मटर Aphid भ्रूण में immunostaining के लिए गंभीर स्थिति की पहचान: ऊतक पारगम्यता बढ़ाने और पृष्ठभूमि धुंधला घटाना

Developmental Biology

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Lin, G. W., Chang, C. c. Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining. J. Vis. Exp. (108), e53883, doi:10.3791/53883 (2016).

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Abstract

मटर एफिड Acyrthosiphon पाइसम, एक अनुक्रम जीनोम और प्रचुर मात्रा में प्ररूपी प्लास्टिसिटी साथ जीनोमिक और विकास अध्ययन के लिए एक उभरती हुई मॉडल बन गया है। अन्य एफिड, एक तरह। पाइसम भ्रूण ovariole में एक विधानसभा लाइन फैशन में अंडा कक्षों के भीतर विकसित जहां स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली प्रजनन, के माध्यम से तेजी से प्रचार। पहले हम एफिड भ्रूण में mRNA अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए अनुमति देता है स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट की एक मजबूत मंच की स्थापना की है। प्रोटीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, हालांकि, संतोषजनक परिणाम नहीं मिला अलैंगिक जीवित बच्चा जनने वाली एफिड की ovarioles immunostaining के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की। यहाँ हम ऊतक पारगम्यता बढ़ाने और स्थापित दृष्टिकोण को लागू करने जब समस्याओं थे, जो दोनों की पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना, कम करने के लिए अनुकूलित शर्तों की रिपोर्ट। अनुकूलन शामिल हैं: आवश्यक च पाया गया था जो proteinase कश्मीर (1 माइक्रोग्राम / एमएल, 10 मिनट), (1) के ऊष्मायनमध्य और देर चरण एफिड भ्रूण में या एंटीबॉडी पैठ; एक digoxigenin (डीआईजी) द्वारा आपूर्ति की एक अवरुद्ध अभिकर्मक के साथ सामान्य बकरी सीरम / गोजातीय सीरम albumin (2) के प्रतिस्थापन सेट बफर और अंतर्जात peroxidase विरंजन के लिए मेथनॉल बल्कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 22) (3) आवेदन आधारित; जो काफी एफिड ऊतकों में पृष्ठभूमि धुंधला कम कर दिया। Immunostaining के लिए अनुकूलित ये गंभीर स्थिति एक। पाइसम और अन्य एफिड के भ्रूण में जीन उत्पादों की प्रभावी पता लगाने की अनुमति होगी।

Introduction

एफिड छोटे (1-10 मिमी) मुलायम निकायों के साथ hemipteran कीड़े हैं। वे भेदी mouthparts साथ फ्लोएम एसएपी चूसने से पौधों को खाते हैं। इसके अतिरिक्त, वे फ्लोएम एसएपी आहार में कमी कर रहे हैं कि आवश्यक अमीनो एसिड के संश्लेषण के लिए, एक लाचार एंडोसिम्बायोटक जीवाणु, Buchnera aphidicola पर भरोसा करते हैं। एफिड वसंत और गर्मियों लंबे दिन Photoperiods और वे overwintering अंडे 1,2 की एक सीमित संख्या में रखना है, जिसके दौरान कम दिन Photoperiods से चालू होने वाले यौन अंडोत्पन्न प्रजनन के दौरान स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली प्रजनन भी शामिल है कि एक जटिल जीवन का इतिहास है। वसंत ऋतु में इन अंडों से शरद ऋतु तक स्वजात प्रजनन के कई दौर के बाद, सभी महिला एफिड (fundatrices) की पहली पीढ़ी का निर्माण करने के हैच। वार्षिक जीवन चक्र में अलैंगिक और यौन चरणों वैकल्पिक, एक विकासवादी नवीनता 1,2 के रूप में माना गया है, जहां एफिड, में चक्रीय अनिषेकजनन। स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली एफिड में, भ्रूण डिम्बग्रंथि नलिकाओं (ovarioles) का अंडा कक्षों के भीतर जगह लेता है। इसके विपरीत, यौन अंडोत्पन्न भ्रूण निषेचित अंडे में विकसित करना। इसके अलावा प्रजनन प्लास्टिसिटी से, एफिड transgenerational विंग polyphenism प्रदर्शित कर सकते हैं: भीड़भाड़ संकेतों और शिकारी की धमकी के जवाब में, unwinged अलैंगिक महिलाओं viviparously लंबी दूरी माइग्रेशन के लिए पंखों वाला वंश का उत्पादन कर सकते हैं। मटर एफिड के जीनोम अनुक्रम का प्रकाशन Acyrthosiphon पाइसम -इस के लिए पहला जीनोम अनुक्रम एक बेसल hemimetabolous कीट-अनुमति देता है प्रजनन प्लास्टिसिटी, विंग polyphenism, और एक आणविक पर एफिड में कीट-संयंत्र बातचीत, वायरल vectoring और सहजीवन सहित अन्य सुविधाओं की आगे की खोज आधार 3।

अनुक्रम जीनोम के अलावा, जीन अभिव्यक्ति और समारोह निस्र्पक के लिए उपकरण एक परिपक्व मॉडल जीव के रूप में 4 मटर एफिड को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक हैं। हम पूरे माउंट की मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है 5-7 में mRNA की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए स्वस्थानी संकरण में। डबल असहाय आरएनए इंजेक्शन और खिलाने के माध्यम से शाही सेना के हस्तक्षेप (आरएनएआई) एफिड देवियां और वयस्कों में जीन मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन भ्रूण में पछाड़ना जीन के लिए स्थिर की स्थिति अभी तक 8-10 सूचना नहीं किया गया है। Immunostaining, और आरएनएआई पछाड़ना के बाद, मटर एफिड भ्रूण 11-13 पर प्रदर्शन किया गया है पहले नमूने में प्रोटीन अभिव्यक्ति पता लगा सकते हैं कि एक एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोण। हालांकि, ऊतक पारगम्यता और पृष्ठभूमि धुंधला के उन्मूलन की वृद्धि मटर एफिड की अलैंगिक जीवित बच्चा जनने वाली भ्रूण में immunostaining के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग के रूप में अभी तक असंतोषजनक हैं। उदाहरण के लिए, हम ऊतकों को एंटीबॉडी की कि प्रवेश gastrulating भ्रूण में कमी आई पाया (8-10 चरणों) और आकृति विज्ञान से पहचाने जाने अंग कलियों (चरणों 13-14) के साथ भ्रूण एंटीबॉडी के लिए मुश्किल से पारगम्य थे। इसके अलावा, पृष्ठभूमि धुंधला अलैंगिक viviparo में कल्पना की गई थीgermline मार्कर वासा के साथ-साथ उस के खिलाफ भ्रूण खंडों 12,13 में व्यक्त Engrailed / Invected प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग दाग हमें मटर एफिड भ्रूण। असल पृष्ठभूमि धुंधला अभी भी अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग भ्रूण में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा था।

एफिड ऊतकों की अखंडता को नुकसान पहुँचाए बिना पारगम्यता बढ़ाने के क्रम में, हम ध्यान proteinase कश्मीर की एकाग्रता titrated और एफिड भ्रूण पर ऊतक पाचन के लिए इष्टतम स्थितियों चुना गया। मटर एफिड में गैर विशिष्ट धुंधला से बचने के क्रम में, हम प्रभावी रूप से भ्रूण ब्लॉक और अंतर्जात peroxidase (पॉड) की गतिविधि, immunostaining के दौरान संकेतों amplifying के लिए कार्यरत एक एंजाइम को दबा सकता है कि यौगिकों के लिए खोज की। पारंपरिक रूप से इस्तेमाल सामान्य बकरी सीरम बल्कि (NGS), एक digoxigenin (डीआईजी) आधारित बफर सेट द्वारा उपलब्ध कराए गए एक अवरुद्ध अभिकर्मक / गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), काफी पृष्ठभूमि धुंधला कम कर दिया। इसके अलावा, मेथनॉल inhi पाया गयाहाइड्रोजन पेरोक्साइड से अधिक प्रभावी ढंग से अंतर्जात पॉड गतिविधि बिट (एच 22)। भ्रूण पर immunostaining के लिए इन एफिड-विशिष्ट परिस्थितियों के बारे में विवरण निम्न वर्गों में वर्णित किया जाएगा।

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Protocol

एफिड्स की 1. संस्कृति

नोट:। स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली मटर एफिड की प्रयोगशाला तनाव पाइसम मूल रूप से केंद्रीय ताइवान में एकत्र किया गया था और 300 से अधिक पीढ़ियों के लिए लंबे समय से दिन फोटो पीरियड के तहत मेजबान पौधों (उद्यान मटर पाइसम sativum या व्यापक सेम Vicia faba) पर पाला कर दिया गया है (एक पीढ़ी: ~ 10 दिन)।

  1. बीजों के अंकुरण
    1. आरटी पर 3-5 दिनों के लिए नल के पानी में मेजबान पौधों के बीज लेना। प्रति दिन एक बार ताजे पानी के साथ फिर से भरना।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, सीधे नम मिट्टी में मेजबान पौधों के बीज डाल के रूप में अच्छी तरह से अंकुरण के लिए प्रेरित कर सकते हैं।
    2. फोटो पीरियड 16 घंटा / प्रकाश 20 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे अंधेरे के तहत विकास कक्ष में मिट्टी के साथ एक छोटे बर्तन (9 सेमी व्यास x 7 सेमी लंबा) में 10 germinating बीज बढ़ें।
    3. विकास शुरू होता है के बारे में 10 दिनों के बाद, जिनकी ऊंचाई अधिक से अधिक 8 सेमी है पौधों पर एफिड हस्तांतरण।
  2. एफिड्स के स्थानांतरण एक 1 एल कांच बीकर भीतर पौधों में से प्रत्येक बर्तन रखें एक तूलिका का उपयोग पौधों पर 8 वयस्क एफिड हस्तांतरण, और फिर भागने से एफिड को रोकने के लिए इस तरह की धुंध जाल के रूप में एक एयर पारगम्य कवर के साथ बीकर सील।
  3. फोटो पीरियड 16 घंटा / प्रकाश 20 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे अंधेरे के तहत एक विकास कक्ष में एफिड सेते हैं। हर दिन एक बार पौधों में से प्रत्येक संयंत्र बर्तन पानी।
  4. एफिड की अगली पीढ़ी को प्राप्त करने के लिए, कदम 1.1.3-1.2.2 दस दिनों प्राथमिक एफिड स्थानांतरण के बाद दोहराते हैं।

2. विच्छेदन और अंडाशय के फिक्सेशन

  1. हौसले निर्धारण बफर के रूप में 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करते हैं।
  2. पीएफए ​​(लगभग 500 μl) के साथ एक जगह की थाली में से एक अच्छी तरह से भरें, कम बढ़ाई एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट जगह है, और विच्छेदन के लिए पीएफए ​​के भीतर एक वयस्क एफिड डूब।
  3. संदंश के एक सेट के साथ सिर और पेट पकड़े पृष्ठीय खुला काटने से अंडाशय काटनापेट की छल्ली, और उदर गुहा से दूर अंडाशय घसीट।
  4. 20 मिनट के लिए आरटी पर पीएफए ​​के 1 मिलीलीटर युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में अंडाशय के तीन जोड़े को ठीक करें।
  5. एक हस्तांतरण पिपेट (कांच या डिस्पोजेबल) 1x पीबीएस में 0.2% TritonX-100 (PBST) 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार के साथ अंडाशय धोने और फिर से छानना निर्धारण बफर। हल्के (रोटेशन कोण: 60 ° (F60) / रोटेशन की गति: 8 आरपीएम) एक मिक्सर / रोटेटर पर मिलाते निर्धारण और कपड़े धोने के लिए दोनों की सिफारिश की है।

3. Proteinase कश्मीर (पीके) के साथ इलाज भ्रूण के ऊतकों की पारगम्यता वृद्धि करने के लिए

नोट: पीके उपचार आगे रोगाणु बैंड विस्तार (चरण के विकास के लिए 11) से भ्रूण को लागू किया जाता है। युवा भ्रूण के लिए, यह कदम वैकल्पिक है।

  1. क्रमानुसार काम एकाग्रता 1 माइक्रोग्राम / एमएल 1x पीबीएस के साथ पी के शेयर समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) पतला।
  2. हल्के झटकों के साथ 10 मिनट के लिए पी (लगभग 500 μl) की एक माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ अंडाशय सेते हैं।
  3. छानना पीके solutiऔर फिर ग्लाइसिन के 700 μl (2 मिलीग्राम / एमएल) के 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार के साथ अंडाशय धोने पर।
  4. 10 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार 0.2% PBST के साथ अंडाशय धो लें।
  5. हल्के झटकों के साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए निर्धारण बफर के साथ फिर से अंडाशय को ठीक करें।
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार 0.2% PBST के साथ अंडाशय धो लें।

4. मेथनॉल ऊष्मायन अंतर्जात peroxidase दबाकर (Pod) गतिविधि के लिए

नोट: मेथनॉल ऊष्मायन मेथनॉल संवेदनशील होते हैं कि Phalloidin धुंधला या एंटीबॉडी एपिटोप्स के अधीन भ्रूण को लागू नहीं है।

  1. क्रमानुसार 0.2% PBST में मेथनॉल के विभिन्न प्रतिशत के साथ अंडाशय निर्जलीकरण (3: 1:: 1 1, 3: वी / वी 1) हल्के आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए मेथनॉल समाधान के प्रत्येक एकाग्रता में अंडाशय incubating द्वारा।
  2. हल्के झटकों के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए 100% मेथनॉल के साथ अंडाशय निर्जलीकरण।
    नोट: धुंधला के संतोषजनक परिणाम अभी भी कम से 100% मेथनॉल में संग्रहीत किया गया है कि एफिड ऊतकों से प्राप्त किया जा सकता -20 &# 176; सी एक महीने के लिए।
  3. क्रमानुसार 0.2% PBST में मेथनॉल के विभिन्न प्रतिशत के साथ अंडाशय rehydrate (1: 1:: 3 1: 1, वी / वी 3) हल्के आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए मेथनॉल समाधान के प्रत्येक एकाग्रता में अंडाशय incubating द्वारा।

5. एंटीबॉडी धुंधला

  1. डीआईजी आधारित बफर सेट से 10x अवरुद्ध समाधान पतला (डीआईजी बी) 1x करने के लिए।
    नोट: 1x डीआईजी बी अवरुद्ध समाधान (बीएसए मानक अवरुद्ध 5% से बना अभिकर्मक (वी / वी) सामान्य बकरी सीरम (NGS) और 0.5% (वी / वी) गोजातीय सीरम albumin से धुंधला पृष्ठभूमि को कम करने के लिए और अधिक प्रभावी है ) 0.2% PBST में।
  2. हल्के झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन पर 2.5 घंटे से 4 के लिए 1x डीआईजी बी अवरुद्ध समाधान के साथ अंडाशय सेते हैं।
    नोट: एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में अंडाशय के तीन जोड़े के लिए, 200 μl नमूना अवरुद्ध और एंटीबॉडी धुंधला के लिए न्यूनतम मात्रा है।
  3. सतह पर तैरनेवाला छानना और उचित diluti पर प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त ताजा 1x डीआईजी बी अवरुद्ध समाधान के साथ की जगहअनुपात पर। हल्के झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन में 4 घंटे के लिए अंडाशय दाग।
    नोट: (1) ApVas1 एंटीबॉडी: 1: यहाँ वर्णित प्रयोग के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी के निम्न इष्टतम dilutions उपयोग वर्णजनीय धुंधला के लिए 500, immunofluorescence धुंधला के लिए 01:50; (2) विरोधी α ट्यूबिलिन एंटीबॉडी: 1: 500; (3) 4D9 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी: 01:25।
  4. 15 मिनट प्रत्येक के लिए 0.2% PBST के साथ 4 बार अंडाशय धो लें।
  5. हल्के झटकों के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए 1x डीआईजी बी अवरुद्ध समाधान के साथ अंडाशय सेते हैं।
  6. सतह पर तैरनेवाला छानना और ताजा 1x डीआईजी बी अवरुद्ध समाधान उपयुक्त कमजोर पड़ने अनुपात पर माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त के साथ बदलें। हल्के झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन में 4 घंटे के लिए अंडाशय दाग।
    1. माध्यमिक एंटीबॉडी के निम्न कमजोर पड़ने अनुपात का उपयोग: (1) immunofluorescence धुंधला के लिए: 1: एलेक्सा स्त्राव 633 बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी या एलेक्सा स्त्राव 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी के लिए 500; (2) वर्णजनीय धुंधला के लिए: 1: 200 biotinylated बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के लिए।
      नोट: biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला संकेतों काफी परिलक्षित कर रहे हैं जिसके माध्यम से सब्सट्रेट आधारित (वर्णजनीय) का पता लगाने में avidin बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) के साथ बातचीत के लिए लागू किया जाता है।
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील है क्योंकि immunofluorescence धुंधला के लिए, अंधेरे में धुंधला बाहर ले।
  7. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 0.2% PBST के साथ 4 बार माध्यमिक एंटीबॉडी से धो लें।

6. परमाणु और एफ actin धुंधला

नोट: यह केवल immunofluorescence धुंधला के लिए लागू किया जाता है।

  1. अंधेरे में आरटी पर DAPI (2 एनजी / μl) और 2 घंटे के लिए Phalloidin-TRITC (100 एनएम) युक्त 0.2% PBST के साथ अंडाशय दाग।
  2. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 0.2% PBST के साथ 4 बार अंडाशय धो लें।
  3. हल्के झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते मध्यम हे / एन के साथ अंडाशय सेते हैं।

7. सिग्नल विकास

नोट: यह केवल वर्णजनीय धुंधला के लिए लागू किया जाता है।

  1. के 100 μl तैयारबायोटिन हॉर्सरैडिश peroxidase के साथ संयुग्मित (अभिकर्मक बी के 1 μl, 0.2% PBST के 98 μl में अभिकर्मक ए (avidin) के 1 μl जोड़ने कोमल pipetting के माध्यम से अच्छी तरह से मिश्रण है, और जोड़कर संकेतों को बढ़ाने के लिए (एबीसी) अभिकर्मक avidin बायोटिन कॉम्प्लेक्स ), तत्काल मिश्रण द्वारा पीछा किया। हल्के झटकों के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं।
  2. हल्के झटकों के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए अभिकर्मकों ए और बी के मिश्रण में (disassociated अंडा कक्षों सहित) अंडाशय सेते हैं।
  3. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 0.2% PBST के साथ 4 बार अभिकर्मकों ए और बी के मिश्रण से धो लें।
  4. एक प्लास्टिक ड्रॉपर के साथ मौके थाली पर एक अच्छी तरह से करने के लिए PBST में डूबे हुए अंडाशय स्थानांतरण।
  5. 3,3'-diaminobenzidine (थपका) के सब्सट्रेट समाधान तैयार: एक थपका गोली प्लस 1 मिनट के लिए जोरदार vortexing के माध्यम से DDH 2 हे के 1 मिलीलीटर में एक दूसरे से युक्त यूरिया हाइड्रोजन पेरोक्साइड भंग।
    नोट: थपका, peroxidase की एक precipitating सब्सट्रेट, immunostaining के लिए एक लोकप्रिय वर्णकोत्पादक है। यह एक बीआर का उत्पादनperoxidase द्वारा ऑक्सीकरण होने के बाद खुद का और अघुलनशील वेग। कमजोर संकेतों सब्सट्रेट समाधान (अंतिम एकाग्रता 0.05-0.08%) करने के लिए निकल क्लोराइड जोड़कर बढ़ाया जा सकता है।
  6. कुएं में शेष PBST के समाधान निकालें और संकेत के विकास के लिए थपका सब्सट्रेट समाधान के 100 μl के साथ फिर से भरना।
  7. कम बढ़ाई एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत संकेतों की तीव्रता की निगरानी करें।
  8. तुरंत 1x पीबीएस के साथ refilling द्वारा पीछा थपका समाधान, को हटाने के द्वारा प्रतिक्रियाओं को रोकने के। दो बार धोने दोहराएँ।
  9. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को वापस अंडाशय हस्तांतरण और फिर 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार 1x पीबीएस या PBST से धो लें।
  10. हल्के झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते मध्यम (70% ग्लिसरॉल) हे / एन में अंडाशय सेते हैं।

8. Aphid भ्रूण बढ़ते

नोट: एफिड भ्रूण की मोटाई के विकास के चरणों के बीच होती है। बढ़ते रणनीतियों इस प्रकार जल्दी फिट करने के लिए संशोधित (germaria और 0-10 चरणों), मध्य (चरणों रहे हैंचित्रा 2 बी में प्रदर्शन कर रहे हैं, जो 11-18), और देर से भ्रूण (चरणों 19-20), - डी। भ्रूण मचान मिउरा एट अल पीछा किया। 12

  1. कम बढ़ाई एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत नमूने एक प्लास्टिक ड्रॉपर के साथ सेल ट्रे के लिए बढ़ते मध्यम के साथ एक साथ अंडाशय स्थानांतरण और निरीक्षण करते हैं।
  2. कीट पिन का उपयोग कर पार्श्व डिंबवाहिनी के साथ जुड़े calyces कटौती और फिर एक dropper के साथ अच्छी तरह से एक खाली गिलास के लिए एक पृथक ovariole हस्तांतरण। बढ़ते माध्यम का उपयोग कर μl 50-100 अंतिम मात्रा अप करें।
  3. एक गिलास dropper के साथ स्लाइड पर एक ovariole हस्तांतरण और फिर कीट पिन का उपयोग अंडा कक्षों काटना।
    नोट: विकास का चरण 6 से अधिक पुराने भ्रूण के लिए, अंडा कक्षों की जुदाई का सुझाव दिया है; germaria और स्टेज 6 की तुलना में छोटी पहले दो अंडे कक्षों के लिए, जुदाई वैकल्पिक है।
  4. एक गिलास ड्रॉपर का उपयोग कर एक साफ स्लाइड करने के लिए एक विच्छेदित अंडा चैम्बर स्थानांतरित करना।
  5. एक coverslip (आकार रखो: 22 x 22विच्छेदित germaria या धीरे-धीरे बुलबुले से बचने के लिए अंडा कक्षों (चरणों विकास के 1-10 पर भ्रूण युक्त) से अधिक मिमी)।
    1. माउंट अंडा कक्षों एक तरफा coverslip के पुल के साथ एक स्लाइड पर (चरणों विकास की 11-18 में भ्रूण युक्त) और एक अन्य coverslip जगह: नमूना के शीर्ष पर (आकार 18 x 18 मिमी)।
    2. माउंट अंडा कक्षों दो तरफा coverslip के पुल के साथ एक स्लाइड पर (विकास का चरण 19 से अधिक पुराने भ्रूण युक्त) और एक अन्य coverslip जगह: नमूना के शीर्ष पर (आकार 18 x 18 मिमी)।
  6. नमूना सुखाने से बचने के बढ़ते मीडिया के साथ शीर्ष coverslip नीचे अंतरिक्ष भरें।
  7. हल्का अवलोकन के लिए सही उन्मुखीकरण प्राप्त करने के लिए coverslip के फिसलने से भ्रूण रोल।
  8. नेल पॉलिश के साथ (पुल coverslips सहित) coverslips के किनारे के आसपास सील।

9. इमेजिंग विश्लेषण

  1. फोटोग्राफ अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) की छवियों को एक compou के साथ भ्रूण पूरे माउंटएन डी माइक्रोस्कोप डीआईसी प्रकाशिकी और एक कैमरे से जुड़ा एक सूखी उद्देश्य लेंस (10X, 20X, 40X) के साथ सुसज्जित। निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर कैमरे और कंप्यूटर के बीच छवि हस्तांतरण के लिए सॉफ्टवेयर स्थापित करें।
  2. एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के साथ 14 fluorescently लेबल भ्रूण के अनुमानों मोल। Photographing के जेड-स्टैकिंग, और 3 डी इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ पेश करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    1. 10x उद्देश्य के साथ घुड़सवार नमूना मिल जाए, उल्टा स्लाइड बारी है, और एक ठीक से सना हुआ आधारित कलम के साथ नमूना क्षेत्रफल वृत्त।
      नोट: यह एक confocal खुर्दबीन के उद्देश्यों के माध्यम से इसके लिए खोज जब नमूना आसान की पहचान बनाता है।
    2. जिसका विपरीत पक्ष 9.2.1 में वर्णित के रूप में चिह्नित किया गया है coverslip क्षेत्र के शीर्ष पर तेल की एक बूंद जोड़ें।
  3. 40X उद्देश्य तेल विसर्जन पर फोकल हवाई जहाज़ तो एक 63X उद्देश्य तेल विसर्जन करने के लिए परिवर्तन का पता लगाएं। मैन्युअल ठीक ऊपर ध्यान केंद्रित नियंत्रण के लिए कदम और करनाWN सबसे अच्छा फोकल हवाई जहाज़ पर कब्जा करने के लिए।
    नोट: germaria और जल्दी भ्रूण के संरचनात्मक विवरण के अवलोकन के लिए, हम 40X उद्देश्यों या उच्च वृद्धि के साथ उन का उपयोग कर सुझाव देते हैं।
  4. अलग उत्तेजना चैनलों में भ्रूण स्कैन और एक Z-ढेर छवि प्राप्त करते हैं।
    नोट: मटर एफिड ऊतकों के लिए, 1.5 माइक्रोन या कम करने के लिए नीचे प्रत्येक ऑप्टिकल अनुभाग की मोटाई कम।

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Representative Results

इस अध्ययन में, हम अलैंगिक मटर एफिड (चित्रा 1 ए) के भ्रूण पर पूरे माउंट immunostaining प्रदर्शन किया। इन महिलाओं parthenogenetically और viviparously वंश का उत्पादन। इन महिला भ्रूण डिम्बग्रंथि नलिकाओं (ovarioles) (चित्रा 1 बी और 2A चित्रा) का अंडा कक्षों के भीतर विकसित करना। माइक्रोस्कोपी से पहले, विच्छेदित ovarioles धुंधला लक्ष्य कर रहे हैं; हालांकि, अंडा कक्षों की जुदाई एक माइक्रोस्कोप (- डी चित्रा 2 बी) के तहत भ्रूण के अवलोकन के लिए आवश्यक है।

ऊतक पारगम्यता की वृद्धि

Proteinase कश्मीर (पीके) के इलाज के ऊतकों पारगम्यता बढ़ाने के लिए एक मानक तरीका है, लेकिन इस तरह के जीवों Caenorhabditis एलिगेंस (निमेटोड), ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (मक्खी), और देनियो rerio के रूप में कुछ मॉडल की भ्रूण (के लिएzebrafish) -इस चरण वैकल्पिक है। मटर एफिड में, पी के इलाज के लिए आवश्यकता के चरण पर निर्भर है: पहले gastrulation को germaria और भ्रूण (चरणों 0-7) के लिए, पीके उपचार छोड़ा जा सकता है; लेकिन germband एक्सटेंशन (चरण 11) के तहत या बाद के चरणों में भ्रूण के लिए यह कदम अत्यधिक की सिफारिश की है। उदाहरण के लिए, मध्य भ्रूण संकेतों के दौरान मुश्किल से पीके उपचार (- सी चित्रा 3) के बिना भ्रूण में पाया गया। इसके विपरीत, संकेत तीव्रता काफी ('- सी', एक "- सी" चित्रा 3) पीके पाचन के अधीन भ्रूण में बढ़ाया गया था।

पृष्ठभूमि धुंधला की कमी

अंतर्जात peroxidase (पॉड) गतिविधि के एक उच्च स्तर एफिड के भ्रूण के ऊतकों में पहचान की थी। इस एंजाइम गतिविधि को दबाने के लिए, paraformaldehyde तय भ्रूण हरियाणा की उपस्थिति में incubated रहे थेपॉड के ऑक्सीकरण के लिए drogen पेरोक्साइड (एच 22), एक आम अभिकर्मक। हमारे परिणाम एच 22 उपचार देर चरण भ्रूण (चित्रा -4 ए, डी) में प्रभावी ढंग से अंतर्जात फली की गतिविधि को दबाने नहीं था कि पता चला है। इसके विपरीत, पृष्ठभूमि धुंधला काफी हद तक मेथनॉल ऊष्मायन (चित्रा 4 बी, सी, ई, एफ) के अधीन भ्रूण में कम हो गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी भ्रूण के आवेदन एंटीबॉडी धुंधला के लिए मानक प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में NGS और बीएसए युक्त समाधान में अवरुद्ध थे। हालांकि, एफिड भ्रूण में अवशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला ('- सी' चित्रा 3) का पता चला था। यह समस्या ऐसी स्वस्थानी संकरण ("- सी" चित्रा 3) के रूप में डीआईजी लेबलिंग प्रयोगों के लिए एक बफर सेट द्वारा आपूर्ति अवरुद्ध अभिकर्मक के साथ NGS / बीएसए की जगह के बाद हल किया गया था। हम इस प्रकार डीआईजी बी के साथ मेथनॉल और ऊष्मायन के साथ कि पोस्ट-निर्धारण निष्कर्ष निकालनाअभिकर्मक अवरुद्ध एफिड भ्रूण में पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के लिए आवश्यक दोनों हैं।

पी उपचार और डीआईजी बी अवरुद्ध अभिकर्मक वर्णजनीय लेकिन यह भी फ्लोरोसेंट तरीकों का उपयोग प्रभावी संकेत का पता लगाने के लिए न केवल आवश्यक हैं। मेथनॉल के प्रति संवेदनशील मिलान के लिए phalloidin या धुंधला के साथ एक्टिन धुंधला, तथापि, actin या एंटीबॉडी के मूल रूप को नष्ट कर सकता है, जो पूर्व निर्धारण करने के लिए मेथनॉल के साथ अधीन भ्रूण में काम नहीं करता है। प्रतिदीप्ति immunostaining प्रदर्शन जब तदनुसार, इस इलाज से परहेज किया जाना चाहिए। इसके अलावा मेथनॉल उपचार कदम को नष्ट करने से इम्यूनोफ्लोरेसेंस एफिड भ्रूण में बहु-लेबलिंग प्रयोगों की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, जर्म कोशिकाओं, नाभिक में सूक्ष्मनलिकाएं में α ट्यूबिलिन, microfilaments में एफ actin, और डीएनए में मटर एफिड Vasa1 प्रोटीन (ApVas1) समवर्ती चिह्नित और (चित्रा 5 ए, सी) कल्पना की जा सकती है। Chro के साथ तुलना मेंलेबलिंग के लिए शर्तों को गोद लेने। - mogenic विधि (चित्रा 5 ब), fluorescently लेबल नमूने सेक्शनिंग कोंफोकल ऐसी जल्दी एफिड भ्रूण में रोगाणु प्लाज्म और cellularizing रोगाणु कोशिकाओं में ApVas1 (डी "चित्रा 5C ', डी) के रूप में स्थानीय संकेतों के बेहतर समाधान प्रदान करता है ऊपर वर्णित जर्म कोशिकाओं, विस्तार रोगाणु बैंड के क्षेत्रों में Engrailed / Invected प्रोटीन भी एंटीबॉडी 4D9 (चित्रा 6) के साथ सना हुआ था। इससे पता चलता है कि के लिए हमारे प्रोटोकॉल immunostaining सहित वर्णजनीय और फ्लोरोसेंट तरीकों से कर सकते हैं प्रभावी ढंग से पता लगाने के संकेत के लिए लागू किया germline और एफिड में दैहिक सेल प्रजातियों दोनों में।

आकृति 1
चित्रा 1. स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली मटर एफिड। (ए) एक अलैंगिक जीवित बच्चा जनने वाली महिला वयस्क से उभरती एक पहली इनस्टार अप्सरा। (बी 12 के बीच चर हो सकता है। एक ovariole टिप में एक germarium (तीर), 1-2 oocytes, और 5-7 भ्रूण कक्षों में शामिल है। पेट और पुच्छ आमतौर पर विच्छेदित अंडाशय के साथ जुड़े रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
विकास के विभिन्न चरणों में एफिड भ्रूण बढ़ते के लिए रणनीतियों के चित्रा 2. चित्रण। एक स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली महिला वयस्क से विच्छेदित ovariole में भ्रूण के विकास के (ए) को रेखांकित करें। संक्षिप्त डिम्बजनन (germarial मंच और चरणों 0-2) भ्रूण (चरणों 3-20) द्वारा पीछा किया जाता है। भ्रूण की रूपरेखा: च syncytial निषिक्त की ormation (चरणों 3-5); blastulation (चरणों 6-7); gastrulation (चरणों 8-10); रोगाणु बैंड के बढ़ाव (चरणों 11-14); katatrepsis (15 चरणों); पोस्ट katatrepsis और रोगाणु बैंड त्याग (चरणों 16-17); जीवोत्पत्ति (18-20 चरणों)। रंग चाबियाँ आंकड़ा के नीचे हैं। (बी, बी ') Germarium और 0-10 भ्रूण चरणों। कोई coverslip पुल की आवश्यकता है। (सी, सी ') 11-18 भ्रूण चरणों। एक coverslip पुल की आवश्यकता है। (डी, डी ') 19-20 भ्रूण चरणों। डबल coverslip पुलों के लिए आवश्यक हैं। Coverslip के फिसलने से भ्रूण रोलिंग अवलोकन के विभिन्न कोणों बना सकते हैं। Coverslips के आकार: 22 x 22 (बी) में मिमी, (सी) में 18 x 18 मिमी और (डी)। coverslips की मोटाई: 0.13-0.16 मिमी। भ्रूण मचान मिउरा पीछा एट अल 12 लघुरूप: छ:। Germarium; सेंट: मंच।com / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,883 / 53883fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
। चित्रा 3. Proteinase कश्मीर उपचार और विभिन्न अवरुद्ध प्रभाव के साथ अभिकर्मकों की तुलना पूर्वकाल अंडा कक्षों के बाईं ओर है; सभी विचारों पृष्ठीय जो कर रहे हैं (बी ',' सी ', सी ") में दिखाया गया भ्रूण को छोड़कर पार्श्व हैं। भ्रूण सभी ApVas1 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1: 500) का उपयोग दाग रहे हैं और ApVas1 के संकेतों 10-20 सेकंड के भीतर विकसित कर रहे हैं। तीर रोगाणु कोशिकाओं के स्थान संकेत मिलता है। (एक - सी) भ्रूण proteinase कश्मीर (पीके) के इलाज के बिना। रोगाणु कोशिकाओं में ApVas1 संकेतों मुश्किल से पता चला रहे हैं। (ए '- सी', एक "- सी") भ्रूण गुट में पृष्ठभूमि धुंधला की तुलना('- सी' ए) और डीआईजी धो और ब्लॉक बफर सेट (डीआईजी बी) (ए "- सी") में वाणिज्यिक अवरुद्ध अभिकर्मक के NGS और बीएसए के साथ ked। पृष्ठभूमि काफी ("- सी" ए) में दिखाया भ्रूण में कम हो जाता है। संक्षिप्त: बी: बैक्टीरिया। स्केल सलाखों:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
भ्रूण की मेथनॉल पूर्वकाल के साथ चित्रा 4. कम से कम पृष्ठभूमि धुंधला बाईं ओर है; सभी विचारों पृष्ठीय हैं। भ्रूण एंटीबॉडी की पारगम्यता बढ़ाने के लिए पी के साथ व्यवहार कर रहे हैं। तीर रोगाणु कोशिकाओं के स्थान संकेत मिलता है। उपचार की (ए, बी, डी, ई) तुलनाहाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 22) और मेथनॉल के साथ। भ्रूण केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं। एच 22 उपचार (w / वी 0.3%, 10 मिनट): उच्च पृष्ठभूमि (ए, डी); मेथनॉल उपचार (100%, 60 मिनट): कम पृष्ठभूमि (बी, ई)। (सी, एफ) मेथनॉल के साथ इलाज भ्रूण पर प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला। मेथनॉल उपचार की शर्तें (बी, ई) में दिखाया गया भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए समान हैं। ApVas1 एंटीबॉडी अधिमान्यतया भ्रूण जनन कोशिकाओं लेबल। स्केल सलाखों:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
जल्दी भ्रूण पर चित्रा 5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। (बी) में: और 1 - ApVas1 एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने अनुपात (डी ए, सी) में 1:50 हैं। ApVas1, α ट्यूबिलिन, एफ actin और परमाणु डीएनए में शामिल हैं जो (ए) धुंधला संकेतों, अलग अलग तरंग दैर्ध्य के साथ चार चैनलों का उपयोग कर पता चला रहे हैं। संकेतों के रंग चाबियाँ आंकड़ा के तल पर दिखाए जाते हैं। तुलना के लिए एक वर्णजनीय परिणाम (बी) डीआईसी छवि। चरण-तीन भ्रूण में ApVas1 के पीछे स्थानीयकरण (तीर) के विपरीत तीव्रता (सी, सी ') में दिखाया गया है कि जैसे ही स्पष्ट नहीं है जबकि ApVas1 germarium भीतर समृद्ध है। (सी, सी ') अंडा पीछे में ApVas1 संकेतों के संवर्धन। अंडा कक्ष (तीर) के पीछे क्षेत्र के लिए स्थानीय सिग्नल की छवि स्टैकिंग से बढ़ा रहे हैं। एफ actin और α ट्यूबिलिन के संकेतों को आंशिक रूप से (पोस्टीरियर में ApVas1 के उन मुखौटा क्योंकिसी), एकल मोड़ा स्कैनिंग द्वारा उत्पादित एक छवि (सी) में दिखाया गया है। चरण -4 भ्रूण के पीछे क्षेत्र में स्थानीय ApVas1 की - (डी डी '') Confocal सेक्शनिंग। (डी) और (डी ') में दिखाया छवियाँ ApVas1 क्रमशः, सतह और केंद्रीय फोकल विमानों में पता चला रहे हैं। (डी ") (डी) और (डी ') के रूप में ही भ्रूण से सभी वर्गों के मर्ज किए गए छवि है लघुरूप: के रूप में: एस्टर, एफसी, कूप कोशिकाओं; पीओसी, भावी डिम्बाणुजनकोशिका; सपा:। धुरी, टीसी, पौष्टिकता डोरियों। स्केल सलाखों:। 10 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 भ्रूण खंडों पर Immunostaining। एकअंडा कक्षों के terior बाईं ओर है। पी-इलाज भ्रूण भ्रूण खंडों में व्यक्त कर रहे हैं जो Engrailed / Invected के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 4D9, साथ दाग रहे हैं। संकेतों के रंग चाबियाँ आंकड़ा के तल पर दिखाए जाते हैं। (ए, ') एक मंच-13 भ्रूण पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। (ए), Engrailed / Invected, α ट्यूबिलिन, एफ actin और परमाणु डीएनए stainings की छवियों से खड़ी एक confocal छवि। (ए ') केवल Engrailed / Invected का धुंधला दिखा एक confocal छवि। अन्य चैनलों से संकेतों के हस्तक्षेप के बिना, संकेतों बेहतर प्रदर्शित कर रहे हैं। चरणों में 13 और क्रमश: विकास की 17, भ्रूण पर (बी, सी) वर्णजनीय धुंधला हो जाना। (बी) के स्टेज-13 भ्रूण। (सी) स्टेज -17 भ्रूण। चरणों से 13-17, पेट में क्षेत्रों की बढ़ती संख्या 4D9 द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। (डी) नकारात्मक नियंत्रण (-Ctrl) दागएलेक्सा स्त्राव 633. साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी लगभग कोई immunostaining के संकेतों प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना ovariole पर पता चला रहे हैं साथ ही हैैं। हालांकि, चरण 7 और अंडे कक्षों में से 13 के भीतर बैक्टीरिया (डैश लाइन) के autofluorescence उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 488 एनएम पर पता चला रहे हैं। लघुरूप: एक: पेट; बी: बैक्टीरिया; एच: सिर; टी: छाती। स्केल सलाखों:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम मटर एफिड में सफल immunostaining के लिए महत्वपूर्ण इष्टतम स्थितियों की पहचान की। पाइसम, जीनोमिक और विकास अध्ययन 3,15 के लिए एक उभरती हुई मॉडल जीव। ऊतक पारगम्यता बढ़ाने और पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के लिए अनुकूलित शर्तों तीव्रता और संकेतों की विशिष्टता बढ़ाया। वे कोशिका झिल्ली के छिद्रों बनाने और बाध्यकारी गैर विशिष्ट एंटीबॉडी रोकने के लिए चरणों में अन्य पशु मॉडल में immunostaining के लिए मानक प्रोटोकॉल से अलग।

Immunostaining के लिए और स्वस्थानी संकरण में, proteinase कश्मीर (पीके) पाचन ऊतक पारगम्यता 16-19 बढ़ाने के लिए आम तरीकों में से एक है। (1) पीके पाचन काफी हालांकि, रोगाणु बैंड विस्तार (चरणों 11-14) (चित्रा 3 बी ',' सी '') के दौरान स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली भ्रूण में immunostaining के संकेतों को बढ़ाया: एफिड ऊतकों के एंटीबॉडी धुंधला में, हमारे परिणामों से पता चला किकमजोर संकेतों अभी भी पी उपचार (चित्रा 3 बी, सी) से रहित भ्रूण में दिखाई दे रहे थे; और (2) पीके पाचन आगे katatrepsis से भ्रूण (15-20 चरणों) (चित्रा 4C, एफ और चित्रा 6C) के लिए अनिवार्य किया गया था। प्रायर katatrepsis को अलैंगिक जीवित बच्चा जनने वाली भ्रूण के लिए, अंडा कक्षों की मात्रा प्रवेश की समस्या के कारण की संभावना नहीं है क्योंकि रखी अंडे-जो सबसे परिपक्व अलैंगिक अंडा chamber- करने के लिए आकार में लगभग बराबर हैं में रहने वाले जल्दी यौन अंडोत्पन्न भ्रूण पर सफल immunostaining पीके पाचन 20 की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, रोगाणु बैंड की elongating और तह एंटीबॉडी के प्रवेश द्वार में बाधा हो सकती अलैंगिक अंडा कक्षों के सीमित स्थान में (11 से 14 चरणों), और यह के बीच कोशिका झिल्ली के छिद्रों बनाने के द्वारा एंटीबॉडी के प्रवेश की अनुमति देता है कि पी है जाम भ्रूण संरचनाओं। इसके विपरीत, यौन अंडे में रोगाणु बैंड की सीधी रेखा विस्तार यह भी दाग ​​है क्यों समझा जा सकता हैपीके के अभाव। पीतक लिफाफा / जरायु से हटाने की भी एंटीबॉडी के लिए यौन अंडोत्पन्न भ्रूण अधिक सुलभ बना सकते हैं। भ्रूण 19 cuticled मोटी हैं क्योंकि katatrepsis के बाद भ्रूण को (16 से 20 चरण) के लिए, पीके उपचार दोनों अलैंगिक और यौन morphs के लिए आवश्यक है (चित्रा 4C, एफ और चित्रा 6C)।

भ्रूण संरचनाओं की अखंडता या संकेतों की तीव्रता संतोषजनक नहीं है फिर भी, यदि पीके पाचन के लिए सुझाव हालत (10 मिनट के लिए एक माइक्रोग्राम / एमएल) के आगे समायोजन की आवश्यकता है। यह मुख्य रूप से बैच से बैच के लिए अलग-अलग हो सकता है कि पीके गतिविधि के कारण होता है। भ्रूण के ऊतकों पीके पाचन के बाद क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, तो उदाहरण के लिए, पी की एकाग्रता 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल तक कम किया जा सकता है। संकेत तीव्रता कमजोर है इसी तरह, अगर 15-20 मिनट के लिए ऊष्मायन के विस्तार के इस प्रकार की सिफारिश की है। 1.0 माइक्रोग्राम / एमएल एकाग्रता, होवे पर 20 मिनट के लिए ऊपर लंबे समय तक पी ऊष्मायन के अधीन सबसे परिपक्व भ्रूण (चरण 20)देखें, आम तौर पर पी पाचन अभी तक अधूरा है, सुझाव है कि कमजोर संकेतों प्रदर्शित करते हैं। लंबे समय तक पाचन धुंधला संकेतों को बढ़ाने लेकिन चरण में पता चला अभिव्यक्ति पैटर्न 18 भ्रूण चरण 20 भ्रूण में उन लोगों के लिए समान हैं, खासकर जब वैकल्पिक है सकते हैं। विकास के चरण में 20 में भ्रूण के साथ इसकी तुलना में, अभी तक शरीर छल्ली की कम राशि के साथ अनुरूप आकृति विज्ञान के साथ मंच 18 भ्रूण आम तौर पर मजबूत संकेत तीव्रता उपज कर सकते हैं।

संकेत विकास के दौरान, पृष्ठभूमि धुंधला substrates के साथ पार प्रतिक्रिया कर सकते हैं कि अंतर्जात एंजाइम की गतिविधि के द्वारा उठाया जा सकता है। मटर एफिड भ्रूण में, संकेत substrates के पचाने के लिए आम एंटीबॉडी conjugates हैं, जो दोनों के अंतर्जात alkaline फॉस्फेट (एपी) और peroxidase (पॉड), की गतिविधि का पता चला था। अंतर्जात एपी के hydrolase गतिविधि को प्रभावी ढंग से levamisole द्वारा भ्रूण भर में दबा दिया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया। फिर भी, 0.3-0.6% hydrog के साथ भ्रूण का उपचारपेरोक्साइड (एच 22) एन केवल katatrepsis करने से पहले अंतर्जात पॉड गतिविधि को खत्म करने पर पुराने भ्रूण (चित्रा -4 ए, डी) के लिए पर्याप्त नहीं था सकता है। मेथनॉल ऊष्मायन, अंतर्जात प्रोटीन denaturing के लिए एक वैकल्पिक तरीका, एफिड 21 (चित्रा 4 बी, ई) में प्रभावी होने के लिए प्रदर्शन किया गया। एच 22 के विपरीत 30 मिनट या उससे अधिक समय के लंबे समय तक गर्मी के दौरान जो नुकसान एफिड ऊतकों, मेथनॉल पचाने या विकास के किसी भी स्तर (चित्रा 4C, एफ) के दौरान भ्रूण ख़राब नहीं करता है। नतीजतन, मेथनॉल एफिड भ्रूण में अंतर्जात पॉड गतिविधि को दबाने के लिए एक बेहतर विकल्प है। अवशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला आमतौर पर 4 में मेथनॉल में छल्ली की एक गाढ़ा परत हे / एन ऊष्मायन के साथ परिपक्व भ्रूण के लिए होता है, जो पता चला है डिग्री सेल्सियस अनुसार हमारे लिए अनुभव कर सकते हैं आगे अंतर्जात पॉड गतिविधि को कम।

अवशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला में पाया गया थाइस तरह के सामान्य गधा सीरम (एनडीएस), सामान्य बकरी सीरम (NGS), गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), या उनके मिश्रण 13 (चित्रा 3A'-सी ') के रूप में सीरम प्रोटीन के साथ अवरुद्ध भ्रूण। (- 'चित्रा 3 ए' 'सी') इसके विपरीत द्वारा स्वस्थानी संकरण में के लिए इस्तेमाल एक व्यावसायिक रूप से आपूर्ति अवरुद्ध अभिकर्मक, गोद लेने, immunostaining के दौरान शेष पृष्ठभूमि काफी होना 5 का सफाया कर सकता है। अवरुद्ध अभिकर्मक की सामग्री के मालिकाना कर रहे हैं, यह संभावना मटर एफिड प्रोटीन की गैर विशिष्ट एपिटोप्स ब्लॉक कर सकते हैं कि गैर-सीरम प्रोटीन होता है। अवरुद्ध अभिकर्मक भी हरी आड़ू एफिड Myzus persicae में जानवर सीरा की तुलना में ज्यादा बेहतर काम किया। इसी तरह, persicae पीके पाचन और मेथनॉल ऊष्मायन संतोषजनक एंटीबॉडी पैठ और पृष्ठभूमि में कमी के परिणामस्वरूप में एम। - बेहतर परिणाम के लिए इसी तरह में हासिल की पाइसम (डेटा) नहीं दिखाया। हम स्थितियों optimiz आशा करते हैं किएड ऊतक पारगम्यता बढ़ाने और पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, एक वर्णजनीय धुंधला या प्रतिदीप्ति का उपयोग करता है, कई अन्य एफिड प्रजातियों के लिए लागू होगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2) Sigma-Aldrich 18304 For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody Developmental studies hybridoma bank AB_528224 For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody Our laboratory N/A For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. 
Austerlitz Insect pins ENTOMORAVIA N/A For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope Canon EOS 5D For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray Kartell Labware 357 For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics Leica Microsystems DMR For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set Sigma-Aldrich (Roche) 11585762001 For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps Ideal-tek N/A For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. 
Glass dropper N/A N/A For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine Bioshop N/A For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 Invitrogen A11017 For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 Invitrogen A21072 For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer ELMI laboratory equipment RM-2M For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy Leica Microsystems SP5 For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol  Burdick and Jackson AH2304 For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides  Thermo scientific 10143560 For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses Marienfeld 0101030 For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses Marienfeld 0101050 For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) Santa Cruz Biotechnology sc-32293 For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish N/A N/A For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA) VWR MK262159 For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC Sigma-Aldrich P1951 For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper N/A N/A For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. 
Proteinase K Merck 124678 For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. 
Pyrex spot plate N/A N/A For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets  Sigma-Aldrich D4168 For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope Leica Microsystems EZ4 For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100 Sigma-Aldrich T8787 For creating pores (punching) on the cell membrane. 
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector laboratories PK-6101 For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium Vector laboratories H1000 For clearing of aphid embryos and mounting.

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References

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