Комбинированный 3D Tissue Engineered * These authors contributed equally

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В настоящем исследовании, мы объединили в пробирке модель опухоли легких 3D с силикомарганца в модели для оптимизации предсказания реакции лекарственного средства на основе конкретных мутационный фоне. Модель генерируется на decellularized свиных эшафот, воспроизводящем тканеспецифические характеристики относительно внеклеточной матрицы состава и архитектуры, включая базальную мембрану. Мы стандартизирован протокол, который позволяет генерировать искусственную опухолевой ткани в течение 14 дней, включая три дня лечения наркозависимости. Наша статья содержит несколько подробных описаний 3D считывания методы скрининга , как определение индекса пролиферации Ki67 окрашивания в, апоптоз от супернатантах M30-ELISA и оценки эпителиальной к переходу мезенхимальных (EMT), которые являются полезными инструментами для оценки эффективности терапевтические соединения. Мы могли бы показать по сравнению с 2D-культуры сокращение распространения в нашей 3D модели опухоли, которое RELATред к клинической ситуации. Несмотря на это более низкой пролиферации, модель предсказал EGFR -targeted ответы наркотиков правильно в соответствии со статусом биомаркеров , как показано сравнением линий клеток карциномы легкого HCC827 (EGFR -mutated, KRAS дикого типа) и А549 (EGFR дикого типа, KRAS - мутировали) была обработана ингибитором тирозинкиназы (ИТК) гефитиниб. Для изучения реакции снадобья более продвинутых опухолевых клеток, мы индуцированный EMT путем длительного лечения с TGF-бета-1 по оценке виментина / пан-цитокератина иммунофлуоресцентного окрашивания. Поток-биореактор был использован для регулировки культуры в физиологических условиях, в котором улучшено образование тканей. Кроме того, мы покажем интеграцию реакций лекарственных средств при лечении гефитинибом или TGF-бета-1 стимуляции - апоптоза, пролиферации и индекс ЕМТ - в булевское в силикомарганца модели. Кроме того, мы объясним, как наркотиков реакции опухолевых клеток с определенным мутационного фона и подсчетаerstrategies против сопротивления можно предсказать. Мы уверены , что наша 3D экстракорпоральное подход особенно с его расширением в силикомарганца обеспечивает дополнительную ценность для доклинических испытаний лекарственных средств в более реалистичных условиях , чем в культуре клеток 2D.

Introduction

Фармацевтическая промышленность сталкивается с высокими темпами истирание до 95% в области лечения онкологических заболеваний в клинической фазе вызывает огромные затраты на 1-5. Одной из причин этого дефицита является тот факт, что в настоящее время эффективность потенциальных новых соединений оценивают в крупномасштабных скринингов на клеточных культурах 2D-клеточных линий рака или в моделях на животных. Животные модели имеют более высокий уровень сложности , но есть существенные различия между мужчинами мышей и 6,7. В последнее десятилетие, модели рака 3D с использованием различных подходов были сформированы , чтобы преодолеть разрыв между 2D культуры раковых клеточных линий и комплекса в естественных условиях 6,8,9 опухоли. Воздействие 3D среды на дифференциации клеток , а также на передаче сигналов было показано в нескольких исследованиях лет назад (например., С помощью Mina Bissell) 10,11. Сегодня многие 3D - модели клеточной культуры имеются такие , как сфероида культур, гидрогели или микрожидкостных чипов 12-16. Несмотря на то, Фесе модели повышения сложности по сравнению с традиционными системами 2D культуры, в большинстве случаев они испытывают недостаток в микросреду ткани, который, как известно, опухолевые поддерживающие эффекты, а также влияет на эффективность лекарственного средства.

Для решения этой проблемы, мы получили 3D модель опухоли на основе биологического помост под названием SISmuc (малая кишка-подслизистая + слизистую оболочку) , который является производным от decellularized тощей свиньи. Таким образом, архитектура ткани и важными компонентами внеклеточного матрикса , таких как различные коллагенов, а также структуры базальных мембран сохраняются 17. Эта уникальная особенность имеет решающее значение для опухолевой модели генерации карцином, которые возникают из эпителием и содержат около 80% твердых опухолей. Кроме того, скорость распространения в нашей модели опухоли тканевой инженерии снижается по сравнению с искусственно высокими показателями, достигнутыми в 2D культуре. Поскольку распространение является важным параметром при оценке эффективности лекарственных средств, тестирование на наркотики включена в нашей модели более похожиусловия в естественных условиях 17 опухолей.

Для того , чтобы оценить потенциал нашей модели , чтобы правильно спрогнозировать биомаркеров-зависимый эффективность препарата, мы здесь представить данные для двух различных клеточных линий рака легких , которые отличаются по своему статусу EGFR -biomarker. Этот мутационный статус начал определяться рутинно у пациентов с немелкоклеточным раком легких. Целенаправленные процедуры с ИТК , такие как EGFR Ингибитор гефитинибом против опухолей , несущих мутации EGFR активируя показать более высоких результатов по сравнению с теми , с платиновой химиотерапии на основе 18-21.

Мы создали несколько методов для чтения, что имеют отношение к оценке эффективности соединения. Кроме того, после того, как TGF-бета-1 стимуляции мы можем исследовать сложные действия в опухолевых клетках , которые начали процесс ЕМТ, который , как полагают, является важным шагом в злокачественной трансформации 22,23 и который соединен с оМ наркотиковCE 24.

3D модель опухоли позволяют мониторинг клеточных конкретных ответов целевых методов лечения, химиотерапии или комбинации препаратов с хорошими контрастов. В целях дальнейшего укрепления и ускорения наркотиков скрининга и столкнуться с сопротивлением, это дополняется в силикомарганца моделирования. На основе нескольких экспериментов, реакция опухоли может быть предсказано в силикомарганца относительно результатов для полного спектра лекарственных средств и их комбинаций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Двумерная (2D) Культура клеток

  1. Коммерчески получить линии опухолевых клеток HCC827 (DSMZ). Культура легких клеток аденокарциномы линии HCC827 (EGFR , мутировали, KRAS дикого типа) в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FCS. Изменение средней каждые 2 - 3 дня. Разделите клетки два раза в неделю. Клетки используют до прохода 20 не будет достигнуто.
  2. Коммерчески получить опухолевых клеток линии А549 (DSMZ). Культура карциномы легких клеток линии А549 (EGFR дикого типа, KRAS мутантного) в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FCS. Выполните культуру, как указано выше. Клетки используют до прохода 20 не будет достигнуто.
  3. Проверьте клетки регулярно (каждые 4 - 6 недель) для загрязнений, таких как микоплазмы загрязнениями.
  4. Культивирование A549 или HCC827 клеток на покровные стекла
    1. Поместите 1 стерильный покровного стекла в каждую лунку 24-луночного планшета с использованием пинцет.
    2. Семенной 50000 опухолевых клеток обеих клеточных линий в объеме 500 мкл в лунках сстеклянные покровные, соответственно.
    3. Культуры клеток , пока они не достигают слитности 70% при стандартных условиях культивирования (37 ° С, 5% СО 2). За это время отсасывает старой среды с использованием пипетки Пастера и добавляют 500 мкл свежей среды, через каждые 2 - 3 дня культивирования.

2. Генерация Опухоль тест-систем на биологическом Коллаген строительные леса

  1. Статические условия культивирования
    1. Генерирование decellularized небольшой кишка-подслизистой + слизистую оболочку (SISmuc) и закрепить их между двумя металлическими кольцами, так называемые клеточные коронок, как описано в предыдущей публикации 25.
    2. Семенной 100000 клеток либо HCC827 или клеток А549 в общем объеме 500 мкл на сторону бывших просвете кишечника зафиксированной в клеточных коронок.
    3. Разрешить опухолевым клеткам прилипать в течение 2 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Добавьте 1 мл среды внутри клеток короны и 1 мл снаружи.
    4. Культура опухольмодель в статических условиях при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в инкубаторе в течение 14 дней. Изменение культуральной среды через каждые 2 - 3 дня. Поэтому, аспирация среды с помощью пипетки Пастера и пипеткой 1 мл свежей RPMI с соответствующим количеством FCS (А549: 10%, HCC827: 20%) внутри клеток короны и 1,5 мл той же среды снаружи.
  2. Динамические условия культивирования
    1. Настройка тестовой системы опухоли с decellularized матрицей внутри клетки коронок и посевом клеток, как описано в подразделе 2.1.1 2.1.3.
    2. Культура модель опухоли в статических условиях при 37 ° С, 5% СО 2 в инкубаторе в течение 3 -х дней.
    3. Соберите автоклавного биореактор и вставьте посеяны SISmuc, опубликованной ранее 25.
    4. Пипетка 45 мл RPMI с соответствующим количеством FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) в колбу и соединяют безигольчатой ​​устройство для взятия проб в системе трубопроводов между биореактора асреда колбу.
    5. Поместите биореактор в инкубаторе, подключить его к насосу и культуре модель опухоли в дополнительных 14 дней с постоянным потоком среды (3 мл / мин) при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2.
    6. Изменить всю культуральную среду после того, как 7 дней. Для этого переместите биореактор из инкубатора под колпаком с ламинарным потоком. Аспирируйте среду в СМИ колбу с помощью пипетки Пастера. Поднимите биореактор, аспирируя избавиться от среды в системе трубопроводов. Пипетка 45 мл свежей среды в колбу. Поместите биореактор обратно в инкубатор и подключить его к насосу.

3. Лечение статической модели с опухолью Gefitinib

  1. Культура модель опухоли, как описано в разделе 2.1.
  2. На 11-й день культуры, подготовить RPMI / FCS с 1 мкМ гефитинибом (2,5 мл для каждой ячейки короны). Аспирируйте старую среду из лунок с помощью пипетки Пастера и добавляют 1 мл приготовленного RPMI / FCS / гефитинибом внутри тон клетка короны и 1,5 мл той же самой среды снаружи.
    Примечание: размораживали гефитиниб раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение одной недели.
  3. Изменение среды на 13-й день, как описано в пункте 3.2.

4. Стимулирование статической модели с опухолью TGF-бета-1 для ЕМТ Induction

  1. Культура модель опухоли, как описано в разделе 2.1.
  2. На 3-й день культуры, подготовить RPMI / FCS с 2 нг / мл TGF-бета-1 с носителем (2,5 мл для каждой ячейки коронки). Аспирируйте старой среды из скважин с использованием пипетки Пастера и добавляют 1 мл приготовленного RPMI / FCS / TGF-бета-1 внутри клетки короны и 1,5 мл той же среды снаружи. Измените среда с добавлением TGF-бета-1 каждые 2 - 3 дня до 14-й день, как описано в разделе 4.2.

5. Read-ауты

  1. Взятие проб для ELISA измерений
    1. Отбирают образцы из супернатантов статической (раздел 2.1) и динамической (раздел 2.2) культуры во времяЛечение с гефитинибом (раздел 3) в дни 11-14 культуры , как показано на рисунке 2. Кроме того, взять пробу перед обработкой (Т0).
    2. В статических условиях культивирования, можно получить до 100 мкл пробы из внутренней части клеточной короны. В динамических условиях культивирования, винт шприц на устройстве для отбора проб и принимать по 1 мл среды из системы биореактора. Хранить все собранные супернатанты при -80 ° С до тех пор, ELISA, не выполняется.
  2. M30-ELISA для Апоптоз Количественное
    1. Для количественной оценки апоптоза в супернатанты выполнения анализа гибели клеток в соответствии с инструкциями изготовителя. Разрешить все реагенты для достижения RT перед выполнением анализа.
    2. Vortex все реагенты. Разведите промывочную таблетку в 500 мл свежей деионизированной водой. Развести конъюгат пероксидазы хрена с 9,2 мл Сопряженных разбавляющего буфера и перемешать. Пипетка 25 мкл стандарта или пробы на лунку.
    3. Добавьте 75 мкл разведенного HRP ConjuВорота раствора в каждую лунку. Закройте планшет и инкубировать ее на шейкере в течение 4 ч при комнатной температуре. Промыть пластины вручную, в 5 раз с 250 мкл приготовленного промывочного раствора.
    4. Добавить 200 мкл 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) субстрата в каждую лунку. Инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Встряхните планшет в течение 10 секунд и оставьте микропланшет в течение 5 мин перед чтением абсорбцию. Определяют оптическую плотность при длине волны 450 нм в ридере для микропланшетов. Вычислить стандартную кривую и концентрации в образцах, используя соответствующую программу для обработки данных типа ELISA, такие как происхождение.
  3. образец Окрашивание
    1. Крепление, Парафин-вложение и раздел Подготовка 3D - модели
      1. Закрепите посеяны SISmuc с использованием 2,5 мл 4% параформальдегида (PFA) на клетку корону в течение 2 ч и вставлять его в парафин
      2. Подготовьте секции 3 мкм ткани для окрашивания, опубликованных ранее25.
    2. Фиксация клеток , выращенных в 2D условиях культуры
      1. Когда 70% сплошности достигается, мыть клетки, культивируемые на покровных стеклах в 24-луночный планшет один раз PBS и зафиксировать их с 500 мкл 4% PFA / лунку в течение 10 мин.
      2. Удалить PFA и хранить покровные стекла в хорошо пластину, покрытую PBS при 4 ° С до окрашивания не выполняется.
    3. H & E Окрашивание
      1. Пятно регидрировали секции гематоксилином / эозином как обзор окрашивания в соответствии со стандартными протоколами.
    4. Иммунофлуоресцентного Окрашивание 3D - модели
      1. Для иммунофлуоресцентного окрашивания, выполнить поиск антигена путем размещения депарафинировали и регидрировали слайды в пароварке с предварительно нагретым цитратного буфера (рН 6,0) в течение 20 мин.
        Примечание: Смотрите таблицу материалов и оборудования для приготовления цитратного буфера.
      2. Передача слайдовв промывочном буфере (0,5 М PBS буфер + 0,5% Tween), круг участки с РАР ручкой, чтобы свести к минимуму необходимый объем для окрашивания растворов и поместить слайды в камере влажности.
      3. Блок срезов ткани с 5% сыворотки от хозяина видов вторичных антител, используемых в подразделе 5.3.4.6 в течение 20 мин при комнатной температуре.
      4. Удалить блокирующий сыворотку прижав слайды бумажной салфеткой и нанести первичное антитело к окруженным секций в разведении в соответствии с инструкцией производителя (кролик анти Ki67 1: 100, кроличьими анти виментину 1: 100, мышь анти пан-цитокератином 1 : 100). Выдержите O / N при температуре 4 ° С. Для получения двойного окрашивания, необходимо использовать первичные антитела из разных видов хозяев.
      5. Тщательно смыть несвязанного антитела с промывочным буфером три раза в течение 5 мин.
      6. Для выявления специфических антиген-антитело привязок, применяют вторичные антитела в разведении 1: 400 до секций и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
      7. Смыть УНБкруглый вырез антитела с промывочным буфером три раза в течение 5 мин.
      8. Установите слайды с водной средой, содержащей DAPI для ядер контрастное и дайте им высохнуть O / N.
    5. Иммунофлуоресцентного Окрашивание 2D культивируемых клеток
      1. Удалить PBS и покрывают сеяных стекла покровных стеклах с 0,2% Triton-X100 в PBS в течение 5 мин для пермеабилизации. Вымойте стеклянную крышку слипы с промывочным буфером (0,5 М PBS буфера + 0,5% Tween) в течение 5 мин.
      2. Выполните шаги 5.3.4.3 на 5.3.4.7. Выполните все действия, описанные в луночного планшета на качающейся платформе и удаления реагентов опрокидыванием планшета.
      3. Для монтажа, определить каплю водной среды, содержащей DAPI для контрастное ядер на немелованной предметное стекло и передать покровное к нему с клетками, с которыми сталкивается монтажную среду с помощью щипцов. Дайте ему высохнуть, прежде чем визуализации.
  4. Определение индекса пролиферации
    1. Выполните иммунофлуоресцентногоокрашивание против Ki67 в соответствии с разделом 5.3.4. или 5,3 5.
    2. Возьмем флуоресцентных изображений срезах тканей или 2D культивированных клеток с помощью инвертированного микроскопа. Используйте различные фильтры для съемки изображений DAPI окрашиванием и из Ki67 окрашиванием. Для количественной оценки, использовать 10 изображений 3D-секций или 5 изображений 2D культур (увеличение 20х) каждого состояния из непересекающихся частей образца.
    3. Определить количество ядер и количество ядер положительно для Ki67 в 2D
      1. Граф Ki67 положительных ядер вручную , используя счетчик плагин ячейки программного обеспечения Фиджи 26. Поэтому, откройте изображение и нажмите кнопку "Плагины" → "Анализ" → "Счетчик клеток". Нажмите кнопку "Initialize" и выберите тип счетчика. Нажмите на каждую Ki67 положительного ядра. Количество кликов отображается рядом с выбранным типом счетчика.
      2. Для автоматического подсчета клеток от общего числа ядер создать макрокоманду , используя Фиджи 27,28. Adjусть макрос для каждого окрашивания и клеточной линии. Ниже смотрите пример того, как создать макрос.
        1. Начало записи макросов. Откройте DAPI-изображение и преобразовать его в 8-битном формате, нажав кнопку "Изображение" → "Тип" → "8 бит". Нажмите "Повышение контрастности", установите "насыщенный", как "1" и "нормализации".
        2. Установите "нерезкой маски" для повышения резкости изображения. Используйте 'радиус' "1" и "маски" из "0,60". Нажмите кнопку "автоматический порог", выберите метод "RenyiEntropy" с "белые объекты на черном фоне", чтобы binarise изображение.
        3. Нажмите кнопку "Плагины" → "BioVoxxel" → "водосборные нерегулярные особенности" с радиусом эрозии "5", чтобы отделить клетки. Нажмите кнопку "Анализ" → "Анализ частиц" и установить "размер" на "0,02-Infinity".
          Примечание: Число частиц / клетокприведены в сводной таблице в виде графов.
        4. Нажмите кнопку "Создать", чтобы сохранить макрос для анализа дальнейших изображений.
    4. Определить количество ядер и количество ядер положительных для Ki67 в 3D вручную, как описано в подразделе 5.4.3.1.
    5. Рассчитывают индекс средней пролиферации (ИП) в соответствии со следующей формулой:
      Equation1
      п = количество изображений (3D: 10, 2D: 5)

6. В Silico поколения Опухоль модели и моделирование Анти- EGFR терапии в клетках HCC827

  1. Сетевое поколение с помощью анализа сетевого программного обеспечения
    1. Используйте различные известные базы данных для формирования сети опухоли на основе важных экспериментальных параметров Считывание и мутационный фоне HCC827 клеточной линии.
    2. Открытое программное обеспечение 21 сетевого анализа , чтобы визуализироватьсеть.
      1. Нажмите кнопку "Файл" → "Новый" → типа "модели JoVE_tumor" → нажмите кнопку "OK", чтобы создать новую сеть. Нажмите "Квадрат крупного плана Север" → "OK", чтобы визуализировать рецептор в двойной мембраной. Нажмите кнопку "Generic белок" для визуализации узлов (= белки) в виде прямоугольников → типа 'EGFR' → нажмите кнопку "OK"; повторите эту процедуру для каждого узла в сети.
      2. Добавьте узлы в сети: Щелкните правой кнопкой мыши → "Изменение цвета и формы ..." → выбрать для узлов EGFR и (EGF-EGFR) цветовым кодом "255,0,0" (цвет красный); для узлов с-МЕТ и (с-Met) код цвета "0,255,0" (цвет зеленый); для гефитинибом цветового кода "255,255,0" (желтый цвет); для PI3K-Inh цветовым кодом "204204204" (цвет светло-серый); для МЕК-Inh цветовой код "102102102" (цвет темно-серый); для всех остальных узлов в сети выберите цветовой код4; 255255255 "(цвет белый).
      3. Нажмите кнопку "фенотип", чтобы визуализировать параметры считывающие в виде шестиугольников → 'распространения' типа → нажмите кнопку "OK" → правой кнопкой мыши → "Изменить цвет & Shape ..." → выбрать цвет код "255204204" (цвет лосося); повторить это для параметра апоптозу → выберите цветовой код "255,51,204" (фиолетовый цвет).
      4. Визуализируйте кромками (= взаимодействий): Нажмите кнопку "State Transition" для активаций (стрелки), нажмите кнопку "Торможение" для торможений (притупилось стрелки); повторите эту процедуру для каждого взаимодействия в сети.
    3. Нажмите кнопку "Файл" → "Сохранить как ..." → тип 'JoVE_tumor models.xml' → нажмите кнопку "Сохранить", чтобы сохранить сгенерированный сигнализации сети в формате .xml.
  2. В Silico моделирование с использованием SQUAD
    Примечание: SQUAD представляет тысэлектронной топологии сети в виде дискретной логической булевой системы (AND, OR, NOT) и выполняет постоянный анализ состояния. Установившаяся анализ отражает систему равновесия и ответственность на сигнальные раздражители (например., Применение препарата или мутации).
    1. Open ОТРЯД 17 программного обеспечения, нажмите кнопку "Load Network" → загрузки 'models.xml JoVE_tumor' файл. Нажмите кнопку "Выполнить анализ":
      Примечание: Далее ОТРЯД применяется экспоненциальная функция для интерполяции логическое подключение к сети, что позволяет динамическое моделирование поведения сети с течением времени (цветные кривые сигмовидной активности).
    2. Нажмите кнопку "Дополнительно" → "Возбудитель", чтобы написать протокол моделирования. Имитировать сопротивление анти - EGFR: Нажмите кнопку "Изменить протокол"
      1. Нажмите кнопку "возмущением" → использовать стандартные "InitialState = SS-4" (стационарное состояние 4) → Нажмите кнопку "Добавить", чтобы добавить "новый постоянный импульс '→ SeLect параметр "состояние" → Выбор целевого "FLIP" → Выбор времени "0" → Выберите значение "0,4" → Нажмите кнопку "OK".
      2. Повторите эту операцию: Нажмите кнопку "Добавить" → Выберите параметр "состояние" → Выбор цели "C-MET" → Выбор времени "0" → Выберите значение "0,4" → Нажмите кнопку "OK"; Нажмите кнопку "Добавить" → Выберите параметр "состояние" → "Выбор цели" гефитинибом → Выбор времени "0" → Выберите значение "1" → Нажмите кнопку "OK".
      3. Установить значение состояния для активного узла (EGF-EGFR): Нажмите кнопку "activenode" → Нажмите кнопку "Изменить" → Выберите состояние "0,8" → Нажмите кнопку "OK"; для всех остальных узлов: Нажмите кнопку "Изменить" → Выберите состояние "0" → Нажмите кнопку "OK". Нажмите кнопку "OK" для сохранения протокола.
      4. Отображение конкретных кривых: Перейти к панели "Настройки" → Выберите "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* МЕК", "каспазы", "(с-МЕТ)", "PI3K", "гефитиниб", "апоптоз", "распространение", "МЕК-инг" и "PI3K-инг" для графического представления. Нажмите кнопку "Initialize" → "Выполнить", чтобы начать полное моделирование реакции системы. Нажмите кнопку "Reset", чтобы начать новую моделирования.
    3. Имитировать комбинированный PI3K и MEK лечение ингибиторами: Нажмите кнопку "Изменить протокол"
      1. Используйте тот же параметр узла, как описано в разделе 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Нажмите кнопку "возмущением" → Нажмите кнопку "Добавить", чтобы добавить "новый постоянный импульс '→ Выберите параметр" состояние "→ Выберите целевой" PI3K-Inh "→ Выбор времени" 0 "→ Выберите значение" 1 "→ Нажмите кнопку" OK "; Нажмите кнопку "Добавить"добавить 'новый постоянный импульс' → Выберите параметр "состояние" → Выбор цели "МЕК-инг" → Выбор времени "0" → Выберите значение "1" → Нажмите кнопку "OK".
      2. Нажмите кнопку "OK" для сохранения протокола. Перейти к панели «Параметры»: Используйте те же узлы для графического представления, как описано в разделе 6.2.2.4. Нажмите кнопку "Initialize" → "Выполнить", чтобы начать полное моделирование реакции системы. Нажмите кнопку "Сброс", чтобы закончить моделирование.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На основе эшафот SISmuc (фиг.2А-С), мы установили , стандартизованный протокол работы для формирования, стимуляции и лечения тест - системы опухоли 3D (рис 2D). Эта модель позволяет определить индекс пролиферации и количественной оценки апоптоза с использованием M30-ELISA , как показано на фиг.1 и 3, соответственно. На рисунке 3 показана представитель H & E окрашивание A549 и HCC827 моделей и один представитель измерения апоптозу с гефитинибом. Здесь представлена ​​модель разработана с использованием примера EGFR -mutated НМРЛ , который успешно лечится с помощью целевых ингибиторов в клинике. Соответственно, только EGFR -mutated HCC827 клетки , а не на клетки А549 реагируют на EGFR ингибирование по ИТК гефитиниб в нашей модели оцениваемое по увеличению апоптоза. Рисунок 4 рисунке 5С и D. Кроме того, в динамических условиях культивирования гефитинибом оказывает сильное влияние на EGFR -mutated HCC827 (рис 5D).

На рисунке 6 показана топология сети (рис 6а) и подробно описаны в силикомарганца моделировании анти - EGFR терапии сопротивления в HCC827 клетках (рис 6В, С). Сеть передачи сигналов была сгенерирована с использованием известных данных со специальной литературой , такие как HPRD, KEGG и QIAGEN (Genes & Pathways), что приводит к топологии 42 узлов и 55 ребер, визуализировали с помощью программного обеспечения CellDesigner 26. Моделирование известного драйвера мутации EGFR (в красном) и C-MET совместно активации (в зеленом, значение около 0,7) показывает повышенную пролСкорость iferation (кривая лосося) и уменьшение скорости апоптоза (фиолетово кривая) с течением времени отражает гефитиниб (в желтом) сопротивления в HCC827 клетках происходит наряду с активацией МЕК и PI3K (рис 6В, темно - зеленый и голубой). Моделирование комбинированных PI3K и ингибитора MEK (темного и светло - серые кривые) приводит к реверсии эффекта анти - EGFR сопротивление, уменьшает пролиферацию и индуцирует апоптоз (6С).

Рисунок 1
Рисунок 1. Пролиферация ставка снижается в 3D по сравнению с 2D культуре клеток. Ki67-положительные HCC827 клетки (красный в А и В) были окрашены в культуре клеток 2D (A) и культуры клеток 3D на SISmuc (B). HCC827 клетки и A549 клетки подсчитывали и индекс пролиферации (процент Ki67 положительных клеток) определяли (С </ Сильный>, один представитель рассчитывает из пяти). Шкала баров в А и В:. 100 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. SISmuc Леска Морфология и графика лечения с ИТК Gefitinib Клетки высевают на SISmuc , который состоит из тонкой кишки подслизистой (SIS) + слизистую оболочку (А:., В светлом поле : DAPI окрашенных клеток на верхней части SISmuc, C: наложение а и в) и фиксируется в клеточных коронок в день 0. схема лечения показана на D: Средние изменения (MC) выполняются каждые 2 до 3 дней. На 11-й день начинается лечение. Супернатанты собирают и используют для M30-ELISA для того , чтобы количественно оценить апоптоз в течение долгого времени (Синие стрелки и коробки). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Гефитиниб Лечение Изменения роста клеток на SISmuc и индуцирует апоптоз в HCC827, но не в A549 3D Модели Опухолевые. Без какого - либо лечения, обе клеточные линии образуют монослой на SISmuc и В) , а также урегулировать прежние крипт структуры. В то время как модель роста клеток А549 не изменяется после обработки гефитиниб (С), количество HCC827 клеток снижается сопровождается изменением в удлиненной формы клеток (D). Апоптоз индуцируется гефитинибом в HCC827 моделях , как видно по результатам измерений M30-ELISA из супернатанта культуральной жидкости (E D:. 100 мкм от А до D Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. TGF-бета-1 Индуцирует EMT в клетках HCC827 на SISmuc. HCC827 клетки , культивируемые в 3D показывают общее выражение пан-цитокератином (ФКК) (зеленый в A, A1) , но только единичные клетки экспрессируют виментин (красный в A, а2). После того, как TGF-бета-1 стимуляции, клетки меняют свою морфологию в удлиненную форму и выражение виментину сильно увеличивается (красный в B, б2), тогда как экспрессия PCK сохраняется (зеленый в B, B1). Шкала бар в B: 100 мкм для A B. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Динамическая Культура клеток Расширяет тканей поколения. При культивируют в 3D условиях в биореакторе (В), монослой из статической модели (А, Н & Е окрашивание) изменяется от монослоя (А) к многослойным ткани (С, Н & Е окрашивания ). HCC827 клетки демонстрируют сильную реакцию на наркотики при лечении гефитиниб (окрашивание D, H & E). Шкала бар в D:. 100 мкм для A, C, и D Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры,

Рисунок 6
Инжир. 6. В Silico поколения Опухоль модели и моделирование Анти- EGFR терапия сопротивления. Сетевая топология клетки опухоли с основными узлами сигнализации в красном (EGFR пути) и зеленый (C-MET) и их вниз по течению узлов. Характерная опухоль считывания параметров пролиферации (в лососе) и апоптоз (в фиолетовом) представлены в виде шестиугольника. Стрелки указывают на активацию, торможение притупляются стрелки. Терапевтические мишени представлены темными и светлыми серыми прямоугольниками, ингибирование гефитинибом показан желтым цветом (A). Динамическое моделирование с помощью электронных функций (цветные кривые) интерполиро- логическое подключение к сети (AND, OR, NOT). EGFR и C-MET коэкспрессией вызывает сопротивление Гефитиниб , как свидетельствует увеличение пролиферации (кривая семга) и объявленияecrease апоптоза (фиолетово кривая) после того, как о произвольной временной точке 8 (В). Потенциальные терапия тали как PI3K и МЕК ингибиторами (под желтой кривой, такой же активации, см протокол). (C) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы установили комбинированный в пробирке / в силикомарганца тестовой системе опухоли для биомаркеров наведением предсказаний лечения. Модель в пробирке оценивает различные важные аспекты сложных действий , таких как изменение пролиферации опухолевых клеток и апоптоз на конкретном мутационного фона , который может быть также смоделированных в силикомарганца 17. Здесь мы представляем стандартизированный протокол для 3D поколения модели опухоли и соединения тестирования включая количественную оценку пролиферации и апоптоза и создания Predictive в силикомарганца модели. Модель 3D опухолей основана на линии опухолевых клеток, несущих специфические мутации. Клетки выращивают на матрице decellularized ткани в клеточных коронок. Матрица decellularization, крепление между двумя металлическими кольцами (клеточных коронок), монтаж системы биореактора, а также засев эшафоте были визуализированы в Jove , прежде чем 25.

в пробирке 3D Опухоль Модель
Перевод здесь достигнутых результатов в клинике требует тщательного подбора подходящих опухолевых клеток, несущих мутации, представляющие интерес для классификации пациентов согласно биомаркеров для выбранных целевых лекарственных средств. Для стратифицированной медицины, идентификация мутаций druggable водителя путем секвенирования следующего поколения является серьезной проблемой , особенно в НМРЛ , и мы надеемся выявить новые генетические маркеры в будущем 29. Для тестирования в пробирке, соединение интерес должна быть ориентирована на сайт , который очень активен в выбранной клеточной линии , или в первичных клетках. Здесь клеточные линии HCC827 и А549 были выбраны из - за разницы в их статуса мутации EGFR , и сообщили , гиперчувствительность (HCC827 клетки) и промежуточную чувствительность (А549) по направлению к ИТК гефитиниб в 2D культуре 30-32. На первом этапе 3-го поколения модели опухоли, количество и культура клеток периода выбранной опухоли клетки должны быть AdjuSTED если используются клетки, отличающиеся от здесь упоминается. Для того, чтобы найти оптимальную концентрацию соединения, то целесообразно, чтобы определить величину IC50 с помощью коммерчески доступного анализа жизнеспособности в 2D. На основании этого теста, соединение следует использовать в концентрации IC 50 и следующей более высокой концентрации в 3D-модели. Мы выбрали три дня лечения, с одной стороны, с тем, чтобы получить результаты в течение двух-трех недель, и для легкого по сравнению с 2D-тест опухолевых систем, с другой стороны. Тем не менее, периоды лечения может быть продлен для исследования долговременного эффекта. Тем не менее, следует учитывать, что длительное лечение или высокие дозы тестируемого соединения может привести к полной потере клеток, тем самым предотвращая оценку пролиферации или других иммуногистохимических маркеров.

Для надежного анализа сети сигнализации, опухолевые ответы при обработке определенного соединения должны быть проанализированы различия между пролиферацией и APOптоз. Эти чтения ауты по-разному соединены в сети сигнализации. Таким образом, отличительной анализ обоих параметров позволяет лучше понять действия препарата и последующего целевого прогнозирования. Как упоминалось ранее, пролиферацию опухолевых клеток уменьшается в нашей 3D-модели по сравнению с 2D условиях культивирования, и, таким образом, следует уменьшить ложно-положительных результатов испытанных цитостатических соединений. Для определения индекса пролиферации, общее число ядер и число ядер, положительных в отношении Ki67 окрашивания должны быть определены количественно с помощью программного обеспечения Фиджи, например. Это может быть упрощено путем использования макросов в 2D культурах опухолевых клеток, которые, однако, не представляется возможным, если клетки образуют плотные агрегаты, так как это приводит к более низким или более высоким числом ядер, соответственно. Во всех случаях, макро-параметры должны быть скорректированы тщательно для каждой линии и окрашивания клеток. Апоптоз может быть количественно определена неинвазивно из супернатантов измерения каспазы-расщепляется цитокератин 18, ВГIch ограничена клетками с эпителиальными характеристиками, с использованием M30-ELISA. Это имеет несколько преимуществ: I) Это позволяет контролировать эффективность проводимого лечения с течением времени и определить начальную точку эффективного лечения. II) Образцы не разрушаются и могут быть использованы для других методов считыванием. III), апоптоз клеток эпителиальной можно отличить от мезенхимального апоптоза, который является оптимальным в условиях совместного культивирования. Этот метод, однако, может быть неподходящим для опухолевых клеток, подвергшихся EMT, тем самым теряют эпителиальную фенотип. Таким образом, выражение цитокератином 18 каждой линии опухолевых клеток, используемой должна быть проверена с помощью иммуногистохимического окрашивания перед применением этой методики. Тестирование соединений также может быть выполнена в более клеточноподобного фенотипа опухолевых стволовых клеток. Обычно в наркологической различные инвазивные стадии пренебрегают, хотя большинство из таргетных препаратов, таких, как ИТК, применяются в более поздних стадиях опухолей. Наша модель позволяет исследовать инвазивные или нетп-инвазивная опухолевые клетки, в связи с сохраненной базальной мембраной 17 , который клетки должны пересечь в процессе вторжения. Важнейшим шагом на пути к клеточной подвижности и инвазии является ЕМТ , которые могут быть вызваны в различных моделях рака легких путем стимуляции с TGF-бета-1 17,33. Это, однако, уменьшает пролиферацию и тем самым число клеток на эшафоте. Этот отрицательный побочный эффект может быть обойдена путем применения динамических условиях культивирования, что сильно увеличивает плотность опухолевых клеток в 3D-модели. Даже при том , что биореактор регулирует культуру в физиологических условиях, то необходимо учитывать , что свойства клеток и передача сигналов может быть под влиянием воздействия напряжения сдвига 25.

Использование В силикомарганца моделирования для ускорения клеточной линии конкретных Тестирование на наркотики
Хотя только полуколичественный, последовательность событий правильно смоделирована нашими в силикомарганца модели по уходуполностью принимая во внимание известные мутации для каждой конкретной клеточной линии. Это включает в себя линии клеток специфические модификации различных уровней активации рецептора, степень, в которой участвуют киназ активируются и когда и как долго выход сети, такие как апоптоз или пролиферацию следовало ожидать. Например, можно считать клинически известные C-MET уточнениями, которые полагают, происходит примерно в 20% приобретенного анти - EGFR сопротивления терапии 30. Впоследствии модель в силикомарганца вычисляет соответствующее поведение сети в течение долгого времени, например., Развитие сопротивления гефитиниб в лице повышенной пролиферации и снижение апоптоза. В нашей модели мы определили МЕК и PI3K в качестве наиболее перспективных целевых кандидатов. Следовательно, новый терапевтический потенциал комбинации могут быть быстро предварительно оценены в силикомарганца, которая служит в качестве основы для дальнейшего тестирования в лабораторных условиях . Кроме того, выходные данные экспериментов ин витро можетиспользоваться для уточнения в системе силикомарганца сетевыми корректировками , которые соответствуют экспериментальные результаты лучше всего. Полуколичественное в стратегии силикомарганца имеют некоторые ограничения относительно размера сети (около 100 белок-белковых взаимодействий можно считать). Кроме того, она имеет решающее значение для интеграции всех ключевых белковых узлов в топологии сети, чтобы получением реалистичных результатов. Таким образом , в силикомарганца модель дает лишь приближение существующей сети в клетке живой опухоли. Тем не менее, это целенаправленный вид позволяет моделировать конкретные изменения , представляющие интерес . , Например, влияние комбинаций лекарственных средств на различных мутационных фонов в клеточной линии. Это помогает нам систематически понять сложность таких сигнальных сетей рака, а также получения новых терапевтических стратегий.

В заключение, мы убеждены в том, что мы разработали полезную ткань сконструированную в пробирке инструмент , который может быть легко интегрирован в precliское тестирование на эффективность отдельных лекарственных соединений и их комбинаций. Для снижения затрат и времени тестирования, эта модель опухоли , кроме того , дополнена в инструмент прогнозирования силикомарганца позволяет расширить собранные данные камерного типа специфического прогнозирования эффектов препарата и комбинации лекарственных средств , включая клиники , ориентированных на целевые терапии или новых игроков , чтобы рассмотреть (например., микроРНК).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было организовано Центром междисциплинарных клинических исследований (грант IZKF, BD247) больницы университета Вюрцбурга и программы Bayern Fit (предоставленных Хайке Уоллеса).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics