Быстрый метод обработки крови для увеличения выхода плазмы пептидных уровней в крови человека

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Способ обработки крови БЫСТРОГО может быть использован в организме человека и дает более высокие уровни пептидов, а также позволяет для оценки правильной молекулярной форме. Таким образом, этот метод будет ценным инструментом в пептидной исследования.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Исследования в области регулирования потребления пищи приобретает все большее значение. Это часто включает в себя измерение пептидов, регулирующих потребление пищи. Для правильного определения концентрации с пептидом, то он должен быть стабильным во время обработки крови. Тем не менее, это не так для нескольких пептидов, которые быстро разлагаются эндогенными пептидаз. В последнее время мы разработали метод обработки крови с использованием R температуры, развита cidification, P rotease торможение, я sotopic экзогенные управления и D ilution (Рапид) для использования у крыс. Здесь мы установили эту технику для использования в организме человека и исследовали восстановление, молекулярную форму и циркулирующую концентрацию приема пищи регуляторных гормонов. Экспресс метод значительно улучшает восстановление для 125 I-меченый соматостатин-28 (+ 39%), глюкагон-подобный пептид-1 (+ 35%), ацил грелин и глюкагон (+ 32%), инсулин и kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), лептин(+ 21%) и пептид YY 3-36 (+ 19%) по сравнению со стандартной обработкой (ЭДТА крови на льду, р <0,001). Высокоэффективная жидкостная хроматография показала элюирование эндогенного ацил грелина в ожидаемом положении после быстрой обработки, в то время как после стандартной обработки 62% ацильных грелина деградировали в результате более раннего пика, вероятно, что составляет desacyl грелина. После быстрой обработки отношение грелин ацил / desacyl в крови с нормальной массой тела составляло 1: 3 по сравнению с 1:23 следуя стандартной обработке = 0,03). Также эндогенные kisspeptin уровни были выше , после того, как быстро по сравнению со стандартной обработкой (+ 99%, р = 0,02). Способ обработки крови БЫСТРОГО может быть использован в организме человека, дает более высокие уровни пептида и позволяет для оценки правильной молекулярной форме.

Introduction

В свете растущей во всем мире распространенность ожирения 1,2, исследования в области регулирования потребления пищи приобретает все большее значение. Хотя до сих пор только один пептид известно , что периферически производится и централизованно действуя , чтобы стимулировать потребление пищи, а именно грелин 3, в течение последних десятилетий, широкий спектр пептидов было установлено , что уменьшить потребление пищи, например. лептин, пептид YY (PYY) , а также глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) и инсулина 4. Таким образом, в исследованиях , посвященных регуляторные механизмы голода и сытости пептидных уровней часто оцениваются и в то же время предполагается, что пептид изученным является стабильным и восстанавливается при высоких урожаев в процессе образования плазмы. Тем не менее, очень часто это не так из - за быстрого эндогенного пробоя , как показано выше для например. грелин , который деградирует из ацила до desacyl грелин 5. Таким образом, мы недавно описал быстрый метод предпосе кровипоют у крыс , использующих R температуры, развита cidification, P rotease торможение, я sotopic экзогенные управления и D ilution 6. Этот метод улучшил восстановление для 11 из 12 6 пептидов испытанных и разрешенных для определения правильной циркулирующей молекулярной форме по сравнению со стандартной обработкой крови (ЭДТА крови на льду). Этот метод был использован в нескольких последующих работах 7-12 для выявления циркулирующих грелин, а также кортикотропин-рилизинг-фактора 13. Таким образом, метод оказался полезным для пептидного исследований у грызунов. Однако, поскольку исследования на грызунах не всегда переводимых к другому виду, этот метод должен быть создан для использования в человеческой крови, а также.

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы проверить быстрый метод обработки крови в организме человека по сравнению со стандартной обработкой крови, ЭДТА крови на льду, который широко рекомендуется 14 и часто уСЭД в клинической практике, а также условий исследования. Мы тестировали восстановление выбора 125 I-меченных пептидов , участвующих в регуляции потребления пищи , включая установленные пептиды, а также новых кандидатов недавно предложил , чтобы играть роль в питании регулирования (воздействие на потребление пищи приведены в таблице 1) следующую обработку с обоими методами. Гормоны были также выбраны для представления пептиды различной длины и заряда (таблица 2). Кроме того, для грелина мы исследовали молекулярную форму (ы) в соответствии со стандартными и экспресс-метод. И, наконец, мы провели оценку эндогенного грелин (ацил и desacyl грелина), а также уровни kisspeptin, пептид также недавно предложил играть определенную роль в регуляции потребления пищи 15,16 после быстрого или стандартной обработки. Кроме того, мы также исследовали эти уровни пептида в популяции субъектов с широким диапазоном индекса массы тела ( в диапазоне от 10.2-67.6 кг / м 2) для изучения possibле различия, связанные с хроническими измененном веса тела.

Таблица 1

Таблица 2

Диагностика, оценка и план:
участники исследования
Все участники исследования были недавно госпитализированных пациентов (включение было в течение двух дней с момента поступления в стационар) Отдела психосоматической медицины Шарите-Universitätsmedizin Берлине и дали письменное информированное согласие. Для того, чтобы избежать какого-либо влияния пола только пациентов женского пола были включены. В общей сложности 42 субъектов участвовали в этом исследовании и были разделены на три группы: с нормальным весом (ИМТ 18.5-25 кг / м 2, п = 12), анорексии (ИМТ <17,5 кг / м 2, п = 15) и ожирение (ИМТ> 30 кг / м 2, п = 15). Anorexic и ожирением пациентов былидиагноз в соответствии с Международной классификацией болезней-10 и госпитализированы для увеличения веса (анорексии) или снижения веса (ожирение), соответственно. Все пациенты с нормальным весом были госпитализированы из-за исключительно симптомами соматоформных без соответствующих соматических расстройств. У больных с желудочно-кишечными симптомами соматоформных или в анамнезе желудочно-кишечной хирургии были исключены. Критерии исключения также охватывает возраст <18 лет, текущая беременность и без лечения психотических заболеваний. Сбор крови проводили на день 2 или 3, после того, как госпитализации до получения диетического лечения с целью увеличения или снижения массы тела, соответственно. Антропометрические параметры оценивались в тот же день.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол был одобрен местным комитетом по этике для человеческого исследования (номер протокола EA1 / 114/10).

Обработка 1. Кровь

  1. Сбор венозной крови с 07:00 до 08:00 утра после ночного голодания из вены предплечья и процесса в соответствии со стандартной процедурой или экспресс-метод. Поручить предметы, чтобы не физические нагрузки или дыма перед тем забора крови.
  2. Для стандартной обработки, собирают кровь в охлажденном ЭДТА содержащих пробирки и центрифуге в течение 10 мин при 3000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Соберите супернатант и хранить при температуре -80 ° С до дальнейшей обработки с помощью радиоиммуноанализа.
  3. Для быстрой обработки, немедленно разбавить кровь (в течение 1 мин после забора крови) 1:10 в охлажденном льдом буфере (рН 3,6), содержащего 0,1 М ацетата аммония, 0,5 М NaCl и ингибиторы ферментов (diprotin А, Е-64-д, Антиболь , лейпептина, химостатина, 1 мкг / мл). Затем центрифугу в течение 10 мин при 3000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и собирают надосадочную жидкость с намиING пипетки в полипропиленовые пробирки , как подробно описано ранее у крыс 6.
    1. Заряд хроматографические картриджи (360 мг, 55-105 мкм) с 100% ацетонитрила (скорость 10 мл / мин), уравновешиваться с 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA, скорость 10 мл / мин) и нагрузки с надосадочной жидкостью с постоянной скоростью 1 мл / мин с помощью шприцевого насоса.
    2. После этого промойте картриджи с 3 мл 0,1% TFA (скорость 10 мл / мин) и медленно вымывается с 2 мл 70% ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA (2 мл / мин).
    3. Сухие Элюированные образцы не с помощью вакуумного центрифугирования и хранят при -80 ° С до дальнейшей обработки радиоиммуноанализом.
      Примечание: Провести все шаги полипропилена (Рапид обработка) и боросиликатного (радиоиммуноанализа) трубок , которые обладают значительно более низкую поверхность связывания свойства и тем самым свести к минимуму потери пептида для большинства пептидов изученных до 26.

2. Измерения

Примечание: Шаги в этом разделе должны быть выполнены в лабораториисертифицировано для работы с радиоактивными материалами. Стандартные меры предосторожности при работе с 125 I должны быть приняты.

  1. Восстановление радиоактивной пептидами
    1. Получение 125 I-меченных радиоактивным изотопом пептидов человека (например, ацил-грелина, ГПП-1, глюкагон, инсулин, kisspeptin, лептин, nesfatin-1, PYY 3-36 и соматостатин-28).
    2. Хранить пептиды в виде порошка до эксперимента, а затем свеже разбавить в 0,1% -ной уксусной кислоте (~ 100 000 импульсов в минуту на мл).
    3. Для стандартной обработки крови, непосредственно после того, как для забора крови в охлажденный ЭДТА пробирки, содержащие, трансфер 1 мл крови в пробирку с 50 мкл радиометки, содержащего 3000-6000 СРМ (подсчитывали непосредственно перед началом эксперимента).
    4. Для быстрой обработки, передачи 1 мл крови ЭДТА, содержащей кровь в пробирку, содержащую 9 мл RAPID буфера (для композиции см 1.3) и 500 мкл радиоактивной содержащий 30.000-60.000 имп. Из-за использования в разведении 1:10 в 10 раз больший объем radiolabeл для быстрой обработки.
    5. Затем образцы процесса, как описано в пунктах 1.2 1.3.2.
    6. Для экспериментов по восстановлению, не сухие образцы с помощью вакуумного центрифугирования и не хранить при температуре -80 ° C. Вместо того, чтобы, оценить восстановление радиоактивно меченных пептидов непосредственно после этого с помощью гамма-счетчика.
    7. Мера весь супернатант в стандартных образцах, в то время как в RAPID образцы анализируют 1/10 от общего объема, чтобы получить сопоставимость количества радиоактивной метки, используемой. Для измерения, передачи супернатант в трубах, установленных в гамма-счетчика и оценить число импульсов в минуту
    8. В стандартной комплектации на 100%, используют два образца с 50 мкл 125 I-радиоактивно пептида , которые не подвергаются обработке. Измерить одновременно с другими образцами, как описано в 2.1.7.
    9. Выполнение эксперимента пять-шесть раз для каждого пептида.
  2. Высокоэффективная жидкостная хроматография меченого грелина
    1. Вывод крови в Cокучивать ЭДТА пробирки, содержащие и передачу по 1 мл в пробирки, содержащие 200 мкл меченного радиоактивным изотопом-ацил грелин, содержащего 15000-20000 СРМ (подсчитываются непосредственно перед началом эксперимента).
    2. Для быстрой обработки, передачи 1 мл крови в пробирку, содержащую 9 мл RAPID буфера (для композиции см 1.3) и 200 мкл радиоактивно ацил грелин, содержащий 15000-20000 имп.
    3. Затем образцы процесса, как описано в пунктах 1.2 1.3.2.
    4. Для дальнейшего анализа с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, непосредственно загружать образцы на устойчивую связь колонке С18 (2,1 мм х 50 мм, 1,8 мкм), уравновешенную 17% ацетонитрила в воде (как с добавлением 0,1% TFA).
    5. После 5 мин уравновешивания, используется градиент от 17-40% ацетонитрила, чтобы элюировать образец через 40 мин (скорость 1 мл / мин поток).
    6. Собирают фракции по 1 мл в каждую минуту и ​​анализируют радиоактивность с помощью гамма-счетчика.
    7. В отдельном эксперименте, нагрузка 200 мкл меченного радиоактивным изотопом ацил грелин, содержащего 15000-20000имп на колонку непосредственно и выполняют ВЭЖХ, как описано в пунктах 2.2.4 2.2.6.
  3. радиоиммуноанализ
    1. Для радиоиммунологического, размораживайте супернатантов (стандартная обработка) и высушенный в вакууме порошок (экспресс-метод) при комнатной температуре.
    2. Непосредственно перед радиоиммуноанализ, вновь приостановить сухие RAPID образцы в бидистиллированной H 2 O в соответствии с первоначальным объемом плазмы (500 мкл).
    3. Оценка kisspeptin и общая (включая как desacyl и ацил грелина), а также ацильную грелин , как описано выше 12,27 с использованием коммерческих радиоиммунологической в соответствии с протоколами производителей. Использование боросиликатных трубок, которые позволяют стабильное образование гранул.
      1. В первый день, инкубировать образцов с буфером для анализа и первичным антителом (например, анти-грелина) в разведении , предоставленного производителем в течение 24 часов.
      2. На второй день, добавьте 125 I изотоп (например , 125 I-грелина), В.О.RTEX и инкубировать в течение 24 часов.
      3. На третий день, добавьте осаждая реагента, вихря и инкубировать в соответствии с рекомендациями производителя. Затем, центрифужные пробирки при 3000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатанты и подсчета радиоактивности в гранулах с помощью гамма-счетчика
    4. Вычислить desacyl грелина как разность общего минус ацил грелина. Оценка соотношения грелина ацил / desacyl путем деления ацил на desacyl грелина для каждого отдельного образца.
    5. Процесс все образцы - если это возможно - в одной партии, чтобы избежать между анализами изменчивости. Изменчивость внутри пробы в данном эксперименте был <8% для kisspeptin, <7% для общего и <9% для ацил грелина.

3. Статистический анализ

  1. Определить распределение данных с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Экспресс данные как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM).
  2. Оценка различий между двумягрупп по Т-тест. Оценка различий между несколькими группами от всех попарных нескольких процедур сравнения (Тьюки постфактум тест) или двухсторонним ANOVA с последующим методом Holm-Сидак.
  3. Рассмотрим р <0,05 значимыми и выполнения анализа с использованием статистической программы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Быстрая обработка крови увеличивает выход 125 I-меченных пептидов в крови человека по сравнению со стандартной обработкой крови.
После стандартной обработки крови (ЭДТА крови на льду), восстановление меченных пептидов составляла ~ 60% в 9/9 пептидов ( в пределах от 48-68%, рис 1A - K). Быстрая обработка способствовала увеличению урожайности во всех 125 I-меченных пептидов, а именно в соматостатина-28 (+ 39%, рис 1А), глюкагон-подобный пептид-1 (+ 35%, на фиг.1В), ацил грелин (н-октаноил грелин, + 32%, рис 1C), глюкагон (+ 32%, рис 1D), инсулин (+ 29%, рис 1E), kisspeptin (+ 29%, рис 1F), nesfatin-1 (+ 28%, рис 1G), лептин (+ 21%, рис 1H) и пептид YY 3-36 (+ 19%, рис 1K) , по сравнению со стандартной обработки <0.001). В этих 9 пептидов, восстановление после RAPID метода составила ~ 90% ( в пределах от 71-98%, рис - 1A K).

Рисунок 1
Рисунок 1:. Восстановление 125 I-меченных пептидов в крови человека в соответствии со стандартными или RAPID крови Обработка радиоактивной пептида был добавлен в крови человека и обрабатываются в соответствии со стандартной процедурой (ЭДТА крови на льду) или экспресс - метод (пониженной температуры, подкисление, протеазы ингибирование, изотопные экзогенные контролирует и разведение). Супернатанты собирали и считывали радиоактивность. Каждый столбец представляет собой среднее ± SEM от пяти до шести экспериментов. *** Р <0,001 по сравнению с стандартной обработкой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы вива большую версию этой фигуры.

После быстрой обработки грелин элюируется на ожидаемой позиции.
После быстрой обработки крови человека, 125 I-меченого грелина элюировали в ожидаемом положении, в то время как после стандартной процедуры ранний пик наблюдался , скорее всего , что соответствует desacyl грелина (рисунок 2). Это составило 62% деградации пептида с.

фигура 2
Рисунок 2:. Элюирование Профиль 125 I-меченного ацил грелина в крови человека слежение за стандартным или БЫСТРОГО крови Обработка радиоактивной пептида был добавлен в крови человека , и обрабатывается в соответствии со стандартной процедурой , или экспресс - метода. Затем надосадочную жидкость загружали на колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии. Элюат Colбранной каждую минуту и ​​считывали радиоактивность. После быстрой обработки большей части пептида, элюированной в ожидаемое время, в то время как после стандартной обработки большую часть элюировался раньше, скорее всего, что составляет desacyl грелина. Сокращенное наименование:. Имп, число импульсов в минуту Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Быстрая обработка крови Улучшает ацил / Desacyl грелина Ratio и результаты в Повышенные уровни крови эндогенного Kisspeptin по сравнению со стандартной обработки.
Кровь отбирают из анорексией, нормальной массой тела и ожирением и обработаны в соответствии со стандартом или ускоренную процедуру. Эндогенный грелин (всего и ацил грелина) оценивали с помощью радиоиммуноанализа. Антропометрические и сопутствующие заболевания / лекарства из исследуемых групп приведены в таблицах 3 и 4. После быстрой обработки отношение грелин ацил / desacyl в крови с нормальной массой тела составляло 1: 3 по сравнению с 1:23 следуя стандартной обработке крови = 0,03; рис 3А). Аналогичные результаты наблюдались при анорексией (1: 3 против 1:19, р <0,001) , а также с ожирением условий (1: 3 против 1:13; р = 0,04; Фиг.3А.). Не было обнаружено различий между тремя различными группами для стандартной или быстрой обработки (рис 3А). Два пути ANOVA указали значимы в фл uence метода обработки (F 1,64 = 15,3, р <0,001), в то время как масса тела / метаболическое состояние , которое не имело никакого эффекта (F 2,64 = 0,5, р = 0,62).

Таблица 3

tp_upload / 53959 / 53959table4.jpg "/>

Циркулирующие эндогенные уровни kisspeptin были значительно выше , следующие БЫСТРОГО по сравнению со стандартной обработкой в анорексией (+ 60%, р = 0,02) и с нормальной массой тела (+ 99%, р = 0,02), в то время как разница не достигала значения в условиях ожирения ( 23%, р = 0,39; фигура 3В). Не было обнаружено существенных различий между тремя различными группами ИМТ (р> 0,05; Рисунок 3B). Два пути ANOVA указали значимы в фл uence метода обработки (F 1,74 = 10,8, р = 0,002), в то время как масса тела / метаболическое состояние , которое не имело никакого эффекта (F 2,74 = 0,5, р = 0,60).

Рисунок 3 Рисунок 3: Циркуляционный Отношение ацил / Desacyl грелина и циркуляционные Kisspeptin уровней при различных метаболических состояниях после RAPID или Standard крови во время обработки крови был снят с анорексией, нормального веса или ожирением после ночного голодания и обрабатываются в соответствии со стандартной процедурой или экспресс - метод.. Супернатант собирали и ацил, а также общий уровни грелина или kisspeptin уровни (B) оценивали с помощью радиоиммуноанализа. Desacyl грелина был получен путем вычитания ацил от общего грелина. Отношение рассчитывали делением ацил по desacyl грелина (A). Размер группы указывается в нижней части колонны. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM. * Р <0,05, ** р <0,01 и *** р <0,001 против. стандартная обработка. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версиюэта фигура.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы сообщали ранее , что экспресс - метод для обработки крови улучшается восстановление для 11/12 пептидов по сравнению со стандартной обработкой крови у крыс 6. В настоящем исследовании мы показали, что этот метод также подходит для использования в организме человека. После быстрой обработки, была усовершенствована для восстановления 9 из 9 125 I-меченных пептидов испытания по сравнению со стандартной обработкой крови (ЭДТА крови на льду). Наблюдаемое улучшение колебалась от 19-39%, что, вероятно, будет актуальна, особенно в условиях, когда только тонкие различия, как ожидается, которые могут быть замаскированы, когда выход пептида является низким.

Мы также показали, что после быстрой обработки крови грелина обнаруживается в правильном положении элюции после ВЭЖХ с указанием правильной молекулярной форме (ацил грелина), в то время как после стандартной обработки крови 2/3 деградируют до desacyl грелина. Так как ацильная группа имеет важное значение для связывания с рецептором грелина 28, ге-ацилирование, как ожидается, существенно изменить биологическую функцию пептида. Тем не менее, также desacyl грелин все чаще признается в качестве биологически активного пептида 29. Интересно, что desacyl грелин было предложено противодействовать эффектам грелина , как было показано выше для приема пищи 30 или 31 моторики толстого кишечника. Это еще раз подчеркивает важность исследования правильную молекулярную форму.

При изучении эндогенных уровней kisspeptin в нормальной массой тела, мы показали значительно увеличенные уровни (+ 99%) после RAPID по сравнению со стандартной обработкой крови. Тем не менее, никаких улучшений не наблюдалось в условиях ожирения, что может быть связано с общим повышением уровня kisspeptin (+ 50% в ожирением против. Нормальный вес). Между группами ИМТ (анорексии, нормальный вес и ожирение) в крови, обработанных с любым методом, не наблюдалось никаких существенных различий, которые могут быть из-за того, что только натощак уровни WERе оценены. Различия могут быть очевидными постпрандиально, гипотеза, которая должна быть исследована в будущих исследованиях.

Kisspeptin была измерена до того, в исследованиях с использованием только ЭДТА пробирки на лед 32 (в настоящем исследовании упоминается как стандартная обработка) или добавлением ингибиторов протеазы 33. На основании данного исследования сковывающий трубок недостаточно для предотвращения деградации пептида. Является ли одна подкисление или одного ингибиторы протеазы достаточно, чтобы сохранить kisspeptin должны быть исследованы в будущих исследованиях.

Кроме того, быстрая обработка также увеличивает выход эндогенного ацил грелина, как указано в значительно увеличенным соотношением ацил / desacyl грелина (1: 3) по сравнению со стандартной обработкой крови (1:23). Это открытие показывает хорошее согласование с исследованиями на грызунах, где мы сообщали соотношение грелина ацил / desacyl 1: 5 после быстрого обработки перед тем (по сравнению с 1:19 после стандартной обработки).Широкие диапазоны / desacyl отношение грелина ацил 1:15 до 1:55 34,35 сообщалось ранее были поэтому , скорее всего , из - за де-ацилирования зависящих от высокой доли desacyl грелина. Как было описано выше для kisspeptin, не наблюдалось никаких изменений по отношению грелина ацил / desacyl при различных условиях хронически измененном массы тела (анорексии VS. Нормального веса против. Ожирение). Это также может быть связано с тем, что только пост уровни ацил / desacyl грелина были оценены и постпрандиальный регулирование является более важным. С другой стороны, это также указывает на то, что, несмотря на хронически измененном массы тела доля ацил и desacyl грелина не изменяется при базальных условиях и не могут играть важную роль в адаптивных изменений, наблюдаемых в этих условиях. Тем не менее, будущие исследования с использованием стандартных протоколов приема пищи и применение экспресс-метода будет способствовать дальнейшему ответить на этот вопрос.

RAPID меняThOD использует следующие компоненты: Так как химические реакции , в основном , зависит от температуры 36а снижение температуры с помощью льдом раствор замедляет деградацию пептида. Далее, также снижение рН (подкисление) снижает скорость деградации 37. Кроме того, снижение рН уменьшает адсорбцию пептидов на другие поверхности, и, следовательно, также снижает риск потери пептида. Ингибиторы протеазы , используемые здесь , были выбраны для того , чтобы охватить широкий спектр эндогенных пептидаз: (. , Например , катепсина B / H) diprotin А в качестве ингибитора дипептидилпептидазы IV, E-64-й в качестве ингибитора для тиолпротеазами, Антиболь , как ингибитор для трипсин, папаин и катепсина а / в, лейпептин в качестве ингибитора для трипсин, плазмин, папаин и катепсина и химостатина в качестве ингибитора для химотрипсина, папаина и катепсина B / G. Кроме того, изотопные пептиды полезны для того, чтобы оценить улучшение восстановления методом. И, наконец, как со скоростью Ое комплексообразование фермент-субстрат , зависит от концентрации фермента (пептидазы) и субстрат (пептидный гормон) 38 разбавление плазмы снижает скорость образования и , следовательно , деградация (десятикратного разбавления снижает скорость сторицей в соответствии с Михаэлиса -Menten кинетика).

Несмотря на преимущества экспресс-метода, несколько ограничений метода следует признать также. Самым важным шагом протокола является время. Образцы крови должны быть разведены в RAPID буфере сразу после забора крови, который может быть трудным в клинических условиях. Кроме того, этот метод требует больше времени, требует более высокого уровня подготовки, а также более дорогостоящим, чем стандартной обработки крови. Хотя это может быть сложно реализовать в повседневной клинической практике, это будет полезно для исследовательских целей, особенно когда только тонкие различия, как ожидается, и, следовательно, высокий выход пептида является желательным.

Хотя RAPID метод описан и рекомендуется со всеми его компонентами (R эвольвентной температур, A cidification, P rotease торможение, я sotopic экзогенные управления и D ilution) в настоящей работе, будущие исследования могут использовать модификации этого метода. Использование изотопных экзогенных элементов управления не может быть обязательным, и, следовательно, ограничена экспериментальных исследований, с тем чтобы определить, какие пептиды показывают наибольшее улучшение добычи нефти с использованием быстрой обработки. Кроме того, также состав ингибиторов протеаз могут быть изменены, когда оцениваются другие пептиды. Тем не менее, это должно быть проверено, когда измеряется новый пептид.

Таким образом, быстрый метод обработки крови может быть использован для человеческой крови и значительно улучшить восстановление 9/9 пептидов тестируемых по сравнению со стандартной обработкой крови. Так как для некоторых пептидов лишь небольшое или умеренное улучшение наблюдалось восстановление, необходимостьспособа может быть испытанным, когда новый пептид анализируют. Кроме того, быстрый метод позволяет для обнаружения правильной молекулярной форме, как показано на ацил грелина, а также значительно увеличивает выход эндогенных уровней циркулирующего пептидов, таких как kisspeptin по сравнению со стандартной обработкой крови. Таким образом, этот метод должен быть полезным инструментом в исследованиях на людях , оценивающих циркулирующих уровней пептидов, например. тех, кто участвует в регуляции голода и сытости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана STE Research Foundation German 1765 / 3-1 (AS) и германским министерством по образованию и научным исследованиям 03IPT614A (CG). Мы благодарим Reinhard Ломмель и Петра Буссе за отличную техническую поддержку, а также Карин Йоханссон и Кристины Hentzschel за помощь в организации и проведения антропометрических измерений

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377, (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263, (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14, (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37, (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50, (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150, (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31, (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23, (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306, (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93, (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45, (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22, (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147, (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86, (12), 5992 (2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11, (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92, (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20, (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282, (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349, (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42, (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414, (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28, (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402, (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18, (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22, (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88, (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9, (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279, (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21, (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34, (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14, (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics