שיטה מהירה עבור עיבוד דם כדי להגדיל את התשואה של רמות הפפטיד פלזמה בדם אנושי

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

שיטת עיבוד דם RAPID ניתן להשתמש בבני אדם ובבעלי מניב רמות פפטיד גבוהות כמו גם מאפשרת הערכה של הטופס המולקולרי הנכון. לכן, שיטה זו תהיה כלי רב ערך במחקר פפטיד.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מחקר בתחום הרגולציה צריכת המזון הוא צובר חשיבות. זה בדרך כלל כולל מדידת פפטידים ויסות צריכת המזון. עבור והקביעה הנכונה של הריכוז של הפפטיד, זה צריך להיות יציב במהלך עיבוד דם. עם זאת, זה אינו המקרה במשך כמה פפטידים אשר מפורקים במהירות על ידי peptidases אנדוגני. לאחרונה, פתחנו שיטת עיבוד דם העסקה בטמפרטורות educed R, A cidification, P rotease עיכוב, אני sotopic שולט אקסוגניים ו- D ilution (RAPID) לשימוש אצל חולדות. כאן, הקמנו את הטכניקה הזו לשימוש בבני אדם וחקרתי התאוששות, טופס מולקולרי וריכוז במחזור של הורמונים רגולטוריות צריכת מזון. את השיטה המהירה שיפרה בצורה משמעותית את התאוששות עבור 125 שכותרתו לי סומטוסטטין-28 (+ 39%), כמו-גלוקגון פפטיד-1 (+ 35%), גרלין acyl וגלוקגון (+ 32%), אינסולין kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), לפטין(+ 21%) ו פפטיד YY 3-36 (+ 19%) לעומת עיבוד סטנדרטי (דם EDTA על הקרח, p <0.001). כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים הראה elution של גרלין acyl אנדוגני במיקום הצפוי לאחר עיבוד RAPID, זמן מה לאחר עיבוד סטנדרטי 62% של גרלין acyl היו מפורקים וכתוצאה מכך שיא קודם לכן המייצג סביר גרלין desacyl. לאחר עיבוד RAPID היחס גרלין acyl / desacyl בדם של נושאים בעלי משקל תקין היה 1: 3 לעומת 1:23 הבאים עיבוד סטנדרטי (p = 0.03). כמו כן רמות kisspeptin אנדוגני היו גבוהות לאחר RAPID לעומת עיבוד סטנדרטי (+ 99%, p = 0.02). שיטת עיבוד דם RAPID ניתן להשתמש בבני אדם, מניב רמות פפטיד גבוהות ומאפשר הערכה של הטופס המולקולרי הנכון.

Introduction

לאור השכיחות הגוברת ברחבי העולם ההשמנה 1,2, מחקר בתחום הרגולציה צריכת המזון הוא צובר חשיבות. בעוד עד כה רק פפטיד אחד ידוע כי הוא מיוצר באופן שולי מרכזי פועל כדי לעורר את צריכת מזון, כלומר גרלין 3, בתוך העשורים האחרונים, מגוון רחב של פפטידים זוהה המפחית את צריכת מזון, למשל. לפטין, פפטיד YY (PYY) וגם גלוקגון דמוי פפטיד 1 (GLP-1) ואינסולין 4, לכן, במחקרים חוקרת את מנגנוני ויסות רמות הרעב פפטיד שובע מוערכים לעתים קרובות בעת ובעונה אחת, ההנחה היא כי הפפטיד למד יציב התאושש על תשואות גבוהות במהלך היווצרות פלזמה. עם זאת, לעתים קרובות זה לא המקרה עקב התמוטטות אנדוגני מהירה כפי שמוצג לפני עבור למשל. גרלין אשר נפגע מן acyl כדי desacyl גרלין 5. לכן, תיארנו לאחרונה שיטה מהירה למחזור הדםלשיר בחולדות העסקת בטמפרטורות educed R, A cidification, P rotease עיכוב, אני sotopic שולטת אקסוגניים ו- D ilution 6. שיטה זו שפרה את ההתאוששות עבור 11 של 12 פפטידים נבדקו ואפשרו לקביעה בצורה המולקולרית הנכונה במחזור לעומת עיבוד דם רגיל (דם EDTA על קרח) 6. שיטה זו נעשה שימוש בכמה מחקרים עוקבים 7-12 לצורך זיהוי של מחזורי גרלין וכן גורם משחררים corticotropin 13. לכן, השיטה הוכיחה שימושית למחקר פפטיד במכרסמים. עם זאת, מאז מחקרים במכרסמים אינם תמיד לתרגום לזן אחר, השיטה צריכה להיות הוקמה לשימוש בדם אנושי.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לבחון את השיטה המהירה לעיבוד דם בבני אדם לעומת עיבוד דם רגיל, דם EDTA על קרח, אשר מומלץ נרחב 14 ולעתים קרובות used בסביבה וכן המחקר הקלינית. בדקנו את ההתאוששות של מבחר של 125 פפטידים שכותרתו ערבו בויסות צריכת מזון כוללים פפטידים הוקם וכן מועמדים חדשים הציע לאחרונה לשחק תפקיד האכלת רגולציה (השפעות על צריכת מזון מוצגות בלוח 1) העיבוד הבא עם שתי השיטות. הורמונים נבחרו גם לייצג פפטידים באורך ולחייב שונים (טבלה 2). יתר על כן, עבור גרלין חקרנו בצורה המולקולרית (ים) בעקבות השיטה הסטנדרטית ומהירה. לבסוף, אנו העריכו גרלין אנדוגני (acyl ועל גרלין desacyl) כמו גם רמות kisspeptin, פפטיד גם הציע לאחרונה לשחק תפקיד בוויסות צריכת המזון 15,16 הבאים עיבוד RAPID או רגיל. בנוסף, גם חקרנו רמות פפטיד אלה בקרב אוכלוסיה של נבדקים עם מגוון רחב של מדד מסת הגוף (החל 10.2-67.6 ק"ג / מ 2) ללמוד possibהבדלי le הקשורים למשקל גוף שינה באופן כרוני.

שולחן 1

טבלה 2

אבחון, הערכה, ואת תוכנית:
משתתפי המחקר
כל משתתפי המחקר אושפזו חדשים חולים (הכללה הייתה בתוך ימים של אשפוז בבית החולים) של אגף רפואת פסיכוסומטית ב Charité-Universitätsmedizin בברלין ומסרו בכתב הסכמה מדעת. כדי למנוע השפעה של מגדר רק מטופלות נכללו. סך של 42 נבדקים השתתפו במחקר זה חולקו לשלוש קבוצות: בעלי משקל תקין (BMI 18.5-25 ק"ג / מ 2, n = 12), אנורקסיה נרבוזה (BMI <17.5 ק"ג / מ 2, n = 15) והשמנה (BMI> 30 ק"ג / מ 2, n = 15). אנורקסית וחולים הסובלים מהשמנת יתר היומאובחנים על פי סיווג המחלות-10 הבינלאומי ואושפז לעלייה במשקל (אנורקסיה נרבוזה) או הפחתת משקל (השמנה), בהתאמה. כל חולי המשקל התקינים אושפזו באופן בלעדי עקב סימפטומים סומאטי ללא הפרעות סומטיות רלוונטיות. חולים עם תסמינים סומאטי עיכול או היסטוריה של ניתוחים במערכת עיכול לא נכללו במחקר. הכללת קריטריונים גם הקיפו בעידן <18 שנים, הריון נוכחי ומחלות פסיכוטי מטופל. איסוף דם בוצע ביום 2 או 3 לאחר אשפוז בבית החולים לפני קבלת טיפול תזונתי על מנת להגביר או להפחית את משקל גוף, בהתאמה. פרמטרים אנתרופומטריות הוערכו על אותו היום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית למחקר האנושי (EA1 מספר פרוטוקול / 114/10).

עיבוד דם 1.

  1. איסוף דם ורידי 7:00-08:00 אחרי הלילה מהר מוריד אמת תהליך על פי הנוהל מקובל או את השיטה המהירה. הדרך את הנושאים שלא לממש או עשן לפני נסיגת דם.
  2. לעיבוד סטנדרטי, לאסוף דם צינורות המכיל EDTA צוננים צנטריפוגות תוך 10 דקות ב 3000 XG במשך 10 דקות ב 4 °. איסוף supernatant ולשמור ב -80 ° C עד לעיבוד נוסף על ידי radioimmunoassay.
  3. עבור עיבוד מהיר, מייד לדלל דם (בתוך 1 דקות לאחר נסיגת דם) 1:10 ב חיץ קר כקרח (pH 3.6) המכיל 0.1 M אמוניום יצטט, 0.5 M NaCl ו אנזים מעכבים (א diprotin, E-64-ד, antipain , leupeptin, chymostatin, 1 מיקרוגרם / מ"ל). ואז, צנטריפוגה בתוך 10 דקות ב 3000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף supernatant לנוing פיפטה צינורות פוליפרופילן כמפורט לפני בחולדות 6.
    1. מחסניות כרומטוגרפיה תשלום (360 מ"ג, 55-105 מיקרומטר) עם 100% אצטוניטריל (שיעור 10 מ"ל / דקה), לאזן עם 0.1% trifluoroacetate (TFA, שיעור 10 mL / min) ועומס עם supernatant בקצב קבוע של 1 מ"ל / min באמצעות משאבת מזרק.
    2. לאחר מכן, לשטוף מחסניות עם 3 מ"ל 0.1% TFA (שיעור 10 mL / min) ו elute לאט עם 2 מ"ל 70% אצטוניטריל המכיל 0.1% TFA (2 מ"ל / דקה).
    3. ניקוי דגימות eluted באמצעות צנטריפוגה ולאחסן ואקום ב -80 ° C עד לעיבוד נוסף על ידי radioimmunoassay.
      הערה: ניהול כל שלבי פוליפרופילן (עיבוד מהיר) ו בורוסיליקט (radioimmunoassay) צינורות כי תערוכת משטח נמוך משמעותי מחייב נכסים ובכך להקטין את איבוד פפטיד עבור רוב פפטידים למדו לפני 26.

2. מדידות

הערה: השלבים בסעיף זה צריך להתבצע במעבדהמוסמך לעבודה עם חומר רדיואקטיבי. אמצעי זהירות תקן עבור העבודה עם 125 אני צריך להילקח.

  1. שחזור של פפטידים radiolabeled
    1. השג 125 פפטידים האדם I-רדיואקטיבי (למשל. Acyl-גרלין, GLP-1, גלוקגון, אינסולין, kisspeptin, לפטין, nesfatin-1, PYY 3-36 ו סומטוסטטין-28).
    2. שמור פפטידים בצורת אבקה עד הניסוי, אז טרי לדלל ב 0.1% חומצה אצטית (~ 100,000 עותקים לדקה לכל מ"ל).
    3. לעיבוד דם רגיל, מיד לאחר הנסיגה הדם לתוך EDTA מצונן המכיל צינורות, להעביר 1 מ"ל של דם לתוך צינור עם 50 μl של radiolabel המכיל 3,000-6,000 עותקים לדקה (ספרתי ישירות לפני הניסוי מתחיל).
    4. לעיבוד RAPID, דם מ"ל העברת 1 של EDTA המכיל דם לתוך צינור המכיל 9 מ"ל חיץ RAPID (להלחנה לראות 1.3) ו 500 μl radiolabel המכיל 30,000-60,000 לדקה. בשל 1:10 שימוש דילול של 10 פעמים נפח גבוה יותר של radiolabel לעיבוד RAPID.
    5. לאחר מכן, דגימות תהליך כמתואר בשלבים 1.2 1.3.2.
    6. עבור ניסויי ההתאוששות, לא דגימות יבשות על ידי צנטריפוגה ואקום לא שומר ב -80 מעלות צלזיוס. במקום זאת, להעריך התאוששות של פפטידים שכותרתו רדיואקטיבית מייד לאחר מכן באמצעות מונה גמא.
    7. מדוד את supernatant השלם דגימות תקן, בעוד RAPID דגימות לנתח 1/10 מהנפח הכולל להשיג יכולת השוואה של כמות radiolabel בשימוש. עבור מדידה, להעביר את supernatant צינורות להשתלב הדלפק גמא ולהעריך את ספירת לדקה
    8. כסטנדרט 100%, השתמש בשתי דגימות עם 50 μl של 125 פפטיד I-רדיואקטיבי שאינם עוברים עיבוד. מדוד בעת ובעונה אחת עם דוגמאות אחרות כמתואר 2.1.7.
    9. בצעו את הניסוי חמש עד שש פעמים עבור כל הפפטיד.
  2. כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים של גרלין radiolabeled
    1. לסגת דם גEDTA hilled המכיל צינורות והעברת 1 מ"ל ל צינורות המכילים גרלין 200 μl radiolabeled-acyl המכיל 15,000-20,000 לדקה (ספרתי ישירות לפני הניסוי מתחיל).
    2. לעיבוד RAPID, דם מ"ל העברת 1 לתוך צינור המכיל 9 מ"ל חיץ RAPID (להלחנה לראות 1.3) ו -200 μl גרלין acyl רדיואקטיבי המכיל 15,000-20,000 לדקה.
    3. לאחר מכן, דגימות תהליך כמתואר בשלבים 1.2 1.3.2.
    4. לניתוח נוסף על ידי HPLC שלב הפוכה, ישירות לטעון דגימות על עמודה C18 האג"ח יציב (2.1 מ"מ x 50 מ"מ, 1.8 מיקרומטר) equilibrated ב אצטוניטריל 17% במים (הן השלימו עם 0.1% TFA).
    5. לאחר 5 דקות איזון, להשתמש שיפוע מ אצטוניטריל 17-40% כדי elute המדגם ב 40 דקות (קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה).
    6. אסוף שברים של 1 מ"ל בכל דקה ולנתח רדיואקטיביות באמצעות מונה גמא.
    7. בניסוי נפרד, עומס 200 μl גרלין acyl רדיואקטיבי המכיל 15,000-20,000לדקה על הטור ישירות ולבצע HPLC כמתואר בשלבים 2.2.4 ל 2.2.6.
  3. radioimmunoassay
    1. לקבלת radioimmunoassay, להפשיר supernatants קפוא (עיבוד סטנדרטי) ואקום אבקת יבשים (שיטה מהירה) בטמפרטורת החדר.
    2. מייד לפני radioimmunoassay, מחדש להשעות דגימות RAPID יבשות בכפול מזוקק H 2 O בהתאם להיקף המקורי של פלזמה (500 μl).
    3. להעריך kisspeptin ומוחלטת (כולל שני desacyl ועל גרלין acyl) וכן גרלין acyl כפי שתואר קודם לכן 12,27 באמצעות radioimmunoassays מסחרי לפי הפרוטוקולים של היצרנים. השתמש צינורות בורוסיליקט המאפשרים היווצרות גלולה יציבה.
      1. ביום אחד, דגירה דגימות עם חיץ assay ו נוגדן ראשוני (למשל. אנטי-גרלין) ב דילול שסיפק היצרן לתקופה של 24 שעות.
      2. ביום שני, להוסיף את נותב 125 אני (למשל 125 I-גרלין), vortex דגירה לתקופה של 24 שעות.
      3. ביום השלישי, להוסיף מגיב מזרז, מערבולת דגירה כפי המומלץ על ידי היצרן. ואז, צינורות צנטריפוגות ב 3,000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatants ולספור רדיואקטיביות את הכדורים באמצעות מונה גמא
    4. חישוב desacyl גרלין כהפרש של גרלין acyl מינוס הכולל. להעריך את יחס גרלין acyl / desacyl ידי חלוקת acyl ידי desacyl גרלין עבור כל דגימה הפרט.
    5. לעבד את כל דגימות - במידת האפשר - אצווה אחת כדי למנוע השתנות בין-assay. השתנות תוך assay בניסוי הנוכחי היו <8% עבור kisspeptin, <7% עבור סך <9% עבור גרלין acyl.

3. ניתוח סטטיסטי

  1. קבע את ההתפלגות של הנתונים באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב. לבטא מידע כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM).
  2. להעריך את ההבדלים בין שניקבוצות ידי מבחן t. להעריך את ההבדלים בין קבוצות המרובות על ידי כל הליכי ההשוואה המרובים מנת לסחור בצורה חכמה (Tukey פוסט הוק בדיקה) או דו כיוונית ANOVA ואחריו שיטה ההולמת-Sidak.
  3. שקול p <0.05 משמעותי ולבצע ניתוחים באמצעות תכנית סטטיסטיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עיבוד דם RAPID מגדיל את התשואה של 125 פפטידים I-רדיואקטיבי בדם אנושי לעומת עיבוד דם רגיל.
לאחר עיבוד דם רגיל (דם EDTA על הקרח), ההתאוששות של פפטידים radiolabeled היה ~ 60% ב 9/9 פפטידים (החל 48-68%, איור 1 א - יא). עיבוד RAPID שיפור התשואה בכל 125 פפטידים שכותרתו אני, כלומר ב סומטוסטטין-28 (+ 39%, איור 1 א), 1-פפטיד דמוי גלוקגון (+ 35%, איור 1B), גרלין acyl (n-octanoyl גרלין, + 32%, תרשים 1C), גלוקגון (+ 32%, איור 1D), אינסולין (+ 29%, איור 1E), kisspeptin (+ 29%, איור 1F), nesfatin-1 (+ 28%, איור 1G), לפטין (+ 21%, 1H איור) פפטיד YY 3-36 (+ 19%, איור 1 יא) לעומת עיבוד סטנדרטי (p <0.001). ב 9 הפפטידים האלה, ההתאוששות אחרי השיטה RAPID היה ~ 90% (החל 71-98%, איור 1 א - יא).

איור 1
איור 1:. שחזור של 125 פפטידים שכותרתו לי בדם אנושי להלן רגיל או RAPID דם עיבוד פפטיד radiolabeled התווסף דם אדם ומעובד על פי הנוהל המקובל (דם EDTA על הקרח) או את השיטה המהירה (בטמפרטורות מופחת, החמצה, פרוטאז עיכוב, שולטת אקסוגניים האיזוטופי דילול). את supernatants נאספו נספר עבור רדיואקטיביות. כל עמודה מייצגת את הממוצע ± SEM של חמישה עד שישה ניסויים. *** P <0.001 עיבוד סטנדרטי לעומת. נא ללחוץ כאן vieווה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

בעקבות RAPID עיבוד, גרלין Elutes במיקום הצפוי.
לאחר עיבוד מהיר של דם אנושי, 125 I-שכותרתו גרלין eluted במיקום הצפוי, זמן מה לאחר הליך רגיל שיא קודם לכן נצפה ביותר מתאים עשוי desacyl גרלין (איור 2). ממצא זה מהווה השפלה 62% של הפפטיד.

איור 2
איור 2:. Elution בפרופיל של 125 I-שכותרתו acyl גרלין בדם אנושי להלן רגיל או RAPID דם עיבוד פפטיד radiolabeled התווסף דם אדם ומעובד על פי הנוהל המקובל או את השיטה המהירה. לאחר מכן, supernatant הועמס על עמודת כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים. Eluate היה collected מכל רגע ומנה עבור רדיואקטיביות. לאחר עיבוד RAPID ביותר של הפפטיד eluted בזמן הצפוי, זמן מה לאחר תקן עיבוד חלק גדול eluted לעיל, רוב והדבר מעיד גרלין desacyl. קיצור:. לדקה, ספירות לדקה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

RAPID דם עיבוד משפר את יחס גרלין acyl / Desacyl ותוצאות ב רמות גבוהות אנדוגני Kisspeptin החמצן מאשר עיבוד רגיל.
דם הוסר ממדפי משקל אנורקסית, נורמלי ונושאים שמנים ומעובדים על פי הנוהל המקובל או RAPID. גרלין אנדוגני (גרלין סך acyl) הוערך על ידי radioimmunoassay. אנתרופומטריות ומחלות רקע / תרופות של קבוצות המחקר הוצג בלוחות 3 ו -4. לאחר עיבוד RAPID היחס גרלין acyl / desacyl בדם של נושאים בעלי משקל תקין היה 1: 3 לעומת 1:23 הבאים עיבוד דם רגיל (p = 0.03; איור 3 א). תוצאות דומות נצפו תחת אנורקסית (1: 3 מול 01:19, p <0.001) ותנאי שמנים (1: 3 vs 01:13; p = 0.04; איור 3 א.). לא נצפו הבדלים בין שלוש הקבוצות השונות לעיבוד סטנדרטי או RAPID (איור 3 א). שני way ANOVA הצביע משמעותי ב להשפעת fl של העיבוד (F 1,64 = 15.3, p <0.001), בעוד משקל גוף / מצב מהטבולים לא היה השפעה (F 2,64 = 0.5, p = 0.62).

טבלה 3

tp_upload / 53,959 / 53959table4.jpg "/>

רמות במחזור kisspeptin אנדוגני היו גבוהות באופן משמעותי בעקבות RAPID לעומת עיבוד סטנדרטי אנורקסית (+ 60%, p = 0.02) ונושאים משקל תקין (+ 99%, p = 0.02), בעוד ההבדל לא נמצא מובהק בתנאים של השמנת יתר ( 23%, p = 0.39; איור 3). לא נמצאו הבדלים משמעותיים נצפו בין שלוש קבוצות BMI שונים (p> 0.05; איור 3). שני way ANOVA הצביע משמעותי ב להשפעת fl של העיבוד (F 1,74 = 10.8, p = 0.002), בעוד משקל גוף / מצב מהטבולים לא היה השפעה (F 2,74 = 0.5, p = 0.60).

איור 3 איור 3: במחזור acyl / Desacyl גרלין יחס במחזור רמות Kisspeptin תחת מטבולית תנאים שונים הבאים RAPID או עיבוד דם רגיל דם הוסר ממדפי משקל אנורקסית, רגיל או נושאים שמנים לאחר צום לילה ומעובד על פי הנוהל המקובל או את השיטה המהירה.. Supernatant היה נאסף acyl כמו גם רמות גרלין המוחלטות או רמות kisspeptin (B) הוערכו על ידי radioimmunoassay. גרלין Desacyl הושג על ידי הפחתת acyl מ גרלין הכולל. היחס היה מחושב על ידי חלוקת acyl ידי desacyl גרלין (א). גודל הקבוצה מצוין בתחתית העמודים. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM. * P <0.05, ** p <0.01 ו *** p <0.001 לעומת. עיבוד סטנדרטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר שלנתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דיווחנו לפני ששיטת RAPID לעיבוד דם השתפרה ההתאוששות עבור 11/12 פפטידים לעומת עיבוד דם רגיל בחולדות 6. במחקר הנוכחי אנו הראינו כי בשיטה זו מתאימה גם לשימוש בבני אדם. בעקבות עיבוד RAPID, ההתאוששות עבור 9 מתוך 9 125 פפטידים שכותרתו בדקה השתפרה לעומת עיבוד דם רגיל (דם EDTA על קרח). השיפור שנצפה נע בין 19-39% אשר עשוי להיות רלוונטיים, במיוחד בתנאים כאשר הבדלים דקים בלבד צפויים עלולים להיות רעול פנים כאשר התשואה של הפפטיד היא נמוכה.

גם הראינו כי לאחר גרלין עיבוד דם RAPID מזוהה במיקום elution הנכון אחרי HPLC המציין בצורה מולקולרית הנכון (גרלין acyl), זמן מה לאחר עיבוד דם רגיל 2/3 מפורקים כדי desacyl גרלין. מאז הקבוצה acyl חיוני מחייב לקולטן גרלין 28, דדואר acylation צפויה לשנות את הפונקציה הביולוגית מאוד של הפפטיד. עם זאת, גם desacyl גרלין מוכר יותר ויותר כמו פפטיד פעיל ביולוגי 29. מעניין, desacyl גרלין הוצע כדי לנטרל את ההשפעות של גרלין כמוצג לפני עבור צריכת המזון 30 או תנועתיות המעי הגס 31. עוד דבר זה מדגיש את החשיבות של חוקר את הטופס המולקולרי הנכון.

כאשר לומדים רמות אנדוגני של kisspeptin במקצועות בעלי משקל תקין, הראינו רמות גבוהות מאוד (+ 99%) בעקבות RAPID לעומת עיבוד דם רגיל. עם זאת, לא נצפה שיפור בתנאים של השמנת יתר, אשר עשוי להיות עקב רמות kisspeptin עלייה הכלליות (+ 50% ב שמני vs. משקל תקין). בין קבוצות BMI (אנורקסיה נרבוזה, משקל תקין והשמנה) בדם מעובד עם אחת מהשיטות, לא נמצאו הבדלים משמעותיים נצפו אשר עשוי להיות בשל העובדה כי רמות בצום רק werדואר העריך. הבדלים עשויים להיות postprandially לכאורה, שערה כי יש לחקור במחקרים עתידיים.

Kisspeptin כבר נמדד לפני במחקרים באמצעות צינורות EDTA רק על קרח 32 (במחקר הנוכחי התייחס עיבוד סטנדרטי כמו) או על ידי תוספת של מעכבי פרוטאז 33. בהתבסס על המחקר הנוכחי המצמרר של הצינורות אינו מספיק כדי למנוע שפלת פפטיד. בין אם מעכבי החמצה לבד או יחיד פרוטאז הם מספיק כדי לשמר kisspeptin צריך להיחקר במחקרים עתידיים.

באופן דומה, עיבוד RAPID גם מגדיל את התשואה של גרלין acyl אנדוגני כפי שצוין על ידי יחס גרלין acyl גדל מאוד / desacyl (1: 3) לעומת עיבוד דם רגיל (01:23). ממצא זה מלמד הקונקורדנציה טוב עם מחקרים במכרסמים שבו דיווחנו יחס גרלין acyl / desacyl של 1: 5 לאחר עיבוד RAPID לפני (לעומת 01:19 לאחר עיבוד סטנדרטי).הטווחים הרחבים של יחס גרלין acyl / desacyl של 1:15 כדי 1:55 34,35 דיווח לפני כן היו ככל הנראה בשל שיעור גבוה דה-acylation התלוי של גרלין desacyl. כפי שתואר לעיל עבור kisspeptin, אין שינויים של יחס גרלין acyl / desacyl נצפו בתנאים שונים של משקל הגוף שינו באופן כרוני (אנורקסיה נרבוזה vs. משקל תקין vs. השמנת יתר). זה יכול להיות גם בשל העובדה כי רק רמות בצום של גרלין acyl / desacyl הוערכו והרגולציה לאחר ארוחה חשובה יותר. מצד השני זה גם מציין כי למרות משקל הגוף שינה באופן כרוני חלקם של acyl ועל גרלין desacyl לא השתנה בתנאים בסיסיים וייתכן שלא לשחק תפקיד חשוב בשינויים אדפטיבית ציינו בתנאים אלה. עם זאת, מחקרים עתידיים באמצעות פרוטוקולי ארוחה סטנדרטיים וליישם את השיטה המהירה יעזרו כדי להמשיך לענות על שאלה זו.

המהיר אותיthod משתמש את הרכיבים הבאים: מאז תגובות כימיות בעיקר תלויות בטמפרטורה 36 הפחתה של טמפרטורה באמצעות פתרון קר כקרח מאט את הפירוק של הפפטיד. גם לאחר מכן, ירידה ב- pH (חומציות) מקטינה את המהירות של השפלה 37. יתר על כן, הפחתת pH יורדת הספיחה של פפטידים על משטחים אחרים ולכן גם מקטינה את הסיכון של אובדן פפטיד. מעכבי פרוטאז משמש כאן נבחרו על מנת לכסות ספקטרום רחב של peptidases אנדוגני: (. למשל cathepsin B / H) diprotin כמעכב של IV peptidase dipeptidyl, E-64-D כמעכב עבור פרוטאזות תיאול, antipain כמו מעכב עבור טריפסין, פפאין cathepsin A / B, leupeptin כמעכב עבור טריפסין, פלסמין, פפאין cathepsin ו chymostatin כמעכב עבור chymotrypsin, פפאין cathepsin B / G. יתר על כן, פפטידים איזוטופי שימושיים כדי להעריך את השיפור של התאוששות בשיטה. לבסוף, כמו o שיעורf ההיווצרות המורכבת-מצע האנזים תלויה בריכוז של האנזים (peptidase) ואת המצע (הורמון פפטידי) 38 דילול של הפלזמה מפחית את קצב ההיווצרות ולכן שפלה (דילול פי עשרה מפחית את השיעור מאה פי מיכאליס קינטיקה -Menten).

למרות היתרונות של השיטה המהירה, מספר מגבלות של השיטה צריכות להיות מוסכמות גם כן. השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הזמן. דגימות דם צריכות להיות מדוללות במאגר RAPID מייד לאחר נסיגת דם אשר עלול להיות קשה בסביבה הקלינית. יתר על כן, השיטה היא יותר גוזל זמן דורש רמה גבוהה יותר של אימון, והוא גם יקר יותר מאשר עיבוד דם רגיל. למרות שזה עשוי להיות מאתגר ליישם בשגרה קלינית, זה יהיה מועיל למטרות מחקר, במיוחד כאשר הבדלים דקים בלבד צפויים ולכן תשואה גבוהה של הפפטיד רצויה.

למרות ששיטת RAPID מתוארת והמליצה על כל מרכיביה (טמפרטורות educed R, A cidification, P rotease עיכוב, אני sotopic שולט אקסוגניים ilution D) בעבודה הנוכחית, מחקרים עתידיים עשויים להשתמש שינויים של הטכניקה הזו. השימוש בבקרות איזוטופי אקסוגניים לא יכול להיות חובה ולכן מוגבל מחקרי פיילוט כדי להעריך אילו פפטידים להראות את השיפור הגדול ביותר ב התאוששות באמצעות עיבוד מהיר. יתר על כן, גם בהרכב מעכבי פרוטאז הקוקטייל עשוי להיות שונה כאשר פפטידים אחרים מוערכים. עם זאת, זה צריך להיבדק כאשר נמדד פפטיד חדש.

לסיכום, השיטה המהירה של עיבוד דם יכול לשמש דם אדם שיפר מאוד את ההתאוששות של 9/9 פפטידים נבדק לעומת עיבוד דם רגיל. מאז פפטידים מסוימים רק קטנים שיפור מתון של התאוששות נצפה, ההכרחשל השיטה עשויה צריך להיבדק כאשר מנותח פפטיד חדש. יתר על כן, שיטת RAPID מאפשרת זיהוי של הטופס המולקולרי המתאים כמוצג עבור גרלין acyl וגם מעלה משמעותי את התשואה של רמות במחזור אנדוגני של פפטידים כגון kisspeptin לעומת עיבוד דם רגיל. לכן, שיטה זו צריכה להיות כלי שימושי במחקרים בבני אדם להערכה במחזור רמות פפטיד, למשל. המעורבים בוויסות הרעב שובע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי גרמנית Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) וגרמנית משרד לחינוך ולמחקר 03IPT614A (CG). אנו מודים ריינהרד Lommel ופטר בוסה לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם, כמו גם קארין ג'והנסון וכריסטינה Hentzschel לעזרה עם ארגון וביצוע מדידות אנתרופומטריות

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377, (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263, (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14, (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37, (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50, (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150, (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31, (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23, (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306, (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93, (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45, (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22, (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147, (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86, (12), 5992 (2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11, (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92, (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20, (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282, (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349, (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42, (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414, (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28, (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402, (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18, (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22, (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88, (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9, (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279, (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21, (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34, (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14, (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics