सहायक कारक के उत्थान और बेहतर reusability के लिए Alginate मोती में मल्टी biocatalysts का स्थिरीकरण

Chemistry

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Summary

प्रस्तुत सहायक कारक के उत्थान और बेहतर reusability के लिए सह immobilizing पूरे सेल biocatalysts, एक उदाहरण के रूप में एल xylulose के उत्पादन प्रयोग करने के लिए प्रोटोकॉल है। सहायक कारक के उत्थान दो कोलाई कार्यात्मक पूरक एंजाइमों व्यक्त उपभेदों युग्मन द्वारा हासिल की है; पूरे सेल biocatalyst स्थिरीकरण कैल्शियम alginate मोती में सेल encapsulation द्वारा हासिल की है।

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Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

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Abstract

हमने हाल ही में सुधार के उत्पादन उपज और निरंतर संश्लेषण के लिए सहायक कारक के उत्थान और biocatalyst स्थिरीकरण की क्षमता के साथ एक सरल, पुन: प्रयोज्य और मिलकर पूरे सेल biocatalytic प्रणाली विकसित की है। इसके साथ वर्णित दो से मिलकर एक ऐसी प्रणाली के विकास के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया है कोलाई उपभेदों कि कार्यात्मक पूरक एंजाइमों व्यक्त करते हैं। साथ में, इन दो एंजाइमों bioreaction के उत्पाद उपज में सुधार के लिए महंगा सहकारकों के उत्थान मध्यस्थता करने के लिए कार्य कर सकते हैं सह ऑपरेशन। इसके अलावा, कैल्शियम alginate मोती में पूरे कोशिकाओं के encapsulation से मिलकर biocatalytic प्रणाली का एक स्थिर रूप synthesizing की विधि बताई गई है। एक उदाहरण के रूप में, हम युग्मन द्वारा एल arabinitol से एल xylulose के बेहतर जैवसंश्लेषण पेश कोलाई कोशिकाओं एंजाइमों एल arabinitol डिहाइड्रोजनेज या NADH oxidase व्यक्त। इष्टतम शर्तों के तहत और 150 के एक प्रारंभिक एकाग्रता का उपयोगमिमी एल arabinitol, अधिक से अधिक एल xylulose उपज 96% है, जो साहित्य रिपोर्ट में उन लोगों की तुलना में अधिक है पर पहुंच गया। मिलकर पूरे सेल biocatalysts के स्थिर प्रपत्र अच्छा परिचालन स्थिरता का प्रदर्शन किया, उपज लगातार फिर से उपयोग के 7 चक्र के बाद पहले चक्र में प्राप्त की 65% को बनाए रखने, जबकि मुक्त सेल प्रणाली लगभग पूरी तरह से उत्प्रेरक गतिविधि खो दिया है। इसलिए, तरीकों यहां बताया दो रणनीतियों एल xylulose के औद्योगिक उत्पादन के साथ-साथ अन्य मूल्य वर्धित यौगिकों सामान्य में सहकारकों के उपयोग की आवश्यकता को बेहतर बनाने में मदद कर सकता है प्रदान करता है।

Introduction

3 - reductive पूरे सेल सूक्ष्मजीवों का उपयोग कर biotransformation व्यावसायिक और चिकित्सा के महत्वपूर्ण biomolecules 1 की केमो-enzymatic संश्लेषण के लिए एक व्यापक तरीका बन गया है। 7 - यह अलग एंजाइमों के इस्तेमाल को लेकर कई फायदे हैं, विशेष रूप से लागत गहन बहाव के शुद्धिकरण की प्रक्रिया के उन्मूलन और एक विस्तारित जीवन भर के 4 का प्रदर्शन प्रस्तुत करता है। Biocatalytic रास्ते जहां सहकारकों उत्पाद गठन के लिए आवश्यक हैं के लिए, पूरे सेल सिस्टम संभावित सस्ती इलेक्ट्रॉन दान सह substrates 5,8,9 के अलावा के माध्यम से सीटू सहायक कारक के उत्थान में प्रदान किया है। 13 - हालांकि, इस क्षमता प्रतिक्रियाओं है कि दुर्लभ या महंगा सह substrates 10 की एक stoichiometric एकाग्रता की आवश्यकता के लिए कम है। एक साथ पूरे कोशिकाओं के गरीब reusability के साथ, यह एक स्केलेबल और निरंतर उत्पादों होगा की स्थापना में बाधा उत्पन्नction प्रणाली। इन सहायक कारक पर निर्भर biotransformations के लिए पूरे सेल प्रणालियों के सामरिक संशोधनों के ऊपर उल्लिखित सीमाओं को पार करने के लिए आवश्यक हैं। विशेष रूप से, पूरे सेल biocatalysts कि मिलकर काम का संयोजन काफी उत्पादकता और harbored एंजाइमों 14 की स्थिरता को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। ये कारक है, जो अक्सर वाणिज्यिक रूप से व्यवहार्य उत्पादों का बड़े पैमाने पर उत्पादन को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, सह immobilizing biocatalytic रोगाणुओं 15 से आगे अनुकूलित किया जा सकता। हमने हाल ही में एक सरल और पुन: प्रयोज्य पूरे सेल biocatalytic प्रणाली है कि एल xylulose उत्पादन 16 के लिए दोनों सहायक कारक के उत्थान और biocatalyst स्थिरीकरण की अनुमति देता है विकसित किया है। इस अध्ययन में, इस प्रणाली में सुधार के लिए एक उदाहरण biotransformation उत्पादन उपज और biocatalyst reusability के लिए इन दो रणनीतियों को लागू करने की प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को वर्णन करने के रूप में उपयोग किया गया था।

एल xylulose एक सीएलए के अंतर्गत आता हैजैविक रूप से उपयोगी अणुओं के एसएस दुर्लभ शर्करा नाम दिया है। दुर्लभ शर्करा अद्वितीय monosaccharides या चीनी डेरिवेटिव है कि प्रकृति में बहुत कम ही होते हैं, लेकिन बायोएक्टिव अणुओं 17,18 में मान्यता तत्व के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे मिठास, कार्यात्मक खाद्य पदार्थों से संभावित चिकित्सा 19 से लेकर आवेदनों की एक किस्म है। एल xylulose कई α-glucosidases का एक संभावित अवरोध के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और भी हेपेटाइटिस या लीवर सिरोसिस 17,20 का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। पूरे सेल प्रणाली में एल xylulose को xylitol के उच्च दक्षता रूपांतरण Pantoea में पहले से सूचित कर दिया गया है 21,22, Alcaligenes सपा ananatis। 701B 23, बेसिलस पैलीडस Y25 24,25 और 26 कोलाई। में कोलाई, हालांकि, यह केवल कम (<67 मिमी) xylitol सांद्रता 26 का उपयोग कर 1 से अधिक एक प्रारंभिक xylitol एकाग्रता की क्षमता निरोधात्मक प्रभाव के कारण हासिल की थीXylitol-4-डिहाइड्रोजनेज गतिविधि 21,26 पर 00 मिमी। Xylulose और xylitol के बीच संतुलन thermodynamic जोरदार xylitol 25,27 के गठन के पक्ष में दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, xylulose उपज महंगा सहकारकों है कि सीटू सहायक कारक के उत्थान प्रणाली में एक के अभाव में आपूर्ति की जा की राशि तक सीमित है। साथ में, इन कारकों एल xylulose जैवसंश्लेषण के लिए स्थायी प्रणालियों में स्केलिंग के लिए क्षमता की सीमा।

इन सीमाओं को पार और एल xylulose biotransformation उपज में सुधार करने के लिए, सहायक कारक के उत्थान की रणनीति एक मिलकर पूरे सेल biocatalytic प्रणाली की स्थापना से पहले नियुक्त किया गया था। विशेष रूप से, एल Arabinitol 4-डिहाइड्रोजनेज (ईसी 1.1.1.12) Hypocrea jecorina से (HjLAD), एल arabinose कवक के catabolic मार्ग में एक एंजाइम, एल xylulose 28,29 में एल arabinitol के रूपांतरण को उत्प्रेरित करने के लिए चयनित किया गया था । कई biosynthetic एंजाइमों की तरह, एक प्रमुख limitatioHjLAD के एन कि यह इस रूपांतरण बाहर ले जाने के लिए महंगा निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड सहायक कारक (NAD +, NADH का ऑक्सीकरण फार्म) की एक stoichiometric राशि की आवश्यकता है। NADH oxidase स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस (SpNox) में पाया उच्च cofactor-उत्थान गतिविधि 30,31 प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। SpNox, की इस विशेषता का लाभ उठाते हुए कोलाई कोशिकाओं एल xylulose के उत्पादन के लिए HjLAD व्यक्त के साथ मिलकर कर रहे थे कोलाई कोशिकाओं NAD + के उत्थान के लिए SpNox व्यक्त एल xylulose उत्पादन चित्रा 1 ए में दिखाया गया मिलकर प्रतिक्रिया द्वारा दर्शाया बढ़ावा देने के लिए। इष्टतम स्थितियों और 150 मिमी एल arabinitol की एक प्रारंभिक एकाग्रता का उपयोग कर के तहत अधिक से अधिक एल xylulose उपज 96% तक पहुँच गया है, इस प्रणाली बहुत साहित्य रिपोर्ट में उन लोगों की तुलना में अधिक कुशल बनाने।

पूरे सेल स्थिरीकरण की रणनीति अगले नियुक्त किया गया था और आगे मिलकर biocatalyt के reusability को बढ़ाने के लिएआईसी प्रणाली। पूरे सेल स्थिरीकरण के लिए इस्तेमाल किया तरीकों सोखना / सहसंयोजक ठोस matrices, पार से जोड़ने / फंसाने और बहुलक नेटवर्क 32 में encapsulation को जोड़ने शामिल हैं। इन तरीकों के अलावा, सेल स्थिरीकरण के लिए सबसे उपयुक्त विधि कैल्शियम alginate मोती में encapsulation है। उनके हल्के जमाना गुण, अक्रिय जलीय मैट्रिक्स और उच्च porosity शारीरिक गुणों और समझाया बायोलॉजिकल 33 की कार्यक्षमता को बनाए रखने में मदद। इसलिए, मिलकर biocatalyst प्रणाली दोनों युक्त HjLAD या SpNox शरण कोलाई कोशिकाओं कैल्शियम alginate मोती में स्थिर था एल xylulose उत्पादन की कई चक्र सक्षम करने के लिए (चित्रा 2) व्याप्ति स्थिर biocatalyst प्रणाली अच्छी परिचालन स्थिरता का प्रदर्शन किया, पहले चक्र के रूपांतरण उपज का 65% बनाए रखने के 7 चक्र के बाद लगातार फिर से उपयोग करते हैं, जबकि मुक्त सेल प्रणाली लगभग पूरी तरह से अपनी उत्प्रेरक गतिविधि खो दिया है।

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Protocol

1. पूरे सेल biocatalysts तैयारी

नोट: पुनः संयोजक pET28a- SpNox 31 या pET28a- HjLAD 28 को शरण देने कोलाई कोशिकाओं इसके बाद के रूप में भेजा जाता है कोलाई SpNox और ई कोलाई HjLAD, क्रमशः।

  1. की एक भी कॉलोनी टीका लगाना Luria-Bertani (पौंड) मध्यम केनामाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक के 3 मिलीलीटर में कोली HjLAD और एक मशीन प्रकार के बरतन में सेते हे / एन सी 37, 250 rpm पर।
  2. 1 से संस्कृति पतला: 100 युक्त 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन और 37 सी सेते ताजा पौंड की 200 मिलीलीटर में, 250 आरपीएम आयुध डिपो तक 600 तक पहुँच जाता है ~ 0.6।
  3. संस्कृति के माध्यम से 0.1 मिमी isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़कर प्रेरित HjLAD प्रोटीन अभिव्यक्ति और 16 सी, 16 घंटे के लिए 180 rpm पर सेते हैं।
    1. वैकल्पिक रूप से, 25 सी, 200 आरपी पर प्रेरण प्रदर्शन6 घंटा यदि एल xylulose जैवसंश्लेषण (नीचे चरण 2) के लिए मीटर उसी दिन किया जाता है।
  4. फसल प्रेरित ई कोलाई HjLAD 4 सी पर 20 मिनट के लिए 3200 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 2 चरण के लिए सेल गोली संसाधित करने के लिए आगे बढ़ें।
  5. समानांतर में, प्रदर्शन कदम 1.1 - 1.4 के लिए कोलाई SpNox।

युग्मन द्वारा 2 के जैवसंश्लेषण एल xylulose कोलाई HjLAD और सहायक कारक के उत्थान के लिए कोलाई SpNox

  1. की सेल छर्रों Resuspend कोलाई HjLAD और ई कोलाई SpNox अलग से 5.0 ग्राम सूखी सेल वजन (gDCW) / एल के एक सेल घनत्व में 50 मिमी Tris एचसीएल बफर (पीएच 8.0) में।
    नोट: gDCW और ऑप्टिकल घनत्व 600 एनएम (600 आयुध डिपो) में मापा के बीच एक संबंध प्रयोग की सुविधा के लिए स्थापित किया जा सकता है। सूत्र में इस्तेमाल कियाइस प्रोटोकॉल है 1 gDCW / एल = 0.722 * 600 आयुध डिपो - 0,0965, जो अलग अलग स्पेक्ट्रोमीटर के बीच भिन्न हो सकते हैं।
  2. 5.0 gDCW / एल के 600 μl मिक्स कोलाई HjLAD, 5.0 gDCW / एल के 600 μl कोलाई SpNox, एक 14 मिलीलीटर में 20 मिमी NAD + 100 μl, और 2 एम एल arabinitol के 150 μl दौर नीचे ट्यूब और 50 मिमी Tris एचसीएल के 550 μl जोड़कर 2 मिलीलीटर की प्रतिक्रिया मात्रा लाने (8.0 पीएच) ।
    नोट: दो पूरे सेल biocatalysts राशि का अनुपात उत्पाद के biosynthesis में सुधार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वर्णित प्रणाली, के अनुपात के लिए कोलाई SpNox: ई कोलाई HjLAD = 1: 1 एल xylulose जैवसंश्लेषण (चित्रा 1 बी) के लिए इष्टतम होना पाया गया।
  3. 30 सी, 8 घंटे के लिए 200 rpm पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
  4. 4 सी पर centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला लीजिए, 3200 10 मिनट के एक के लिए XGएन डी के नीचे चरण 3 में वर्णित के रूप में एल xylulose उत्पादन यों लिए आगे बढ़ें।

3. एल xylulose मात्रा के लिए Colorimetric परख

  1. महाप्राण एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 2.4 कदम से एकत्र प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला के 100 μl।
  2. 1.5% सिस्टीन के 50 μl, 70% सल्फ्यूरिक एसिड के 900 μl, और 0.1% Carbazole इथेनॉल में भंग के 50 μl जोड़ें और inverting ट्यूब 3 बार से धीरे मिश्रण।
  3. 37 सी, 20 मिनट के लिए 200 rpm पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
  4. उपाय 560 एनएम (ए 560) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग पर प्रतिक्रिया मिश्रण के ऑप्टिकल absorbance।
    1. प्रतिक्रिया मिश्रण पतला है, तो एक 560 पढ़ने 1 से ऊपर है।

कैल्शियम Alginate मोती में संयोजक पूरे सेल उत्प्रेरक 4. स्थिरीकरण

  1. आसुत जल की 100 मिलीलीटर में 4 ग्राम सोडियम alginate भंग। एस जोड़कर alginate समाधान तैयारपानी के लिए घृणा alginate झुरमुटों के गठन से बचने के लिए। मिश्रण गर्मी अगर जरूरत है।
  2. 5.0 gDCW / एल के 600 μl जोड़े कोलाई HjLAD और 5.0 gDCW / एल के 600 μl में 1.2 मिलीलीटर 4% कोलाई SpNox alginate 4.1 चरण में तैयार किया है और बुलबुला गठन से बचने के लिए कोमल pipetting द्वारा कोशिकाओं और alginate मिश्रण।
  3. एक सिरिंज एक सुई का उपयोग करने में alginate / सेल निलंबन Aspirate और एक 0.3 एम कैल्शियम क्लोराइड में मिश्रण जोड़ने बूंद-वार (2 CaCl) निरंतर क्रियाशीलता के साथ एक 100 मिलीलीटर बीकर में समाधान।
    नोट: 2 CaCl alginate मनका गठन के लिए इस्तेमाल किया समाधान की मात्रा पर्याप्त होना चाहिए के लिए alginate बूंदों पूरी तरह से जलमग्न हो। इसके अतिरिक्त, सिरिंज सुई और कैल्शियम क्लोराइड समाधान की सतह के बीच की दूरी को समान रूप से गोलाकार मोतियों के गठन को सुनिश्चित करने के लिए एक इष्टतम सीमा के भीतर बनाए रखा जाना चाहिए। इष्टतम दूरी रेंज प्रयोग निर्धारित किया जा सकतासहयोगी और सुई के भीतरी व्यास पर निर्भर करता है। एक अनुमान के रूप में, ~ 15 ± 5 सेमी की दूरी 0.6 सेमी (भीतरी व्यास) सिरिंज सुई के लिए इष्टतम होना पाया गया।
  4. Crosslinking और जेल मोती गठन की अनुमति के लिए सरगर्मी के बिना आरटी पर 3 घंटा - 2 के लिए 2 CaCl समाधान में मोती छोड़ दें।
  5. ध्यान से एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2 CaCl समाधान गिरने से मोती परेशान बिना CaCl 2 समाधान छानना, और एक अन्य 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2 CaCl समाधान में शेष मोती हस्तांतरण।
  6. मोती 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 8.0) के 10 मिलीलीटर के साथ बफर अत्यधिक 2 CaCl और संयुक्त राष्ट्र समझाया कोशिकाओं को हटाने के लिए तीन बार धोएं।
    ध्यान दें: किसी भी कदम पर, ऐसा करने से उन्हें टूटना होगा के रूप में मोती अपकेंद्रित्र नहीं है। 5 मिनट - समाधान से मोतियों को अलग करने के लिए, निलंबन 3 के लिए अबाधित खड़ा करने के लिए अनुमति देते हैं। मोती तल पर आदी हो जाएगा और धोने बफर निथर जा सकती हैएक और कंटेनर में।
    1. इस्तेमाल किया धोने बफर नहीं छोड़ें। 4.5 कदम से एकत्र खेतों में 2 CaCl समाधान के साथ प्रयोग किया Tris एचसीएल धोने बफर (30 मिलीलीटर) पूल।
  7. गोली संयुक्त राष्ट्र के स्थिर ई कोलाई कोशिकाओं जमा 2 CaCl और Tris एचसीएल समाधान के centrifugation द्वारा 20 मिनट के लिए 3200 XG पर 4.6 कदम से एकत्र की। स्थिरीकरण क्षमता का निर्धारण करने के लिए, gDCW / एल में pelleted संयुक्त राष्ट्र के समझाया कोशिकाओं का घनत्व 2.1 चरण में वर्णित के रूप में गणना।
  8. एक ट्यूब में 4.6 कदम से धोया मोती स्थानांतरण। सेल छर्रों के स्थान पर धोया मोती के सभी का उपयोग एल xylulose जैवसंश्लेषण का मूल्यांकन करने के लिए 3.4 - 2.2 कदम का पालन करें।

एल xylulose उत्पादन के लिए स्थिर biocatalysts की 5. स्थिरता परख

  1. कदम 4.8 से मोती लीजिए और (4.6 कदम में वर्णित) centrifugation के बिना 50 मिमी Tris एचसीएल (8.0 पीएच) बफर के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने।
  2. सभी का उपयोग करेंधोया मोतियों की प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने के लिए कदम 2.2 में वर्णित के रूप में - 3.4।
  3. दोहराएँ 5.1 कदम - 5.2 उत्पादन चक्र की वांछित संख्या के लिए और एल xylulose प्रत्येक चक्र में प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला में उत्पादन की मात्रा को मापने।

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Representative Results

सहायक कारक के उत्थान सक्षम करने के लिए, एल xylulose संश्लेषण एक मिलकर पूरे सेल biocatalytic युक्त सिस्टम में बाहर किया गया था कोलाई HjLAD और ई कोलाई SpNox कोशिकाओं। विभिन्न मानकों के अनुकूलन के बाद, इस प्रणाली के reusability कैल्शियम alginate मोती में यह immobilizing (चित्रा 2) से सुधार हुआ है।

सहायक कारक के उत्थान युग्मन के साथ एल xylulose उत्पादन कोलाई HjLAD और ई कोलाई SpNox कोशिकाओं।
एल xylulose में एल arabinitol की bioconversion बढ़ाने के लिए, ई कोलाई HjLAD और ई कोलाई SpNox कोशिकाओं को सक्षम करने के लिए मिलकर कर रहे थेसहायक कारक के उत्थान। में प्रोटीन अभिव्यक्ति और सहायक कारक उपलब्धता में अंतर के लिए खाते में करने के लिए कोलाई SpNox और ई कोलाई HjLAD कोशिकाओं, विभिन्न एल-xylulose उपज की तुलना अध्ययन कोलाई SpNox -to- ई कोलाई HjLAD अनुपात में प्रदर्शन किया गया था। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 बी, उपज के रूप में वृद्धि कोलाई SpNox -to- ई कोलाई HjLAD अनुपात 0.13 से बढ़ाकर: 1 1: 1। पैदावार अनुपात में 1 के लिए प्राप्त किया: 1 और 1.33: 1 के बराबर है और इस मिलकर प्रणाली के लिए अधिक से अधिक थे। सभी आगे के प्रयोगों के साथ प्रदर्शन किया गया कोलाई SpNox -to- 1 के कोलाई HjLAD अनुपात: 1। 150 मिमी एल arabinitol की एक प्रारंभिक एकाग्रता, के उपयोग के साथ शुरू कोलाई HjLAD biocatalyst अकेले 8 घंटा (संतृप्ति बिंदु के बाद 118 मिमी एल xylulose का उत्पादनएल xylulose एकाग्रता), 79% (चित्रा 1 सी) की एक उपज का प्रतिनिधित्व करने के लिए। इसकी तुलना में, का उपयोग कोलाई HjLAD और एक 1 पर कोलाई SpNox कोशिकाओं: 1 के अनुपात में 144 मिमी एल xylulose का उत्पादन 96% तक उपज में सुधार।

पूरे सेल biocatalyst स्थिरीकरण के अनुकूलन
कैल्शियम alginate मोती में biocatalysts का स्थिरीकरण हल्के जेल वातावरण है कि एक बायोरिएक्टर में शारीरिक तनाव से कोशिकाओं की रक्षा का एक परिणाम के रूप में, इस तरह के सुधार व्यवहार्यता के रूप में कई लाभ प्रदान करता है। इन alginate मोतियों के गुणों को काफी हद तक तैयार करने और प्रसंस्करण मानकों 34 से निर्धारित होता है। मिलकर पूरे सेल ऊपर वर्णित biocatalyst की एक स्थिर रूप से एल xylulose के उत्पादन उपज का अनुकूलन करने के लिए, दो मुख्य मापदंडों, अर्थात् सोडियम alginate एकाग्रता और 2 CaCl एकाग्रता, का मूल्यांकन किया गया। य़े हैंमुख्य मापदंडों है कि ईमानदारी और कैल्शियम alginate मोती, जो बदले में biocatalyst स्थिरीकरण दक्षता और आणविक प्रसार को प्रभावित की कठोरता का निर्धारण।

जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 3 ए, biocatalyst स्थिरीकरण दक्षता 1 की श्रेणी में सोडियम alginate एकाग्रता में वृद्धि के साथ एक बढ़ती हुई प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया - 3% (डब्ल्यू / वी)। सोडियम alginate स्थिरीकरण मैट्रिक्स में इस्तेमाल एकाग्रता 1% से कम था, जिसके परिणामस्वरूप मोती कम यांत्रिक स्थिरता की वजह से कमजोर और आसानी से टूट गए थे, आसपास के 2 CaCl समाधान में कोशिकाओं के सबसे रिहा (डेटा) नहीं दिखाया। 2% से अधिक करने के लिए सोडियम alginate एकाग्रता में वृद्धि करने पर, जिसके परिणामस्वरूप मोती आणविक प्रसार 35 (चित्रा 4) में समस्याओं के लिए जरूरत से ज्यादा अग्रणी कठोर। 2 CaCl एकाग्रता झुकेंगे परिवर्तनीय biocatalyst immobilizat में एक इसी तरह की प्रवृत्तिआयन दक्षता। सोडियम alginate की एक निश्चित एकाग्रता के लिए (2% w / v) और 0.1 की रेंज में - 0.4 एम 2 CaCl, कम 2 CaCl सांद्रता में हुई मोतियों की कठोरता में कमी आई है और वृद्धि की कोशिकाओं के रिसाव से आसपास के समाधान में। इस alginate बहुलक श्रृंखला 36 (चित्रा 3 बी) पर guluronate ब्लॉकों पार से जोड़ने के लिए सीए 2 आयनों की सीमित उपलब्धता के कारण है। हालांकि, 0.3 एम 0.4 एम से 2 CaCl एकाग्रता बढ़ाने biocatalyst स्थिरीकरण दक्षता केवल मामूली सुधार हुआ है। उच्च स्थिरीकरण दक्षता (> 90%) के कारण, 2 CaCl सांद्रता परे 0.4 मीटर मूल्यांकन नहीं किया गया। जब कम से कम 0.1 एम के 2 CaCl सांद्रता इस्तेमाल किया गया, सोडियम alginate biocatalyst युक्त छोटी बूंद 2 CaCl समाधान में अलग हो गया और कोई गोलाकार मोतियों का गठन किया गया (डेटा) नहीं दिखाया।

अधिकतम करने के लिएकाफी कैल्शियम alginate मोती में आणविक प्रसार, सोडियम alginate और 2 CaCl एकाग्रता धीमा के बिना biocatalyst स्थिरीकरण दक्षता अगले एल xylulose उत्पादन में सुधार के लिए अनुकूलित किया गया। (- 3% w / v सोडियम alginate और 0.1 - 0.4 मीटर 2 CaCl 1), 2% की एक इष्टतम सोडियम alginate एकाग्रता एल xylulose उत्पादन के लिए अधिक से अधिक उपज प्राप्त करने के लिए मनाया गया (चित्रा -4 ए स्थिरीकरण दक्षता के लिए के रूप में ही एकाग्रता रेंज का उपयोग )। इस इष्टतम एकाग्रता के अलावा, उपज में कमी की प्रवृत्ति देखी गई। यह उम्मीद की गई थी, प्रसार में मुद्दों कैल्शियम alginate मोतियों की अत्यधिक कठोरता के साथ जुड़े होने के कारण। इसी तरह, इष्टतम 2 CaCl एकाग्रता 0.3 एम (चित्रा 4 बी) होना पाया गया। चित्रा 3, इष्टतम सोडियम alginate एकाग्रता (2%) और 2 CaCl एकाग्रता (0.3 एम) उस के साथ मोती के गठन की अनुमति दी में दिखाया गया डेटा के साथ संयुक्तउपयुक्त कठोरता और पारगम्यता स्थापित किया गया था, कम से कम सेल रिसाव और अधिक से अधिक एल xylulose उत्पादन उपज सक्षम करने से।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक और पहलू स्थिर biocatalyst के समग्र उत्प्रेरक क्षमता को प्रभावित करता है कि समझाया सेल संस्कृति का वजन है। एक इष्टतम inoculum वजन, जिसके आगे यह एक कम प्रवृत्ति 37 से पता चलता अप करने के लिए सेल inoculum में वृद्धि के साथ उत्प्रेरक क्षमता बढ़ जाती है। इस कमी के लिए एक संभावित व्याख्या यह सेलुलर भीड़भाड़, जो कैल्शियम alginate मोती भर आणविक प्रसार में अवरोध उत्पन्न होता है और इस प्रणाली का उत्प्रेरक क्षमता कम हो जाती है। ऊपर अनुकूलित स्थिरीकरण हालत का प्रयोग, उच्चतम एल xylulose उत्पादन 3.75 की एक सेल लोड हो रहा है (gDCW) के साथ प्राप्त किया गया था / एल 16 (डेटा) नहीं दिखाया।

के लिए स्थिर और फ्री पूरे सेल biocatalysts के reusabilityएल xylulose उत्पादन।
1 ई: 1 की स्थापना की हालत अनुकूलित का प्रयोग कोलाई SpNox करने के लिए कोलाई HjLAD अनुपात, 2% (w / v) सोडियम alginate, और 0.3 एम 2 CaCl, स्थिर मिलकर पूरे सेल biocatalyst उत्पादन 64% की एक अधिकतम एल xylulose उपज, मुक्त करने के लिए 96% का एक बहुत उच्च उपज की तुलना मिलकर पूरे सेल प्रणाली (चित्रा 5 का चक्र 1)। ध्यान दें कि स्थिर की उपज कोलाई HjLAD सेल अकेले केवल 32.5% थी (नहीं दिखाया डेटा), स्थिर मिलकर प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से मुक्त एकल biocatalyst प्रणाली (79%, चित्रा 1 सी) की तुलना में कम है। इस कमी के रूप में स्थिरीकरण biocatalysts की गतिविधि, संभवतः प्रसार सीमाओं सब्सट्रेट करने के कारण कम करने के लिए जाना जाता है, लेकिन स्थिरीकरण पर एक biocatalyst के सुधार reusability का लाभ द्वारा मुआवजा दिया गया था उम्मीद थी। biocatalyst की स्थिरता पर यह प्रभाव हैएल xylulose उपज को बार-बार एक बैच प्रतिक्रिया प्रक्रिया करने के लिए स्वतंत्र और स्थिर सिस्टम subjecting पर मनाया में कम प्रवृत्ति, चित्रा 5 में दिखाया द्वारा प्रदर्शन किया। मुक्त प्रणाली के लिए उपज स्थिर प्रणाली की तुलना में एक बहुत steeper गिरावट दर्ज की गई, एक संकेत है मुक्त प्रणाली में एंजाइम गतिविधि के और अधिक तेजी से नुकसान। नतीजतन, दोनों प्रणालियों लगातार फिर से उपयोग के 7 चक्र के अंत में उत्पादन चक्र 2. के लिए एक तुलनीय एल xylulose उपज था, समझाया biocatalysts अपनी स्थिरता को बनाए रखा है और मूल उपज का 65% को बरकरार रखा है, जबकि मुक्त पूरे सेल प्रणाली एल xylulose उत्पादन करने की क्षमता के कम से कम 10% बनाए रखा। यह दर्शाता है कि स्थिर biocatalysts प्रभावी रूप से एल xylulose के उत्पादन के लिए और कहा कि पुन: उपयोग किया जा सकता है सुधार reusability और स्थिरता के लाभ के स्थिरीकरण के द्वारा लाया दूर biocatalyst की गतिविधि में कमी outweighs, अधिक उत्पादन की प्रक्रिया के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदानएक नि: शुल्क पूरे सेल प्रणाली।

आकृति 1
एल xylulose की Biocatalytic उत्पादन के लिए चित्रा 1. मिलकर पूरे सेल प्रणाली। (ए) योजनाबद्ध सहायक कारक के उत्थान प्रतिक्रिया एक मिलकर पूरे सेल जिसमें प्रणाली में होने वाली illustrating कोलाई कोशिकाओं क्रमश HjLAD या SpNox शरण। (बी) के अलग-अलग के साथ एल xylulose की उपज में रूपांतर कोलाई SpNox करने के लिए कोलाई HjLAD अनुपात। (सी) एल xylulose एक पूरे सेल biocatalyst से उपज केवल के शामिल कोलाई HjLAD एक मिलकर पूरे सेल के शामिल प्रणाली की तुलना कोलाई HjLAD और ई कोलाई SpNox कोशिकाओं सहायक कारक के उत्थान के लिए सक्षम। औसत और स्टेशन दिखाए गए भूखंडों का प्रतिनिधित्वतीन स्वतंत्र प्रयोगों के ndard विचलन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Alginate मोती में एन्कैप्सुलेशन के माध्यम से पूरे सेल biocatalysts का स्थिरीकरण। योजनाबद्ध कैल्शियम क्लोराइड का एक समाधान करने के लिए सोडियम alginate-सेल निलंबन के dropwise अलावा द्वारा समान रूप से आकार सीए 2 alginate मोतियों के गठन का प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पैरामीटर्स के स्थिरीकरण की क्षमता को प्रभावित Alginate मोती में पूरे सेल biocatalyst। (ए) सोडियम alginate के एक समारोह के रूप में स्थिरीकरण दक्षता (% w / v) (बी) 2 CaCl (एम) एकाग्रता। दिखाए गए भूखंडों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत और मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 (ए) सोडियम alginate के एक समारोह के रूप में Immobilized मिलकर पूरे सेल biocatalyst से एल xylulose की उपज के मूल्यांकन (% w / v) (बी) 2 CaCl (एम) एकाग्रता। दिखाए गए भूखंडों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते।दुबला "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. biocatalyst Reusability। स्थिर और मुक्त मिलकर पूरे सेल biocatalyst का पुन: उपयोग के 7 लगातार चक्र के लिए एल xylulose उत्पादन की उपज का आकलन क्रमश: अंधेरे और हल्के भूरे रंग में दिखाया गया है। साजिश दिखाए तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हाल ही में तकनीकी प्रगति पुनः संयोजक biotherapeutics के व्यावसायीकरण में वृद्धि के लिए सक्षम है, जैव प्रौद्योगिकी उद्योग में उनके बाजार मूल्य में एक क्रमिक वृद्धि हो जाती है। ऐसा ही एक उन्नति पुनः संयोजक सूक्ष्मजीवों में चयापचय इंजीनियरिंग, जो स्केलेबल औद्योगिक सिस्टम 38 स्थापित करने में एक महान वादा दिखाया है का आगमन होता है। सबसे प्रक्रियाओं के साथ के रूप में, पुनः संयोजक अनुवांशिक इंजीनियर रोगाणुओं द्वारा उत्पादित biomolecules के सफल व्यावसायीकरण प्रणाली 39 के उत्पादन उपज पर निर्भर है। यह "जानवर बल" आनुवंशिकी 39, जहां biocatalytic एंजाइमों का निर्देश दिया विकास biocatalyst गतिविधि 3 में सुधार करने के क्रम में लागू किया गया है के तेजी से विकास के लिए प्रेरित किया। हालांकि, इस तरह redox रास्ते के रूप में कुछ चयापचय मार्ग, के लिए, मात्र biocatalyst सुधार नहीं पर्याप्त अन्य संगठनों की महत्वपूर्ण प्रभाव के कारण उत्पादन की किफायत को प्रभावित करने के लिए हैऐसे महंगे सहकारकों के रूप में ईआर आवश्यक प्रतिक्रिया आवश्यकताओं,। बड़े पैमाने अप एक ऐसी प्रणाली की, यहां तक ​​कि सुधार biocatalysts के साथ, केवल उत्पादन लागत में वृद्धि करने के लिए काम करेगा। इस प्रकार, अतिरिक्त सामरिक तरीकों सहकारकों की stoichiometric अनुपात शामिल bioreactions के व्यावसायीकरण के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, एक biocatalyst की recyclability भी एक बायोप्रोसैस की आर्थिक व्यवहार्यता में सुधार के लिए आवश्यक है। तेजी से cofactor की खपत और पूरे सेल biocatalysts के गरीब reusability के सीमित प्रभाव पर काबू पाने के लिए, हम पहले एक स्थिर, मिलकर पूरे सेल biocatalytic सहायक कारक के उत्थान और स्थिर पुनः उपयोग के लिए 16 प्रणाली विकसित की है। वर्तमान अध्ययन में वर्णित प्रयोगात्मक जोड़े को और बेहतर biotransformation उपज और reusability के लिए दो पूरे सेल biocatalysts, प्रतिनिधि परिणामों के साथ सह-स्थिर करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं हैं।

एक महत्वपूर्ण कारक पूरे सेल biocat युग्मन के लिए विचार कियाalysts की स्थिति प्रोटीन प्रेरण और biocatalytic उत्पाद गठन के लिए स्थापित प्रणाली के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए एक से अधिक सटीक नियंत्रण के रखरखाव है। प्रेरण 600 आयुध डिपो, प्रेरण समय, और IPTG एकाग्रता जैसे मानकों में बदलाव बैच को बैच भिन्नता को कम करने से परहेज किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, सेल करने वाली सेल अनुपात के पुन: मूल्यांकन अलग biotransformations के लिए आवश्यक है। नोट है कि कोलाई HjLAD: 1 के कोलाई SpNox: 1 के अनुपात में इस अध्ययन की रिपोर्ट में सैद्धांतिक stoichiometric अनुपात प्रयोगात्मक अनुकूलन के बजाय द्वारा निर्धारित किया गया था। कैल्शियम alginate मोती में पुनः संयोजक पूरे सेल biocatalysts के स्थिरीकरण के लिए, वहाँ मनका कठोरता और कोशिकाओं के वितरण के संबंध में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, alginate समाधान पानी में धीरे-धीरे उनका कहना है सोडियम alginate द्वारा तैयार किया जाना चाहिए, और इसके विपरीत नहीं clumping कि सह रोकने के लिएuld स्थानीय alginate एकाग्रता और इस प्रकार पार से जोड़ने की हद तक प्रभावित करते हैं। दूसरे, कोमल pipetting जब सेल alginate निलंबन हवा के बुलबुले, जो समझाया कोशिकाओं पर कतरनी तनाव दण्ड के गठन से बचने के लिए से निपटने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए, कुशल बड़े पैमाने पर स्थानांतरण में बाधा और यहां तक ​​कि मोती फ्लोट करने के लिए पैदा कर सकता है। मामले में हवा के बुलबुले निलंबन में पेश कर रहे हैं, सेल alginate निलंबन 20 के लिए अबाधित खड़े करने की अनुमति - 30 मिनट के बुलबुले से बचने के लिए करते हैं। तीसरा, जब मोती बनाने, सेल alginate निलंबन धीरे धीरे और सावधानी से एक बूंद-वार ढंग से समान आकार और आकृति विज्ञान के लिए कैल्शियम क्लोराइड समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए। कैल्शियम क्लोराइड में अधूरे जलमग्न मोती एक अनियमित आकार और गरीब कठोरता है कि सेल रिसाव के लिए योगदान कर सकते हैं होगा। अन्त में, अवशिष्ट धो बफर से प्रतिक्रिया मात्रा में परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, चरण 4.8 में मोती हल्के से फिल्टर पेपर के साथ मिट जा सकता है (हवा सूखी नहीं)।

ई युग्मन के एक अलग रणनीति को रोजगार कोलाई SpNox और ई कोलाई HjLAD सेल संस्कृतियों, दो एंजाइमों के बीच एक वांछित अनुपात को बनाए रखने में एक बेहतर नियंत्रण की पेशकश की। इसके अतिरिक्त, एक प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं उन सह व्यक्त कई प्रोटीन, जो कम प्रोटीन misfolding और बढ़ प्रोटीन अभिव्यक्ति 40,41 करने के लिए ले जा सकता है की तुलना में कम तनाव के अधीन हैं। इस प्रकार, प्रत्यक्ष पूरे सेल युग्मन काफी उत्पाद उपज समझौता किए बिना बहु एंजाइम उत्प्रेरक प्रक्रियाओं मध्यस्थता करने की क्षमता प्रस्तुत करता है। ऐसे राइबोसोम बाध्यकारी साइटों 44 नियुक्त किया जा सकता है ताकत 42,43 और सुधार के साथ अलग जीवाणु प्रमोटरों का चयन सावधानी के रूप में हालांकि, की स्थापना की रणनीतियोंडी सह संस्कृति या सह अभिव्यक्ति प्रणालियों में लक्ष्य एंजाइमों के अनुपात पर सीमित नियंत्रण कम करने के लिए। कई स्थिरीकरण तकनीक के अलावा, इस तरह के encapsulation के पार से जोड़ने और सोखना के रूप में वैकल्पिक तरीकों, जो शुद्ध एंजाइमों के लिए अधिक अनुकूल हैं भर में पूरे सेल biocatalysts immobilizing के लिए कई फायदे प्रस्तुत करता है। कोशिकाओं के encapsulation भी अग्रवाल, chitosan, मसूड़ों, carrageenan, जिलेटिन की तरह biomaterials की एक किस्म में प्रदर्शन किया जा सकता है और biocatalysts के reusability में सुधार के लिए 45 alginate। हालांकि, कैल्शियम alginate encapsulation स्थिरीकरण दक्षता और बायोमोलिक्यूल उत्पादन 46,47 के संबंध में सबसे प्रभावी तरीका होना दिखाया गया है।

बैक्टीरियल पूरे सेल biocatalysts के उपयोग से एक प्रमुख सीमा जंगली प्रकार के में heterologous प्रोटीन के बाद translational संशोधन के लिए कम से कम क्षमता है कोलाई 48। यह w यूकेरियोटिक biocatalysts के सफल प्रयोग प्रतिबंधितइस प्रणाली Ithin। इस सीमा को पार करने के लिए एक विकल्प है कि बेहतर यूकेरियोटिक पोस्ट translational मशीनरी से लैस हैं ऐसे खमीर के रूप में जीवों का उपयोग हो सकता है। वर्णित प्रणाली की एक और सीमा सुधार reusability के लिए स्थिरीकरण के उपयोग से संबंधित है। 51 - स्थिरीकरण एक आम लागत प्रभावी biocatalysts के गरीब स्थिरता प्रतिक्रिया और बायोप्रोसैस को सरल बनाने के 49 से उनके कारोबार की दर में सुधार करने के लिए कार्यरत रणनीति है। मुख्य मापदंडों कि समझाया पूरे सेल biocatalysts का उत्प्रेरक प्रदर्शन को प्रभावित सोडियम alginate एकाग्रता, 2 CaCl एकाग्रता, सेल लोड हो रहा है और मनका आकार शामिल हैं। यह समझते हैं कि इन मानकों को एक दूसरे से स्वतंत्र नहीं हैं महत्वपूर्ण है। जैसे, एक अध्ययन के भीतर सभी कारकों में से एक व्यापक विश्लेषण, बहुत समय लेने वाली है, इस प्रकार यह अनुकूलन के लिए सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों का चयन करने के लिए आवश्यक है। मूल्यांकन और यहाँ प्रस्तुत की इफेक्ट होते हैंदो मापदंडों, सोडियम alginate और 2 CaCl एकाग्रता। हालांकि यहां विस्तार से चर्चा नहीं है, हम पहले से सेल लोडिंग के अनुकूलन प्रदर्शन किया है, 16 से स्थिर कोशिकाओं के वजन पर उपज की निर्भरता की तुलना। साहित्य में रिपोर्ट मनका आकार की है कि बदलाव का संकेत भी बदल परिवहन गुणों के कारण एंजाइम encapsulation बढ़ रही है, स्थिर प्रणाली की वृद्धि की सतह क्षेत्र के माध्यम से गतिविधि में सुधार के द्वारा या substrates और उत्पादों के प्रसार बदलकर उत्पादन उपज मिलाना सकता है। विचाराधीन biocatalytic प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करता है, वैकल्पिक महत्वपूर्ण कारकों में से चयन की आवश्यकता हो सकती है, जो इष्टतम स्थितियों का एक अलग सेट की पीढ़ी के लिए ले जा सकता है। अतिरिक्त पैरामीटर के लिए इष्टतम स्थितियों की स्थापना के लिए एक विस्तृत अध्ययन मिलकर पूरे सेल प्रणाली के प्रदर्शन में और सुधार की गुंजाइश है।

सारांश में, हम प्रयोगात्मक implemen रिपोर्टएक मिलकर पूरे सेल biocatalytic प्रणाली कैल्शियम alginate मोती में स्थिर, एल xylulose के बेहतर उत्पादन illustrating के tation। अलग पुनः संयोजक एंजाइमों कि अन्य सहायक कारक निर्भर biocatalytic रास्ते, कई जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं की उच्च पैदावार की सुविधा व्यक्त करने से यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रणाली उत्पादों 52 और इस तरह के जैव रासायनिक ऑक्सीजन की मांग 53 के लिए माइक्रोबियल biosensors के रूप में biocatalytic उत्पादन के अलावा अन्य अनुप्रयोगों की एक पॉट बहु एंजाइम जैवसंश्लेषण के लिए दो से अधिक पुनः संयोजक biocatalysts को समायोजित करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। 56, जैव ईंधन के लिए 57 पूरे सेल bioprocessing, मिट्टी bioaugmentation 58 और धातु वसूली के लिए biomining द्वारा पौधों की वृद्धि को बढ़ावा देने के - इस प्रणाली के synergistic सुविधा का लाभ ले रहा है, सहजीवी माइक्रोबियल भागीदारी के encapsulation इस तरह के जैविक उपचार 54 के रूप में आवेदन की एक बहुत बड़ी संख्या के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 59

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Disclosures

लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की। कागज विस्तृत कार्यप्रणाली रिपोर्टिंग एक मिलकर पूरे सेल biocatalytic प्रणाली alginate मोती में स्थिर उत्पन्न करने के लिए करना है। वैज्ञानिक सस्ता माल पिछले एक अध्ययन 16 में सूचना दी गई है।

Acknowledgments

इस शोध कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) शिक्षा, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (एनआरएफ-2013R1A1A2012159 और एनआरएफ-2013R1A1A2007561), Konkuk विश्वविद्यालय के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित है, और केमिकल इंजीनियरिंग और MCubed विभाग के माध्यम से बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया मिशिगन विश्वविद्यालय में कार्यक्रम।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

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