Immobilisation de Multi-biocatalyseurs dans des billes d'alginate pour cofacteur Régénération et amélioration de réutilisabilité

Chemistry

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Summary

Présenté est le protocole de biocatalyseurs de cellules entières co-immobilisant pour la régénération du cofacteur et l'amélioration de la réutilisabilité, en utilisant la production de L-xylulose à titre d'exemple. La régénération du cofacteur est réalisée par couplage de deux souches d' Escherichia coli exprimant des enzymes fonctionnellement complémentaires; l'immobilisation du biocatalyseur à cellules entières est obtenue par l'encapsulation des cellules dans des billes d'alginate de calcium.

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Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

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Abstract

Nous avons récemment développé un système de biocatalyseur à cellules entières simple, réutilisable et couplé à la capacité de régénération de cofacteur, et l'immobilisation de biocatalyseur pour un meilleur rendement de la production et la synthèse soutenue. Ci-joint décrit le processus expérimental pour l'élaboration d'un tel système composé de deux E. souches de E. coli qui expriment des enzymes fonctionnellement complémentaires. Ensemble, ces deux enzymes peuvent fonctionner de concert pour servir de médiateur à la régénération de cofacteurs chers pour améliorer le rendement de la production de la bioréaction. En outre, le procédé de synthèse d'une forme immobilisée du système couplé biocatalytique par encapsulation de cellules entières dans des billes d'alginate de calcium est signalée. A titre d'exemple, nous présentons l'amélioration de la biosynthèse de la L-xylulose à partir du L-arabinitol par couplage E. les cellules coli exprimant les enzymes L-arabinitol déhydrogénase ou la NADH oxydase. Dans des conditions optimales, et en utilisant une concentration initiale de 150mM de L-arabinitol, le rendement en L-xylulose maximale atteint 96%, ce qui est supérieur à ceux rapportés dans la littérature. La forme immobilisée des biocatalyseurs cellules entières couplées a démontré une bonne stabilité opérationnelle, le maintien de 65% du rendement obtenu dans le premier cycle après 7 cycles de réutilisation successive, tandis que le système de cellule libre presque complètement perdu l'activité catalytique. Par conséquent, les procédés présentés ici fournissent deux stratégies qui pourraient contribuer à l'amélioration de la production industrielle de L-xylulose, ainsi que d'autres composés à forte valeur ajoutée nécessitant l'utilisation de cofacteurs en général.

Introduction

Biotransformation des cellules entières en utilisant des microorganismes réductive est devenue une méthode très répandue pour la synthèse chimio-enzymatique de biomolécules dans le commerce et thérapeutiquement importantes 1 - 3. Il présente plusieurs avantages sur l'utilisation d'enzymes isolées, en particulier l'élimination des procédés de purification en aval coûteuses et la démonstration d'une durée de vie prolongée 4-7. Pour les voies biocatalytiques où les cofacteurs sont nécessaires pour la formation du produit, des systèmes de cellules entières ont le potentiel d'offrir in situ dans la régénération du cofacteur par l'addition de donneurs d' électrons co-substrats peu coûteux 5,8,9. Cependant, cette capacité est diminuée pour les réactions qui nécessitent une concentration stoechiométrique de co-substrats rares ou coûteux 10 - 13. Avec une mauvaise réutilisabilité des cellules entières, ce empêche la création d'un produ évolutif et continuSystème ction. modifications stratégiques des systèmes de cellules entières pour ces biotransformations cofacteur dépendant sont nécessaires pour surmonter les limitations mentionnées ci-dessus. Plus précisément, la combinaison de biocatalyseur de cellules entières qui agissent ensemble a été démontré que d'améliorer considérablement la productivité et la stabilité des enzymes 14 abrités. Ces facteurs, qui sont souvent essentielles pour permettre une production à grande échelle de produits commercialement viables, peuvent être optimisés en outre par biocatalytiques microbes co-immobilisant 15. Nous avons récemment développé un système biocatalytique cellule entière simple et réutilisable qui permet à la fois la régénération du cofacteur et biocatalyseur immobilisation pour la L-xylulose production 16. Dans cette étude, ce système a été utilisé comme un exemple pour illustrer les procédures expérimentales de l'application de ces deux stratégies pour améliorer le rendement de la production de biotransformation et biocatalyseur réutilisabilité.

L-xylulose appartient à une class de molécules biologiquement utiles nommé sucres rares. Sucres rares sont monosaccharides uniques ou des dérivés de sucre qui se produisent très rarement dans la nature, mais jouent un rôle crucial en tant qu'éléments de reconnaissance dans les molécules bioactives 17,18. Ils ont une variété d'applications allant des édulcorants, des aliments fonctionnels 19 agents thérapeutiques potentiels. L-xylulose peut être utilisé comme un inhibiteur potentiel de plusieurs alpha-glucosidases, et peut également être utilisé comme un indicateur de l' hépatite ou la cirrhose du foie 17,20. L'efficacité de conversion élevé de xylitol à L-xylulose dans les systèmes de cellules entières a été rapporté précédemment dans Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 et Escherichia coli 26. Dans E. coli, cependant, il a été réalisé en utilisant uniquement (<67 mM) , de faibles concentrations de xylitol 26 en raison des effets inhibiteurs potentiels d'une concentration initiale de xylitol supérieur à 100 mM sur l' activité de xylitol-4-déshydrogénase 21,26. L'équilibre thermodynamique entre le xylulose et le xylitol a été montré pour favoriser fortement la formation de xylitol 25,27. En outre, le rendement xylulose est limitée par la quantité de cofacteurs coûteux qui doivent être fournis en l'absence d'un système in situ de régénération de cofacteur. Ensemble, ces facteurs limitent le potentiel de mise à l'échelle dans les systèmes durables pour L-xylulose biosynthèse.

Pour surmonter ces limitations et améliorer le rendement de biotransformation L-xylulose, la stratégie de régénération du cofacteur a été employée d'abord par l'établissement d'un système de biocatalytique cellule entière couplée. Plus précisément, la L-arabinitol 4-déshydrogénase (EC 1.1.1.12) à partir Hypocrea jecorina (HjLAD), une enzyme dans la voie catabolique L-arabinose de champignons, a été sélectionné pour catalyser la conversion de la L-arabinitol en L-xylulose 28,29 . Comme beaucoup d'enzymes de biosynthèse, un limitatio majeurn de HjLAD est qu'il nécessite une quantité stoechiométrique de la chère nicotinamide adénine dinucléotide cofacteur (NAD +, la forme oxydée du NADH) pour effectuer cette conversion. NADH oxydase trouvée dans Streptococcus pyogenes (SpNox) a été montré pour afficher une forte activité cofacteur régénération 30,31. Profitant de cet attribut de SpNox, E. coli exprimant des cellules HjLAD pour la production de L-xylulose ont été couplés avec E. coli exprimant des cellules SpNox pour la régénération du NAD + pour stimuler la production de L-xylulose représenté par la réaction de couplage représentée sur la figure 1A. Dans des conditions optimales et en utilisant une concentration initiale de 150 mM de L-arabinitol, le rendement en L-xylulose maximale atteint 96%, ce qui rend ce système beaucoup plus efficace que ceux rapportés dans la littérature.

La stratégie d'immobilisation de cellules entières a été employée à côté d'améliorer encore la possibilité de réutilisation de la biocatalyt coupléesystème ic. Méthodes couramment utilisées pour l' immobilisation de cellules entières comprennent adsorption / liaison covalente à des matrices solides, réticulation / piégeage et l' encapsulation dans des réseaux polymères 32. Parmi ces méthodes, la méthode la plus appropriée pour l'immobilisation des cellules est l'encapsulation dans des perles d'alginate de calcium. Leurs propriétés de gélification doux, matrice aqueuse inerte et porosité élevée aident à préserver les propriétés physiologiques et la fonctionnalité des produits biologiques encapsulées 33. Par conséquent, le système couplé biocatalyseur contenant à la fois E. cellules de E. coli hébergeant HjLAD ou SpNox ont été immobilisés dans des billes d'alginate de calcium , pour permettre de multiples cycles de production de L-xylulose (figure 2) .Le système biocatalyseur immobilisé a démontré une bonne stabilité de fonctionnement, le maintien de 65% du rendement de conversion du premier cycle après 7 cycles de réutilisation successive, tandis que le système acellulaire presque complètement perdu son activité catalytique.

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Protocol

1. Le total des cellules biocatalyseurs Préparation

NOTE: Le recombinant E. cellules coli hébergeant pET28a- SpNox 31 ou pET28a- HjLAD 28 sont ci - après dénommées E. et E. coli SpNox coli HjLAD, respectivement.

  1. Inoculer une seule colonie de E. coli HjLAD dans 3 ml de milieu Luria-Bertani (LB) additionné de kanamycine (50 pg / ml) et on incube dans un incubateur secoueur O / N à 37 ° C, 250 tours par minute.
  2. Diluer la culture de 1: 100 dans 200 ml de LB frais contenant 50 ug / ml de kanamycine et incuber à 37 ° C, 250 tours par minute jusqu'à ce que la DO600 atteigne environ 0,6.
  3. HjLAD induire l' expression de protéine en ajoutant 0,1 mM de β-D-thiogalactopyranoside d' isopropyle (IPTG) au milieu de culture et on incube à 16 ° C, 180 tpm pendant 16 heures.
    1. Vous pouvez également réaliser l' induction à 25 ° C, 200 rpm pendant 6 heures si la biosynthèse de la L-xylulose (étape 2 ci-dessous) est réalisée le même jour.
  4. Récolter les E. induite coli , des cellules HjLAD par centrifugation à 3.200 x g pendant 20 min à 4 ° C Jeter le surnageant et passer à l'étape 2 pour traiter le culot cellulaire.
  5. En parallèle, effectuez les étapes 1.1 à 1.4 pour E. coli SpNox.

2. biosynthèse de L-xylulose par couplage E. et E. coli HjLAD coli SpNox pour la régénération du cofacteur

  1. Remettre en suspension les culots de cellules de E. et E. coli HjLAD coli SpNox séparément dans un tampon de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0) à une densité cellulaire de 5,0 g de poids cellulaire sec (gDCW) / L.
    Remarque: Une corrélation entre gDCW et la densité optique mesurée à 600 nm (DO 600) peut être mis en place pour faciliter l'expérience. La formule utilisée dansce protocole est 1 gDCW / L = 0,722 * OD 600 à 0,0965, qui peut varier entre les différents spectromètres.
  2. Mélanger 600 pi de 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 pi de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 ul de 20 mM de NAD +, et 150 ul de 2 M de L-arabitol dans un 14 ml , tube à fond rond et à amener le volume réactionnel à 2 ml par addition de 550 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0) .
    Remarque: Le rapport des deux cellules entières biocatalyseurs montant peut être optimisé pour améliorer la biosynthèse du produit. Pour le système décrit, un rapport de E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 a été trouvée comme étant optimale pour la L-xylulose biosynthèse (figure 1B).
  3. Incuber le mélange réactionnel à 30 ° C, 200 tours par minute pendant 8 heures.
  4. Recueillir le surnageant après centrifugation à 4 ° C, 3.200 xg pendant 10 min une procéder à quantifier la production de L-xylulose comme décrit à l'étape 3 ci-dessous.

3. Dosage colorimétrique L-xylulose Quantification

  1. Aspirer 100 ul du surnageant ont été recueillies de la réaction de l'étape 2.4 dans un tube de 1,5 ml.
  2. Ajouter 50 ul de 1,5% de cystéine, 900 ul d'acide sulfurique à 70%, et 50 ul de 0,1% carbazole dissous dans l'éthanol et mélanger doucement en retournant le tube 3 fois.
  3. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C, 200 tours par minute pendant 20 minutes.
  4. Mesurer l'absorbance optique du mélange réactionnel à 560 nm (560) à l' aide d' un spectrophotomètre.
    1. On dilue le mélange réactionnel si la lecture A 560 est supérieur à 1.

4. Immobilisation des recombinants catalyseurs de cellules entières dans des billes d'alginate de calcium

  1. Dissoudre 4 g d'alginate de sodium dans 100 ml d'eau distillée. Préparer une solution d'alginate par addition de sodium alginate à l'eau pour éviter la formation de grumeaux. Chauffer le mélange si nécessaire.
  2. Ajouter 600 pi de 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD et 600 pi de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox dans 1,2 ml de 4% alginate préparé à l' étape 4.1 et mélanger les cellules et l' alginate par pipetage doux pour éviter la formation de bulles.
  3. Aspirer la suspension d' alginate / cellule dans une seringue en utilisant une aiguille et ajouter le mélange goutte à goutte en un chlorure de 0,3 M de calcium (CaCl 2) une solution dans un bêcher de 100 ml avec une agitation continue.
    Remarque: Le volume de 2 solution CaCl utilisée pour la formation d' alginate de talon devrait être suffisant pour que les gouttelettes d'alginate d'être complètement submergés. En outre, la distance entre l'aiguille de la seringue et la surface de la solution de chlorure de calcium doit être maintenue dans une plage optimale pour assurer la formation de perles sphériques uniformément. La plage de distance optimale peut être déterminée expérienceallié et dépend du diamètre interne de l'aiguille. Comme une estimation, une distance de ~ 15 ± 5 cm a été jugée optimale pour un 0,6 cm (diamètre intérieur) de l'aiguille de la seringue.
  4. Laissez les perles dans la solution de CaCl 2 pour 2 - 3 heures à température ambiante sans agitation pour permettre la formation de réticulation et de gel des perles.
  5. Décanter la solution de CaCl 2 , sans perturber les perles en versant avec précaution la solution de CaCl 2 dans un tube conique de 50 ml, et de transférer les billes restantes dans une solution de CaCl 2 dans un autre tube conique de 50 ml.
  6. Laver les billes avec 10 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) de tampon trois fois pour éliminer les cellules excessives CaCl 2 et non-encapsulée.
    REMARQUE: A chaque étape donnée, ne pas centrifuger les perles comme faisant leur rupture. Pour séparer les perles de la solution, laisser reposer la suspension reposer pendant 3-5 min. Les perles se déposent au fond et le tampon de lavage peuvent être décantédans un autre récipient.
    1. Ne pas jeter le tampon de lavage utilisé. Rassembler le tampon utilisé Tris-HCl lavage (30 ml) avec la solution de CaCl 2 usée recueillie lors de l' étape 4.5.
  7. Pellet E. de non immobilisé cellules de E. coli par centrifugation du CaCl2 et du Tris-HCl à la solution de l' étape regroupés récoltés 4,6 à 3.200 g pendant 20 min. Pour déterminer l'efficacité de l'immobilisation, calculer la densité des cellules un-encapsulé sédimentées dans gDCW / L comme décrit à l'étape 2.1.
  8. Transférer les billes lavées à l'étape 4.6 dans un tube. Suivre les étapes 2.2 - 3.4 pour évaluer la biosynthèse de la L-xylulose en utilisant toutes les billes lavées à la place des pastilles cellulaires.

5. Stabilité Dosage de Immobilized biocatalyseurs pour L-xylulose production

  1. Collecter les perles provenant de l'étape 4.8 et laver deux fois avec 10 ml de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0) tampon sans centrifugation (comme décrit à l'étape 4.6).
  2. Utilisez tousdes billes lavées pour effectuer la réaction décrite dans les étapes 2.2 - 3.4.
  3. Répéter les étapes 05.01 à 05.02 pour le nombre souhaité de cycles de production et de mesurer la quantité de L-xylulose produite dans le surnageant de réaction dans chaque cycle.

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Representative Results

Pour permettre la régénération du cofacteur, la synthèse de la L-xylulose a été réalisée dans un système de biocatalyseur à cellules entières contenant couplée E. et E. coli HjLAD coli , des cellules SpNox. À la suite de l'optimisation des différents paramètres, la réutilisabilité de ce système a été amélioré par l' immobilisant dans des billes d'alginate de calcium (Figure 2).

L-xylulose production avec régénération du cofacteur par couplage E. et E. coli HjLAD coli , des cellules SpNox.
Pour améliorer la bioconversion de L-arabinitol en L-xylulose, le E. et E. coli HjLAD coli , les cellules ont été couplés SpNox pour permettrela régénération du cofacteur. Pour tenir compte des différences dans l'expression de la protéine et de la disponibilité du cofacteur dans E. et E. coli SpNox coli HjLAD cellules, une étude comparative du rendement de L-xylulose à divers E. E. coli de SpNox coli rapports HjLAD a été réalisée. Comme on le voit sur ​​la figure 1B, le rendement accru en E. E. coli de SpNox coli HjLAD rapport est passé de 0,13: 1 à 1: 1. Les rendements obtenus pour des rapports 1: 1 et 1.33: 1 sont équivalentes et maximale pour ce système couplé. Toutes les autres expériences ont été réalisées avec E. E. coli de SpNox coli HjLAD rapport de 1: 1. A partir d'une concentration initiale de 150 mM de L-arabinitol, l'utilisation de E. coli HjLAD biocatalyseur seul produit 118 mM L-xylulose après 8 heures (point de saturationpour la concentration de L-xylulose), ce qui représente un rendement de 79% (figure 1C). A titre de comparaison, l'utilisation de E. et E. coli HjLAD coli , des cellules SpNox à un rapport 1: 1 a donné 144 mM de L-xylulose, ce qui améliore le rendement à 96%.

Optimisation de cellules entières biocatalyseur Immobilisation
Immobilisation de biocatalyseurs dans des billes d'alginate de calcium présente de nombreux avantages, comme une meilleure viabilité, en raison de l'environnement d'un gel doux qui protège les cellules contre les contraintes physiques dans un bioréacteur. Les propriétés de ces billes d' alginate est largement déterminée par la formulation et de traitement des paramètres 34. Pour optimiser le rendement de L-xylulose production par une forme immobilisée du biocatalyseur à cellules entières couplé décrit ci - dessus, deux paramètres principaux, à savoir la concentration de sodium d'alginate et de la concentration de CaCl 2, ont été évalués. Ceux-ci sontles principaux paramètres qui déterminent l'intégrité et de la rigidité des billes d'alginate de calcium, ce qui à son tour affectent l'efficacité biocatalyseur d'immobilisation et à la diffusion moléculaire.

Comme on le voit sur ​​la figure 3A, le rendement d'immobilisation de biocatalyseur a démontré une tendance croissante avec l' augmentation de la concentration en alginate de sodium dans la plage de 1 à 3% (p / v). Lorsque la concentration d'alginate de sodium utilisée dans la matrice d'immobilisation est inférieure à 1%, les billes résultantes étaient fragiles et cassants en raison de la faible stabilité mécanique, en libérant la plupart des cellules dans la solution environnante CaCl 2 (données non montrées). Lors de l' augmentation de la concentration d'alginate de sodium à une valeur supérieure à 2%, les billes résultantes durcissent trop conduisant à des problèmes de diffusion moléculaire 35 (figure 4). La variation de la concentration de CaCl2 a abouti à une tendance similaire dans le immobilizat biocatalyseurl'efficacité d'ions. Pour une concentration fixe d'alginate de sodium (2% p / v) et dans la gamme de 0,1 à 0,4 M CaCl 2, CaCl 2 concentrations plus faibles ont entraîné une diminution de la rigidité des bourrelets et une augmentation des fuites de cellules dans la solution environnante. Ceci est dû à la faible disponibilité des ions Ca 2+ pour la réticulation des blocs de guluronate sur les chaînes de polymère d'alginate 36 (figure 3B). Cependant, l' augmentation de la concentration de 0,3 M à 0,4 M de CaCl 2 a amélioré l'efficacité biocatalyseur d'immobilisation marginale. En raison du rendement élevé d'immobilisation (> 90%), CaCl 2 concentrations au - delà de 0,4 M n'a pas été évaluée. Lors de CaCl 2 concentrations inférieures à 0,1 M ont été utilisées, la goutte d'alginate de sodium contenant le biocatalyseur est effondré dans la solution de CaCl 2 et pas de billes sphériques sont formées (données non présentées).

Afin de maximiser lal' immobilisation de biocatalyseur efficacité sans ralentir considérablement la diffusion moléculaire vers le bas dans les perles d'alginate de calcium, l'alginate de sodium et la concentration de CaCl 2 a été optimisée suivante pour l' amélioration de la production de L-xylulose. En utilisant la même gamme de concentrations que pour l' efficacité d'immobilisation (1 - 3% en poids / alginate de sodium v et 0,1 à 0,4 M CaCl 2), une concentration en alginate de sodium optimale de 2% a été observée pour obtenir un rendement maximal de production de L-xylulose (figure 4A ). Au-delà de cette concentration optimale, le rendement a montré une tendance à la baisse. Ce résultat était attendu, du fait des problèmes de diffusion associés à la rigidité excessive des billes d'alginate de calcium. De même, la concentration optimale de CaCl 2 a été trouvée être 0,3 M (figure 4B). Combinée avec les données représentées sur la figure 3, la concentration d'alginate de sodium optimale (2%) et la concentration de CaCl 2 (0,3 M) , qui a permis la formation de billes avecla rigidité et la perméabilité appropriée a été établie, ce qui permet une fuite de cellule minimale et le rendement de la production de L-xylulose maximale.

Il convient de noter que, un autre facteur qui influe sur l'efficacité catalytique globale du biocatalyseur immobilisé est le poids de la culture de cellules encapsulées. Les augmentations d' efficacité catalytique avec l' augmentation de l' inoculum de cellules jusqu'à un poids d'inoculum optimal, au - delà duquel il montre une tendance à la baisse 37. Une explication possible de cette diminution est la surpopulation cellulaire, ce qui empêche la diffusion moléculaire à travers des perles d'alginate de calcium et diminue l'efficacité catalytique du système. En utilisant la condition d'immobilisation optimisé ci - dessus, la plus forte production de L-xylulose a été obtenue avec une charge de cellule de 3,75 (gDCW) / L 16 (données non présentées).

Réutilisation des biocatalyseurs de cellules entières immobilisées et gratuites pourL-xylulose production.
Optimisé en utilisant la condition établie de 1: 1 E. coli SpNox à E. coli rapport HjLAD, 2% (p / v) d' alginate de sodium et 0,3 M de CaCl 2, la sortie du biocatalyseur à cellules entières couplé immobilisé avec un rendement maximal de la L-xylulose de 64%, par rapport à un rendement beaucoup plus élevé de 96% pour le libre système à cellules entières couplé (cycle 1 de la figure 5). On notera que le rendement de l' immobilisation E. coli cellule HjLAD seul était seulement de 32,5% (données non présentées), inférieure à celle du système couplé immobilisé, ainsi que le système de biocatalyseur unique libre (79%, figure 1C). Cette réduction était prévu que l'immobilisation est connu pour diminuer l'activité de biocatalyseur, peut-être en raison de limitations de la diffusion du substrat, mais il a été compensé par l'avantage d'une meilleure réutilisabilité d'un biocatalyseur lors de l'immobilisation. Cet effet sur la stabilité du biocatalyseur estdémontrée par la tendance à la baisse du rendement en L-xylulose observée à soumettre les systèmes libres et immobilisés de façon répétée à un procédé de réaction en discontinu, à la figure 5. Le rendement du système libre a montré une baisse beaucoup plus forte que celle du système immobilisé, ce qui indique un plus la perte rapide de l'activité enzymatique dans le système libre. En conséquence, les deux systèmes ont eu un rendement en L-xylulose comparable pour le cycle de production 2. Au bout de 7 cycles de réutilisation successive, les biocatalyseurs encapsulées ont maintenu leur stabilité et conservé 65% du rendement initial tandis que l'ensemble des cellules libres système conservé moins de 10% de sa capacité à produire de la L-xylulose. Cela démontre que les biocatalyseurs immobilisés peuvent être réutilisés de manière efficace pour la production de L-xylulose et que les avantages de l'amélioration de la réutilisabilité et la stabilité provoquée par l'immobilisation dépasse de loin la réduction de l'activité du biocatalyseur, ce qui confère un avantage significatif dans le processus de production par rapport àun système à cellules entières libre.

Figure 1
Figure 1. Système à cellules entières Couplé pour la production biocatalytique de L-xylulose. (A) Schéma illustrant la réaction cofacteur de régénération se produisant dans un système de cellule entière couplée comprenant E. cellules coli hébergeant HjLAD ou SpNox, respectivement. (B) Variation du rendement en L-xylulose avec différents E. coli SpNox à E. coli ratios HjLAD. (C) L-xylulose rendement à partir d' un biocatalyseur à cellules entières composé de seulement E. coli HjLAD par rapport à celle d'un système à cellules entières couplée composé de E. et E. coli HjLAD cellules coli SpNox capables de régénération du cofacteur. Les parcelles indiquées représentent la moyenne et staécart ndard de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Immobilisation des biocatalyseurs de cellules entières par Encapsulation dans des billes d' alginate. Schéma représentant la formation de taille uniforme Ca2 + des billes d' alginate par addition goutte à goutte de la suspension d' alginate de sodium-cellule à une solution de chlorure de calcium. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Paramètres influant sur ​​l'efficacité de la Immobilisation le biocatalyseur à cellules entières dans des billes d' alginate. Immobilisation d' efficacité en fonction de (A) , l' alginate de sodium (% p / v) (B) , CaCl 2 (M) de concentration. Les parcelles indiquées représentent la moyenne et l' écart - type de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. L' évaluation du rendement de la L-xylulose à partir du couplage biocatalyseur à cellules entières immobilisées en fonction de (A) , l' alginate de sodium (% p / v) (B) , CaCl 2 (M) de concentration. Les parcelles indiquées représentent la moyenne et l'écart-type de trois expériences indépendantes.décharné "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Évaluation du biocatalyseur réutilisabilité. Le rendement de la production de L-xylulose pour 7 cycles successifs de réutilisation des immobilisé et libre couplé biocatalyseur cellule entière est représentée en gris foncé et de la lumière, respectivement. Le tracé représenté représente la moyenne et écart type de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

les progrès technologiques récents ont permis une forte augmentation dans la commercialisation de produits biothérapeutiques recombinants, ce qui entraîne une augmentation progressive de leur valeur de marché dans l'industrie de la biotechnologie. Un tel progrès est l'avènement de l' ingénierie métabolique dans des microorganismes recombinants, qui a montré une grande promesse dans l' établissement de systèmes industriels évolutifs 38. Comme avec la plupart des procédés, la commercialisation réussie des biomolécules recombinantes produites par les microorganismes génétiquement modifiés est hautement dépendante du rendement de l'installation 39 de production. Cela a conduit à l'évolution rapide de la génétique "force brute" 39, où l' évolution dirigée d'enzymes biocatalytiques a été mis en œuvre afin d'améliorer l' activité de biocatalyseur 3. Cependant, pour certaines voies métaboliques, telles que les voies d'oxydo-réduction, une simple amélioration de la biocatalyseur est insuffisante pour influencer la production économisation en raison de l'effet significatif de OTHexigences de réaction essentielles er, comme cofacteurs coûteux. Mise à l'échelle d'un tel système, même avec des biocatalyseurs améliorés, ne servira à augmenter les coûts de production. Ainsi, les méthodes stratégiques supplémentaires sont nécessaires pour la commercialisation de bioreactions impliquant des rapports stoechiométriques de cofacteurs. En outre, le recyclage d'un biocatalyseur est également nécessaire d'améliorer la faisabilité économique d'un bioprocédé. Pour surmonter l'effet de limitation de la consommation de cofacteur rapide et pauvre réutilisabilité des biocatalyseurs de cellules entières, nous avons déjà développé un, système couplé biocatalytique cellule entière immobilisée pour la régénération du cofacteur et la réutilisation stable 16. Décrite dans la présente étude sont les procédures expérimentales nécessaires pour couple et co-immobiliser deux biocatalyseurs cellules entières pour améliorer le rendement de biotransformation et la réutilisabilité, ainsi que les résultats représentatifs.

Un facteur important à prendre en considération pour coupler la cellule entière Biocatalysts est le maintien d'un contrôle précis des conditions fixées pour l'induction de la protéine et la formation du produit biocatalytique pour garantir la reproductibilité du système. Des variations de paramètres tels que l' induction OD 600, le temps d' induction et de la concentration d' IPTG doivent être évitées pour minimiser la variation de lot à lot. En outre, la réévaluation du rapport de cellule à cellule est requise pour différents biotransformations. A noter que le E. coli HjLAD: E. coli SpNox rapport de 1: 1 rapporté dans cette étude a été déterminée par optimisation expérimentale plutôt que le rapport stoechiométrique théorique. Pour l'immobilisation du biocatalyseur de cellules entières recombinantes dans des billes d'alginate de calcium, il existe plusieurs étapes essentielles pour assurer l'homogénéité en ce qui concerne la rigidité et la répartition des cellules bourrelet. Tout d'abord, la solution d'alginate doit être préparée en ajoutant lentement de l'alginate de sodium dans l'eau, et non vice versa pour empêcher l'agglutination qui coULD affecter la concentration d'alginate locale et donc l'étendue de la réticulation. En second lieu, le pipetage doux doit être utilisé lors de la manipulation de la suspension cellulaire-alginate pour éviter la formation de bulles d'air, qui infligent une contrainte de cisaillement sur les cellules encapsulées, entraver le transfert de masse efficace et peut même causer des perles de flotter. Dans le cas où des bulles d'air sont introduites dans la suspension, permettre à la suspension cellulaire d'alginate au repos pendant 20 - 30 minutes pour laisser les bulles échappent. En troisième lieu, en faisant les perles, la suspension cellulaire alginate doit être ajouté lentement et avec précaution d'une manière goutte à goutte dans un volume suffisant de solution de chlorure de calcium pour une taille uniforme et la morphologie. Perles immergées incomplètement dans le chlorure de calcium aura une forme irrégulière et une mauvaise rigidité qui peut contribuer à une fuite de la cellule. Enfin, pour éviter la variabilité du volume de réaction de tampon de lavage résiduel, les perles à l'étape 4.8 peuvent être légèrement effacés avec du papier filtre (ne pas l'air sec).

E. séparée et E. coli SpNox des cultures de cellules coli HjLAD, offrant un meilleur contrôle pour maintenir un rapport désiré entre les deux enzymes. De plus, les cellules exprimant des protéines isolées sont soumises à moins de contraintes que les multiples protéines co-expression, ce qui pourrait conduire à une réduction de repliement de la protéine et l'expression accrue de la protéine 40,41. Ainsi, le couplage cellule entière directe présente la capacité de médiation multi-enzymatiques procédés catalytiques sans compromettre de manière significative le rendement du produit. Stratégies Toutefois, établies telles que la sélection minutieuse des promoteurs bactériens avec une force 42,43 et l' amélioration des sites de liaison de ribosome 44 peut être employe variabled pour atténuer le contrôle limité sur le taux d'enzymes cibles en co-culture ou de co-expression de systèmes. Parmi les nombreuses techniques d'immobilisation, encapsulation présente de multiples avantages pour immobilisant biocatalyseurs cellules entières par rapport aux méthodes alternatives telles que la réticulation et l'adsorption, qui sont plus adaptés pour les enzymes purifiées. Encapsulation de cellules peut également être réalisée dans une variété de biomatériaux tels que l' agar, le chitosane, les gommes, la carragénine, la gélatine et de l' alginate 45 pour améliorer la réutilisation des biocatalyseurs. Cependant, l' alginate de calcium encapsulation a été démontré que l'approche la plus efficace en matière d'efficacité de l' immobilisation et la biomolécule production 46,47.

Une limitation majeure de l' utilisation de biocatalyseurs cellules entières bactériennes est la capacité minimale de modification post-traductionnelle de protéines hétérologues dans de type sauvage E. coli 48. Ceci limite l'utilisation réussie de biocatalyseurs eucaryotes wurant ce système. Une alternative pour surmonter cette limitation pourrait être l'utilisation d'organismes tels que la levure qui sont mieux équipés avec des machines post traductionnelle eucaryote. Une autre limitation du système décrit est liée à l'utilisation d'immobilisation pour améliorer la réutilisabilité. Immobilisation est une stratégie rentable couramment utilisée pour contrer la mauvaise stabilité de biocatalyseurs et d' améliorer leur taux de rotation en simplifiant le bioprocédé 49-51. Les principaux paramètres qui affectent la performance catalytique du biocatalyseur de cellules entières encapsulées comprennent le sodium de concentration d'alginate, la concentration de CaCl 2, la cellule de chargement et la taille des billes. Il est important de reconnaître que ces paramètres ne sont pas indépendants les uns des autres. En tant que tel, une analyse exhaustive de tous les facteurs au sein d'une seule étude est très chronophage, il est donc nécessaire de sélectionner les paramètres les plus importants pour l'optimisation. Évalués et présentés ici sont les effets dedeux paramètres, l' alginate de sodium et la concentration de CaCl 2. Bien que pas discuté en détail ici, nous avons déjà réalisé l'optimisation de la cellule de chargement, en comparant la dépendance du rendement sur ​​le poids des cellules immobilisées 16. Les rapports de la littérature indiquent que la variation de la taille des billes peut également moduler le rendement de la production en augmentant l'enzyme d'encapsulation, l'amélioration de l'activité par l'intermédiaire d'une surface accrue du système immobilisé ou en changeant la diffusion des substrats et des produits en raison de propriétés de transport modifiées. Selon les réactions biocatalytiques à l'étude, la sélection des facteurs critiques de remplacement peut être nécessaire, ce qui pourrait conduire à la génération d'un ensemble différent de conditions optimales. Une étude détaillée pour l'établissement de conditions optimales pour des paramètres supplémentaires prévoit la possibilité pour la poursuite de l'amélioration des performances du système à cellules entières couplé.

En résumé, nous rapportons la mise en expérimentationla mise d'un système de biocatalyseur à cellules entières immobilisées dans des billes couplées à base d'alginate de calcium, ce qui illustre l'amélioration de la production de L-xylulose. En exprimant différentes enzymes recombinantes qui facilitent d'autres voies biocatalytiques dépendant de cofacteurs, des rendements élevés de nombreuses molécules biologiquement pertinentes peuvent être obtenues en utilisant le protocole décrit ici. En outre, ce système peut être étendu pour accueillir plus de deux biocatalyseurs recombinantes pour un pot multi-enzymatique de la biosynthèse des produits 52 et d'autres applications que la production biocatalytique, comme biocapteurs microbiens pour la demande biochimique en oxygène 53. Profitant de la fonction synergique de ce système, l' encapsulation des consortiums microbiens symbiotique peut être utilisé pour une multitude d'applications telles que la bioremédiation 54-56, biotraitement cellule entière pour les biocarburants 57, la promotion de la croissance des plantes par le sol bioaugmentation 58 et bioprospection pour la récupération des métaux 59

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Disclosures

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition. Le document vise à rapports méthodologie détaillée pour générer un système de biocatalytique cellule entière couplée immobilisée dans des billes d'alginate. Nouveautés scientifiques ont été rapportés dans une étude précédente 16.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le Programme de recherche en sciences de base par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le Ministère de l'éducation, de la science et de la technologie (NRF-2013R1A1A2012159 et NRF-2013R1A1A2007561), Université Konkuk, et le Département de génie chimique et mCubed Programme à l'Université du Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

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