Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

différenciation terminale du muscle squelettique commence par l'engagement des cellules précurseurs mésodermiques pluripotentes à myoblastes. Ces cellules ont encore la capacité de proliférer ou ils peuvent se différencier et fusionnent en myotubes multinucléés, qui maturate encore pour former des myofibres. différenciation terminale du muscle squelettique est orchestré par l'action coordonnée des différents facteurs de transcription, en particulier les membres des facteurs ou des CTMR réglementaires musculaires (MyoD, Myogenin, Myf5 et MRF4), aussi appelé le bHLH myogéniques facteurs de transcription famille. Ces facteurs coopèrent avec des complexes de remodelage de la chromatine au sein complexe réseau de régulation transcriptionnelle pour atteindre myogenèse squelettique. En cela, MyoD est considéré comme le maître myogénique facteur de transcription dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire. Cette notion est renforcée par la possibilité de MyoD pour convertir les cellules non musculaires dans les cellules musculaires squelettiques. Nous décrivons ici une approche utilisée pour identifier MyoDpartenaires protéiques d'une manière exhaustive dans le but d'élucider les différents facteurs impliqués dans la différenciation terminale des muscles squelettiques. L'objectif à long terme est de comprendre les mécanismes épigénétiques impliqués dans la régulation des gènes du muscle squelettique, à savoir., Les cibles MyoD. Les partenaires MyoD sont identifiés à l'aide de purification d'affinité en tandem (TAP-Tag) à partir d'un système hétérologue couplée à la spectrométrie de masse (MS), la caractérisation, suivie de la validation du rôle des partenaires appropriés au cours de la différenciation terminale du muscle squelettique. des formes aberrantes de facteurs myogènes, ou leur régulation aberrante, sont associés à un certain nombre de troubles musculaires: myasthénie congénitale, la dystrophie myotonique, le rhabdomyosarcome et les défauts dans la régénération musculaire. En tant que tel, les facteurs myogéniques constituent un bassin de cibles thérapeutiques potentielles dans les troubles musculaires, à la fois en ce qui concerne les mécanismes qui causent la maladie elle-même et des mécanismes de régénération qui peut améliorer le traitement de la maladie. Ainsi, la understan détailléeding des interactions intermoléculaires et les programmes génétiques contrôlés par les facteurs myogéniques est essentiel pour la conception rationnelle de thérapies efficaces.

Introduction

organismes multicellulaires eucaryotes sont composés de différents organes et tissus. Chaque tissu fonctionnel présente un motif d'expression de gène spécifique qui est déterminé à chaque étape de la différenciation. la différenciation cellulaire implique l'activation de gènes spécifiques, l'entretien de leur expression et, en général, réduisant au silence d'un ensemble de gènes tels ceux impliqués dans la prolifération cellulaire. la différenciation des muscles squelettiques, ou la myogenèse est donc un procédé à plusieurs étapes, qui commence par la détermination des cellules souches mésodermiques en myoblastes, puis conduit à la différenciation terminale des myoblastes en premier mononuclées, puis multi nucléées, les myotubes . Ainsi, les myoblastes sont "déterminés" cellules, qui sont encore capables de proliférer, mais ils se sont engagés à la lignée du muscle squelettique, et peut donc se différencier uniquement dans les cellules musculaires squelettiques, soit au cours du développement embryonnaire ou chez les adultes la régénération musculaire. Le processus de terminal de muscle squelettique diffèrentciation est orchestrée par un programme génétique spécifique qui commence par la sortie définitive du cycle des cellules précurseurs de cellules de myoblastes qui conduit à une extinction définitive de la prolifération des gènes associés, tels que E2F gènes cibles 1. En effet, au cours du processus de différenciation terminale, myoblastes prolifération arrestation est une étape cruciale qui précède l'expression de gènes spécifiques du muscle squelettique et la fusion des myoblastes en myotubes 2. Un tel programme permet à des cellules souches musculaires adultes, également appelées cellules satellites, pour différencier au cours du processus de régénération suite à une lésion du muscle squelettique.

Myogenesis Mammalian dépend de manière critique sur une famille de l' hélice-boucle-hélice basique myogénique (bHLH) facteurs de transcription MyoD, Myf5, MRF4 et Myogenin, souvent appelé la famille de squelette facteurs de détermination musculaire ou MRF (Facteurs réglementaires musculaires) 3. Chacun d'eux joue un rôle essentiel dans la spécification et difrenciation des cellules musculaires squelettiques et a un motif d'expression spécifique 4 5-7. L'activation de MyoD et Myf5 constitue l'étape déterminante qui engage les cellules de la lignée myogénique, et l'expression subséquente de Myogenin déclenche myogenèse avec l'activation de gènes spécifiques du muscle squelettique, comme MCK (Muscle Creatine Kinase). Les facteurs de transcription bHLH myogéniques coopèrent avec les membres de la famille MEF2 dans l'activation des gènes musculaires de loci silencieux 8 précédemment. Elles stimulent également la transcription du gène du squelette musculaire hétérodimères avec des protéines bHLH omniprésentes, E12 et E47, appelées protéines qui se lient à E, que l' on appelle E-boîtes dans les différentes régions des gènes de régulation 8. Twist, Id (inhibiteur de la différenciation) et d' autres facteurs à réguler négativement ce processus, en compétition avec MyoD pour E protéines de liaison 8.

MyoD est considéré comme l'acteur majeur dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire 9 10-13. En effet, l' expression forcée de MyoD induit la trans-différenciation des différents types cellulaires , même ceux provenant d' une autre origine embryologique 12. Par exemple, MyoD peut convertir les hépatocytes, les fibroblastes, les mélanocytes, les neuroblastes et les adipocytes en cellules musculaires analogue. L'action trans-différenciation de MyoD implique une activation anormale du programme génétique myogénique (notamment ses gènes cibles) dans un environnement non-musculaire, concomitante à la réduction au silence du programme génétique d'origine (notamment, les gènes de prolifération).

Dans la prolifération des myoblastes, MyoD est exprimé , mais est incapable d'activer ses gènes cibles , même quand il se lie à leurs promoteurs 14-16. Par conséquent, l'exigence de MyoD soient exprimées en continu dans des myoblastes non différenciés reste assez elusive. MyoD pouvait réprimer ses gènes cibles en raison de recrutement d'enzymes de chromatine modifiant répressives dans la prolifération des myoblastes avant le chargement d'activer remodelage de la chromatine enzymes 14,17. Par exemple, dans la prolifération des myoblastes, MyoD est associée avec le co-répresseur de la transcription KAP-1, histone désacétylases (HDAC) et les méthyltransférases de la lysine répressive (Kmts), dont l'histone H3 lysine 9 ou H3K9 et H3K27 Kmts et suppriment activement l'expression des gènes cibles en établissant une structure chromatine localement répressive 14,17. Surtout, un rapport récent a indiqué que MyoD est lui - même directement méthylé par le H3K9 KMT G9a entraînant l'inhibition de son activité de transactivation 16.

Les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette trans-différenciation des cellules non musculaires par MyoD sont largement inconnues. Notamment, certaines lignées cellulaires sont résistantes à l'induit MyoD-trans-différenciation. Ainsi, dans les cellules HeLa, MyoD est inactif oumême pourrait fonctionner comme répresseur plutôt que activateur de la transcription en raison du manque d'expression de la sous - unité BAF60C du remodelage de la chromatine complexe SWI / SNF 18. Ce modèle peut donc être de choix pour mieux caractériser les mécanismes de répression génique induite par MyoD. Il est également approprié pour tester la capacité de MyoD pour induire l' environnement de la chromatine répressive à sa loci cible avec ses partenaires associés et donc découvrir les mécanismes répressifs MyoD-dépendants dans la prolifération des myoblastes pour affiner la différenciation terminale.

Nous décrivons ici le protocole pour l'identification des partenaires MyoD en utilisant Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) couplée à la spectrométrie de masse (MS) la caractérisation. L'utilisation de cellules HeLa exprimant de manière stable S3 Flag-HA MyoD permis d'obtenir suffisamment de matériel pour purifier les complexes de MyoD à partir d'extraits nucléaires fractionnées. L'identification des partenaires de MyoD dans le système hétérologue a été suivie par validatidans un système pertinent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation des Fractions HeLa-S3 nucléaire Salt-extractibles et chromatine-liés

  1. La collecte des cellules
    1. Cultiver les cellules HeLa-S3 Flag-HA-MyoD et HeLa-S3 Flag-HA (lignée cellulaire témoin) dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (croissance milieu) à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humide.
      Remarque: les cellules HeLa-S3 exprimant de manière stable les cellules transduites avec le vecteur vide (HeLa-S3 Flag-HA) Drapeau-HA-MyoD et HeLa-S3 pourraient être soit mis en place en utilisant le protocole décrit dans: 19,20, ou fournis par les auteurs.
    2. Amplifier les cellules jusqu'à 10 complètement confluentes de 150 mm plats de chaque lignée cellulaire HeLa-S3 (Flag-HA-MyoD et HeLa-S3 Flag-HA cellules).
    3. Recueillir le surnageant (contiennent sous-population non-adhérent) dans 5 L spinner.
    4. Laver la sous-population adhérente avec 10 ml de PBS par 150 mm plat, trypsiniser cellules pendant 1 min à temtempérature (solution de trypsine-EDTA à 0,05%, 2 ml pour une boîte de 15 cm).
    5. Ajouter 4 ml du milieu par 150 mm plat et de recueillir les cellules dans 50 ml tubes.
    6. Combinez le surnageant de l'étape 1.1.3 (dans le 5 L spinner) et les cellules de l'étape 1.1.5, ajouter 500 ml de milieu de croissance préchauffé frais pour chaque lignée cellulaire.
    7. Transférer la suspension cellulaire dans 5 L centrifugeuse et faire croître les cellules pendant au moins 60 heures à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humide.
    8. Ajouter 500 ml de milieu de croissance frais et faire croître les cellules pendant 24 heures.
    9. Ajouter 1 L de milieu de croissance frais et faire croître les cellules pendant 24 heures.
    10. Sortez 1 ml de la suspension cellulaire pour compter les cellules et vérifier la viabilité des cellules. Couleur 30 pl de suspension cellulaire avec 30 ul de 0,4% de bleu trypan et compter les cellules vivantes (non bleus) au microscope en utilisant hémocytomètre.
    11. Gardez la densité cellulaire à 2 - 6 x 10 5 cellules / ml en ajoutant du milieu de croissance frais tous les jours; ne dépasse pas 1 x 10 6 cellules / ml. Le maximumvolume pour un 5 L spinner est de 2,5 L.
      Remarque: Pour les étapes suivantes, procéder par lots de 2 à 2,5 L de la culture à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml. Répétez les étapes 1.1.12 - 1.1.14 pour recueillir environ 20 L (≈ 20 g de granulés de bois sec) de chaque lignée cellulaire avant de passer à l'étape suivante.
    12. cellules à pellets par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
    13. Resuspendre les cellules dans 100 ml de PBS glacé par pipetage et centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et laver le culot.
    14. Répétez le lavage en remettant en suspension les cellules avec 25 ml de PBS glacé, transfert de la suspension dans 50 ml tube et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C.
      Nota: Les culots cellulaires peuvent être soit utilisées immédiatement ou congelées dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C pendant plusieurs jours.
  2. L'isolement des noyaux
    Remarque: Effectuer les étapes 1.2.1 - 1.4.3 dans la chambre froide.
    1. Pré-froid buffers et homogénéisateurs.
    2. En cas d'utilisation de matériel congelé, décongeler rapidement les culots cellulaires dans un bain d'eau à 37 ° C.
    3. Remettre en suspension 20 g (≈ 20 ml) de cellules dans 20 ml (un volume égal à la taille du culot cellulaire) du tampon hypotonique A (Tableau 3) à l'aide de 10 ml du tampon au début, puis en ajoutant 5 ml, puis en ajoutant encore 5 ml. Laver les pipettes bien avec un tampon frais pour obtenir le maximum de cellules.
    4. Transfert de 40 ml de suspension cellulaire dans le homogénéisateur pré-réfrigéré avec un pilon hermétique.
    5. Homogénéiser les cellules avec 20 coups dans un homogénéiseur (20 et des mouvements) et à transférer la suspension cellulaire dans 50 ml tube.
    6. Laver le homogénéisateur avec 7 ml de tampon de saccharose (1/3 du volume initial de cellules, le tableau 3) pour récupérer le maximum de cellules. Transférer cette suspension rapidement dans le tube de 50 ml à l'étape 1.2.5 pour préserver les noyaux et limiter les fuites.
    7. Colorer une aliquote de 30 pi par 30 pi de 0,4% trYPAN bleu, analyser au microscope pour contrôler l'efficacité de lyse (si la lyse est réussie, tous les noyaux doivent être bleu). Si nécessaire, répétez l'étape d'homogénéisation.
    8. Centrifuger pendant 7 min à 10 000 x g et 4 ° C pour sédimenter les noyaux. Enregistrez le surnageant comme la fraction cytoplasmique.
  3. Préparation de Salt-extractible (SE) Fraction nucléaire
    1. Remettre en suspension le culot de noyaux dans 8 ml de tampon de saccharose (un volume égal à la taille de la pastille de noyaux). Ajouter goutte à goutte tout en mélangeant soigneusement dans un vortex 8 ml de tampon à forte concentration saline (1 volume de culot de noyaux, le tableau 3) pour obtenir une concentration finale de 300 mM de NaCl. Incuber pendant 30 min sur la glace et mélanger toutes les 5 min.
    2. Diminuer la concentration de NaCl à 150 mM par addition de 8 ml (1/3 du volume total) de tampon de saccharose. Centrifugeuse pendant 10 min à 13 000 xg et 4 ° C. Recueillir le surnageant (fraction de sel extractibles nucléaire, SE).
      Remarque: Soit passer à l'étape 1.3.3 ou quitter la SEfraction sur la glace lors de la préparation de la fraction de la chromatine liée et ultra-centrifuge les deux fractions simultanément.
    3. Ultra-centrifuge SE pendant 30 minutes à 85.000 xg à 4 ° C. Prenez surnageant (≈ 26 ml).
    4. Congeler 100 aliquote ul dans de l'azote liquide. Passez à l'étape 2 "Purification des protéines complexes", en utilisant le reste de l'extrait.
      Remarque: L'aliquote est utilisée comme commande d'entrée lors de l'étape 5.1.1.
  4. Préparation de la fraction de la chromatine liée
    1. Remettre en suspension le culot (étape 1.3.5). Méticuleusement dans 7 ml (un volume égal à la taille de la pastille) d'un tampon de saccharose.
    2. Ajouter CaCl 2 à une concentration finale de 1 mM (28 pi de 0,5 M de CaCl2 pour 14 ml de suspension) pour activer la MNase (étape 1.4.4) et mélanger.
    3. suspension Préchauffer pendant 1 min à 37 ° C.
    4. Ajouter 70 ul nucléase micrococcique (MNase) pour obtenir une concentration finale de 0,0025 U / pl (1/200 dilution de 0,5U / ul stock) et mélanger.
    5. Incuber exactement 12 min à 37 ° C. Mélanger toutes les 4 min.
    6. Placer immédiatement la réaction sur la glace.
    7. Pour arrêter l'activité MNase, ajouter 112 ul d'EDTA 0,5 M pH 8,0 (1/125 dilution) à une concentration finale de 4 mM. Incuber pendant 5 min sur la glace.
    8. Soniquez 5 fois pendant 1 min à haute amplitude, entre deux sonications permettent une pause de 1 min (10 min au total).
    9. Ultracentrifugeuse pendant 30 minutes à 85.000 xg et 4 ° C.
    10. Recueillir le surnageant (nucléosome fraction enrichie, NE, ≈ 12 ml).
    11. Congeler 50 aliquote ul dans de l'azote liquide. Passez à l'étape 2 "Purification des protéines complexes", en utilisant le reste de l'extrait.
      Remarque: L'aliquote est utilisée comme commande d'entrée lors de l'étape 5.1.1.

2. Protein Purification Complexes

Remarque: Procéder dans des extraits parallèles de chaque lignée cellulaire (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD et le contrôle, Hela-S3 Flag-HA).

  1. Une purification à base FLAG
    1. Pré-lavage de résine Flag. Utilisez 600 pi de résine de drapeau (de la publicité 50% actions) pour chaque point expérimental (SE et NE fractions pour chaque lignée cellulaire).
    2. Résine de transfert en tube de 15 ml, remettre en suspension dans 13 ml de tegn froid (tableau 3), centrifuger pendant 2 min à 1000 xg et retirer le surnageant. Répétez 5 fois. Après que la résine resuspendre Flag dernier lavage dans un volume égal de tegn (300 pi pour chaque point expérimental).
    3. Pour chaque point expérimental, mélanger 600 pi de résine Drapeau lavé et les extraits de protéines correspondantes (dans un tube de 15 ml pour 12 ml NE et dans un tube de 50 ml pour les 26 ml SE fractions, respectivement). Incuber sur une nuit de roue tournante à 4 ° C.
    4. Centrifugeuse pendant 2 min à 1000 xg à 4 ° C, mettre de côté le surnageant et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que le résultat du test d'efficacité de purification (2.2).
    5. Pour les échantillons SE, resuspendre la résine Flagdans 4 ml de tegn et le transfert à un tube de 15 ml. Répéter cette étape 3 fois, à chaque fois que le transfert dans le même tube de 15 ml pour éviter la perte des billes. Centrifugeuse 2 min à 1000 xg et 4 ° C et retirer le surnageant.
    6. résine Flag Wash 7 fois dans un tube de 15 ml en utilisant 13 ml de tegn et centrifuger 2 min à 1000 xg et 4 ° C.
    7. Après le dernier lavage, remettre en suspension dans 1 ml tegn et transfert dans un tube de 1,5 ml à faible liaison. Centrifugeuse 2 min à 1000 xg et 4 ° C et retirer le surnageant.
    8. Remettre en suspension dans 200 pi de solution de peptide FLAG à 4 mg / ml à un pH de 7,8 pour chaque point expérimental. Mélanger les billes et le peptide. Ajouter 200 pi de tampon tegn et incuber à 4 ° C pendant au moins 4 heures ou toute la nuit pour éluer les protéines liées.
    9. Centrifuger pendant 2 min à 1000 xg à 4 ° C et transférer la résine et le surnageant (Flag éluat) à une colonne de centrifugation vide placé dans un tube de 2 ml.
    10. Centrifugeuse la colonne, recueillir les restes de surnageant dans le tube de 2 ml. Recueillir la résine de Flag en ajoutant un tampon tegn à la colonne et passer à la deuxième élution de drapeau avec 200 pi de solution de peptide Flag (4 mg / ml) pendant une nuit à 4 ° C pour chaque point expérimental.
    11. Répétez les étapes 2.1.9 - 2.1.10 pour recueillir deuxième élution. Combiner les première et seconde éluats.
  2. Test d'efficacité de la purification
    Remarque: Lors de l'étape 2.1.11 - 2.1.12, effectuer SDS-PAGE et coloration à l'argent (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Prenez 15 pi des éluats, ajouter 5 pl de tampon 4x de chargement et 2 pi de 10x agent réducteur, faire bouillir pendant 5 min à 96 ° C et exécuter un SDS-polyacrylamide 4 - gel à 12% selon les instructions du fabricant.
    2. Colorer le gel en utilisant le kit de coloration à l'argent (suivre les instructions du fabricant). S'il y a des différences claires dans les modèles de protéines entre Flag-HA-MyoD et Flag-HA éluats simulacres, en particulier la bande de Flag-HA MyoD (environ 50 kDa, la figure 1A), procéder à la prochaine step.
  3. Hémagglutinine (HA) de purification à base de
    1. résine Wash HA en transférant en tube de 15 ml, remise en suspension dans 13 ml de tegn et centrifuger 2 min à 1000 xg à 4 ° C. Répéter l'étape de lavage 5 fois. Après le dernier lavage des perles de remettre en suspension dans un volume égal de tampon tegn.
      Remarque: Le volume doit être ajusté en fonction de l'efficacité de la purification à base de drapeau. Commencez avec 300 pi du commerce 50% actions pour chaque point expérimental.
    2. Transfert de résine HA pour chaque point expérimental dans un faible tube de liaison de 1,5 ml. Centrifuger 2 min à 1000 x g à 4 ° C, d' éliminer le maximum du tampon de lavage (tableau 3) et d' ajouter les éluats provenant de la purification à base d' un drapeau à la résine HA.
    3. Incuber les tubes sur la nuit de la roue tournant à 4 ° C.
    4. Centrifugeuse pendant 2 min à 1000 xg à 4 ° C, mettre de côté le surnageant et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que le résultat du test d'efficacité de purification (2.3.12.).
    5. Résuspendre la résine HA dans 0,5 ml de tegn, transfert à un nouveau 1,5 ml tube de liaison faible. Répéter une fois la remise en suspension en ajoutant dans le même tube de 1,5 ml pour éviter de perdre des billes et centrifuger 2 min à 1000 x g et 4 ° C. Retirer le surnageant.
    6. Laver les billes 8 fois en utilisant 1 ml de tegn à chaque fois, centrifuger 2 min à 1000 x g et 4 ° C et en éliminant le surnageant (pour éviter de perdre des billes). Après le dernier lavage, transférer les billes dans 0,5 ml tubes.
    7. Retirez autant surnageant que possible. Ajouter 100 ul de solution de peptide HA libre (4 mg / ml) à pH 7,8 sur des billes pour éluer les protéines liées. Incuber sur la roue en rotation pendant une nuit à 4 ° C.
      Remarque: La quantité de HA-peptide doit être ajustée en fonction de l'abondance des complexes.
    8. Centrifuger pendant 2 min à 1000 xg à 4 ° C et transférer la résine et le surnageant (HA éluat) à une colonne de centrifugation vide placé dans un tube de 2 ml.
    9. Centrifuger la colonne pour recueillir les restes de surnageant dans le tube de 2 ml. Effectuer une deuxième élution avec 100 ul de peptide HA (4 mg / ml) pour chaque point expérimental. Incuber sur la roue en rotation pendant une nuit à 4 ° C. Répétez l'étape 2.3.8 - 2.3.9 pour recueillir deuxième élution.
    10. Combiner les première et seconde éluats.
    11. Test d' efficacité de purification par SDS-PAGE et coloration à l'argent (voir les étapes 2.2.) (Figure 1A).
    12. Concentrer le éluat HA 30 ul en utilisant des unités de filtration centrifuge avec un (limite nominale de poids moléculaire, PMNL) 10 kDa coupure selon les instructions du fabricant.
    13. Diviser les échantillons concentrés en deux parties: 22,5 (3/4) et 7,5 (1/4) ul. Snap geler 1/4 des échantillons dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Utilisez la partie 3/4 pour l'étape 3.
      Remarque: La partie gelée 1/4 doit être utilisé pour la confirmation des résultats de spectrométrie de masse par western blot (voir étape 5.1).

3. Analyse de spectrométrie de masse

Remarque: Les étapes suivantes devraient être discutées avec l'installation de spectrométrie de masse qui effectuera l'analyse.

  1. Supplément 3/4 (22,5 pi) des échantillons avec 7,5 pi de tampon de chargement 4x et 3,3 pi de 10x agent réducteur et faire bouillir pendant 5 min à 96 ° C.
  2. Charger les échantillons sur un SDS-polyacrylamide 4 - gel à 12%. gel Exécutez à 150 V constante pendant 5 minutes pour permettre à tous les protéines d'entrer dans le gel sans séparation.
  3. Laver le gel avec de l'eau; fixer pour 20 - 30 min avec une solution de fixateur (acide acétique à 10%, 50% de methanol, 40% d'eau ultra-propre) puis laver le gel fixe 5 fois dans l'eau ultra-propre.
  4. Couper les bandes contenant les protéines, stocker dans 1 ml d'eau dans un tube de 1,5 ml et l'envoyer à l'installation de la spectrométrie de masse.

Analyse 4. Données

Note: Ceci est une orientation générale pour l'analyse. Les étapes exactes dépendent du mode particulier des données fournies par MS installationutilisé pour effectuer l'analyse (par exemple, 21,22).

  1. Comparez la liste des protéines identifiées dans les éluats "de MyoD" avec la liste obtenue à partir de la préparation de contrôle négatif correspondant. Exclure de l'analyse les protéines présentes dans les deux listes.
  2. Retirer des protéines qui ont ≤2 nombre total de peptides identifiés à partir restants liste.
  3. Accès annotation fonctionnelle et la classification fonctionnelle de la liste obtenue de protéines à l' aide de ressources DAVID Bioinformatique (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) et classer la liste des protéines 23,24.
  4. (Facultatif) Retirer de la liste «auto - stoppeurs», chargés des protéines non-nucléaires avec une forte adventice de liaison à l' ADN chargé négativement 25. Ceux - ci contiennent des protéines du cytosquelette, cytoplasmiques, mitochondriales, membrane et récepteurs (repliement des protéines, cytosquelette et diverses protéines de groupe dans les tableaux 1 et 2). </ Li>
  5. Comparez les listes obtenues des interacteurs de MyoD de SE et NE fractions pour identifier des protéines et des protéines communes spécifiques pour chaque fraction (Figure 2).

5. Confirmation des Interactiens identifiées par Western Blot

  1. Confirmation dans HeLa-S3 Flag-HA-MyoD et HeLa-S3 Flag-HA
    1. échantillons d'éluat Décongeler obtenus à l'étape 2.3.14 (7,5 pi) sur la glace. Ajouter 12 pi de tampon tegn, 10 ul de tampon de chargement 4x et 3 pl de 10x agent réducteur. Faire bouillir les échantillons pendant 5 min à 96 ° C.
    2. Préparer des échantillons d'entrée pour le transfert de Western.
      1. Décongeler aliquotes des étapes 1.3.9 et 1.4.11 et mesurer la concentration de protéines, par exemple en utilisant le kit BCA (suivez les instructions du fabricant).
      2. Utilisez 15 ug de la protéine par voie. Mesurer la quantité appropriée de l'extrait et de régler le volume de l'échantillon jusqu'à 15 pi avec un tampon tegn.
      3. Ajouter un tampon de chargement 4x 5 pi et1,5 ul 10x agent réducteur. Faire bouillir les échantillons pendant 5 min à 96 ° C.
    3. Effectuer une analyse western blot avec des anticorps spécifiques d'intérêt (pour le candidat partenaire identifié lors de l'analyse MS) en utilisant 15 ul d'échantillons d'éluat. Utiliser des extraits d'entrée comme un contrôle des niveaux de protéines endogènes (Figure 3A).
  2. Confirmation dans le système cellulaire pertinent
    1. Préparation de l'extrait nucléaire total de myoblastes de souris C2C12.
      1. Cultiver les myoblastes de souris C2C12 dans du milieu DMEM additionné de 15% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humide. Ne jamais dépasser 80% de confluence cellulaire pour maintenir les cellules en état prolifératif.
      2. Cultiver au moins deux 150 plats mm de C2C12 pour un point (un anticorps) de immunoprécipitation (IP). Aspirer le milieu, laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS.
      3. Grattez les cellules et de recueillir dans 15 ml tube. Centrifuge à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. surnageant Jeter.
      4. Estimer le volume du culot cellulaire (cellule = V). Resuspendre doucement le culot dans 3 volumes V cellule hypotonique tampon B à perturber membrane cytoplasmique (tableau 3).
      5. Ajouter le volume de cellule V 0,44 x de 10% de NP-40 pour atteindre la concentration finale de 1% (v / v). Retourner doucement le tube plusieurs fois pour mélanger.
      6. Ajouter le volume de cellule V 0,89 x SR (tableau 3) pour préserver l'intégrité des noyaux. Retourner doucement le tube plusieurs fois pour homogénéiser la suspension, et centrifuger pendant 5 min à 2000 xg pour sédimenter les noyaux.
      7. Retirer le surnageant (fraction cytosolique). Estimer le volume des noyaux pellet (= V nuc). Resuspendre le culot de noyaux dans un volume V nuc de tampon saccharose.
      8. Ajouter goutte à goutte tout en mélangeant soigneusement dans un tourbillon d' un volume V de tampon nuc haute teneur en sel pour obtenir une concentration finale de 300 mM ,NaCl, et incuber pendant 30 minutes sur la glace. Mélanger toutes les 5 min.
      9. Ajouter un volume V nuc de tampon de saccharose (pour diminuer la concentration de NaCl à 150 mM) et du CaCl2 (concentration finale 1 mM). Mélanger.
      10. suspension Préchauffer pendant 1 min à 37 ° C, ajouter nucléase micrococcique pour obtenir finale de concentration 0,0025 U / pl (1/200 du stock de 0,5 U / ul). Mélanger.
      11. Incuber exactement 12 min à 37 ° C. Mélanger tous les 3 min.
      12. Placer immédiatement la réaction sur la glace et ajouter EDTA (concentration finale 4 mM) pour arrêter l'activité MNase. Incuber pendant 5 min sur la glace.
      13. Soniquez 5 fois pendant 0,5 min chacun à haute amplitude. Entre deux sonications, permettre une pause de 0,5 min (5 min au total).
      14. Ultra-centrifugeuse pendant 30 minutes à 85.000 xg et 4 ° C. Recueillir le surnageant (extrait nucléaire total).
      15. Mesurer la concentration en protéines de l'extrait nucléaire total, par exemple en utilisant le kit BCA (suivez les instructions du fabricant) et procéder immediately à l'étape 5.2.2.
    2. Immunoprécipitation (IP) de MyoD endogène.
      1. Pour pré-clair que les extraits, laver 10 pi de la protéine G des billes d'agarose pour chaque point IP.
        1. Transférer le volume nécessaire de la protéine G des billes d'agarose dans un tube de 1,5 ml, remettre en suspension dans 1,4 ml de tegn froid, centrifuger 2 min à 1800 xg et retirer le surnageant. Répétez 3 fois.
      2. Mélanger les perles pré-lavés protéine G agarose avec le volume approprié d'extrait nucléaire total. Utilisez 500 ug de protéines totales d'extrait nucléaire par point IP.
      3. Incuber sur une roue tournant à 4 ° C pendant 2 heures pour pré-nettoyer les extraits.
      4. Centrifugeuse pendant 5 min à 1800 xg à 4 ° C. Gardez surnageant.
      5. Mélanger 5 ug de MyoD Ab ou 5 ug de IgG de lapin avec 500 pg d'extraits nucléaires totaux pré-autorisé, dans 1,5 ml de faibles tubes de liaison. Ajouter tegn tampon jusqu'à 1 ml. Incuber sur une roue tournant à 4 ° C pendant la nuit.
        Remarque: Effectuer la fuite étapes lors de l'étape 5.2.2.3.
      6. Pré-lavage 7,5 ul de protéine A / G perles de stock solution par point IP.
        1. Transférer le volume nécessaire de billes dans un tube de 1,5 ml, des billes de remettre en suspension dans 1 ml de tegn et centrifuger à 1800 g à 4 ° C pendant 2 min. Retirer le surnageant. Répétez 3 fois.
      7. Protéines Resuspendre A / G perles dans 1,5 ml de solution de blocage (tableau 3) et incuber sur une roue en rotation pendant une nuit à 4 ° C.
      8. des extraits nucléaires totaux Centrifugeuse incubés avec Abs (étape 5.2.2.5) à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Gardez surnageant.
      9. Centrifugeuse bloqué la protéine A / G résine (étape 5.2.2.7) à 1.800 xg pendant 2 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de tampon tegn. Re-centrifugeuse à 1800 g pendant 2 min à 4 ° C pour laver le tampon de blocage.
      10. Resuspendre bloqué la protéine A / G résine dans 1 ml de tampon tegn et aliquote dans de nouveaux tubes de protéine de liaison faible pour obtenir 7,5 pi bloprotéines cked Une résine / G par point IP. Centrifuger à 1800 g à 4 ° C pendant 2 min et éliminer autant que possible le surnageant.
      11. Ajouter les extraits nucléaires totales incubées avec le Abs (ou contrôler IgG) à la résine A / G. Mélanger et incuber pendant 2 heures à la température ambiante (RT) sur une roue en rotation.
      12. Centrifugeuse suspension 1.800 xg à température ambiante pendant 2 min. Rejeter le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage et de transfert de suspension dans de nouveaux tubes de liaison faible. Incuber à température ambiante sur une roue en rotation pendant 5 min.
      13. Centrifugeuse suspension à 1800 xg à température ambiante pendant 2 min, remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage et incuber à température ambiante sur une roue en rotation pendant 5 min. Répétez 4 fois. Pour le dernier transfert de lavage dans un nouveau tube de liaison faible.
      14. Éliminer au maximum le surnageant. Ajouter 7 pi de tampon de lavage, 7 pi de tampon 4x de chargement et 3 pi de 10x agent réducteur pour les perles, mélanger et faire bouillir pendant 5 min à 96 ° C.
      15. Effectuer une analyse de western blot avec des anticorps de intEREST (spécifique pour le candidat de partenaire pour le système immunitaire protéine précipitée). En utilisant 1% (5 ug) d'extraits d'entrée comme un contrôle des niveaux de protéines endogènes (figure 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pour comprendre la régulation de l'activité de MyoD, nous avons entrepris la caractérisation exhaustive des complexes MyoD utilisant la purification biochimique, sur la base du immunopurification d'une double forme étiqueté de MyoD suivie par spectrométrie de masse (MS). L'utilisation de la lignée cellulaire HeLa-S3 exprimant MyoD Flag-HA-marqués et une lignée de cellules de contrôle exprimant permis Flag-HA pour obtenir suffisamment de matériel pour purifier le complexe de MyoD en effectuant double purification par affinité de Flag-HA-MyoD.

On fractionne les extraits cellulaires en fractions cytoplasmique et nucléaire, puis fractionnés en outre la fraction nucléaire du sel extrait (sel extractibles nucléaire, SE) et enrichi en nucléosomes (NE nucléosome, enrichi en fractions). TAP-Tag purification à partir de ces fractions nucléaires séparées (figure 1, tableaux 1 et 2) a permis démêler les partenaires qui ont relativement faible abundance quand localisée à un compartiment subnucléaire spécifique. En outre, une telle stratégie a été exploitée pour découvrir les partenaires de non liée (SE) par rapport à l' ADN lié (NE) MyoD pour obtenir des idées sur la régulation de l' activité de MyoD.

Pour la purification TAP-Tag, le système d'épitope Flag en tandem-HA a été utilisé. Le petit drapeau hydrophile et épitopes HA ont un minimum d'interférence avec la fonction des protéines et sont très accessibles pour l'interaction anticorps-antigène. Anti-Flag et anti-HA à base de résine immunopurification séquentielle a été effectuée, suivie d'une élution des complexes immunopurifiés utilisant des peptides Flag et HA. Les protéines éluées ont ensuite été exécutés sur un SDS-PAGE pour permettre toutes les protéines d'entrer dans le gel. Les morceaux de gel contenant toutes les protéines purifiées ont été coupées; les protéines ont été extraites, trypsine digéré et identifié par spectrométrie de masse (MS).

Comme on le voit sur ​​la figure 2, (Figure 2 et 3) 26-28. Cela met en lumière les partenaires de MyoD ADN lié et co-régulateurs possibles qui peuvent établir un environnement répressif-chromatine. Par exemple, les protéines HP1, qui ont été identifiés en tant que partenaires de MyoD par la méthodologie décrite, sont connus pour lier H3K9 méthylé pour maintenir la répression génique et la structure de l'hétérochromatine. En effet, MyoD HP1 inhibe l' activité transcriptionnelle résultant de l'expression du gène cible altérée MyoD et la différenciation terminale des muscles 26.

Un fractionnement plus poussé deles complexes de MyoD SE et NE le gradient de glycérol (comme décrit dans 29) à découvert les sous-ensembles de MyoD dans les deux compartiments subnuclear (figure 1B). En particulier, SE MyoD est distribué en trois sous-ensembles, tandis que le MyoD chromatine lié appartient principalement à un seul complexe.

Une partie de la TAP-tag / MS a révélé interacteurs ont été confirmées par western blot sur les complexes de MyoD. Ceux - ci incluent le CBF facteur de transcription, EBB, MTG8R et la sous - unité BAF47 SWI / SNF (SNF5) (figure 3A, à gauche) et les protéines HP1 (CBX1 et CBX3) (figure 3A, à droite). Surtout, étant donné que les cellules HeLa sont pas des cellules musculaires et ne reflètent pas MyoD, il est nécessaire de confirmer les interactions entre interacteurs nouvellement identifiées et MyoD dans les myoblastes (figure 3 BD). Notamment, pour une telle validation, les extraits nucléaires totaux (sans séparation sur les SE et NE) sont généralement suffisants, which permet de réduire la quantité de myoblastes utilisés pour la préparation des échantillons. Les tests in vitro d'interaction comme dans 26,27, aident à valider davantage ces conclusions. Enfin, la signification fonctionnelle de ces interactions dans les cellules musculaires devraient être davantage traitées comme dans 26-28.

Pris ensemble, ont présenté des données montrent une vision globale des partenaires MyoD ubiquitaires et ouvrent la voie à d'autres études fonctionnelles dans un modèle musculaire plus pertinent.

Figure 1
Figure 1: MyoD Complexes isolés par Tandem Affinity Purification (liste A) Une __gVirt_NP_NN_NNPS<__ coloration à l'argent des doubles complexes eMyoD purifiés par affinité isolés à partir d'un sel extractibles nucléaire (SE) , ou des nucléosomes enrichie (NE) , des fractions nucléaires des lignées cellulaires HeLa-S3 stablement. exprimant Flag-HA-MyoD (complexe de MyoD) und lignée cellulaire de commande (Mock). MW marqueur de poids moléculaire en kilo Daltons (kDa). La flèche indique Flag-HA-MyoD (eMyoD). Cette recherche a été publié à l' origine dans 37. Droit d'auteur La Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire. Ce chiffre a été modifié depuis 26: les voies avec purifications simulées et eMyoD complexe isolé à partir de fractions nucléaires SE sont maintenant indiquées. (B) des complexes eMyoD purifiés par affinité double comme dans (A) ont été fractionnés sur un gradient de glycerol allant de 20% à 41%. Les fractions ont été collectées manuellement, concentrées et analysées par Western Blot (WB) en utilisant des anticorps anti-Flag. A noter la présence de plusieurs eMyoD contenant des sous-complexes en sel extractible (SE) fraction nucléaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 Figure 2:. Comparaison de la chromatine liée (nucléosome enrichi, NE) versus Soluble nucléaire (sel nucléaire extractible, SE) MyoD Partners Top: diagramme de Venn montrant chevauchement entre eMyoD interacteurs isolées de sel extractible nucléaire (SE) et nucléosome enrichi ( NE) fraction. Les protéines ribosomales, les facteurs d'initiation de traduction, les facteurs de réparation d' ADN et des isoformes de tubuline ont été exclus de l'analyse car ils sont présents dans divers différents ensembles de données obtenues par TAP et considérés comme spécifiques non-Bas. Les interacteurs MyoD trouvés dans les deux SE et les fractions NE (communes) ou spécifiques pour l'une des fractions (uniques) ont été divisés en groupes en fonction de leurs annotations fonctionnelles. Cytosquelette liée et d'autres protéines diverses ne sont pas représentés. Les protéines soulignées sont interacteurs MyoD validées soit dans HeLa et / ou en myoblasts de co-immunoprécipitation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Validation de Selected Ensemble de MyoD Interactors (A) Validation des interacteurs de MyoD, identifié par spectrométrie de masse, dans la lignée cellulaire HeLa-S3 exprimant de manière stable Flag-HA-MyoD (eMyoD) Panneau de gauche:. Analyse par Western blot de la double affinité des complexes isolés à partir MyoD purifié à (NE) des fractions enrichies nucléosomes de la lignée cellulaire HeLa-S3 exprimant de manière stable la ligne eMyoD ou de la cellule de commande (Mock) avec les anticorps indiqués sel extractibles nucléaire (SE) ou. MW, marqueur de poids moléculaire Panneau de droite:. Analyse par transfert Western de doubles complexes MyoD purifiés par affinité isolé à partir de fractions nucléosomes enrichi nucléaires de HeLa-S3 lignée cellulaire sexprimant tamment ou une lignée cellulaire de contrôle eMyoD (Mock) avec les anticorps indiqués. Ce panneau a été initialement publié dans The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. Aoû 2008 29; 283 (35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 juillet 2. Droit d'auteur La Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire. Ce chiffre a été modifié depuis 26: le type de police et la taille a été modifiée et le texte a été tourné pour unifier l'étiquetage dans le chiffre. MyoD a été étiqueté comme eMyoD pour éviter la confusion avec IP endogène présenté dans les autres panneaux. (BD) Validation des interacteurs MyoD dans les myoblastes de souris C2C12. (B) des extraits totaux nucléaires de prolifération des myoblastes C2C12 ont été utilisés pour l' immunoprécipitation (IP) avec des anticorps dirigés contre BAF47 (SNF5) ou MyoD, ou avec le contrôle IgG. Les précipités résultants ont été analysés par l'esprit WBh les anticorps indiqués. Pour les anticorps anti-MyoD plus longs (longue expo.) Et plus courte (courte expo.) Temps d'exposition sont présentés. extraits d'entrée ont été chargés de présenter des niveaux de protéines endogènes. Ce panneau a été publié dans 28 sous la licence Creative Commons Paternité (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Ce chiffre a été modifié à partir de 28: le type de police et la taille a été changé et le test a été tourné pour unifier l'étiquetage dans le chiffre. (C) des extraits totaux nucléaires de prolifération des myoblastes C2C12 ont été utilisés pour l' immunoprécipitation avec des anticorps dirigés contre MyoD, SUV39H1 (contrôle positif), ou contrôle IgG (contrôle négatif). Les précipités résultants ont été ensuite soumis à WB avec les anticorps indiqués. Ce panneau a été initialement publié dans The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. Aoû 2008 29; 283(35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 juillet 2. Droit d'auteur La Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire. Ce chiffre a été modifié depuis 26: le type de police et la taille a été modifiée et le texte a été tourné pour unifier l'étiquetage dans le chiffre. (D) des extraits totaux nucléaires de proliférer (prolif.) Et différenciant C2C12 de myoblastes (48 hr, indiquée comme diff.) Ont été utilisés pour l' immunoprécipitation (IP) avec des anticorps dirigés contre MyoD et Myf5, ou avec des IgG de lapin normal et avec des billes vides sous la forme contrôle négatif. Les précipités résultants ont été analysés par WB avec les anticorps indiqués. extraits d'entrée ont été chargés de présenter des niveaux de protéines endogènes. Ce panneau a été publié dans 27 sous la licence Creative Commons Paternité (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Ce chiffre a été modifié depuis 27: le type de police et la taille a été modifiée et le texte a été tourné pour unifier l'étiquetage au figure. Les panneaux avec les résultats obtenus à partir de la prolifération et la différenciation des C2C12 sont séparés en deux par opposition à la figure originale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1:. Liste des protéines identifiées par MS Analysis dans Complexes eMyoD Double Affinity-purifiées isolées à partir nucléaire Fraction Salt-extractible après la Soustraction des protéines de fond (protéines identifiées par MS dans les éluats de la lignée cellulaire de contrôle ont été considérés comme fond non spécifique .) les données représentent la somme de quatre purifications indépendants. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 2: Liste des protéines Iindéterminés par MS Analysis dans Complexes eMyoD Double Affinity-purifiées isolées de Fraction nucléosomes enrichi après la soustraction des protéines d'arrière - plan. Les données représentent la somme de trois purifications indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 3. Buffer Compositions. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La méthode présentée permet une identification exhaustive des partenaires d'un facteur de transcription, MyoD. Elle a révélé des partenaires de MyoD dans un système hétérologue résistant à la différenciation induite MyoD, à savoir les cellules HeLa-S3. Ainsi, par définition, les partenaires de MyoD identifiés sont exprimés de façon ubiquitaire. Ceux - ci comprennent des facteurs généraux et spécifiques d' une séquence de transcription, des enzymes de modification de la chromatine, des protéines de traitement de l' ARN, des kinases (Tableaux 1 et 2). Puisque les cellules HeLa-S3 sont résistantes à induit MyoD-trans-différenciation, l'activité MyoD est principalement répressive et les partenaires identifiés sont susceptibles d'être co-répresseurs MyoD. Ceci est mis en évidence par la présence de protéines Id (tableaux 1 et 2, Figure 2), connus pour inhiber la capacité de transactivation MyoD 8. Surtout, cet état répressif correspond à l'état de MyoD dans la prolifération des myoblastes. En effet, nous avons confirmé que les interactions avec MyoD CBFβ, un MyoDpartenaire identifié par le procédé décrit, peut être détectée dans la prolifération des myoblastes C2C12, mais sont perdus lorsque les cellules ont subi une différenciation (voir la figure 3D). Néanmoins, il est important de noter que l'une des principales limitations de la méthodologie présentée est l'absence de co-activateurs MyoD identification. Cohérente, en utilisant cette méthode , aucune des co-activateurs de MyoD connus, tels que l' histone acétyltransférases 32 ont été identifiés.

La purification des complexes de MyoD soit à partir de la fraction soluble (sel nucléaire soluble, SE) du noyau ou de la fraction enrichie chromatine (nucléosome enrichi, NE) (figure 1A) sert au moins deux fonctions principales. Tout d'abord, comme le fractionnement augmente la représentation des partenaires non stoechiométriques qui seraient masquées si la purification MyoD réalisée à partir d'extraits nucléaires totaux. En second lieu, ce qui permet la séparation des deux sous-populations fonctionnelles de MyoD: / evic pré-déposéted (SE) et chromatine lié (NE). Chez les interacteurs spécifiques pour l' ADN non lié MyoD, de nombreuses kinases, facteurs de transcription, le trafic de protéines ainsi que certains remodelers chromatine ont été identifiés (figure 2). Lorsqu'il sera pleinement validé, un tel réseau pourrait fournir un aperçu du mode de régulation de l'activité de MyoD d'ADN non lié. Recherche supplémentaire pour des modifications post-traductionnelles MyoD dans ces deux compartiments nucléaires par spectrométrie de masse, pourrait encore élucider la régulation de l'activité de MyoD. Enfin, le fractionnement des complexes MyoD solubles et chromatine lié sur un gradient de glycérol a révélé que tandis que le MyoD chromatine liée est principalement contenue dans un seul complexe, MyoD ADN non lié est distribué en trois sous-ensembles (figure 1B). La caractérisation de ces sous-ensembles soit par MS et / ou Western blot contre les candidats de protéines devrait élucider le mode de régulation de MyoD.

Comme l'a souligné ci-dessus, les cellules HeLa n'Expre pas naturellementss le facteur de MyoD de transcription musculaire. Il était donc important de confirmer les interactions trouvées dans un modèle de muscle squelettique (figure 3). De nombreux rapports confirmés dans les modèles pertinents telles interactions fonctionnelles entre MyoD et certains des partenaires identifiés dans la TAP-tag test présenté. Ceci est par exemple le cas pour prohibitin 33, DDX17 34, Meis1 35, CBF 27, HP1 26 et SWI / SNF remodelage de la chromatine 36,28,30 complexe.

Notez qu'il est possible d'effectuer un tel TAP-tag purification d'une faible quantité de cellules, telles que de myoblastes, lorsqu'ils sont combinés à MS sensibles. En effet, un récent article décrit partenaires MyoD caractérisation après expression inductible de MyoD de marquage Flag dans les myoblastes 30. Depuis stable et continue surexpression de MyoD dans les myoblastes est délétère, une approche alternative serait d' ajouter les balises Flag-HA dans l'allèle (s) de MyoD endogène dans myoblastesen utilisant des méthodes du génome édition, comme CRISPR-cas9 31. Notamment, l'ajout de l'étiquette (s) pourrait altérer la fonction et / ou une association de protéines avec des partenaires de liaison, donc le lieu de la balise (N- ou C-terminale) doit être choisi avec prudence. Une analyse fonctionnelle de la protéine de fusion dans le système concerné doit être effectué avant la purification TAP-tag afin d'assurer la protéine marquée est fonctionnel. Immunoprécipitation des protéines endogènes permet d'éviter ces problèmes, cependant, il repose sur la disponibilité d'un anticorps d'affinité spécifique et élevée, ce qui est rarement disponible.

Une autre valeur ajoutée de l'approche décrite est la possibilité d'identifier les modifications post-traductionnelles (PTM) de la protéine purifiée elle-même et de ses partenaires abondants. Ainsi, avec cette fonctionnalité la purification TAP-tag est adapté pour identifier non seulement les nouveaux partenaires d'interaction, mais aussi de nouvelles fonctions enzymatiques associées à la protéine d'intérêt et / ou de ses partenaires. Dansle cas d'une protéine de liaison à la chromatine ( par exemple., facteurs de transcription, des enzymes), cette méthode est ainsi adaptée à l' identification du «code des histones» associé. En effet, les queues d'histones amino-terminal, qui sont exposés à la surface nucléosome, sont soumis à de multiples PTM covalentes. PTM histones confèrent une signature unique aux nucléosomes impliqués. Une combinaison de différentes modifications sur histones queues de N-terminal peut donc modifier la structure de la chromatine pour permettre la régulation de l'expression des gènes. Ainsi, la caractérisation des modifications associées à une protéine donnée pourrait fournir des indications sur les rôles et les mécanismes d'action des protéines de la chromatine liaison étudiés 22.

En résumé, la méthodologie présentée permet une identification complète des partenaires MyoD. La purification TAP-tag fournit une alternative à d'autres approches telles que la TPS pull-bas, levure dosages à deux hybrides et affichage de phage. Même si pour des raisons pratiques (production d'une grande quantité d'extraits nucléaires), nous devons utiliser un système cellulaire hétérologue, nous avons été en mesure de confirmer l'implication des partenaires de MyoD identifiés dans la différenciation du muscle squelettique. Les données obtenues montrent que le facteur myogénique MyoD semble interagir avec une multitude de protéines allant de régulateurs de transcription des protéines de liaison à l'ARN, ce qui suggère des différents mécanismes qui régulent l'activité d'un facteur de transcription.

En conclusion, la même approche méthodologique pourrait être utilisée pour identifier des partenaires ubiquitaires de nombreux facteurs nucléaires qui pourraient être difficiles à étudier dans leur contexte cellulaire spécifique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23, (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24, (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8, (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11, (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8, (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6, (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40, (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185, (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132, (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47, (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25, (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22, (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31, (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20, (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37, (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8, (12), R270 (2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5, (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9, (10), e108858 (2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29, (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10, (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117, (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11, (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27, (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316, (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics