補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

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Summary

提示例としてL-キシルロースの生産を使用して、補因子再生と改善された再利用のための共固定化全細胞生体触媒のためのプロトコルです。補因子再生の機能的相補酵素を表す2 大腸菌株を結合することによって達成されます。全細胞生体触媒の固定化は、カルシウムアルギネートビーズ中の細胞のカプセル化により達成されます。

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Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

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Abstract

我々は最近改善された生産収量と持続的な合成のための補因子再生と生体触媒の固定化の機能を備えた、シンプルな再利用可能と連結された全細胞生体触媒システムを開発しました。本明細書に記載さ2 E.から成るこのようなシステムの開発のための実験手順であります機能的に相補的な酵素を発現する大腸菌株 。一緒に、これらの二つの酵素はバイオ反応の生成物の収率を改善するため、高価な補因子の再生を仲介する協同機能することができます。また、アルギン酸カルシウムビーズ中の全細胞のカプセル化によって結合された生体触媒システムの固定化形態を合成する方法が報告されています。一例として、我々は、Eが結合することによって、L-アラビニトールからLキシルロースの改良された生合成を提示します大腸菌細胞が酵素のL-アラビニトール脱水素酵素やNADHオキシダーゼを発現しています。最適条件下で、150の初期濃度を用いmMのL-アラビニトール、最大Lキシルロース収率は、文献に報告されたものよりも高い96%に達しました。結合した全細胞生体触媒の固定化された形態は、遊離細胞系がほぼ完全に触媒活性を失っている間、連続した再使用の7サイクル後の最初のサイクルで得られた収率の65%を維持し、良好な動作安定性を示しました。したがって、ここで報告された方法は、L-キシルロースの工業生産だけでなく、一般的には補因子の使用を必要とする他の付加価値化合物の改善に役立つ可能性が2つの戦略を提供します。

Introduction

3 -微生物を使用する還元全細胞生体内変化は、商業的および治療 ​​的に重要な生体分子1の化学酵素合成のための普及した方法となっています。 7 -それは孤立した酵素の使用に比べていくつかの利点、特にコストのかかる下流の精製工程の排除と長寿命4のデモを提示します。補因子は、生成物の形成に必要とされる生体触媒の経路のために、全細胞系は、安価な電子供与共基質5,8,9の添加によってその場での補因子再生提供する可能性を有します。 13 -しかし、この容量が希少または高価な補基質10の化学量論的濃度を必要とする反応のために減少します。一緒に細胞全体の貧しい再利用して、これはスケーラブルで連続のproduの確立を妨げますctionシステム。これらの補因子依存性生物変換のための全細胞システムの戦略的な改変は、前述の制限を克服するために必要とされます。具体的には、協働して動作する全細胞生体触媒の組み合わせは、有意に保有酵素14の生産性及び安定性を高めることが示されています。多くの場合、商業的に実行可能な製品の大量生産を可能にするために重要であり、これらの因子は、共固定化生体触媒微生物15によってさらに最適化することができます。我々は最近、L-キシルロース生産の16のための補因子再生と生体触媒の固定化の両方を可能にする、シンプルで再利用可能な全細胞生体触媒システムを開発しました。この研究では、このシステムは、改善された生体内変換歩留まりと生体触媒の再利用のために、これら2つの戦略を適用する実験手順を説明するための例として使用しました。

L-キシルロースは、CLAに属し生物学的に有用な分子のssは希少糖と命名します。希少糖は、自然の中で非常にまれにしか発生しないユニークな単糖類または糖誘導体であるが、生物活性分子17,18における認識要素として重要な役割を果たしています。彼らは、甘味料、機能性食品からの潜在的な治療薬19に至るまでのさまざまなアプリケーションを持っています。 Lキシルロースは、複数のαグルコシダーゼの潜在的な阻害剤として使用することができ、また、肝炎または肝硬変17,20の指標として用いることができます。全細胞系におけるLキシルロースをキシリトールの高効率変換をパントエアで以前に報告されているが21,22、 アルカリゲネス属 アナナティス 。 701B 23、 バチルス・淡蒼球 Y25 24,25および大腸菌(Escherichia coli)26。 E.大腸菌は、しかしながら、それは唯一の原因で1よりも初期のキシリトール濃度の潜在的阻害効果に低い(<67 mM)のキシリトール濃度26を使用して達成されましたキシリトール-4-デヒドロゲナーゼ活性21,26上の00 mMの。キシルロースおよびキシリトールの間の熱力学的平衡を強くキシリトール25,27の形成に有利に働くことが示されています。さらに、キシルロース収率は、 その場 補因子再生系の非存在下で供給されなければならない高価な補因子の量によって制限されます。一緒に、これらの要因は、L-キシルロース生合成のための持続可能なシステムにスケーリングするための可能性を制限します。

これらの制限を克服し、L-キシルロース生体内変換の収率を改善するために、補因子再生の戦略は、結合された全細胞生体触媒システムを確立することにより最初に使用しました。具体的には、 ハイポクレアジェコリーナ (HjLAD)、菌類のL-アラビノース異化経路中の酵素からのL-アラビニトール4-脱水素酵素(EC 1.1.1.12)は、L-キシルロース28,29にL-アラビニトールの変換を触媒するために選ばれました。多くの生合成酵素と同様に、主要なlimitatioHjLADのNは、この変換を実行するために高価なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補助因子(NAD +、NADHの酸化型)の化学量論量を必要とすることです。 化膿連鎖球菌 (SpNox)で見つかったNADHオキシダーゼは、高い補因子再生活性30,31を表示することが示されています。 SpNox、Eのこの属性を利用してLキシルロースの産生のためHjLADを発現する大腸菌細胞、Eに結合されました図1(a)に示す結合された反応によって示されるL-キシルロース生産を後押しするNAD +の再生のためにSpNoxを発現している大腸菌細胞。最適な条件と150 mMのL-アラビニトールの初期濃度を使用して下に、最大Lキシルロース収率は、このシステムは、はるかに効率的な文献に報告されたものよりも製造、96%に達しました。

全細胞固定化の戦略がさらに結合されたbiocatalytの再利用性を高めるために、次の使用しましたICシステム。全細胞固定化のために一般に使用される方法は、高分子ネットワーク32架橋/捕捉およびカプセル化を固体マトリックスにリンク吸着/共有結合が含まれます。これらのアプローチの中で、細胞の固定化のための最も適切な方法は、カルシウムアルギネートビーズ中のカプセル化です。その穏やかなゲル化特性、不活性水性マトリックスおよび高気孔率は、カプセル化された生物学的製剤33の生理学的特性と機能を維持するのに役立ちます。 E.両方を含むため、結合された生体触媒システム大腸菌 HjLADまたはSpNoxをL-キシルロース生産の複数のサイクルを有効にするには、アルギン酸カルシウムビーズに固定化した保有する細胞( 図2)【選択固定化生体触媒システムは、7サイクル後の最初のサイクルの変換収率の65%を維持し、良好な動作安定性を実証しました連続的な再使用、フリー電池システムは、ほぼ完全にその触媒活性を失っています。

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Protocol

1.全細胞生体触媒の調製

注:組換えE. pET28a- SpNox 31またはpET28a- HjLAD 28を保有する 大腸菌細胞を、以下、Eと呼ばれています大腸菌SpNoxE.大腸菌HjLAD、それぞれ。

  1. E.の単一コロニーを接種しますルリア-ベルターニ(LB)培地3ml中の大腸菌 HjLADはカナマイシン(50μg/ ml)を補充し、37°C ​​の 、250rpmでインキュベーターシェーカーO / Nでインキュベートします。
  2. 50μg/ mlのカナマイシンを含有する新鮮なLB 200ml中に100とOD 600が 〜0.6に達するまで37 O C、250rpmでインキュベートする:1により培養を希釈します。
  3. 培地に0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することによりHjLADタンパク質発現を誘導し、16 O C、16時間、180rpmでインキュベートします。
    1. また、25°Cの 、200 RPで誘導を行います6時間メートルL-キシルロース生合成(下記のステップ2)が同じ日に行われた場合。
  4. 誘導された大腸菌を収穫4 O℃で20分間、3200×gで遠心分離により大腸菌 HjLAD細胞上清を捨て、細胞ペレットを処理するために、ステップ2に進みます。
  5. E.のための1.4 -並行して、ステップ1.1を実行大腸菌 SpNox。

カップリングE.によるL-キシルロースの2生合成大腸菌 HjLADE.補因子再生のための大腸菌 SpNox

  1. 大腸菌の細胞ペレットを再懸濁大腸菌 HjLADE.コリ SpNox別々に50 mMトリス-塩酸緩衝液(pH 8.0)5.0 g乾燥細胞重量(gDCW)/ Lの細胞密度で。
    注:gDCWから600nm(OD 600)で測定した光学密度との相関関係は、実験を容易にするために確立することができます。において使用される式異なる分光計によって異なる場合があります0.0965、 -このプロトコルは、1 gDCW / L = 0.722 * OD 600です。
  2. 5.0 gDCW / L Eの600μLをミックス大腸菌 HjLAD、5.0 gDCW / L E.600μlコリ SpNox、20mMのNAD +を100μl、および14 mLの丸底チューブ内の2 MのL-アラビニトール150μlの50 mMトリス-塩酸(pH8.0)を550μlずつ添加することによって、2 mlまで反応容量をもたらします。
    注二つ全細胞生体触媒量の比は、生成物の生合成を改善するために最適化することができます。記載されているシステム、Eの比率のための大腸菌 SpNox:E.コリ HjLAD = 1:1のLキシルロース生合成( 図1B)のために最適であることが見出されました。
  3. 30 Oは C、8時間、200rpmで反応混合物をインキュベートします。
  4. 、4°Cので遠心分離後の上清を回収し3200×gで10分間aについてndは以下の手順3で説明したように、L-キシルロース生産を定量化するために進んでください。

L-キシルロース定量化のための3比色アッセイ

  1. 吸引し1.5mlチューブにステップ2.4​​から収集した反応上清100μl。
  2. エタノールに溶解し、1.5%のシステインを50μl、70%硫酸を900μlの、および0.1%のカルバゾールの50μlを添加し、チューブを3回転倒混和します。
  3. 37 O C、20分間200rpmで反応混合物をインキュベートします。
  4. 分光光度計を用いて560nm(560)で反応混合物の吸光度を測定します。
    1. A 560読み取り値が1を超える場合、反応混合物を希釈します。

アルギン酸カルシウムビーズにおける組換え全細胞触媒の4固定化

  1. 100mlの蒸留水に4gのアルギン酸ナトリウムを溶解します。 Sを加えることによりアルギン酸塩溶液を調製します塊の形成を回避するために水に憎悪アルギン酸。必要に応じて、混合液を加熱しました。
  2. 5.0 gDCW / L Eの600μLを追加大腸菌 HjLADおよび5.0 gDCW / L E.600μlの1.2ミリリットルの4%アルギン酸塩で大腸菌 SpNoxは、ステップ4.1で調製し、気泡の形成を避けるために、穏やかなピペッティングにより細胞およびアルギン酸塩を混ぜます。
  3. 連続的に攪拌しながら100ミリリットルのビーカー中(のCaCl 2)溶液を注射針を用いて注射器にアルギン酸/細胞懸濁液を吸引し、0.3 M塩化カルシウムに滴下混合物を追加します。
    注:アルギン酸塩の液滴が完全に水没するためのアルギン酸ビーズ形成のために使用される塩化カルシウム溶液の量が十分でなければなりません。また、注射針および塩化カルシウム溶液の表面との間の距離が均一に球状のビーズの形成を確実にするために最適な範囲内に維持されなければなりません。最適な距離範囲は、実験を決定することができます同盟国とは、針の内径に依存します。推定として、〜15±5cmの距離0.6 cmの(内径)注射針のために最適であることが見出されました。
  4. 架橋およびゲルビーズの形成を可能にするために撹拌することなく室温で3時間- 2のためのCaCl 2溶液中のビーズを残します。
  5. 慎重に50ミリリットルコニカルチューブに塩化カルシウム溶液を注ぐことにより、ビーズを乱すことなくのCaCl 2溶液をデカントし、そして別の50mlコニカルチューブに塩化カルシウム溶液中に残っているビーズを転送します。
  6. 過剰のCaCl 2および非カプセル化細胞を除去するために3回の緩衝液を50mMトリス-HCl(pH8.0)10mlでビーズを洗浄します。
    注意: 任意のステップで、それらを破裂するようにすることなどのビーズを遠心分離しません。 5分 - 溶液からビーズを分離するために、サスペンションは3静置することができます。ビーズを底部に沈降し、洗浄緩衝液をデカントすることができ別の容器に。
    1. 使用する洗浄緩衝液を廃棄しないでください。ステップ4.5から収集した使用済みのCaCl 2溶液で使用トリス塩酸洗浄緩衝液(30ミリリットル)をプールします。
  7. 非固定化されたE.ペレットプールされたのCaCl 2およびトリス塩酸溶液を遠心分離により大腸菌細胞を20分間3200×gでステップ4.6から収集しました。ステップ2.1で説明したように固定化効率を決定するために、gDCW / Lでペレット化し、非カプセル化された細胞の密度を計算します。
  8. チューブにステップ4.6から洗浄したビーズを転送します。手順2.2に従ってください - 3.4を細胞ペレットの代わりに、洗浄したビーズの全てを用いたL-キシルロース生合成を評価します。

L-キシルロース生産のための固定化生体触媒の5安定性アッセイ

  1. ステップ4.8からビーズを収集し、(ステップ4.6で説明したように)遠心分離することなく、50mMのトリス-HCl(pH8.0)緩衝液10mlで二回洗浄します。
  2. すべての使用3.4 - 工程2.2に記載のように洗浄したビーズの反応を実行します。
  3. 生産サイクルの所望の数の5.2と各サイクルにおける反応上清中に産生さL-キシルロースの量を測定する - 繰り返して、5.1を繰り返します。

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Representative Results

補因子再生を有効にするには、L-キシルロース合成はE.を含む結合された全細胞生体触媒システムで行いました大腸菌 HjLADE.コリ SpNox細胞 。様々なパラメータの最適化に続いて、このシステムの再利用は、アルギン酸カルシウムビーズ( 図2)の中に固定化することにより改善されました。

カップリング E. によって補因子再生を伴うL-キシルロース生産 大腸菌 HjLAD E.コリ SpNox 細胞
L-キシルロース、E.にL-アラビニトールの生物変換を高めるために、 大腸菌 HjLADE.大腸菌 SpNox細胞を有効にするために結合させました補因子再生。 大腸菌におけるタンパク質発現および補因子の可用性の違いを考慮するため大腸菌 SpNoxE.大腸菌 HjLAD細胞、様々な大腸菌のL-キシルロース収量の比較研究大腸菌 SpNox -to- E.コリ HjLAD比を行いました。 図1Bに示されるように、収率は、Eに増加しました大腸菌 SpNox -to- E. 1:1〜1: 大腸菌 HjLAD比が0.13から増加しました。比の場合に得られた収率は1:1と1.33:1がこの結合系の等価と最大でした。すべてのさらなる実験は、Eを用いて行きました大腸菌 SpNox -to- E. 1:1の大腸菌 HjLAD比。 150 mMのL-アラビニトールの初期濃度、Eの使用で始まります大腸菌 HjLAD生体触媒は単独で8時間(飽和点の後に118 mMのL-キシルロースを生産しましたLキシルロース濃度について)、79%( 図1C)の収率を示します。比較では、Eの使用大腸菌 HjLADE.コリ SpNox 1の細胞:1の比率は96%の収率を向上させる、144 mMのL-キシルロースを産生しました。

全細胞生体触媒の固定化の最適化
アルギン酸カルシウムビーズ中の生体触媒の固定化は、バイオリアクター内の物理的ストレスから細胞を保護する軽度のゲル環境の結果として、そのような改善された生存性など多くの利点を提供しています。これらのアルギン酸ビーズの特性は、主に、製剤と処理パラメータ34によって決定されます。上述の結合された全細胞生体触媒の固定化された形式で、L-キシルロースの生産収率を最適化するために、二つの主要なパラメータ、すなわちアルギン酸ナトリウムの濃度とのCaCl 2濃度を評価しました。これらは今度は生体触媒の固定化効率と分子拡散に影響を与えるアルギン酸カルシウムビーズの整合性と剛性を決定する主要なパラメータ。

図3Aに示すように、生体触媒固定化効率が1の範囲でアルギン酸ナトリウム濃度の増加に伴って増加する傾向を示した- 3%(W / V)。固定化マトリックスに使用されるアルギン酸ナトリウムの濃度が1%未満であった場合には、得られたビーズは、周囲のCaCl 2溶液中の細胞の大部分を放出し、低い機械的安定性に脆く、簡単に壊れていた(データは示さず)。 2より大きい重量%アルギン酸ナトリウムの濃度を増加すると、得られたビーズを、過剰の分子拡散の問題点35( 図4)に至る硬化しました。 CaCl 2濃度を変化させると、生体触媒でも同様の傾向が得られたimmobilizatイオン効率。アルギン酸ナトリウム(w / vの2%)の固定濃度および0.1〜 - 0.4 M CaCl 2を、下部のCaCl 2濃度は、ビーズの剛性が低下し、周囲の溶液中の細胞の漏出が増加をもたらしました。これは、アルギネートポリマー鎖36( 図3B)のグルロネートブロックを架橋するためのCa 2+イオンの限られた利用可能性です。しかし、0.4 M、0.3 MからのCaCl 2濃度を増加させるとわずか生体触媒の固定化効率を向上させます。高い固定化効率(> 90%)に、0.4 Mを超えたのCaCl 2濃度は評価しませんでした。 0.1未満Mの濃度のCaCl 2を使用した場合、生体触媒を含有するアルギン酸ナトリウム滴が塩化カルシウム溶液中に離れて落ち、全くの球状ビーズ(データは図示せず)を形成しませんでした。

最大にするために、有意アルギン酸カルシウムビーズの分子拡散、アルギン酸ナトリウムとのCaCl 2濃度を落とすことなく、生体触媒の固定化効率は次の改善された、L-キシルロース産生のために最適化しました。 ( - W 3%/ vのアルギン酸ナトリウムおよび0.1 - 、0.4MのCaCl 2 1)、2%の最適なアルギン酸ナトリウムの濃度は、L-キシルロース生産の最大収率を達成することが観察された( 図4(a)固定化効率と同じ濃度範囲を使用して)。この最適濃度を超えると、収率が減少する傾向を示しました。これは、アルギン酸カルシウムビーズの過度の剛性に関連した拡散における問題のために、予想されました。同様に、最適のCaCl 2濃度が0.3 M( 図4B)であることが見出されました。 図3に 、最適なアルギン酸ナトリウム濃度(2%)でビーズの形成を可能にしたのCaCl 2濃度(0.3 M)に示すデータと組み合わせ適切な剛性および透過性は、最小限の細胞の漏出および最大L-キシルロース生産歩留まりを可能に設立されました。

固定化生体触媒の全体的な触媒効率に影響を与える別の要因は、カプセル化された細胞培養物の重量であることに留意すべきです。それは減少傾向37を示し、これを超える最適な接種重量のために、細胞接種物を増加させると触媒効率が高くなります。この減少のための可能な説明は、アルギン酸カルシウムビーズを通して分子拡散を妨げ、システムの触媒効率を低下させる携帯過密、です。上記の最適化された固定化条件を使用して、最高のL-キシルロース生産は、3.75のセルの負荷(gDCW)で得られた/ L 16(データは示さず)。

以下のための固定化と自由ホールセル生体触媒の再利用L-キシルロース生産。
1 E.:1の確立された最適化された条件を使用して、 E大腸菌 SpNox コリ HjLAD率、2%(w / v)のアルギン酸ナトリウム、0.3 M CaCl 2を、固定化された結合された全細胞生体触媒出力無料で96%の非常に高い収量と比較して64%の最大Lキシルロース収率結合された全細胞系( 図5のサイクル1)。なお、固定化されたEの収量コリ HjLAD細胞は、単独で(データは示していない)、固定された結合されたシステムと同様に自由単一生体触媒系(79%、 図1C)のより低いのみ32.5%でした。この減少は、固定化は、生体触媒の活性が低下することが知られているように、拡散制限を基板に起因する可能性が、予想されたが、固定化の際に生体触媒の改良された再利用性の利点によって補償されました。生体触媒の安定性に対するこの効果はあります図5に示すバッチ反応プロセスに繰り返し自由で固定化されたシステムを施す上で観察されたL-キシルロース収率の減少傾向によって実証。無料システムの収率が示す、固定化されたシステムよりもはるかに急勾配の減少を示しました。フリー系における酵素活性のより迅速な喪失。その結果、両方のシステムが連続した再利用の7サイクルの終わりには、生産サイクル2で同等のL-キシルロース収率を持っていた、カプセル化された生体触媒は、その安定性を維持し、無料の全細胞つつ、オリジナルの収量の65%を保持していましたシステムは、L-キシルロースを産生するその能力の10%未満を保持しました。これは、固定化生体触媒は、L-キシルロースの生産のために有効に再利用することができることと改善された再利用性と安定性の利点は、以上の製造プロセスに重要な利点を付与する、はるかに生体触媒の活性の低下を上回る固定化によってもたらされたことを示しています無料の全細胞システム。

図1
L-キシルロースの生体触媒の製造のための1結合ホールセルシステムの図E.を含む結合された全細胞系で発生する補因子再生反応を示す(A)概略それぞれ、HjLADまたはSpNoxを保有する大腸菌細胞。異なるE.とL-キシルロースの収率で(B)バリエーションE大腸菌 SpNox 大腸菌 HjLAD比(C)のみE.からなる全細胞生体触媒からのL-キシルロース収率E.から成る結合された全細胞系のそれに比べて大腸菌 HjLAD 大腸菌 HjLADE.補因子再生可能な大腸菌 SpNox細胞 。示したプロットは、平均とSTAを表します3つの独立した実験のndard偏差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
アルギン酸ビーズでカプセル化を介して、全細胞生体触媒の図2.固定 。塩化カルシウムの溶液にアルギン酸ナトリウム-細胞懸濁液を滴下することにより、均一な大きさのCa 2+アルギン酸ビーズの形成を示す概略。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
の固定化の効率に影響を与える図3.パラメータアルギン酸ビーズ中の全細胞生体触媒。固定化効率(A)アルギン酸ナトリウム(%w / v)の(B)のCaCl 2(M)濃度の関数として。示したプロットは、3つの独立した実験の平均値と標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
(A)アルギン酸ナトリウムの関数として固定化結合全細胞生体触媒からのL-キシルロースの収量の、図4の評価 (B)のCaCl 2(M)濃度(W / V%)。示されたプロットは、3つの独立した実験の平均値および標準偏差を表します。痩せ細った ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
生体触媒再利用。固定化され、無料の結合された全細胞生体触媒の再利用の7連続サイクル用のL-キシルロース生産の歩留まりの図5.評価はそれぞれ、暗い部分と明るい灰色で示されています。示したプロットは、3つの独立した実験の平均値と標準偏差を表している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

最近の技術の進歩は、バイオテクノロジー産業における市場価値の緩やかな上昇をもたらし、組換え生物学的治療薬の商業化の急増を有効にしています。そのような進歩は、スケーラブルな産業システム38の確立に大きな期待を示している組換え微生物中で代謝工学の出現です。ほとんどのプロセスと同様に、遺伝子操作された微生物により産生された組換え生体分子の成功した商業化には ​​、システム39の製造歩留まりに大きく依存します。これは、生体触媒酵素の定方向進化は、生体触媒活性の3を改善するために実施されている「ブルートフォース」遺伝学39、の急速な発展につながっています。しかしながら、このような酸化還元経路のような特定の代謝経路のために、単なる生体触媒の改善はOTHの有意な効果により生産の経済化に影響を与えることは十分ではありません高価な補因子などの必須の反応要件、えー。このようなシステムのスケールアップは、さらに改善された生体触媒を用いて、唯一の製造コストを増大させるために役立ちます。このように、追加の戦略的な方法は、補因子の化学量論比を含む生物反応の実用化のために必要とされます。また、生体触媒のリサイクルはまた、バイオプロセスの経済性を向上させるために必要です。急速補因子の消費量および全細胞生体触媒の乏しい再利用の制限効果を克服するために、我々は以前に補因子再生と安定した再利用16ための固定化、結合された全細胞生体触媒システムを開発しました。本研究で説明した代表的な結果とともに、改善された生体内変換収率と再利用のための実験的なカップルに必要な手順と同時固定化2全細胞生体触媒です。

重要な要因は、全細胞biocatを結合するために考慮されますalystsシステムの再現性を保証するために、タンパク質誘導と生体触媒生成物の形成のために確立された条件の正確な制御を維持します。誘導OD 600のようなパラメータの変動、誘導時間、およびIPTG濃度がバッチ間変動を最小限にするために避けるべきです。また、細胞間の比率の再評価が異なる生体内変換のために必要とされます。 E.ことに注意してください大腸菌 HjLAD:E. 1の大腸菌 SpNox比 :この研究で報告された1は、実験的最適化ではなく、理論的な化学量論比により決定しました。アルギン酸カルシウムビーズにおける組み換え全細胞生体触媒の固定化のために、ビーズの剛性と細胞の分布に関して均一性を確保するには、いくつかの重要なステップがあります。まず、アルギン酸塩溶液をゆっくりと水にアルギン酸ナトリウムを添加することにより調製しなければならず、その逆共凝集を防止するため地元のアルギン酸塩濃度、したがって、架橋の程度に影響を与えるULD。第二に、穏やかにピペッティングは、カプセル化細胞にせん断応力を与える気泡の形成を回避するために、細胞 - アルギン酸塩の懸濁液を処理するときに、効率的な物質移動を妨げる採用すべきであるとさえビーズが浮くことがあります。気泡が脱出できるように30分 - 場合には気泡が細胞アルギン酸塩懸濁液は20のために邪魔されずに放置し、懸濁液に導入されています。ビーズを製造する際に第三に、細胞 - アルギン酸塩懸濁液を均一なサイズおよび形態のための塩化カルシウム溶液の十分なボリュームに滴下方法でゆっくりと慎重に追加する必要があります。塩化カルシウムに不完全に沈めビーズは、セル漏れに寄与することができる不規則な形状と貧しい剛性を持つことになります。最後に、残留洗浄バッファからの反応容積の変動を回避するために、ステップ4.8でビーズを軽くろ紙でブロットすることができます(空気乾燥しません)。

Eを結合する異なる戦略を採用します大腸菌 SpNoxE.コリ HjLAD細胞培養物は、二つの酵素の間の所望の比を維持する上でより良好な制御を提供します。さらに、単一のタンパク質を発現する細胞は、還元されたタンパク質のミスフォールディングおよび増大したタンパク質発現40,41につながる複数のタンパク質を同時発現するものよりもストレスを受けています。したがって、直接細胞全体の結合が有意に生成物の収率を損なうことなく、多酵素触媒プロセスを媒介する能力を示します。しかし、このような様々な強度42,43およびリボソーム結合部位44の改善と細菌プロモーターを慎重に選択するような確立された戦略はemployeすることができますdは共培養または共発現システムでの標的酵素の比の制御は制限付きで緩和します。多くの固定化技術の中で、カプセル化は、精製された酵素のための、より適しているような架橋および吸着などの代替の方法、上に全細胞生体触媒を固定化するための複数の利点を提供します。細胞のカプセル化はまた、生体触媒の再利用性を向上させるために、寒天、キトサン、ゴム、カラギーナン、ゼラチン、およびアルギン酸塩45のような生体材料の様々な行うことができます。しかしながら、アルギン酸カルシウム封入は、固定化効率及び生体分子生産46,47に対する最も効果的なアプローチであることが示されています。

細菌の全細胞生体触媒を利用しての1つの主要な制限は、野生型大腸菌における異種タンパク質の翻訳後修飾のための最小限の機能です大腸菌 48。これは、真核生物の生体触媒の使用の成功ワットを制限しますこのシステムをithin。この制限を克服するための代替手段は、より優れた真核生物の翻訳後の機構が装備されている酵母などの生物の使用である可能性があります。記載されたシステムの別の限界は、改善された再利用のための固定化の使用に関する。 51 -固定化は、生体触媒の低い安定性に対抗し、バイオプロセス49を簡略化することにより、その回転率を改善するために使用一般的な費用対効果の高い戦略です。カプセル化された全細胞生体触媒の触媒性能に影響を与える主なパラメータは、アルギン酸ナトリウムの濃度、のCaCl 2濃度、セル負荷およびビーズサイズが含まれます。これらのパラメータは、互いに独立していないことを認識することが重要です。このように、単一試験中のすべての要因の総合的な分析は非常に時間がかかり、従って、最適化のための最も重要なパラメータを選択する必要があります。評価され、ここで提示することの効果であります二つのパラメータ、アルギン酸ナトリウムとのCaCl 2濃度。ここでは詳細に議論されていないが、我々は以前に16を固定化された細胞の重量に収量の依存性を比較し、セル負荷の最適化を行いました。文献の報告はまた、改変された輸送特性に固定化されたシステムの表面積の増大を介して活性を向上させる、酵素カプセル化を増加させることによって、または基質および生成物の拡散を変更することにより、製造歩留まりを調節し得るビーズの大きさの変化を示しています。検討中の生体触媒反応に応じて、代替の重要な要素の選択は、最適な条件の異なるセットの発生につながる可能性があり、必要な場合があります。追加パラメータの最適条件の確立のための詳細な研究は、結合された全細胞システムの性能の更なる向上のためのスコープを提供します。

要約すると、我々は実験的implemenを報告しますL-キシルロースの改良された産生を示したアルギン酸カルシウムビーズに固定化された結合された全細胞生体触媒システムのテーション。他の補因子依存性の生体触媒経路を促進する別の組換え酵素を発現させることによって、多くの生物学的に関連する分子の高い収量は、ここで記述されたプロトコルを使用して得ることができます。また、このシステムは、製品52と、そのような生物化学的酸素要求量53のための微生物のバイオセンサーとしての生体触媒の生産以外のアプリケーションのワンポット多酵素生合成のためつ以上の組み換え生体触媒を収容するように拡張することができます。 56バイオ燃料57のための、全細胞バイオプロセス、金属回収のための土壌bioaugmentation 58とbiominingによる植物成長促進-このシステムの相乗的な特徴を利用して、共生微生物コンソーシアムのカプセル化は、バイオレメディエーション54のような無数の用途に使用することができます59

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Disclosures

著者には、競合する金融利益を宣言しません。論文は、アルギン酸ビーズに固定化された結合された全細胞生体触媒システムを生成するための詳細な方法論を報告することを目指しています。科学的なノベルティは以前の研究16に報告されています。

Acknowledgments

本研究は、文部科学省、科学技術(NRF-2013R1A1A2012159とNRF-2013R1A1A2007561)、建国大学、化学工学やMCubed省によって資金を供給、韓国の国立研究財団(NRF)を介して基礎科学研究開発プログラムによってサポートされていましたミシガン大学のプログラム。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

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