Иммобилизация Multi-биокатализаторов в альгинатные гранулы для регенерации кофактора и улучшены возможности повторного использования

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Представлен протокол для совместного иммобилизации биокатализаторов целых клеток для регенерации кофактора и улучшенной возможности повторного использования, с использованием производства L-ксилулозу в качестве примера. Регенерация кофактора достигается за счет сочетания двух штаммов кишечной палочки , выражающие функционально комплементарные ферменты; биокатализатор иммобилизация поклеточного достигается за счет клеточного инкапсулирования в альгината кальция бусинок.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Недавно мы разработали простой, многоразовые и связанную систему биокаталитической целой клетки с возможностью регенерации кофактора и биокатализатора иммобилизации для повышения выхода продукции и устойчивого синтеза. Описан при этом является экспериментальная процедура для разработки такой системы , состоящей из двух E. штаммы палочки, выражающие функционально комплементарные ферменты. Вместе эти два фермента могут функционировать совместно оперативно опосредовать регенерацию дорогих кофакторов для улучшения выхода продукта из биореакции. Кроме того, способ синтеза иммобилизованной форме спаренных биокаталитическом системы путем инкапсулирования целых клеток в альгинатные гранулы кальция сообщается. В качестве примера, мы представляем улучшенную биосинтез L-ксилулозы из L-арабинитола путем связывания Е. Клетки палочки , выражающие ферменты L-арабинитол дегидрогеназы или NADPH-оксидаза. При оптимальных условиях и с использованием начальной концентрации 150мМ L-арабинитол, максимальная L-ксилоза выход достигал 96%, что выше, чем в литературе. Иммобилизованная форма спаренных биокатализаторов целых клеток продемонстрировали хорошую стабильность работы, поддержание 65% урожая, полученного в первом цикле после 7 циклов последовательного повторного использования, в то время как система свободного клеток почти полностью утратили каталитическую активность. Поэтому методы, описанные здесь, обеспечивает две стратегии, которые могли бы помочь улучшить промышленного производства L-ксилулозы, а также другие соединения, с добавленной стоимостью, требующих использования кофакторов в целом.

Introduction

Восстановительное цельноклеточная биотрансформацию с использованием микроорганизмов стало распространенным методом для химио-ферментативный синтез коммерчески и терапевтически важных биомолекул 1 - 3. Она представляет ряд преимуществ по сравнению с использованием выделенных ферментов, в частности устранение затратных процессов очистки вниз по течению и демонстрации длительного срока службы 4 - 7. Для биокаталитические путей , где кофакторов необходимы для образования продукта, системы цельноклеточная имеют потенциал , чтобы обеспечить на месте кофактора регенерации в с помощью добавления недорогих донорных сопутствующих субстратов 5,8,9. Тем не менее, эта способность уменьшается для реакций, требующих стехиометрическое концентрации редких и дорогих сопутствующих подложек 10 - 13. Вместе с плохим повторное использование целых клеток, что затрудняет создание масштабируемого и непрерывного продфикция система. Стратегические модификации систем целых клеток для этих кофактора-зависимых биотрансформациях необходимы для преодоления вышеуказанных ограничений. В частности, сочетание целых клеток биокатализаторов , которые работают совместно , как было показано, значительно повысить производительность и стабильность ферментов питали 14. Эти факторы, которые часто имеют решающее значение для обеспечения возможности крупномасштабного производства коммерчески жизнеспособных продуктов, могут быть оптимизированы далее совместно иммобилизации биокаталитические микробов 15. Недавно мы разработали простой и многоразовый целой клетки биокаталитической систему , которая позволяет как кофактора регенерации и биокатализатор иммобилизация для L-ксилоза производства 16. В данном исследовании, эта система была использована в качестве примера, иллюстрирующего экспериментальные методики применения этих двух стратегий для повышения выхода продукции биотрансформации и биокатализатора многократного использования.

L-ксилоза относится к CLAсс биологически полезных молекул названы редкие сахара. Редкие сахара являются уникальными моносахариды или производные сахара , которые встречаются очень редко в природе, но играют решающую роль в качестве элементов распознавания в биоактивных молекул 17,18. Они имеют множество применений , начиная от подсластителей, функциональных пищевых продуктов для потенциальных терапевтических средств 19. L-ксилоза может быть использован в качестве потенциального ингибитора нескольких альфа-глюкозидазами, а также может быть использовано в качестве индикатора гепатита или цирроза печени 17,20. Высокая эффективность преобразования ксилита L-ксилулозы в системах целых клеток сообщалось ранее в Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes SP. 701B 23, Bacillus бледного шара Y25 24,25 и кишечная палочка 26. У Е. палочка, тем не менее, это было достигнуто только с использованием низкой (<67 мм) концентрации ксилита 26 из - за потенциальных ингибирующих эффектов начальной концентрации ксилита выше , чем 100 мМ на ксилит-4-дегидрогеназа активности 21,26. Термодинамическое равновесие между ксилулозы и ксилита было показано , что сильно способствует образованию ксилита 25,27. Кроме того, ксилоза выход ограничен количеством дорогих кофакторов , которые должны быть поставлены в случае отсутствия его на месте системы регенерации кофактора. В совокупности эти факторы ограничивают потенциал для масштабирования в устойчивых систем для L-ксилоза биосинтеза.

Чтобы преодолеть эти ограничения и улучшить L-ксилоза выход биотрансформации, стратегия регенерации кофактора была использована первая путем создания системы биокаталитической в ​​сочетании целой клетки. В частности, L-арабинитола 4-дегидрогеназа (EC 1.1.1.12) из Hypocrea jecorina (HjLAD), фермент , в L-арабинозы катаболического пути грибов, был выбран , чтобы катализировать превращение L-арабинитола в L-ксилоза 28,29 , Как и многие другие ферменты биосинтетических, главный limitatioп HjLAD является то , что она требует стехиометрического количества дорогих никотинамидадениндинуклеотид кофактора (NAD +, окисленный форма NADH) , чтобы осуществить это преобразование. NADH - оксидазы найдено в Streptococcus Пирролидонилпептидаза (SpNox) было показано , для отображения высокой кофактором-регенерации активности 30,31. Пользуясь этим атрибутом SpNox, E. палочка - клетки , экспрессирующие HjLAD для производства L-ксилулозы были соединены с Е. палочка - клетки , экспрессирующие SpNox для регенерации NAD + , чтобы увеличить L-ксилоза производства , изображаемой спаренной реакции , показанной на рисунке 1А. При оптимальных условиях и с использованием начальной концентрации 150 мМ L-арабинитола, максимальная L-ксилоза выход составил 96%, что делает эту систему гораздо более эффективным, чем сообщалось в литературе.

Стратегия целых клеток иммобилизации использовали следующий для дальнейшего повышения многократного использования в сочетании biocatalytСистема IC. Обычно используемые методы цельноклеточная иммобилизации включают адсорбционную / ковалентного связывания с твердыми матрицами сшивание / защемления и капсулирования в полимерных сетях 32. Среди этих подходов, наиболее подходящим методом для клеточной иммобилизации является инкапсуляция в альгината кальция бусин. Их мягкие свойства гелеобразования, инертный водная матрица и высокая пористость помогает сохранить физиологические свойства и функциональность инкапсулированных биопрепаратов 33. Таким образом, связанная система биокатализатор , содержащий как E. Клетки , несущие палочки HjLAD или SpNox иммобилизовали в альгината кальция бусин , чтобы включить несколько циклов L-ксилоза производства (рисунок 2) .The обездвижен система биокатализатор продемонстрировала хорошую стабильность работы, сохраняя 65% конверсионного выхода первого цикла после 7 циклов последовательное повторное использование, в то время как свободная клеточная система почти полностью утратила свою каталитическую активность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. цельноклеточная биокатализаторы Приготовление

Примечание: Рекомбинантный Е. Клетки , несущие палочки pET28a- SpNox 31 или pET28a- HjLAD 28 далее упоминается как E. палочки SpNox и E. палочки HjLAD соответственно.

  1. Привить единственная колония E. палочки HjLAD в 3 мл Лурии-Бертани (LB) среде с канамицином (50 мкг / мл) и инкубируют в термостате шейкера O / N при температуре 37 ° С, 250 оборотов в минуту.
  2. Развести культуры в соотношении 1: 100 в 200 мл свежей LB , содержащей 50 мкг / мл канамицина , и инкубируют при 37 ° С, 250 оборотов в минуту до OD 600 достигает ~ 0,6.
  3. Индуцируют экспрессию белка HjLAD путем добавления 0,1 мМ изопропил- β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) в культуральную среду , и инкубировать при 16 ° С, 180 оборотов в минуту в течение 16 ч.
    1. С другой стороны , проводится индукция при 25 ° С, 200 р.п.м в течение 6 часов, если L-ксилоза биосинтез (шаг 2 ниже) выполняется в тот же день.
  4. Урожай индуцированное E. палочки HjLAD клетки центрифугированием при 3200 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и перейти к шагу 2, чтобы обработать осадок клеток.
  5. Параллельно с этим , выполните шаги 1.1 - 1.4 для Е. SpNox палочка.

2. Биосинтез L-ксилоза Объединяя Е. палочки HjLAD и E. SpNox палочка для регенерации кофактора

  1. Ресуспендируют клеточные гранулы Е. палочки HjLAD и E. палочка SpNox отдельно в буфере 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) при плотности клеток 5,0 г веса сухих клеток (gDCW) / л.
    Примечание: корреляция между gDCW и оптической плотности , измеренной при длине волны 600 нм (OD 600) могут быть установлены для облегчения эксперимента. Формула, используемая вэтот протокол 1 gDCW / L = 0,722 * OD 600 - 0,0965, который может меняться в зависимости от различных спектрометров.
  2. Смешайте 600 мкл 5,0 gDCW / л E. палочки HjLAD, 600 мкл 5,0 gDCW / л E. палочка SpNox, 100 мкл 20 мМ НАД +, и 150 мкл 2 М L-арабинитола в течение 14 мл с круглым дном труб и довести объем реакционной смеси до 2 мл путем добавления 550 мкл 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) ,
    Примечание: Отношение количества биокатализаторов два целых клеток могут быть оптимизированы для улучшения биосинтез продукта. Для описанной системы, отношение Е. палочки SpNox: E. палочки HjLAD = 1: 1 было найдено оптимальным для L-ксилоза биосинтеза (рис 1B).
  3. Инкубируют реакционную смесь при температуре 30 ° С, 200 оборотов в минуту в течение 8 час.
  4. Соберите супернатант после центрифугирования при 4 ° С, 3200 мкг в течение 10 минут вй проследовать для количественного определения L-ксилоза производства, как описано в шаге 3 ниже.

3. колориметрический анализ для L-ксилоза Количественное

  1. Отберите по 100 мкл реакционной супернатант собирали с шага 2,4 в 1,5 мл пробирку.
  2. Добавляют 50 мкл 1,5% цистеина, 900 мкл 70% -ной серной кислоты и 50 мкл 0,1% карбазола растворили в этаноле и осторожно перемешивают путем переворачивания пробирки 3 раза.
  3. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С, 200 оборотов в минуту в течение 20 мин.
  4. Измерьте оптическую поглощение реакционной смеси при 560 нм (А 560) с использованием спектрофотометра.
    1. Разбавляют реакционную смесь , если чтение 560 выше 1.

4. Иммобилизация катализаторах цельноклеточная Рекомбинантные кальция альгинатные гранулы

  1. Разведите 4 г альгината натрия в 100 мл дистиллированной воды. Подготовить альгината решение путем добавления SOdium альгината в воде, чтобы избежать образования комков. Нагревают смесь при необходимости.
  2. Добавьте 600 мкл 5,0 gDCW / л E. палочки HjLAD и 600 мкл 5,0 gDCW / л E. SpNox палочки в 1,2 мл 4% альгината , полученного на стадии 4.1 , и смешать клетки и альгинат осторожно пипеткой , чтобы избежать образования пузырьков.
  3. Аспирируйте суспензии альгинат / клеток в шприц с помощью иглы и добавьте смесь по каплям в хлорид 0,3 М кальция (2) CaCl раствора в 100 мл стакане при непрерывном перемешивании.
    Примечание: Объем 2 раствора CaCl , используемый для формирования альгината шарика должно быть достаточно для капли альгината , чтобы быть полностью погружен в воду. Кроме того, расстояние между иглой шприца и поверхность раствора хлорида кальция должна поддерживаться в пределах оптимального диапазона для обеспечения образования равномерно сферических шариков. Оптимальный диапазон расстояний можно определить экспериментсоюзник и зависит от внутреннего диаметра иглы. В качестве оценки, был найден на расстоянии ~ 15 ± 5 см, чтобы быть оптимальной для 0,6 см (внутренний диаметр) иглы шприца.
  4. Оставьте шарики в растворе CaCl 2 в течение 2 - 3 ч при комнатной температуре без перемешивания , чтобы обеспечить образование сшивающие и гелевые шарики.
  5. Декантируют раствор CaCl 2 , не нарушая бусинки, осторожно выливая раствор CaCl 2 в коническую пробирку емкостью 50 мл, и передавать оставшиеся бусинки в 2 раствора CaCl в другую порцию 50 мл коническую трубку.
  6. Вымойте бисером с 10 мл 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) буфера три раза для удаления избыточных CaCl 2 и снимите инкапсулированные клетки.
    ЗАМЕТКА: На любом данном шаге, не центрифугировать шарики так как это приведет к разрыву их. Чтобы отделить шарики из раствора, суспензии позволяют отстаиваться в течение 3 - 5 мин. Шарики будут оседают на дне, а промывочный буфер может быть сливаютв другой контейнер.
    1. Не выбрасывайте использованный промывочный буфер. Бассейн использованного Трис-HCl буфер для промывки (30 мл) с используемым CaCl 2 раствора , собранной с шага 4.5.
  7. Гранул неразделанный обездвижен E. Клетки палочки центрифугированием объединенном CaCl 2 и трис-HCl раствор собирали с шага 4,6 при 3,200 мкг в течение 20 мин. Для определения эффективности иммобилизации, вычислить плотность осажденные не-инкапсулированных клеток в gDCW / л, как описано на стадии 2.1.
  8. Перенесите промытые шарики с шага 4.6 в трубу. Последующие шаги 2.2 - 3.4, чтобы оценить L-ксилоза биосинтез, используя все промытым бусинок вместо клеточных гранул.

5. Устойчивость Анализ иммобилизованных биокатализаторов для L-ксилоза производства

  1. Собирают бусинки с шага 4.8 и дважды промывают 10 мл 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) буфере без центрифугирования (как описано в шаге 4.6).
  2. Используйте всепромытого бусинок, чтобы осуществить реакцию, как описано в пунктах 2.2 - 3.4.
  3. Повторите шаги 5.1 - 5.2 для заданного числа циклов производства и измерения количества L-ксилулозы, полученного в реакции супернатант в каждом цикле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы включить регенерацию кофактора, L-ксилоза Синтез проводили в связанной системе биокаталитическом целых клеток , содержащей E. палочки HjLAD и E. палочки SpNox клетки. После оптимизации различных параметров, возможность многократного использования этой системы была улучшена путем иммобилизации его в альгината кальция бусин (рисунок 2).

L-ксилоза Производство с кофактором регенерации путем соединения Е. палочки HjLAD и E. палочки SpNox клетки.
Для усиления биоконверсии L-арабинитола в L-ксилулозы, Е. палочки HjLAD и E. палочки SpNox клетки в сочетании с тем чтобыкофактором регенерации. Для учета различий в экспрессии белка и доступности кофактора в E. палочки SpNox и E. палочки HjLAD клетки, сравнение исследование L-ксилоза доходности при различных Е. палочки SpNox -До- E. Коэффициенты палочки HjLAD проводили. Как показано на фигуре 1В, выход увеличивается по мере Е. палочки SpNox -До- E. палочка HjLAD соотношение увеличилось с 0,13: 1 до 1: 1. Выходы, полученные для соотношения 1: 1 и 1,33: 1 были эквивалентны и максимальным для этой связанной системы. Все дальнейшие эксперименты проводились с Е. палочки SpNox -До- E. Соотношение палочка HjLAD 1: 1. Начиная с начальной концентрации 150 мМ L-арабинитола, использование E. палочки HjLAD биокатализатор в одиночку получают 118 мМ L-ксилулозу после 8 ч (точка насыщениядля L-ксилулозы концентрации), что составляет выход 79% (рис 1C). Для сравнения, использование Е. палочки HjLAD и E. палочки SpNox клетки в соотношении 1: 1 получают 144 мМ L-ксилулозу, повышение урожайности до 96%.

Оптимизация цельноклеточная биокатализатора иммобилизации
Иммобилизация биокатализаторов в альгинатные гранулы кальция имеет много преимуществ, таких как улучшение жизнеспособности, в результате мягкой среды гель, который защищает клетки от физических нагрузок в биореакторе. Свойства этих альгинатных шариков в значительной степени определяется рецептурой и обработки параметров 34. Для оптимизации выхода производства L-ксилулозы путем иммобилизованной форме спаренной биокатализатора цельноклеточной , описанной выше, два основных параметра, а именно концентрации альгината натрия и концентрация CaCl 2, были оценены. ЭтиОсновные параметры, которые определяют целостность и жесткость альгината кальция бусинок, которые, в свою очередь, влияет на эффективность биокатализатор иммобилизации и молекулярной диффузии.

Как показано на фигуре 3А, эффективность биокатализатор иммобилизация продемонстрировали тенденцию к увеличению с увеличением концентрации альгината натрия в диапазоне 1 - 3% (вес / объем). Когда концентрация альгинат натрия , используемый в матрице иммобилизацию менее 1%, полученные гранулы хрупки и легко ломаются из - за низкой механической стабильностью, выпуская большинство клеток в окружающий раствор CaCl 2 (данные не показаны). При увеличении концентрации альгината натрия до более чем на 2%, в результате шарики закаленные чрезмерно что приводит к проблемам в области молекулярной диффузии 35 (рис 4). Изменяя концентрацию CaCl 2 Поддавшись аналогичная тенденция в биокатализатора immobilizatкоэффициент полезного действия ионов. При фиксированной концентрации альгината натрия (2% вес / об) , и в диапазоне от 0,1 - 0,4 М CaCl 2, более низкие концентрации CaCl 2 приводило к снижению жесткости бортов и увеличение утечки клеток в окружающий раствор. Это связано с ограниченным наличием ионов Ca 2+ для сшивания guluronate блоков на альгинат полимерных цепей 36 (рис 3б). Тем не менее, увеличение концентрации CaCl 2 от 0,3 М до 0,4 М повысило эффективность биокатализатор иммобилизация лишь незначительно. Благодаря высокой эффективности иммобилизации (> 90%), CaCl 2 концентрации за 0,4 М не были оценены. Когда использовались CaCl 2 концентрации менее 0,1 м, капелька альгинат натрия , содержащий биокатализатор , распались в растворе CaCl 2 и не образовывались сферические гранулы (данные не показаны).

Для того, чтобы максимизироватьбиокатализатор эффективность иммобилизации без значительного замедления молекулярной диффузии в альгината кальция бисер, альгинат натрия и концентрацию CaCl 2 были оптимизированы следующим для улучшения L-ксилоза производства. Используя ту же самом интервале концентраций, для эффективности иммобилизации (1 - 3% вес / об альгината натрия и 0,1 - 0,4 М CaCl 2), оптимальная концентрация альгината натрия 2% наблюдался для достижения максимального выхода L-ксилоза производства (фиг.4А ). Помимо этой оптимальной концентрации, выход показал тенденцию к снижению. Это, как ожидается, из-за проблем, в процессе диффузии, связанных с чрезмерной жесткостью альгината кальция бусинок. Аналогичным образом , оптимальная концентрация CaCl 2 было установлено, что 0,3 М (4В). В сочетании с данными , представленными на рисунке 3, концентрация оптимальной альгинат натрия (2%) и CaCl 2 концентрации (0,3 М) , что позволило формирование шариков сбыла установлена ​​подходящей жесткости и проницаемости, что позволяет минимальную утечку клеток и максимальный L-ксилоза выход продукции.

Следует отметить, что, еще одним фактором, который влияет на общую каталитическую эффективность иммобилизованного биокатализатора является вес клеточной культуры, инкапсулированным. Каталитические эффективность возрастает с увеличением клеточного посевного материала до оптимального веса посевного материала , за которым он показывает тенденцию к снижению 37. Возможное объяснение этого снижения клеточного переполненность, что затрудняет молекулярная диффузия в течение альгинатные гранулы кальция и снижает каталитическую эффективность системы. С помощью оптимизированного состояния иммобилизации выше, самый высокий L-ксилоза производство было получено с нагрузочной ячейкой 3,75 (gDCW) / L 16 (данные не показаны).

Повторное использование иммобилизованных и бесплатных биокатализаторов цельноклеточная дляL-ксилоза Производство.
С помощью установленного оптимизированное условие 1: 1 E. SpNox палочка Е. Соотношение палочка HjLAD, 2% (вес / объем) альгинат натрия, и 0,3 М CaCl 2, иммобилизованного в сочетании выход поклеточного биокатализатор максимальный L-ксилоза выход 64%, по сравнению с намного более высокой выходом 96% для свободного спаренная система цельноклеточная (цикл 1 Рисунок 5). Обратите внимание , что выход иммобилизованной Е. одна палочка HjLAD клетка была только 32,5% (данные не показаны), ниже , чем у иммобилизованного связанной системы, а также свободной единой системы биокатализатора (79%, рис 1C). Это сокращение, как ожидается, как иммобилизация, как известно, снижают активность биокатализаторов, возможно, вследствие субстрату диффузионных ограничений, но компенсировалось преимуществом улучшенной возможности повторного использования биокатализатора при иммобилизации. Этот эффект на стабильность биокатализаторсвидетельствует тенденция уменьшения L-ксилоза доходности наблюдается на подвергая свободных и иммобилизованных систем многократно в процессе периодического действия реакции, показанной на рисунке 5. Выход для свободной системы показали гораздо более крутой спад , чем у иммобилизованным системы, что указывает на более быстрая потеря активности фермента в свободной системе. В результате обе системы имели сопоставимую L-ксилоза выход для производственного цикла 2. В конце 7 циклов последовательного повторного использования, инкапсулированные биокатализаторы сохранили свою стабильность и сохранил 65% от первоначального урожая в то время как свободного цельного клеточного система сохранила менее 10% от его способности производить L-ксилулозу. Это свидетельствует о том, что иммобилизованные биокатализаторы можно было бы эффективно использовать повторно для производства L-ксилулозы и что польза от улучшенного повторного использования и стабильности вызванной иммобилизации значительно перевешивает снижения активности биокатализатора, закреплялось значительное преимущество в процессе производства в течениесвободная система цельноклеточная.

Рисунок 1
Рисунок 1. спаренная система цельноклеточная для биокаталитическая производства L-ксилулозы. (А) Схематическое иллюстрирующий реакцию регенерации кофактора , встречающийся в связанной системе целых клеток , содержащей E. Клетки , несущие палочки HjLAD или SpNox соответственно. (B) Изменение выхода L-ксилулозы с различными Е. SpNox палочка Е. Коэффициенты палочки HjLAD. (C) L-ксилоза выход из целых клеток биокатализатора состоят только из E. палочки HjLAD по сравнению с сопряженной системы целых клеток , состоящей из E. палочки HjLAD и E. палочки SpNox клетки , способные к регенерации кофактора. Графики, представленные представляют собой средние и STAndard отклонение трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Иммобилизация биокатализаторов цельноклеточная через инкапсулирование в альгинатные гранулы. Схема , представляющая образование одинакового размера Ca 2+ альгинатные гранулы , добавляя по каплям суспензии альгинат натрия-клеток к раствору хлорида кальция. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Параметры , влияющие на эффективность иммобилизации биокатализатор поклеточного в альгинатные гранулы. Эффективность иммобилизации в зависимости от (А) альгината натрия (% вес / об) (В) , CaCl 2 (М) концентрации. Графики , представленные представляют собой среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Оценка Выход L-ксилулозу с иммобилизованных Coupled поклеточного биокатализатора в зависимости от (А) альгината натрия (% вес / об) (В) , CaCl 2 (М) концентрации. Графики, представленные представляют собой среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов.тощий "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Оценка биокатализатора повторного использования. Выход L-ксилоза производства в течение 7 последовательных циклов повторного использования иммобилизованного и свободного в сочетании целых клеток биокатализатора показан в темноте и светло - серого цвета, соответственно. Сюжет показал представляет собой среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Последние технологические достижения позволили всплеск коммерциализации рекомбинантных биотерапевтических, что приводит к постепенному повышению их рыночной стоимости в биотехнологической промышленности. Одним из таких продвижение является появление метаболической инженерии в рекомбинантных микроорганизмов, который показал большие перспективы в создании масштабируемых промышленных систем 38. Как и в большинстве процессов, успешной коммерциализации рекомбинантных биомолекул , полученных методами генной инженерии микробов , сильно зависит от выхода продукции системы 39. Это привело к быстрому развитию «грубой силы» генетики 39, где направленная эволюция биокаталитические ферментов были реализованы с целью повышения активности биокатализатора 3. Тем не менее, для некоторых метаболических путей, таких как окислительно-восстановительные пути, просто улучшение биокатализатор не является достаточным, чтобы влиять на экономизации производства вследствие значительного влияния дросновные требования реакции эр, такие как дорогие кофакторов. Расширение масштабов такой системы, даже с улучшенными биокатализаторов, будет только способствовать увеличению издержек производства. Таким образом, дополнительные стратегические методы необходимы для коммерциализации bioreactions с участием стехиометрические соотношения кофакторов. Кроме того, вторичной переработки биокатализатора также необходимо для повышения экономической целесообразности создания биопроцессы. Чтобы преодолеть предельный эффект быстрого потребления кофактора и бедных повторного использования целых клеток биокатализаторов, ранее мы разработали обездвижены в сочетании биокаталитической систему целой клетки для регенерации кофактора и стабильного повторного использования 16. Описанные в настоящем исследовании, являются экспериментальные процедуры, необходимые для пары и совместно обездвижить два биокатализаторов целых клеток для повышения выхода биотрансформации и повторное использование, наряду с представительными результатами.

Критическим фактором, который следует рассматривать для соединения Biocat цельноклеточнаяalysts является поддержание точного контроля над условиями, установленными для индукции белка и образования продукта биокаталитическом для обеспечения воспроизводимости системы. Изменения параметров , таких как индукции OD 600, время индукции и концентрации IPTG следует избегать , чтобы свести к минимуму партии к партии вариаций. Кроме того, переоценка отношения клетки к клетке требуется для различных биотрансформациях. Следует отметить , что Е. палочки HjLAD: E. палочка отношение SpNox 1: 1 в этом исследовании была определена экспериментальной оптимизации , а не теоретического стехиометрического соотношения. Для иммобилизации рекомбинантных биокатализаторов целых клеток в альгинатные гранулы кальция, существует несколько важных шагов для обеспечения единообразия в отношении кромочной жесткости и распределение клеток. Во-первых, раствор альгината должен быть получен путем медленного добавления альгината натрия в воду, а не наоборот, чтобы предотвратить образование комков, что совместноеÜLD влияют на местную концентрацию альгината и, таким образом, степень сшивки. Во-вторых, осторожно пипеткой следует использовать при обращении с клеточно-альгинат подвески, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, которые наносят касательное напряжение на инкапсулированных клеток, препятствует эффективной массопередачи и может даже привести к бусинки плавать. В случае, если воздушные пузырьки вводятся в суспензию, позволяют клетке-альгинат суспензию отстаиваться в течение 20 - 30 мин, чтобы позволить пузырькам избежать. В-третьих, при изготовлении бусин, клетка-альгинат суспензия должна быть медленно и осторожно добавляли в каплям образом в достаточном объеме раствора хлорида кальция для однородного размера и морфологии. Бусинки погруженные в неполно хлорида кальция будет иметь неправильную форму и плохую жесткость, что может способствовать утечке клеток. И, наконец, чтобы избежать изменчивости объема реакции от остаточного промывочного буфера, гранулы в шаге 4.8 может быть слегка промокали фильтровальной бумагой (не сухой воздух).

E. палочки SpNox и E. культуры палочки HjLAD клеток, предлагая лучший контроль в поддержании требуемого соотношения между двумя ферментами. Кроме того, клетки , экспрессирующие единичные белки подвергаются меньшему стрессу , чем те коэкспрессирующей многочисленных белков, которые могут привести к снижению неправильного сворачивания белка и повышение экспрессии белка 40,41. Таким образом, прямая связь цельноклеточная представляет способность опосредовать мульти-ферментных каталитических процессов без существенного ущерба для выхода продукта. Тем не менее, установленные стратегии , такие как тщательный отбор бактериальных промоторов с различной прочностью 42,43 и улучшение рибосом сайтов связывания 44 может быть работающий по наймуd, чтобы смягчить ограниченный контроль над отношением целевых ферментов в совместном культивировании или коэкспрессией систем. Среди многих методов иммобилизации, инкапсуляция представляет многочисленные преимущества для иммобилизации поклеточного биокатализаторы по сравнению с альтернативными способами, такими как сшиванием и адсорбции, которые больше подходят для очищенных ферментов. Инкапсуляция клеток также может быть выполнена в различных биоматериалов , таких как агар, хитозан, камеди, каррагинана, желатин и альгинат 45 для улучшения повторного использования биокатализаторов. Тем не менее, альгинат кальция инкапсуляция было показано, что наиболее эффективным подходом в отношении эффективности иммобилизации и биомолекулы производства 46,47.

Одним из основных ограничений использования бактериальных биокатализаторов целых клеток является минимальным способность к посттрансляционной модификации гетерологичных белков в дикого типа Е. 48 палочка. Это ограничивает успешное использование эукариотических биокатализаторов шithin эту систему. Альтернативой преодолеть это ограничение может быть использование организмов, таких как дрожжи, которые лучше обеспечены эукариотической посттрансляционной техники. Другим ограничением описанной системы связана с использованием иммобилизации для улучшения многократного использования. Иммобилизация является общей экономически эффективной стратегия , используемая для противодействия низкой стабильности биокатализаторов и повысить их скорость оборота за счет упрощения биотехнологического 49 - 51. Основные параметры, влияющие на каталитические характеристики капсулированных биокатализаторов целых клеток включают концентрацию натрия альгинат, CaCl 2, концентрация нагрузки сотовой ячейки и размера шарика. Важно признать, что эти параметры не являются независимыми друг от друга. Таким образом, комплексный анализ всех факторов, в рамках одного исследования очень много времени, поэтому необходимо выбрать наиболее важные параметры для оптимизации. Оценивается и представленные здесь эффектыДва параметра, альгинат натрия и концентрации CaCl 2. Хотя это и не обсуждается здесь подробно, ранее мы проводили оптимизацию нагрузки сотовой ячейки, сравнивая зависимость выхода от массы клеток , иммобилизованных 16. Отчеты в литературе показывают, что изменение размеров гранул может также модулировать выход продукта за счет увеличения фермента инкапсуляцию, улучшение активности за счет увеличения площади поверхности с иммобилизованным системы или путем изменения диффузии субстратов и продуктов из-за измененных транспортных свойств. В зависимости от биокаталитические рассматриваемых реакций, выбор альтернативных критических факторов может потребоваться, что может привести к образованию другого набора оптимальных условий. Детальное исследование для создания оптимальных условий для дополнительных параметров обеспечивает широкие возможности для дальнейшего улучшения производительности системы связанных целых клеток.

Таким образом, мы сообщаем об экспериментальной implemenставление связанной системы биокаталитическом цельноклеточная иммобилизованного в альгината кальция бусин, иллюстрирующего улучшенное производство L-ксилулозы. Выражая различные рекомбинантные ферменты, способствующие других зависимых кофактора биокаталитическом путей, высокие урожаи многих биологически соответствующих молекул могут быть получены с использованием протокола, описанного здесь. Кроме того, эта система может быть расширена , чтобы вместить более двух рекомбинантных биокатализаторов для одной емкости нескольких ферментов биосинтеза продуктов 52 и , кроме биокаталитическом производства приложений, таких как микробные биосенсоры для биохимической потребности 53 кислорода. Пользуясь синергетической особенностью этой системы, инкапсуляция симбиотических микробных консорциумов может быть использован для множества применений , таких как биоремедиации 54 - 56, цельноклеточная биопереработки для производства биотоплива 57, стимулирования роста растений почвой Биоаугментация 58 и biomining для извлечения металлов 59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют нет конкурирующих финансовых интересов. Документ нацелен на отчетности подробную методологию для создания связанную систему биокаталитической целой клетки, иммобилизованной в альгинатных шариков. Научные новинки были представлены в предыдущем исследовании 16.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Основном программой исследования науки через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и техники (СРН-2013R1A1A2012159 и NRF-2013R1A1A2007561), Конкук университет и факультет химической инженерии и MCubed Программа в университете штата Мичиган.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27, (6), 686-714 (2009).
  2. Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110, (1), 68-77 (2013).
  3. Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54, (16), 4021-4032 (2015).
  4. Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76, (4), 1251-1260 (2009).
  5. Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92, (5), 929-937 (2011).
  6. Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32, (3), 652-662 (2014).
  7. Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15, (1), 266-274 (2011).
  8. Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72, (3), 514-520 (2006).
  9. Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5, (1), e8860 (2010).
  10. Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14, (6), 583-589 (2003).
  11. Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20, (6), 238-242 (2002).
  12. Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
  13. Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106, (7), 946-957 (2014).
  14. Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45, (3), 210-217 (2009).
  15. Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89, (11), 1733-1740 (2014).
  16. Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
  17. Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39, (6), 823-834 (2012).
  18. Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72, (1), 231-235 (2008).
  19. Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62, (5), 1161S-1168S (1995).
  20. Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90, (2), 499-507 (2011).
  21. Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72, (1), 368-377 (2006).
  22. Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49, (1), 158-162 (1985).
  23. Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72, (6), 488-490 (1991).
  24. Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40, (5), 1206-1212 (2007).
  25. Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74, (9), 1807-1813 (2010).
  26. Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36, (10), 1323-1330 (2009).
  27. Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67, (1), 25-30 (1989).
  28. Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271, (10), 1864-1872 (2004).
  29. Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, (1), 173-176 (2014).
  30. Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, (16), 7081-7088 (2014).
  31. Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, (5), 1931-1935 (2012).
  32. Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34, (1), 26-32 (2004).
  33. Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31, (3), 267-285 (1998).
  34. Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76, (1), 77-89 (2008).
  35. Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41, (5), 1117-1123 (2006).
  36. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37, (1), 106-126 (2012).
  37. Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11, (1), 119-131 (2012).
  38. Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14, (3), 233-241 (2012).
  39. Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33, (7), 486-495 (2006).
  40. Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22, (11), 1399-1408 (2004).
  41. De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
  42. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (2), 211-222 (2006).
  43. Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103, (8), 12678-12683 (2006).
  44. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, (10), 946-950 (2009).
  45. Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, (3), 231-244 (2013).
  46. Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9, (12), e114291 (2014).
  47. Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
  48. Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30, (5), 1102-1107 (2012).
  49. Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15, (5), 1033-1035 (2011).
  50. Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50, (6-7), 331-336 (2012).
  51. Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163, (3), 292-300 (2013).
  52. Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
  53. Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40, (1), 368-376 (2013).
  54. Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100, (9), 2493-2500 (2009).
  55. Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30, (2), 261-278 (2004).
  56. Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100, (18), 4257-4261 (2009).
  57. Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7, (4), 1446 (2014).
  58. Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012, (491206), (2012).
  59. Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3, (203), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics