (브리지 된 커버 포함) 된 커버의 가장자리 주위에 인감.

9. 이미징 분석

  1. 사진 미분 간섭 대비 (DIC)의 이미지 compou와 배아를 전체를 마운트차 현미경 DIC 광학 및 카메라에 연결 건조 대물 렌즈 (10X, 20X, 40X)를 장착. 제조업체의 지침을 사용하여 카메라와 컴퓨터 사이의 이미지 전송을위한 소프트웨어를 설치합니다.
  2. 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (14)과 형광 표지 된 배아의 돌기를 획득. , 촬영 Z-스태킹 및 3D 이미징 소프트웨어를 사용하여 투사 제조업체의 지침을 따르십시오.
    1. 10X 목적에 탑재 된 샘플을 발견, 거꾸로 슬라이드를 켜고 잘 기름칠 기반의 펜으로 샘플 영역을 동그라미.
      참고 :이 공 초점 현미경의 목표를 통해 검색 할 때 샘플을 쉽게 식별합니다.
    2. 반대측 9.2.1에 설명 된대로 표지 커버 슬립 영역의 상부에 오일 방울을 추가한다.
  3. 40X 기름 침지 목표에 초점면 다음 63X 기름 침지 목표로 변경하실 수 있습니다. 수동으로 미세 초점 제어를 이동 할WN 최고의 초점면을 촬영합니다.
    참고 : germaria 및 초기 배아의 세부 구조를 관찰, 우리는 40X 목적 또는 더 높은 배율을 가진 사람을 사용하는 것이 좋습니다.
  4. 다른 여기 채널에서 배아를 스캔 Z 스택 이미지를 얻을 수 있습니다.
    참고 : 완두콩 진딧물 조직의 경우, 1.5 ㎛ 이하까지 각각의 광 부분의 두께를 줄일 수 있습니다.

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Representative Results

본 연구에서는 무성 완두콩 진딧물 (그림 1A)의 배아에 전체 마운트 면역 염색을 시행 하였다. 이 여성은 생식에와 viviparously 자손을 생산하고 있습니다. 이 여성 배아는 난소 세관 (ovarioles) (그림 1B 그림 2A)의 달걀 챔버 내에서 개발. 현미경 전에 해부 ovarioles는 염색 타겟이고; 그러나, 달걀 챔버 분리 현미경 (- D도 2b) 아래의 배아 관찰 필요하다.

조직 투과성의 증가

테 K는 (PK) 치료는 조직 투과성을 향상시키기위한 표준 방법이지만-같은 생물 예쁜 꼬마 선충 (선충), 초파리 (파리), 및 다니오 레 리오 (rerio)와 같은 일부 모델의 배아 (대한제브라 피쉬) -이 단계는 선택 사항입니다. 완두콩 진딧물에서 PK 처리에 대한 요구 사항은 단계에 의존 : 이전 낭 배기에 germaria 및 배아 (단계 0-7)의 경우, PK 처리를 생략 할 수있다; 하지만 germband 확장 (단계 11)에서 이상 단계의 배아에 대해이 단계는 것이 좋습니다. 예를 들어, 중간 배아 신호 동안 거의 PK 처리 (- C 그림 3A)없이 배아에서 발견되었다. 반대로, 신호 강도가 크게 ( '- C', '- C "도 3A) PK 분해를 실시 배아에서 향상되었다.

배경 염색의 감소

내인성 퍼 옥시 다제 (POD) 활성의 높은 수준의 진딧물 배아 조직에서 확인되었다. 이 효소의 활성을 억제하기 위해, 파라 포름 알데히드 고정 배아 HY의 존재하에 배양시켰다POD의 산화 drogen 과산화수소 (H 2 O 2), 일반 시약. 우리의 결과는 H 2 O 2 처리가 늦게 단계의 배아 (그림 4A, D)에 효과적으로 내생 POD의 활동을 억제하지 않은 것으로 나타났다. 대조적으로 배경 염색은 주로 메탄올 배양 (도 4B, C, E, F)를 실시 배아에서 감소 하였다. 차 항체 배아의 응용 프로그램은 항체 염색을위한 표준 프로토콜에 설명 된대로 NGS와 BSA를 함유 용액에서 차단되기 전에. 그러나, 진딧물 배아 잔류 배경 염색 ( '- C'도 3A) 검출되었다. 이 문제는 현장 하이브리드 ( "- C"그림 3A)과 DIG-라벨 실험을위한 버퍼 세트가 제공하는 차단 시약과 NGS / BSA를 교체 한 후 해결되었습니다. 따라서 우리는 DIG-B와 메탄올과 배양과 그 후 고정을 체결시약을 차단 진딧물 배아에서 배경 염색을 줄이기위한 필수 상표입니다.

PK 처리 및 DIG-B 차단 시약은 발색뿐만 아니라 형광 방법을 사용하여 효과적인 신호 검출을위한뿐만 아니라 필요합니다. 메탄올에 민감한 에피토프에 대한 팔로이 딘 또는 염색 액틴 염색은, 그러나, 굴지 또는 항체의 기본 양식을 파괴 할 수있는, 미리 고정을 메탄올로 실시 배아에서 작동하지 않습니다. 형광 면역 염색을 행하는 경우에 따라서, 이러한 치료는 피해야한다. 별도로 메탄올 처리 단계를 제거에서 면역 형광은 진딧물 배아 멀티 라벨 실험을 할 수 있습니다. 예를 들어, 공 초점 현미경을 사용하여, 생식 세포, 핵의 미세 소관의 α-tubulin에, 미사에 F - 굴지 및 DNA에 완두콩 진딧물 Vasa1 단백질 (ApVas1)가 동시에 표시 (그림 5A, C) 시각화 할 수 있습니다. CHRO와 비교라벨의 조건을 채택. - mogenic 방법 (도 5b는)의 형광 표지 된 샘플을 절편 공 초점은 초기 진딧물 배아에서 배아 원형질과 cellularizing 생식 세포에 ApVas1 (D "그림 5C ', D)으로 지역화 된 신호의 더 나은 해상도를 제공 상기 한 생식 세포가 확장 세균 밴드의 분야에서 Engrailed / Invected 단백질 또한 항체 4D9 (그림 6)로 염색했다.이 보여줍니다 우리의 프로토콜 면역 염색을 포함하여 발색 및 형광 방법-수 효과적으로 검출 신호에 적용 할 수 배아와 진딧물의 체세포 계보 모두.

그림 1
그림 1. 처녀 생식 태생 완두콩 진딧물. (A) 무성 태생 여성 성인에서 신흥 처음 령 애벌레. (B 12 균주간에 변할 수있다. ovariole는 팁 germarium (화살표), 1-2 난자 및 배아 5-7 챔버를 포함한다. 창자와 카우는 일반적으로 해부 난소와 연결되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
개발의 여러 단계에서 진딧물 배아를 장착하기위한 전략의 그림 2. 그림. 처녀 생식 태생 여성 성인 해부 ovariole의 배아 발달의 (A) 개요. 간단한 oogenesis (germarial 단계와 단계 0-2)은 배아 (단 3-20)가옵니다. 배아의 개요 : F 세포 융합의 배반 엽의 ormation (단계 3-5); blastulation (단계 6-7); 낭 배기 (단 8-10); 세균 밴드의 신장 (단계 11 ~ 14) katatrepsis는 (스테이지 (15)); 포스트 katatrepsis 및 세균 밴드 철회 (단 16 ~ 17) 기관 형성은 (18 ~ 20 스테이지). 컬러 키는 도면의 아래쪽에있다. (B, B ') Germarium 및 0-10 배아 스테이지. 어떤 coverslip에 다리가 필요하지 않습니다. (C, C ')는 11-18 배아를 스테이지. coverslip에 다리가 필요합니다. (D, D ')는 19 ~ 20 배아를 스테이지. 더블 coverslip에 브리지가 필요합니다. 커버 슬립을 밀어 배아 롤링 관찰의 다른 각도를 만들 수 있습니다. 커버 슬립의 크기 : 22 × 22 (B)에서 MM, (C) 18 X 18mm와 (D). 커버 슬립의 두께 : 0.13-0.16 mm. 배아 준비가 미우라를 따라 12 약어 : G :. germarium; ST : 단계..COM / 파일 / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
. 그림 3. 테 K 처리 및 다른 차단 효과와 시약의 비교 전방 계란 챔버는 왼쪽에, 모든 뷰는 지느러미있다 (B ', C', C ')에 표시된 배아를 제외하고 측면이다. 태아는 모든 ApVas1 항체 (희석 1 : 500)을 사용하여 염색하고 ApVas1의 신호는 10 ~ 20 초 이내에 개발된다. 화살촉은 생식 세포의 위치를​​ 나타냅니다. (A - C) 배아를 단백질 분해 효소 K (PK)의 처리없이. 생식 세포에서 ApVas1 신호가 거의 감지됩니다. ( '- C', '- C ") 배아의 블록의 배경 염색의 비교( '- C')와 발굴 세척 및 블록 버퍼 세트 (DIG-B) ( "- C")의 상업 차단 시약의 NGS와 BSA와 KED. 배경은 크게 ( "- C")에 표시된 배아 감소된다. 약어 : B : 박테리아. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
. 배아의 메탄올 전방 그림 4. 최소화 배경 염색은 왼쪽에, 모든 뷰는 지느러미 있습니다. 배아는 항체의 투과성을 증가 PK로 처리됩니다. 화살촉은 생식 세포의 위치를​​ 나타냅니다. 치료 (A, B, D, E) 비교과산화수소 (H 2 O 2), 메탄올. 배아은 이차 항체로 염색된다. H 2 O 2 처리 (V / W 0.3 %, 10 분) : 높은 배경 (A, D) 메탄올 처리 (100 %, 60 분) : 낮은 배경 (B, E). (C, F)를 메탄올로 처리 배아 차 항체 염색. 메탄올 처리의 조건 (B, E)에 도시 된 배아에 사용되는 것과 동일하다. ApVas1 항체 우선적 배아 생식 세포 라벨. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
초기 배아에 그림 5. 면역 형광 염색법. (B)에 : 1 - ApVas1 항체의 희석 비율 (D, C)에 1:50입니다. ApVas1, α-tubulin에, F-액틴 및 핵 DNA를 포함하는 (A) 염색 신호는, 서로 다른 파장을 가진 네 개의 채널을 사용하여 검출된다. 신호의 컬러 키는 도면의 하단에 도시되어있다. 비교 발색 결과 (B) DIC 이미지입니다. 스테이지 3에서 배아 ApVas1의 후방 지역화 (화살촉)의 콘트라스트 강도 (C, C ')에 도시 된 것과 같이 명백하지 반면 ApVas1는 germarium 내에 농축된다. (C, C ') 계란 후방에서 ApVas1 신호의 농축. 계란 챔버 (화살촉)의 후방 지역에 현지화 된 신호는 이미지 스택에 의해 강화된다. F - 굴지 및 α-tubulin에의 신호가 부분적으로 (후방에 ApVas1의 그 마스크 때문에C), 단일 - 채널 및 주사에 의해 생성 된 이미지는 (C ')에 도시한다. 무대-4 배아의 후방 지역에서 지역화 ApVas1의 - (D D '') 공 촛점 단면. (D)와 (D ')에 표시된 이미지가 ApVas1는 각각 표면과 중앙 초점면에서 검출된다. (D ")는 (D)와 (D ')와 같은 배아에서 모든 섹션의 병합 된 이미지 약어 : 같은 : 애 스터, FC, 모낭 세포, POC, 미래의 난자; SP :. 스핀들, TC, 영양 코드. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. 배아 부분에 대한 면역 염색.달걀 챔버 terior은 왼쪽이다. PK 처리 된 배아는 배아 세그먼트로 표현된다 Engrailed / Invected에 대한 단일 클론 항체 4D9, 염색된다. 신호의 컬러 키는 도면의 하단에 도시되어있다. (A, A ') 무대 (13) 배아에 면역 형광 염색법. (A), Engrailed / Invected, α-tubulin의 F-액틴, 핵의 DNA의 염색 이미지에서 누적 된 공 초점 이미지. (A ') 만 Engrailed / Invected의 얼룩을 나타내는 공 초점 이미지. 다른 채널에서 신호의 간섭을받지 않고, 신호는 더 나은 표시됩니다. 단계 (13)를 각각 개발의 17에서 배아 (B, C) ​​원체 염색. (B) 스테이지 13 배아. (C) 단계-17 배아. 단계에서 13-17, 복부 세그먼트의 성장 번호는 4D9에 의해 표시된다. (D) 음성 대조군 (-Ctrl) 얼룩알렉사 플 루어 (633)가 결합 이차 항체가 거의 면역 신호가 일차 항체없이 ovariole에 감지되지에서만 보내고. 그러나, 단 7 계란 챔버 (13) 내의 박테리아 (대시 라인)의 형광도는 여기 파장 488 nm에서 검출된다. 약어 : : 복부; B : 박테리아; H : 헤드; T : 가슴. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 완두콩 진딧물에 성공 면역에 중요한 최적의 조건을 확인했다. pisum, 게놈과 발달 연구 3,15에 대한 새로운 모델 생물. 조직 투과성을 증가시키고, 배경 얼룩을 감소시키기위한 최적 조건은 신호 강도 및 특이성을 향상. 이들은 세포막에 구멍을 만들고 결합 비 - 특이 적 항체를 차단하는 단계에서 다른 동물 모델에서 면역 염색을위한 표준 프로토콜이 다르다.

면역 염색 및 현장 하이브리드에, 단백질 분해 효소 K (PK) 소화은 조직 투과성 16-19을 증가시키는 일반적인 방법 중 하나입니다. (1) PK 소화가 상당히 있지만, 세균 밴드 확장 (단계 11 ~ 14) (그림 3B ''C '') 중 처녀 생식 태생 태아의 면역 신호를 강화 : 진딧물 조직의 항체 염색, 우리의 결과는 것을 보여 주었다약한 신호는 여전히 PK 처리 (그림 3B, C)없는 배아에서 볼 수 있었다; (2) PK 소화는 이후 katatrepsis에서 배아 (15 ~ 20 스테이지) (그림 4C, F와 그림 6C)에 대한 의무이다. 종래 katatrepsis에 무성 태생 배아, 계란 챔버의 부피는 침투 문제의 원인을 가능성 때문에 낳고-가장 성숙한 무성 계란 chamber-와 크기가 거의 동일 거주 이른 성적 난생 배아 성공적인 면역 PK 소화 (20)을 필요로하지 않습니다. 따라서, 세균 대역의 연신과 접힘 항체의 입구를 방해 할 수 무성 달걀 챔버의 제한된 공간 (11 내지 14 스테이지) 및 그 사이의 세포막에 구멍을 만들어서 항체의 침투를 허용 PK이며 걸린 배아 구조. 대조적으로, 성적 계란의 세균 밴드의 직선 확장이도에 염색되는 이유를 설명 할 수있다PK의 부재. 난황 봉투 / 융모막의 제거는 또한 항체 성적 난생 배아에보다 쉽게​​ 액세스 할 수 있습니다. 배아는 19 cuticled 두께 때문에 katatrepsis 후 배아 (20 ~ 16 스테이지)의 경우, PK 처리가 모두 무성 성적 모프 필수적이다 (그림 4C, F와 그림 6C).

배아 구조의 완전성 또는 신호의 강도가 만족스럽지 않으면, 그럼에도 불구하고, PK 분해에 대한 제안 된 조건 (10 분 동안 1 ㎍ / ㎖)을 추가 조정을 요구한다. 이것은 주로 배치에서 배치에 따라 달라질 수 있습니다 PK 활성에 의해 발생합니다. 배아 조직이 PK 분해 후에 손상된 경우, 예를 들어, PK의 농도는 0.5 μg의 / ㎖로 감소 될 수있다. 신호 강도가 약한 경우 마찬가지로 15 ~ 20 분에 배양의 확장은 이렇게하는 것이 좋습니다. 1.0 μg의 / ㎖ 농도, 하우시 20 분까지 연장 PK 보육을 실시하는 가장 성숙한 배아 (단계 20)버전은 보통 PK 소화가 아직 완료되지 않았 음을 시사 약한 신호를 표시합니다. 장기간 소화 염색 신호를 강화하지만 단계에서 검출 된 발현 패턴이 18 배아 단계 20 배아 유사하다 특히 선택적있다. 개발 단계 (20)에서 배아와 비교하여, 아직 신체 표피의 적은 양으로 유사한 형태와 스테이지 (18)는 일반적으로 배아 강한 신호 강도를 얻을 수있다.

신호 개발하는 동안, 배경 염색 기판과 교차 반응 할 수 내생 효소의 활동에 의해 증가 될 수있다. 완두콩 진딧물의 배아에서 신호 기판을 소화하기위한 일반적인 항체 복합체 두 가지 모두의 내생 알칼리성 포스파타제 (AP) 및 퍼 옥시 다제 (POD)의 활동이 검출되었다. 내인성 AP 가수 분해 효소의 활성을 효과적으로 레바 미솔 의해 배아에 걸쳐 억제 할 수 있었다 (결과 미도시). 그럼에도 불구하고, 0.3-0.6 %의 hydrog와 배아의 치료과산화수소 (H 2 O 2) 도중에 만 katatrepsis 이전 내생 POD 활성을 제거하지만 이전의 배아 (그림 4A, D)에 대한 충분하지 수 있습니다. 메탄올 배양, 내인성 단백질 변성을위한 대안적인 접근법은, 진디 (21) (도 4B, E)에서 효과적인 것으로 입증되었다. H 2 O 2와 달리 30 분 이상의 장기 배양 중에있는 손해 진딧물 조직, 메탄올 소화 또는 개발의 모든 단계 (그림 4C, F) 동안 배아를 변형하지 않습니다. 따라서, 메탄올은 진딧물의 배아에서 내인성 POD 활동을 억제하기위한 더 나은 대안이다. 잔류 배경 염색은 보통 4에서 메탄올 표피의 두꺼워 층, O / N 배양과 성숙한 배아로 발생하는, 감지되면 °는 C-에 따라 우리에 경험 할 수 있습니다 더 내생 POD 활동을 줄일 수 있습니다.

잔류 배경 염색이 검출되었다이러한 정상 당나귀 혈청 (NDS), 정상 염소 혈청 (NGS), 소 혈청 알부민 (BSA), 또는 이들의 혼합물 (13) (도 3A'-C ')과 같은 혈청 단백질로 차단 배아. (- '도 3a', 'C') 대조적으로 계내 혼성화에 사용되는 상업적으로 공급 차단 시약을 채택 면역 동안 나머지 배경 상당히 제거 될 수있다 (5). 차단 시약의 성분은 독점적이지만, 그것은 아마도 완두 진딧물 단백질의 비특이적 에피토프를 차단할 수있는 비 - 혈청 단백질이 포함. 차단 시약은 또한 녹색 복숭아 진딧물 Myzus persicae의 동물 혈청보다 훨씬 더 일했다. 마찬가지로, persicae의 PK 소화 및 메탄올 배양 만족 항체 침투 및 배경 감소의 결과에 M -. 개선 된 결과와 유사 A. 달성 pisum (데이터는 미도시). 우리는 조건이 optimiz 것으로 예상ED 조직 투과성을 증가시키고 배경을 감소시키기 위해, 하나의 발색 또는 형광 염색법을 사용하는지 여부, 다른 많은 진딧물 종에 적용된다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2) Sigma-Aldrich 18304 For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody Developmental studies hybridoma bank AB_528224 For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody Our laboratory N/A For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. 
Austerlitz Insect pins ENTOMORAVIA N/A For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope Canon EOS 5D For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray Kartell Labware 357 For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics Leica Microsystems DMR For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set Sigma-Aldrich (Roche) 11585762001 For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps Ideal-tek N/A For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. 
Glass dropper N/A N/A For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine Bioshop N/A For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 Invitrogen A11017 For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 Invitrogen A21072 For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer ELMI laboratory equipment RM-2M For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy Leica Microsystems SP5 For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol  Burdick and Jackson AH2304 For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides  Thermo scientific 10143560 For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses Marienfeld 0101030 For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses Marienfeld 0101050 For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) Santa Cruz Biotechnology sc-32293 For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish N/A N/A For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA) VWR MK262159 For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC Sigma-Aldrich P1951 For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper N/A N/A For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. 
Proteinase K Merck 124678 For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. 
Pyrex spot plate N/A N/A For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets  Sigma-Aldrich D4168 For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope Leica Microsystems EZ4 For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100 Sigma-Aldrich T8787 For creating pores (punching) on the cell membrane. 
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector laboratories PK-6101 For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium Vector laboratories H1000 For clearing of aphid embryos and mounting.

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References

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