La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada

Chemistry

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Summary

Se presenta el protocolo para biocatalizadores de células completas co-inmovilización para la regeneración de cofactor y la mejora de la reutilización, usando la producción de L-xilulosa como un ejemplo. La regeneración del cofactor se consigue mediante el acoplamiento de dos cepas de Escherichia coli que expresa las enzimas funcionalmente complementarios; la inmovilización biocatalizador de célula completa se consigue mediante encapsulación de células en perlas de alginato de calcio.

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Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

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Abstract

Hemos desarrollado recientemente un sistema de biocatalítica de células enteras simple, reutilizable y junto con la capacidad de regeneración de cofactor y la inmovilización biocatalizador para el rendimiento de producción mejorada y síntesis sostenida. La presente se describe el procedimiento experimental para el desarrollo de un sistema de este tipo que consta de dos E. cepas de E. coli que expresan enzimas funcionalmente complementarios. Juntas, estas dos enzimas pueden funcionar cooperativamente para mediar en la regeneración de cofactores caros para mejorar el rendimiento del producto de la biorreacción. Además, se informa del método de síntesis de una forma inmovilizada del sistema biocatalıtica acoplado por la encapsulación de células enteras en perlas de alginato de calcio. A modo de ejemplo, presentamos la biosíntesis mejorada de L-xilulosa a partir de L-arabinitol acoplando E. células de E. coli que expresan las enzimas L-arabinitol deshidrogenasa o NADH oxidasa. En condiciones óptimas y el uso de una concentración inicial de 150mM L-arabinitol, el rendimiento máximo L-xilulosa alcanzó 96%, que es superior a los reportados en la literatura. La forma inmovilizada de los biocatalizadores de células completas, junto demostró una buena estabilidad de funcionamiento, el mantenimiento de 65% de los rendimientos obtenidos en el primer ciclo después de 7 ciclos de re-uso sucesivo, mientras que el sistema libre de células perdió casi por completo la actividad catalítica. Por lo tanto, los métodos que aquí se ofrece dos estrategias que podrían ayudar a mejorar la producción industrial de L-xilulosa, así como otros compuestos de valor añadido que requieren el uso de cofactores en general.

Introduction

Biotransformación reductiva de células enteras utilizando microorganismos se ha convertido en un método generalizado para la síntesis quimio-enzimática de biomoléculas comercialmente y terapéuticamente importantes 1 - 3. Presenta varias ventajas sobre el uso de enzimas aisladas, especialmente la eliminación de los procesos de purificación de aguas abajo de alto coste y la demostración de un tiempo de vida prolongado 4-7. Para vías biocatalıticas donde se requieren cofactores para la formación de productos, los sistemas de células enteras tienen el potencial para proporcionar in situ regeneración cofactor mediante la adición de bajo costo donantes de electrones co-sustratos 5,8,9. Sin embargo, esta capacidad se reduce para las reacciones que requieren una concentración estequiométrica de co-sustratos raros o caros 10 - 13. Junto con pobre capacidad de reutilización de células enteras, esto impide el establecimiento de un produ escalable y continuosistema cción. se requieren modificaciones estratégica de los sistemas de células completas para estas biotransformaciones dependiente del cofactor para superar las limitaciones antes mencionadas. Específicamente, la combinación de los biocatalizadores de células completas que funcionan en conjunto se han mostrado para mejorar de manera significativa la productividad y la estabilidad de las enzimas albergaron 14. Estos factores, que son a menudo críticos para permitir la producción a gran escala de productos comercialmente viables, se pueden optimizar aún más por microbios biocatalıticas co-inmovilización 15. Hemos desarrollado recientemente un sistema de biocatalítica de células enteras simple y reutilizable que permite tanto la regeneración de cofactor y la inmovilización biocatalizador para la producción de L-xilulosa 16. En este estudio, este sistema se utiliza como un ejemplo para ilustrar los procedimientos experimentales de la aplicación de estas dos estrategias para mejorar el rendimiento de producción de biotransformación y la reutilización biocatalizador.

L-xilulosa pertenece a una class de moléculas biológicamente útiles nombrado azúcares raros. Azúcares monosacáridos son raros o únicos derivados de azúcares que se producen muy raramente en la naturaleza, sino que desempeñan un papel crucial como elementos de reconocimiento en las moléculas bioactivas 17,18. Tienen una gran variedad de aplicaciones que van desde los edulcorantes, alimentos funcionales para terapéuticos potenciales 19. L-xilulosa se ​​puede utilizar como un inhibidor potencial de múltiples alfa-glucosidasas, y también puede ser utilizado como un indicador de la hepatitis o cirrosis hepática 17,20. Alta eficiencia de conversión de xilitol a L-xilulosa en los sistemas de células enteras se ha informado anteriormente en Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pálido Y25 24,25 y 26 de Escherichia coli. En E. coli, sin embargo, sólo se alcanzó usando (<67 mM) concentraciones bajas de xilitol 26 debido a los posibles efectos inhibidores de una concentración inicial de xilitol superior a 100 mM sobre la actividad xilitol deshidrogenasa-4-21,26. El equilibrio termodinámico entre xilulosa y xilitol se ha demostrado que favorecen fuertemente la formación de xilitol 25,27. Además, el rendimiento de xilulosa está limitada por la cantidad de cofactores caros que tienen que ser suministrado en la ausencia de un sistema de regeneración de cofactor en situ. En conjunto, estos factores limitan el potencial de ampliación en los sistemas sostenibles para la biosíntesis de L-xilulosa.

Para superar estas limitaciones y mejorar el rendimiento de biotransformación-L xilulosa, se empleó la estrategia de regeneración cofactor primero mediante el establecimiento de un sistema de biocatalítica de células enteras acoplado. Específicamente, L-arabinitol 4-deshidrogenasa (EC 1.1.1.12) a partir de Hypocrea jecorina (HjLAD), una enzima en la vía catabólica-L arabinosa de hongos, fue seleccionado para catalizar la conversión de L-arabinitol en L-xilulosa 28,29 . Al igual que muchas enzimas biosintéticas, un limitatio importanten de HjLAD es que requiere una cantidad estequiométrica de la cara dinucleótido de nicotinamida adenina cofactor (NAD +, la forma oxidada de NADH) para llevar a cabo esta conversión. NADH oxidasa se ​​encuentra en Streptococcus pyogenes (SpNox) se ha demostrado que mostrar una alta actividad de cofactor de regeneración 30,31. Aprovechando este atributo de SpNox, E. células de E. coli que expresan HjLAD para la producción de L-xilulosa se ​​acoplaron con E. células de E. coli que expresan SpNox para la regeneración de NAD + para aumentar la producción de L-xilulosa representado por la reacción de acoplamiento se muestra en la Figura 1A. En condiciones óptimas y usando una concentración inicial de 150 mM de L-arabinitol, el rendimiento máximo de L-xilulosa alcanzó el 96%, por lo que este sistema mucho más eficiente que los reportados en la literatura.

La estrategia de inmovilización de células enteras se empleó junto a mejorar aún más la capacidad de reutilización de la biocatalyt acopladoEl sistema de CI. Métodos utilizados comúnmente para la inmovilización de células enteras incluyen la adsorción / unión covalente a las matrices sólidas, la reticulación / atrapamiento y encapsulación en redes poliméricas 32. Entre estos enfoques, el método más adecuado para la inmovilización de células es la encapsulación en perlas de alginato de calcio. Sus propiedades de gelificación leves, matriz acuosa inerte y de alta porosidad ayudan a preservar las propiedades fisiológicas y la funcionalidad de los productos biológicos encapsulados 33. Por lo tanto, el sistema de biocatalizador acoplado que contiene tanto E. células de E. coli que albergan HjLAD o SpNox se inmovilizó en perlas de alginato de calcio para permitir múltiples ciclos de producción de L-xilulosa (Figura 2) .El sistema biocatalizador inmovilizado demostró una buena estabilidad de funcionamiento, el mantenimiento de 65% del rendimiento de conversión del primer ciclo después de 7 ciclos de sucesiva reutilización, mientras que el sistema libre de células perdió casi por completo su actividad catalítica.

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Protocol

1.-Preparación de células enteras biocatalizadores

NOTA: La E. recombinante células de E. coli que albergan pET28a- SpNox 31 o 28 pET28a- HjLAD se denominarán en adelante como E. coli SpNox y E. coli HjLAD, respectivamente.

  1. Se inocula una sola colonia de E. coli HjLAD en 3 ml de medio Luria-Bertani (LB) complementado con kanamicina (50 mg / ml) y se incuba en un incubador agitador O / N a 37 ° C, 250 rpm.
  2. Diluir el cultivo por 1: 100 en 200 ml de LB fresco que contiene 50 mg / ml de kanamicina y se incuba a 37 ° C, 250 rpm hasta que la DO 600 alcanza ~ 0,6.
  3. Inducir la expresión de la proteína HjLAD añadiendo 0,1 mM isopropil β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) al medio de cultivo y se incuba a 16 ° C, 180 rpm durante 16 hr.
    1. Alternativamente, lleve a cabo la inducción a 25 ° C, 200 rpm durante 6 horas si la biosíntesis de L-xilulosa (Paso 2 a continuación) se lleva a cabo el mismo día.
  4. Se recoge el E. inducida coli HjLAD células por centrifugación a 3200 xg durante 20 min a 4 ° C Descartar el sobrenadante y proceder al paso 2 para procesar el sedimento celular.
  5. En paralelo, realice los pasos 1.1 a 1.4 para E. coli SpNox.

2. Biosíntesis de L-xilulosa por acoplamiento E. coli HjLAD y E. coli SpNox para la regeneración del cofactor

  1. Resuspender los sedimentos celulares de E. coli HjLAD y E. coli SpNox por separado en tampón 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) a una densidad celular de 5,0 g de peso celular seco (gDCW) / L.
    Nota: Una correlación entre gDCW y la densidad óptica medida a 600 nm (OD 600) se puede establecer para facilitar el experimento. La fórmula utilizada eneste protocolo es 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 a 0,0965, que puede variar entre los diferentes espectrómetros.
  2. Mezclar 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 l de 20 mM de NAD +, y 150 l de 2 M L-arabinitol en un 14 ml de tubo de fondo redondo y llevar el volumen de reacción a 2 ml mediante la adición de 550 l de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) .
    Nota: La relación de la cantidad biocatalizadores dos de célula completa se puede optimizar para mejorar la biosíntesis del producto. Para el sistema descrito, una proporción de E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 se encontró que era óptima para la biosíntesis de L-xilulosa (Figura 1B).
  3. Incubar la mezcla de reacción a 30 ° C, 200 rpm durante 8 horas.
  4. Recoger el sobrenadante después de centrifugación a 4 ° C, 3.200 × g durante 10 min unand proceder para cuantificar la producción de L-xilulosa como se describe en el Paso 3 a continuación.

3. ensayo colorimétrico para la cuantificación L-xilulosa

  1. Aspirar 100 l del sobrenadante de reacción recogida del paso 2.4 en un tubo de 1,5 ml.
  2. Añadir 50 l de 1,5% de cisteína, 900 l de ácido sulfúrico 70%, y 50 l de 0,1% carbazol disolvió en etanol y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo 3 veces.
  3. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C, 200 rpm durante 20 min.
  4. Medir la absorbancia óptica de la mezcla de reacción a 560 nm (A 560), utilizando un espectrofotómetro.
    1. Se diluye la mezcla de reacción si la lectura A 560 está por encima de 1.

4. Inmovilización de recombinantes catalizadores de células enteras en perlas de alginato de calcio

  1. Disolver 4 g de alginato de sodio en 100 ml de agua destilada. Preparar la solución de alginato mediante la adición sodium alginato al agua para evitar la formación de grumos. Se calienta la mezcla si es necesario.
  2. Añadir 600 l de 5.0 gDCW / L E. coli HjLAD y 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox en 1,2 ml 4% de alginato preparado en la etapa 4.1 y mezclar las células y alginato por pipeteo suave para evitar la formación de burbujas.
  3. Aspirar la suspensión de alginato / células en una jeringa con una aguja y añadir la mezcla gota a gota en un cloruro de 0,3 M de calcio (CaCl 2) solución en un vaso de precipitados de 100 ml con agitación continua.
    Nota: El volumen de la solución de CaCl 2 utilizado para la formación de esferas de alginato debería ser suficiente para que las gotitas de alginato esté completamente sumergido. Además, la distancia entre la aguja de la jeringa y la superficie de la solución de cloruro de calcio debe mantenerse dentro de un intervalo óptimo para asegurar la formación de perlas uniformemente esféricas. El rango óptimo se puede determinar la distancia experimentoaliado y depende del diámetro interior de la aguja. Como una estimación, se encontró una distancia de ~ 15 ± 5 cm para ser óptima para una 0,6 cm (diámetro interior) de la aguja de la jeringa.
  4. Deja las perlas en la solución de CaCl 2 por 2 - 3 horas a TA sin agitación para permitir la formación de reticulación y de gel de perlas.
  5. Decantar la solución de CaCl 2 sin perturbar las perlas vertiendo cuidadosamente la solución de CaCl 2 en un tubo cónico de 50 ml, y la transferencia de las perlas restantes en solución de CaCl2 en otro tubo cónico de 50 ml.
  6. Lavar las perlas con 10 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) Tampón de tres veces para eliminar las células excesivas CaCl 2 y un-encapsulado.
    NOTA: En cualquier paso dado, no centrifugar las perlas ya que al hacerlo se romperá ellos. Para separar las perlas de la solución, permite la suspensión repose durante 3 - 5 min. Las perlas se depositan en el fondo y el tampón de lavado se puede decantaren otro recipiente.
    1. No deseche el tampón de lavado utilizado. En común el tampón utilizado Tris-HCl de lavado (30 ml) con la solución utilizada CaCl 2 recogido de la etapa 4.5.
  7. E. sedimentar los no-inmovilizados coli células por centrifugación de la solución de CaCl 2 y Tris-HCl agrupado recogieron de la etapa 4.6 a 3.200 xg durante 20 min. Para determinar la eficacia de inmovilización, calcular la densidad de las células de un-encapsulado sedimentadas en gDCW / L como se ha descrito en el paso 2.1.
  8. Transferir las perlas lavadas desde el paso 4.6 en un tubo. Siga los pasos 2.2 - 3.4 para evaluar la biosíntesis de L-xilulosa utilizando todas las perlas lavadas en lugar de gránulos de las células.

5. Ensayo de Estabilidad de Inmovilizados biocatalizadores para la producción de L-xilulosa

  1. Recoger las perlas de la etapa 4.8 y lavar dos veces con 10 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) tampón sin centrifugación (como se describe en el paso 4.6).
  2. Use todode las perlas lavadas para llevar a cabo la reacción como se describe en los pasos 2.2 - 3.4.
  3. Repetir los pasos 5.1 a 5.2 para el número deseado de ciclos de producción y medir la cantidad de L-xilulosa producido en el sobrenadante de reacción en cada ciclo.

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Representative Results

Para activar la regeneración de cofactor, la síntesis de L-xilulosa se ​​llevó a cabo en un sistema de biocatalítica de células enteras acoplado que contiene E. coli HjLAD y E. células de E. coli SpNox. Después de la optimización de varios parámetros, la reutilización de este sistema se ha mejorado mediante la inmovilización en perlas de alginato de calcio (Figura 2).

Producción L-xilulosa con Cofactor de regeneración mediante el acoplamiento de E. coli HjLAD y E. células de E. coli SpNox.
Para mejorar la bioconversión de L-arabinitol en L-xilulosa, la E. coli HjLAD y E. células de E. coli SpNox se acoplaron para permitirla regeneración del cofactor. Para tener en cuenta las diferencias en la expresión de la proteína y la disponibilidad cofactor en E. coli SpNox y E. coli HjLAD células, un estudio de comparación del rendimiento L-xilulosa en varios E. coli SpNox -a- E. se realizó proporciones coli HjLAD. Como se muestra en la Figura 1B, el rendimiento aumentó como el E. coli SpNox -a- E. coli HjLAD relación aumentó de 0,13: 1 a 1: 1. Los rendimientos obtenidos para relaciones de 1: 1 y 1,33: 1 fueron equivalentes y máximo para este sistema acoplado. Todos los experimentos adicionales se realizaron con la E. coli SpNox -a- E. relación coli HjLAD de 1: 1. A partir de una concentración inicial de 150 mM L-arabinitol, el uso de E. coli HjLAD biocatalizador sola produjo 118 mM de L-xilulosa después de las 8 h (punto de saturaciónpara la concentración de L-xilulosa), lo que representa un rendimiento del 79% (Figura 1C). En comparación, el uso de la E. coli HjLAD y E. células de E. coli SpNox en una relación 1: 1 produjo 144 mM L-xilulosa, mejorando el rendimiento al 96%.

Optimización de células completas Inmovilización de biocatalizadores
Inmovilización de biocatalizadores en perlas de alginato de calcio ofrece muchas ventajas, tales como la mejora de la viabilidad, como resultado del medio ambiente gel suave que protege a las células de las tensiones físicas en un biorreactor. Las propiedades de estas perlas de alginato se determina en gran parte por parámetros de formulación y procesamiento 34. Para optimizar el rendimiento de producción de L-xilulosa por una forma inmovilizada del biocatalizador de célula completa junto descrito anteriormente, dos parámetros principales, a saber, la concentración de alginato de sodio y la concentración de CaCl 2, se evaluaron. Estos sonlos principales parámetros que determinan la integridad y la rigidez de las perlas de alginato de calcio, que a su vez afectan a la eficiencia biocatalizador inmovilización y la difusión molecular.

Como se muestra en la Figura 3A, la eficiencia biocatalizador inmovilización demostró una tendencia creciente con el aumento de la concentración de alginato de sodio en el intervalo de 1 a 3% (w / v). Cuando la concentración de alginato de sodio usado en la matriz de inmovilización era menos de 1%, las perlas resultantes eran frágiles y se rompen fácilmente debido a la baja estabilidad mecánica, la liberación de la mayor parte de las células en la solución circundante CaCl 2 (datos no mostrados). Al aumentar la concentración de alginato de sodio al 2% mayor que, las perlas resultantes se endurecieron en exceso conduce a problemas en la difusión molecular 35 (Figura 4). La variación de la concentración de CaCl2 arrojó una tendencia similar en el immobilizat biocatalizadoreficiencia de iones. Para una concentración fija de alginato de sodio (2% w / v) y en el intervalo de 0,1 a 0,4 M CaCl 2, inferiores CaCl 2 concentraciones resultaron en una disminución de la rigidez de las perlas y el aumento de las fugas de las células en la solución circundante. Esto es debido a la limitada disponibilidad de iones Ca2 + para la reticulación de los bloques de guluronato en las cadenas de polímero de alginato 36 (Figura 3B). Sin embargo, el aumento de la concentración de CaCl 2 de 0,3 M a 0,4 M mejoró la eficiencia biocatalizador inmovilización sólo marginalmente. Debido a la alta eficiencia de inmovilización (> 90%), CaCl no se evaluaron 2 concentraciones más allá de 0,4 M. Cuando se utilizaron CaCl 2 concentraciones de menos de 0,1 M, la gota de alginato de sodio que contiene el biocatalizador se desintegró en la solución de CaCl 2 y no se formaron perlas esféricas (datos no mostrados).

Para maximizar laeficiencia inmovilización biocatalizador sin ralentizar significativamente por la difusión molecular en las perlas de alginato de calcio, alginato de sodio y la concentración de CaCl2 se optimizaron próximo para mejorar la producción de L-xilulosa. Usando el mismo rango de concentración como para la eficiencia de inmovilización (1 - 3% w / alginato de sodio v y 0,1 a 0,4 M CaCl 2), una concentración óptima de alginato sódico de 2% se observó para lograr el rendimiento máximo de producción de L-xilulosa (Figura 4A ). Más allá de esta concentración óptima, el rendimiento mostró una tendencia decreciente. Esto se esperaba, debido a los problemas en la difusión asociados con la excesiva rigidez de las perlas de alginato de calcio. Del mismo modo, se encontró que la concentración óptima de CaCl 2 a ser 0,3 M (Figura 4B). Combinado con los datos mostrados en la Figura 3, la concentración de alginato de sodio óptima (2%) y CaCl 2 concentración (0,3 M) que permitió la formación de perlas conse estableció la rigidez y la permeabilidad adecuada, lo que permite fugas célula mínima y el rendimiento de producción de L-xilulosa máxima.

Cabe señalar que, otro factor que afecta a la eficacia catalítica global del biocatalizador inmovilizado es el peso del cultivo celular encapsulado. Los eficacia catalítica aumenta con el aumento de inóculo celular hasta un peso inóculo óptimo, más allá del cual se muestra una tendencia decreciente 37. Una posible explicación de esta disminución es el hacinamiento celular, lo que dificulta la difusión molecular a través de las perlas de alginato de calcio y disminuye la eficiencia catalítica del sistema. El uso de la condición de inmovilización optimizado anteriormente, la mayor producción de L-xilulosa se ​​obtuvo con una carga de célula de 3,75 (gDCW) / L 16 (datos no presentados).

La reutilización de los biocatalizadores inmovilizados celulares completos y libres deL-xilulosa Producción.
El uso de la condición optimizada establecida de 1: 1 E. coli SpNox a E. relación coli HjLAD, 2% (w / v) de alginato de sodio, y 0,3 M CaCl 2, el acoplado de salida biocatalizador de célula entera inmovilizada un rendimiento máximo-L xilulosa de 64%, en comparación con un rendimiento mucho más alto de 96% para la libre sistema de células enteras acoplado (ciclo 1 de la Figura 5). Tenga en cuenta que el rendimiento de E. inmovilizado células coli HjLAD solo fue sólo 32,5% (datos no mostrados), inferior a la del sistema acoplado inmovilizado, así como el sistema de biocatalizador único libre (79%, Figura 1C). Se esperaba que esta reducción como la inmovilización se conoce para disminuir la actividad de los biocatalizadores, posiblemente debido a limitaciones de difusión del sustrato, pero fue compensado por la ventaja de una mejor reutilización de un biocatalizador en la inmovilización. Este efecto sobre la estabilidad del biocatalizador esdemuestra por la tendencia a la disminución en el rendimiento de L-xilulosa observado en someter los sistemas libres e inmovilizadas en repetidas ocasiones a un proceso de reacción por lotes, que se muestra en la Figura 5. El rendimiento para el sistema libre mostró una disminución mucho más pronunciada que la del sistema inmovilizado, lo que indica una una pérdida más rápida de la actividad enzimática en el sistema libre. Como resultado, ambos sistemas tenían un rendimiento de L-xilulosa comparable para el ciclo de producción 2. Al final de 7 ciclos de sucesivos re-uso, los biocatalizadores encapsulados mantenido su estabilidad y retenido 65% del rendimiento original, mientras que el conjunto de células libre de sistema retiene menos del 10% de su capacidad de producir L-xilulosa. Esto demuestra que los biocatalizadores inmovilizados pueden ser reutilizados de manera efectiva para la producción de L-xilulosa y que el beneficio de la mejora de la reutilización y la estabilidad provocada por la inmovilización es mucho mayor que la reducción de la actividad del biocatalizador, que confiere una ventaja significativa para el proceso de producción de más deun sistema libre de células enteras.

Figura 1
Figura 1. Sistema de célula entera Junto a la producción biocatalítica de L-xilulosa. (A) Representación esquemática que ilustra la reacción de regeneración del cofactor se produce en un sistema de células enteras junto comprende E. células de E. coli que albergan HjLAD o SpNox, respectivamente. (B) La variación en el rendimiento de L-xilulosa con diferente E. coli SpNox a E. relaciones coli HjLAD. (C) el rendimiento de L-xilulosa de un biocatalizador de célula entera que sólo consta de E. coli HjLAD en comparación con la de un sistema de células enteras junto compuesto de E. coli HjLAD y E. células de E. coli SpNox capaces de la regeneración del cofactor. Las parcelas mostrados representan la media y staándar desviación de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La inmovilización de los biocatalizadores de células enteras a través de encapsulación en perlas de alginato. Esquemático que representa la formación de tamaño uniforme de Ca2 + perlas de alginato mediante la adición gota a gota de la suspensión de células alginato de sodio a una solución de cloruro de calcio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Los parámetros que influyen en la eficacia de la inmovilización de El biocatalizador de célula entera en perlas de alginato. eficiencia Inmovilización como una función de (A) alginato de sodio (% w / v) 2 concentración (B) CaCl (M). Las parcelas mostrados representan la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Evaluación del rendimiento de L-xilulosa desde el biocatalizador de célula entera Junto inmovilizado como una función de (A) alginato de sodio (% w / v) 2 concentración (B) CaCl (M). Las parcelas mostrados representan la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes.lacio "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Evaluación del biocatalizador reutilización. El rendimiento de la producción de L-xilulosa durante 7 ciclos sucesivos de reutilización de biocatalizador de célula entera junto inmovilizado y libre se muestra en gris oscuro y la luz, respectivamente. La trama se muestra representa la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los recientes avances tecnológicos han permitido un aumento en la comercialización de productos bioterapéuticos recombinantes, lo que resulta en un aumento gradual de su valor de mercado en la industria de la biotecnología. Uno de estos avances es la llegada de la ingeniería metabólica de microorganismos recombinantes, que ha mostrado una gran promesa en el establecimiento de sistemas industriales escalables 38. Al igual que con la mayoría de los procesos, la comercialización exitosa de biomoléculas recombinantes producidos por microbios genéticamente modificados depende del rendimiento de la producción del sistema 39 altamente. Esto ha llevado al rápido desarrollo de la genética "fuerza bruta" 39, donde la evolución dirigida de enzimas biocatalıticas se ha implementado con el fin de mejorar la actividad biocatalizador 3. Sin embargo, para ciertas rutas metabólicas, tales como vías de redox, simple mejora biocatalizador no es suficiente para influir en la economización de la producción debido al efecto significativo de OTHrequisitos esenciales de reacción er, como cofactores caros. Escala plano de un sistema de este tipo, incluso con la mejora de biocatalizadores, sólo servirá para aumentar los costes de producción. Por lo tanto, se requieren métodos adicionales estratégicos para la comercialización de bioreactions que implican relaciones estequiométricas de cofactores. Además, el reciclado de un biocatalizador es también necesario para mejorar la viabilidad económica de un bioproceso. Para superar el efecto de limitación del consumo de cofactor rápida y pobres reutilización de biocatalizadores de células completas, hemos desarrollado previamente un sistema inmovilizado, acoplado de células enteras biocatalítica para la regeneración de cofactor y re-uso estable 16. Se describe en el presente estudio son los procedimientos experimentales necesarios para acoplar y co-inmovilizar dos biocatalizadores de células completas para rendimiento de biotransformación mejorada y capacidad de reutilización, junto con los resultados representativos.

Un factor crítico para ser considerado para el acoplamiento del Biocat de células enterasalysts es el mantenimiento de un control preciso de las condiciones establecidas para la inducción de proteínas y la formación de producto biocatalítica para asegurar la reproducibilidad del sistema. Las variaciones en parámetros como la OD de inducción 600, el tiempo de inducción, y la concentración de IPTG deben evitarse para minimizar la variación de lote a lote. Además, se requiere una nueva evaluación de la relación de célula a célula para diferentes biotransformaciones. Tenga en cuenta que la E. coli HjLAD: E. coli relación SpNox de 1: 1 se informa en este estudio se determinó mediante la optimización experimental en lugar de la relación estequiométrica teórica. Para la inmovilización de los biocatalizadores de células enteras recombinantes en perlas de alginato de calcio, hay varios pasos críticos para garantizar la uniformidad con respecto a la rigidez y la distribución de las células del grano. En primer lugar, la solución de alginato debe ser preparado por la adición lenta de alginato de sodio en agua, y no viceversa, para prevenir la formación de grumos que coULD afectar a la concentración de alginato local y por lo tanto el grado de reticulación. En segundo lugar, suave pipeteo se debe emplear cuando el manejo de la suspensión de células de alginato para evitar la formación de burbujas de aire, que causan la tensión de cizallamiento en las células encapsuladas, impedir la transferencia de masa eficiente y puede incluso causar que las perlas se flotan. En caso de que las burbujas de aire se introducen en la suspensión, permite la suspensión de células alginato repose durante 20 - 30 min para permitir que las burbujas se escapan. En tercer lugar, al hacer las perlas, la suspensión de células-alginato debe añadirse lentamente y con cuidado de una manera gota a gota en un volumen suficiente de solución de cloruro de calcio para el tamaño uniforme y morfología. Los granos sumergidos de forma incompleta en cloruro de calcio tienen una forma irregular y de poca rigidez que puede contribuir a la pérdida de células. Por último, para evitar la variabilidad en el volumen de reacción de tampón de lavado, las perlas en el Paso 4.8 se pueden ligera borrados con papel de filtro (no lo hacen secar al aire).

E. coli SpNox y E. cultivos de células coli HjLAD, que ofrece un mejor control en el mantenimiento de una relación deseada entre las dos enzimas. Además, las células que expresan proteínas individuales se someten a menos tensión que los co-expresión de múltiples proteínas, que podrían conducir a la reducción del mal plegamiento de la proteína y el aumento de la expresión de proteínas 40,41. Por lo tanto, el acoplamiento de células enteras directa presenta la capacidad de mediar procesos catalíticos multi-enzima sin comprometer significativamente el rendimiento del producto. Sin embargo las estrategias, establecidos como una cuidadosa selección de los promotores bacterianos con resistencia a la 42,43 y las mejoras en los sitios de unión de ribosomas 44 puede employed para mitigar el control limitado sobre la relación de las enzimas diana en sistemas de co-cultivo o co-expresión. Entre las muchas técnicas de inmovilización, encapsulación presenta múltiples ventajas para la inmovilización de biocatalizadores de células completas respecto a los métodos alternativos, tales como la reticulación y la adsorción, que son más adecuados para las enzimas purificadas. La encapsulación de las células también se puede realizar en una variedad de biomateriales como agar, quitosano, encías, carragenano, gelatina y alginato 45 para mejorar la reutilización de los biocatalizadores. Sin embargo, la encapsulación de alginato de calcio ha demostrado ser el enfoque más eficaz con respecto a la eficiencia y la inmovilización de biomoléculas producción 46,47.

Una limitación importante de la utilización de biocatalizadores de células enteras bacterianas es la capacidad mínima para la modificación post-traduccional de proteínas heterólogas en de tipo salvaje E. coli 48. Esto restringe el uso exitoso de biocatalizadores eucariotas wentro de este sistema. Una alternativa para superar esta limitación podría ser el uso de organismos tales como levadura que están mejor equipados con maquinaria postraduccional eucariota. Otra limitación del sistema descrito se relaciona con el uso de inmovilización para mejorar la capacidad de reutilización. La inmovilización es una estrategia común rentable empleado para contrarrestar la mala estabilidad de biocatalizadores y mejorar su tasa de rotación mediante la simplificación del proceso biotecnológico 49 - de 51. Los principales parámetros que afectan al rendimiento catalítico de los biocatalizadores de células completas encapsulados incluyen la concentración de sodio de alginato, CaCl concentración 2, carga de las células y el tamaño del grano. Es importante reconocer que estos parámetros no son independientes el uno del otro. Como tal, un análisis exhaustivo de todos los factores dentro de un único estudio es muy lento, por lo que es necesario seleccionar los parámetros más importantes para la optimización. Evaluados y presentados aquí son los efectos dedos parámetros, de alginato de sodio y concentración de CaCl2. Aunque no se discute en detalle aquí, hemos realizado previamente la optimización de la carga de las células, comparando la dependencia del rendimiento en el peso de células inmovilizadas 16. Los informes de la literatura indican que la variación de tamaño de perla también podría modular el rendimiento de producción mediante el aumento de la encapsulación de la enzima, la mejora de la actividad a través de una mayor área de superficie del sistema inmovilizado o cambiando la difusión de sustratos y productos debido a la alteración de las propiedades de transporte. Dependiendo de las reacciones biocatalíticas bajo consideración, la selección de los factores críticos alternativos puede ser necesaria, lo que podría conducir a la generación de un conjunto diferente de condiciones óptimas. Un estudio detallado de establecimiento de las condiciones óptimas para parámetros adicionales ofrece la posibilidad de la mejora adicional en el rendimiento del sistema de célula entera acoplado.

En resumen, nos informan de la eje- experimentaltación de un sistema biocatalítica de células enteras junto inmovilizado en perlas de alginato de calcio, que ilustra la producción mejorada de L-xilulosa. Mediante la expresión de diferentes enzimas recombinantes que facilitan otras vías biocatalıticas cofactor dependiente, altos rendimientos de muchas moléculas biológicamente relevantes se pueden obtener utilizando el protocolo descrito aquí. Además, este sistema puede ampliarse para acomodar más de dos biocatalizadores recombinantes para un solo recipiente biosíntesis multi-enzima de los productos 52 y aplicaciones distintos de la producción biocatalítica, tales como biosensores microbianos para la demanda bioquímica de oxígeno 53. Tomando ventaja de la característica sinérgica de este sistema, la encapsulación de consorcios microbianos simbiótica se puede utilizar para una gran variedad de aplicaciones tales como la biorremediación 54-56, bioprocesamiento de células enteras de biocombustibles 57, la promoción del crecimiento de plantas por el suelo bioaumentación 58 y biominería para la recuperación de metales 59

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia. El documento tiene por objeto informar metodología detallada para generar un sistema biocatalıtica de células enteras junto inmovilizada en perlas de alginato. Novedades científicas han sido reportados en un estudio previo 16.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (NRF-2013R1A1A2012159 y NRF-2013R1A1A2007561), Universidad de Konkuk, y el Departamento de Ingeniería Química y mCubed programa de la Universidad de Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

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