Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen

Immunology and Infection

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Summary

Die RAPID Blutverarbeitungsverfahren kann beim Menschen eingesetzt werden und liefert höhere Peptidspiegel sowie ermöglicht die Beurteilung der richtigen molekularen Form. Daher wird dieses Verfahren ein wertvolles Werkzeug in der Peptid Forschung sein.

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Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

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Abstract

Die Forschung im Bereich der Nahrungsaufnahme Regulierung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Dazu gehört oft die Messung von Peptiden Regulierung der Nahrungsaufnahme. Für die korrekte Bestimmung der Konzentration des Peptids, sollte es während der Blutverarbeitung stabil sein. Dies ist jedoch nicht der Fall für mehrere Peptide, die durch endogene Peptidasen schnell abgebaut werden. Vor kurzem haben wir eine Blutverarbeitungsverfahren unter Verwendung von R educed Temperaturen entwickelt, A cidification, rotease P Hemmung, I sotopic exogenen Kontrollen und D ilution (RAPID) für die Verwendung in Ratten. Hier haben wir diese Technik für den Einsatz beim Menschen festgestellt und untersucht Erholung, molekulare Form und zirkulierende Konzentration der Nahrungsaufnahme regulatorischen Hormone. Die RAPID Verfahren erheblich verbessert die Erholung für 125 I-markierte Somatostatin-28 (+ 39%), Glucagon-like Peptid-1 (+ 35%), Acyl- Ghrelin und Glukagon (+ 32%), Insulin und kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), Leptin(+ 21%) und Peptid YY 3-36 (+ 19%) im Vergleich zu Standard - Verarbeitung (EDTA - Blut auf dem Eis, p <0,001). Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zeigte die Elution von endogenen Acyl Ghrelin an der erwarteten Position, nachdem eine schnelle Verarbeitung, während nach Standardverarbeitungs 62% der Acyl Ghrelin abgebaut wurden in einem früheren Peak resultierende Wahrscheinlichkeit darstellt Desacyl Ghrelin. Nach dem schnellen Verarbeitung der Acyl- / Desacyl Ghrelin - Verhältnis im Blut von normalen gewichtigen Probanden betrug 1: 3 im Vergleich zu 1.23 folgende Standardverarbeitung (p = 0,03). Auch endogene kisspeptin Werte waren höher nach RAPID Vergleich zu Standardverarbeitung (+ 99%, p = 0,02). Die RAPID Blutverarbeitungsverfahren kann beim Menschen verwendet werden, ergibt höhere Peptidspiegel und ermöglicht die Beurteilung der richtigen molekularen Form.

Introduction

Angesichts der weltweit zunehmenden Verbreitung von Fettleibigkeit 1,2, Forschung auf dem Gebiet der Nahrungsaufnahme Regulierung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Während bisher nur ein Peptid bekannt ist , dass peripher produziert und wirkt zentral Nahrungsaufnahme zu stimulieren, nämlich Ghrelin 3, in den letzten Jahrzehnten hat sich ein breites Spektrum von Peptiden worden , die Aufnahme zu reduzieren Lebensmittel identifiziert, z. B. Leptin, Peptid YY (PYY) und auch Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) und Insulin - 4 daher in Studien , die die Regulationsmechanismen von Hunger und Sättigung Peptidspiegel sucht werden oft beurteilt und zugleich wird angenommen , dass das Peptid untersucht ist stabil und mit hoher Ausbeute während der Plasmabildung wiedergewonnen. Doch sehr oft ist dies nicht der Fall aufgrund der schnellen endogenen Abbau nach wie vor für zB gezeigt. Ghrelin , die aus Acyl abgebaut wird Ghrelin 5 bis Desacyl. Deshalb haben wir beschrieben, vor kurzem die schnelle Methode zur Blut VorarbVerwendung von R educed Temperaturen bei Ratten singen, A cidification, rotease P Hemmung, ich sotopic 6 exogene Kontrollen und D ilution. Dieses Verfahren verbessert die Erholung für 11 von 12 Peptiden getestet und für die Bestimmung des richtigen zirkulierende molekularer Form im Vergleich zu Standardblutverarbeitung (EDTA - Blut auf Eis) erlaubt 6. Dieses Verfahren wurde in mehreren nachfolgenden Studien 7-12 zur Detektion von zirkulierenden Ghrelin sowie Corticotropin-Releasing - Faktor 13 verwendet. Daher hat das Verfahren für die Peptidforschung in Nagetieren als nützlich erwiesen. da Nagetier Studien sind jedoch nicht immer übersetzbar zu anderen Spezies, soll das Verfahren auch für die Verwendung im menschlichen Blut hergestellt werden.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die schnelle Methode zur Blutverarbeitung beim Menschen im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung, EDTA - Blut auf dem Eis zu testen, die weit 14 empfohlen und häufig uin der klinischen sowie Forschungs Einstellung sed. Wir testeten die Wiederherstellung einer Auswahl von 125 I-markierten Peptiden in der Regulation der Nahrungsaufnahme einschließlich etablierten Peptide beteiligt sowie neue Kandidaten vor kurzem in der Fütterung Regulierung eine Rolle zu spielen vorgeschlagen folgende Verarbeitung (Auswirkungen auf die Nahrungsaufnahme sind in Tabelle 1 gezeigt) mit beiden Methoden. Hormone wurden auch verwendet, um Peptide von unterschiedlicher Länge und Ladung (Tabelle 2) ausgewählt. Darüber hinaus für Ghrelin untersuchten wir die molekularen Form (en) nach dem Standard und schnelle Methode. Schließlich wir endogene Ghrelin (acyl und Desacyl Ghrelin) sowie kisspeptin Ebenen bewertet, ein Peptid , auch vor kurzem vorgeschlagen , eine Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme 15,16 folgenden RAPID oder Standard - Verarbeitung zu spielen. Darüber hinaus untersuchten wir auch diese Peptid - Werte in einer Population von Patienten mit einer breiten Palette von Body - Mass - Index ( im Bereich von 10,2 bis 67,6 kg / m 2) possib zu studierenle Unterschiede zu chronisch veränderte Körpergewicht bezogen.

Tabelle 1

Tabelle 2

Diagnose, Bewertung und Plan:
Die Studienteilnehmer
Alle Studienteilnehmer wurden neu Patienten im Krankenhaus (Aufnahme innerhalb von zwei Tagen nach der Aufnahme ins Krankenhaus war) der Abteilung für Psychosomatische Medizin an der Charité-Universitätsmedizin Berlin und gab informierte Zustimmung geschrieben. Um zu vermeiden, wurden keine Auswirkungen von Geschlecht nur weibliche Patienten eingeschlossen. Insgesamt 42 Probanden nahmen an dieser Studie und wurden in drei Gruppen eingeteilt: Normalgewicht (BMI 18,5 bis 25 kg / m 2, n = 12), Anorexia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) und Adipositas (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorexic und adipösen Patienten warennach der Internationalen Klassifikation der Krankheiten-10 diagnostiziert und für die Gewichtszunahme (Anorexia nervosa) oder Gewichtsreduktion (Adipositas), die jeweils im Krankenhaus. Alle Normalgewicht Patienten wurden ausschließlich auf somatoforme Symptome ohne relevante somatische Störungen ins Krankenhaus. Patienten mit Magen-Darm-somatoforme Symptome oder einer Vorgeschichte von Magen-Darm-Chirurgie wurden ausgeschlossen. Ausschlusskriterien umfassten auch ein Alter <18 Jahre, aktuelle Schwangerschaft und unbehandeltem psychotischen Erkrankungen. Die Blutentnahme wurde am Tag 2 oder 3 nach Einlieferung ins Krankenhaus durchgeführt, bevor diätetischen Behandlung, um Aufnahmekörpergewicht zu erhöhen oder zu verringern, beziehungsweise. Anthropometrische Parameter wurden am selben Tag untersucht.

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Protocol

Das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Humanforschung genehmigt (Protokollnummer EA1 / 114/10).

1. Blutverarbeitung

  1. Venöses Blut von 7.00 bis 08.00 Uhr nach nächtlichem Fasten aus einem Unterarm Vene und Verfahren nach Standardverfahren oder der RAPID-Methode. Weisen Sie die Themen nicht ausüben oder rauchen vor der Blutentnahme.
  2. Für Standard-Verarbeitung, sammeln Blut in gekühlten EDTA-enthaltenden Röhrchen und Zentrifuge innerhalb von 10 min bei 3000 × g für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und halten bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung durch Radioimmunoassay.
  3. Für die schnelle Verarbeitung, sofort Blut verdünnen (innerhalb von 1 min nach der Blutentnahme) 1:10 in eiskaltem Puffer (pH 3,6), enthaltend 0,1 M Ammoniumacetat, 0,5 M NaCl und Enzyminhibitoren (Diprotin A, E-64-d, Antipain , Leupeptin, Chymostatin, 1 & mgr; g / ml). Dann Zentrifuge innerhalb von 10 min bei 3000 xg für 10 min bei 4 ° C und sammle Überstand using einer Pipette in Polypropylenröhrchen nach wie vor 6 bei Ratten beschrieben.
    1. Lade Chromatographie Patronen (360 mg, 55 bis 105 & mgr; m) mit 100% Acetonitril (Rate 10 ml / min), ins Gleichgewicht mit 0,1% Trifluoracetat (TFA, Rate 10 ml / min) und die Last mit dem Überstand bei einer konstanten Geschwindigkeit von 1 ml / min eine Spritzenpumpe.
    2. Danach waschen Kartuschen mit 3 ml 0,1% TFA (Rate 10 ml / min) und langsam mit 2 ml 70% Acetonitril, das 0,1% TFA (2 ml / min) eluiert.
    3. Trockene eluierten Proben unter Verwendung von Vakuum Zentrifugation und bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung durch Radioimmunoassay.
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in Polypropylen (RAPID - Verarbeitung) und Borosilikat (Radioimmunoassay) Rohre , die deutlich niedrigere Oberflächenbindungseigenschaften aufweisen und somit Peptidverlust für die meisten der vor 26 suchten Peptide minimieren.

2. Messungen

Hinweis: Die Schritte in diesem Abschnitt sollte in einem Labor durchgeführt werden,für die Arbeit mit radioaktiven Stoffen zertifiziert. Standard - Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit mit 125 I genommen werden sollte.

  1. Wiederherstellung von radiomarkiertem Peptides
    1. Erhalten Sie 125 I-radiomarkierte menschliche Peptide (z. B. Acyl-Ghrelin, GLP-1, Glukagon, Insulin, kisspeptin, Leptin, nesfatin-1, PYY 3-36 und Somatostatin-28).
    2. Halten Peptide in Pulverform, bis das Experiment, dann frisch verdünnt in 0,1% Essigsäure (~ 100.000 cpm pro ml).
    3. Für Standard-Blutverarbeitung, direkt nach der Blutentnahme in ein gekühltes EDTA enthaltenden Röhrchen, je 1 ml Blut in ein Röhrchen mit 50 ul radioaktiven Marker enthält 3000-6000 cpm (direkt gezählt, bevor das Experiment beginnt).
    4. Für die schnelle Verarbeitung, Übertragung 1 ml Blut aus EDTA-Blut in ein Röhrchen mit 9 ml RAPID-Puffer, enthaltend (Zusammensetzung siehe 1.3) und 500 & mgr; l radioaktiven Marker enthält 30.000-60.000 cpm. Aufgrund der 1:10 Verdünnung Einsatz 10-mal höheres Volumen an radiolabel für eine schnelle Verarbeitung.
    5. Danach Prozessproben wie in den Schritten 1.2 bis 1.3.2 beschrieben.
    6. Für die Wiederfindungsversuche, nicht trockene Proben durch Vakuum Zentrifugation und lagern nicht bei -80 ° C. Stattdessen beurteilen Gewinnung von radioaktiv markierten Peptiden direkt danach einen Gamma-Zähler verwendet wird.
    7. Messen Sie die gesamte Überstand in Standardproben, während in RAPID Proben 1/10 des Gesamtvolumens analysieren Vergleichbarkeit der Menge an radioaktiver Markierung verwendet zu erhalten. Zur Messung den Überstand in den Rohren in den Gamma-Zähler Einbau und die Zählungen pro Minute beurteilen
    8. Als 100% ige Standard, verwenden Sie zwei Proben mit 50 ul 125 I-radiomarkierten Peptid , das die Verarbeitung nicht unterziehen. Messen, die gleichzeitig mit anderen Proben, wie in 2.1.7 beschrieben.
    9. Führen Sie die Experiment fünf bis sechs Mal für jedes Peptid.
  2. High Performance Liquid Chromatography of Radiolabeled Ghrelin
    1. Ziehen Sie Blut in chilled EDTA-Röhrchen und je 1 ml in Röhrchen, die 200 & mgr; l radiomarkierten-acyl Ghrelin enthält 15.000-20.000 cpm (gezählt direkt bevor das Experiment beginnt) enthält.
    2. Für die schnelle Verarbeitung, Übertragung 1 ml Blut in ein Röhrchen mit 9 ml RAPID-Puffer (Zusammensetzung siehe 1.3) und 200 & mgr; l radiomarkierte Acyl- Ghrelin enthält 15.000-20.000 cpm.
    3. Danach Prozessproben wie in den Schritten 1.2 bis 1.3.2 beschrieben.
    4. Zur weiteren Analyse durch Umkehrphasen-HPLC, laden direkt Proben auf eine stabile Bindung C18-Säule (2,1 mm x 50 mm, 1,8 & mgr; m), äquilibriert in 17% Acetonitril in Wasser (beide mit 0,1% TFA ergänzt).
    5. Nach 5 min Äquilibrierung mit einem Gradienten von 17 bis 40% Acetonitril verwenden, um die Probe in 40 min (Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min) zu eluieren.
    6. Sammle Fraktionen von 1 ml pro Minute und zu analysieren, die Radioaktivität eines Gamma-Zählers verwendet wird.
    7. In einem separaten Experiment, Last 200 ul radioaktiv markiertes Acyl Ghrelin enthält 15.000-20.000cpm auf die Säule direkt und HPLC zuführen, wie 2.2.4 bis 2.2.6 in Schritten beschrieben.
  3. Radioimmunoassay
    1. Für Radioimmunoassay, auftauen gefrorenen Stände (Standardverarbeitung) und getrocknete Pulver (RAPID-Methode) bei Raumtemperatur-Vakuum.
    2. Unmittelbar vor dem Radioimmunoassay, resuspendieren trockenen RAPID Proben in doppelt destilliertem H 2 O nach dem ursprünglichen Volumen von Plasma (500 ul).
    3. Beurteilen kisspeptin und insgesamt (einschließlich sowohl Desacyl und Acyl Ghrelin) sowie acyl Ghrelin wie zuvor beschrieben 12,27 kommerziellen Radioimmunoassays verwendet , gemäß der Herstellerprotokolle. Verwenden Sie Borosilikat-Rohre, die stabile Pelletbildung ermöglichen.
      1. Am ersten Tag, inkubiere die Proben mit Testpuffer und primärem Antikörper (z. B. anti-Ghrelin) in der Verdünnung durch den Hersteller für einen Zeitraum von 24 Stunden vorgesehen ist .
      2. Am zweiten Tag, fügen Sie die 125 I - Tracer (zB 125 I-Ghrelin), voRTEX und für einen Zeitraum von 24 Stunden inkubieren.
      3. Am dritten Tag, fügen Sie das Fällungsreagenz, Wirbel und Inkubation, wie vom Hersteller empfohlen. Dann Zentrifugenröhrchen bei 3.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie die Überstände und zählen Radioaktivität in den Pellets mit einem Gamma-Zähler mit
    4. Berechnen Desacyl Ghrelin als Differenz der gesamten minus Acyl- Ghrelin. Beurteilen Sie die Acyl / Desacyl Ghrelin Verhältnis von Acyl von Desacyl Ghrelin für jede einzelne Probe dividiert wird.
    5. Verarbeiten Sie alle Proben - wenn möglich - in einer Charge Variabilität zwischen den Tests zu vermeiden. Die Intra-Assay-Variabilität in dem vorliegenden Experiment war <8% für kisspeptin, <7% für insgesamt und <9% für Acyl Ghrelin.

3. Statistische Analyse

  1. Bestimmen Sie die Verteilung der Daten des Kolmogorov-Smirnov-Test. Express-Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM).
  2. Beurteilen, Unterschiede zwischen zweiGruppen durch t-Test. Beurteilen Sie die Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen von allen paarweisen Mehrfachvergleichsverfahren (Tukey post hoc - Test) oder Zwei-Wege - ANOVA , gefolgt von Holm-Sidak Methode.
  3. Betrachten Sie p <0,05 signifikant und führen Analysen ein Statistik - Programm.

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Representative Results

RAPID Blutverarbeitung erhöht die Ausbeute von 125 I-radiomarkierten Peptide im menschlichen Blut im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung.
Nach Standardblutverarbeitungs (EDTA Blut auf Eis), war die Rückgewinnung von radiomarkierten Peptide ~ 60% in 9/9 Peptide ( im Bereich von 48 bis 68%, 1A - K). Schnellverarbeitung , die Ausbeute in allen 125 I-markierte Peptide, nämlich in Somatostatin-28 (+ 39%, 1A), Glucagon-like peptide-1 (+ 35%, 1B), Acyl- Ghrelin (n-Octanoyl Ghrelin verbessert, + 32%, 1C), Glucagon (+ 32%, 1D), Insulin (+ 29%, 1E), kisspeptin (+ 29%, 1F), nesfatin-1 (+ 28%, 1G), Leptin (+ 21%, Figur 1H) und Peptid YY 3-36 (+ 19%, Bild 1K) im Vergleich zur Standardverarbeitung (p <0.001). In diesen 9 Peptide war die Erholung nach dem Verfahren RAPID ~ 90% ( im Bereich von 71 bis 98%, 1A - K).

Abbildung 1
Abb . 1: Gewinnung von 125 I-markierte Peptide im menschlichen Blut folgenden Standard oder RAPID Blutverarbeitung Radiolabeled Peptid wurde zu menschlichem Blut aufgenommen und verarbeitet werden nach Standardverfahren (EDTA - Blut auf Eis) oder die RAPID - Methode (reduzierten Temperaturen, Versauerung, Protease Hemmung, Isotopen exogene Kontrollen und Verdünnung). Die Überstände wurden auf Radioaktivität gesammelt und gezählt. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± SEM von fünf bis sechs Experimenten. *** P <0,001 vs. Standardverarbeitung. Bitte hier klicken , um viewa größere Version dieser Figur.

Im Anschluss an eine schnelle Verarbeitung, Ghrelin Eluate an der erwarteten Position.
Nach raschem Verarbeitung von menschlichem Blut, 125 I-markiertem Ghrelin an der erwarteten Position eluiert, während nach dem Standardverfahren eine frühere Spitzen wahrscheinlich beobachtet entsprechenden Ghrelin (Abbildung 2) zu Desacyl. Dies entsprach einem 62% igen Abbau des Peptids.

Figur 2
Abbildung 2:. Elutionsprofil von 125 I-markierte Acyl- Ghrelin im Blut des Menschen folgenden Standard oder RAPID Blutverarbeitung Radiolabeled Peptid wurde zu menschlichem Blut aufgenommen und verarbeitet werden nach Standardverfahren oder bei der RAPID - Methode. Danach wurde der Überstand auf eine Hochleistungsflüssigchromatographie-Säule geladen. Das Eluat wurde coljede Minute wählten und auf Radioaktivität gezählt. Nach raschem Verarbeitung meisten des Peptids zu der erwarteten Zeit eluiert, während nach dem Standard einen großen Anteil früher eluierte Verarbeitung, was höchstwahrscheinlich Desacyl Ghrelin. Abkürzung:. Cpm, Zählungen pro Minute Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Verbessert die Blutschnellverarbeitung der Acyl- / Desacyl Ghrelin-Verhältnis und führt zu einer erhöhten Endogene Kisspeptin Blutspiegel im Vergleich zu Standard-Verarbeitung.
Blut wurde von anorexic, Normalgewicht abgezogen und übergewichtigen Probanden und verarbeitet nach dem Standard oder zügiges Verfahren. Endogene Ghrelin (total und Acyl Ghrelin) wurde durch Radioimmuntest bewertet. Anthropometrische und Komorbiditäten / Medikamente der Studiengruppen sind in den Tabellen 3 und 4 gezeigt. Nach dem schnellen Verarbeitung das Acyl / Desacyl Ghrelin - Verhältnis im Blut von normalen gewichtigen Probanden betrug 1: 3 im Vergleich zu 1.23 folgende Standard - Blutverarbeitung (p = 0,03; 3A). Ähnliche Ergebnisse wurden unter anorexic beobachtet (1: 3 gegen 01.19, p <0,001) und adipösen Bedingungen (1: 3 vs 1,13; p = 0,04; 3A.). Es wurden keine Unterschiede zwischen den drei verschiedenen Gruppen für Standard- oder schnelle Verarbeitung (3A) beobachtet. Zwei - Wege - ANOVA zeigte einen signifikanten Einfluss des Verarbeitungsverfahrens (F 1,64 = 15,3, p <0,001), während das Körpergewicht / metabolischen Zustand keine Wirkung hatte (F 2,64 = 0,5, p = 0,62).

Tabelle 3

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Zirkulierende endogenen kisspeptin signifikant höher folgende RAPID im Vergleich zu Standard - Verarbeitung in anorexic (+ 60%, p = 0,02) und normalgewichtigen Probanden (+ 99%, p = 0,02), während die Differenz nicht Bedeutung unter den Bedingungen der Fettleibigkeit erreicht haben ( 23%, p = 0,39; 3B). Wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei verschiedenen Gruppen BMI (; 3B p> 0,05) beobachtet. Zwei - Wege - ANOVA zeigte einen signifikanten Einfluss des Verarbeitungsverfahrens (F 1,74 = 10,8, p = 0,002), während das Körpergewicht / metabolischen Zustand keine Wirkung hatte (F 2,74 = 0,5, p = 0,60).

Figur 3 Abbildung 3: Die Umlauf Acyl- / Desacyl Ghrelin - Verhältnis und Umlauf Kisspeptin Levels unter verschiedenen metabolischen Bedingungen folgenden RAPID oder Standard - Blutverarbeitung Blut wurde mit Anorexie, normales Gewicht oder übergewichtigen Probanden nach einer nächtlichen schnell und verarbeitet werden nach Standardverfahren oder bei der RAPID Verfahren zurückgezogen.. Der Überstand wurde gesammelt und Acyl- sowie insgesamt Ghrelin Ebenen oder kisspeptin Ebenen (B) durch Radioimmunoassay beurteilt. Desacyl Ghrelin wurde durch Subtraktion Acyl von insgesamt Ghrelin erhalten. Das Verhältnis wurde durch Dividieren acyl berechnet durch Desacyl Ghrelin (A). Die Gruppengröße wird am Boden der Spalten angegeben. Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. * P <0,05, ** p <0,01 und *** p <0,001 vs. Standard - Verarbeitung. Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehendiese Figur.

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Discussion

Wir berichteten vor , dass die schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Erholung für 12.11 Peptide im Vergleich zu Standardblutverarbeitung bei Ratten verbessert 6. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass dieses Verfahren auch für die Anwendung beim Menschen geeignet ist. Im Anschluss an eine schnelle Verarbeitung, die Erholung für 9 von 9 125 I-markierten Peptiden getestet wurde verbessert im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung (EDTA - Blut auf Eis). Die beobachtete Verbesserung reichten von 19 bis 39%, was wahrscheinlich relevant sein soll, insbesondere unter Bedingungen, wenn nur kleine Unterschiede zu erwarten sind, die maskiert werden kann, wenn die Ausbeute des Peptids niedrig ist.

Wir zeigten auch, dass nach RAPID Blutverarbeitung Ghrelin ist an der richtigen Eluierposition nach HPLC, welche die korrekte molekulare Form (acyl Ghrelin) nachgewiesen, während nach einer Standard-Blutverarbeitungs 2/3 abgebaut werden Ghrelin Desacyl. Da die Acylgruppe ist für 28, an die Ghrelin - Rezeptorbindungs ​​de-Acylierung wird erwartet, dass die biologische Funktion des Peptids wesentlich zu verändern. Allerdings wird auch Desacyl Ghrelin zunehmend als biologisch aktives Peptid 29 erkannt. Interessanterweise wurde Desacyl Ghrelin vorgeschlagen , um die Effekte von Ghrelin entgegenzuwirken als 31 , bevor sie für die Nahrungsaufnahme 30 oder Kolonmotilität gezeigt. Dies unterstreicht ferner die Bedeutung der richtigen molekularen Form zu untersuchen.

Wenn die endogenen Spiegel von kisspeptin bei normalgewichtigen Probanden studieren, haben wir gezeigt, stark erhöhte Konzentrationen (+ 99%) RAPID folgenden im Vergleich zu Standardblutverarbeitung. Es wurde jedoch keine Verbesserung unter den Bedingungen der Fettleibigkeit beobachtet, was auf die insgesamt erhöhte kisspeptin Niveaus zurückgeführt werden kann (+ 50% bei adipösen vs. Normalgewicht). Zwischen BMI Gruppen (Anorexia nervosa, Normalgewicht und Adipositas) im Blut verarbeitet mit beiden Verfahren wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, was auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass nur Fasten Ebenen WERe beurteilt. Unterschiede könnten offensichtlich postprandial, eine Hypothese, dass in zukünftigen Studien untersucht werden sollten.

Kisspeptin wurde in Studien gemessen , bevor nur EDTA - Röhrchen auf Eis 32 (in der vorliegenden Studie bezeichnet als Standard - Verarbeitung) oder durch die Zugabe von Protease - Inhibitoren 33 verwendet wird . Auf der Grundlage der vorliegenden Studie ist die Abkühlung der Rohre nicht ausreichend Peptidabbau zu verhindern. Ob allein Versauerung oder einzelne Protease-Inhibitoren sind genug kisspeptin zu bewahren sollte in zukünftigen Studien untersucht werden.

In ähnlicher Weise eine schnelle Verarbeitung erhöht auch die Ausbeute von Ghrelin endogenen Acyl, wie durch einen stark erhöhten Acyl / Desacyl Ghrelin-Verhältnis angezeigt (1: 3) im Vergleich zu Standard-Blutverarbeitung (01.23). Dieser Befund zeigt eine gute Übereinstimmung mit Nagetier-Studien, in denen wir eine Acyl- / Desacyl Ghrelin-Verhältnis von 1 berichtet: 5 folgende schnelle Verarbeitung vor (im Vergleich zu 1.19 nach einer Standard-Verarbeitung).Die breiten Bereiche der Acyl- / Desacyl Ghrelin - Verhältnis von 1.15 bis 1.55 34,35 berichtet waren , bevor daher höchstwahrscheinlich aufgrund einer Deacylierung abhängigen hohen Anteil an Desacyl Ghrelin. Wie oben für kisspeptin beschrieben, wurden keine Veränderungen des Säure / Desacyl Ghrelin - Verhältnis unter verschiedenen Bedingungen von chronisch veränderten Körpergewicht (Anorexia nervosa vs. Normales Gewicht vs. Adipositas) beobachtet. Dies kann auch auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass nur Nüchternniveaus Acyl- / Desacyl Ghrelin wurden bewertet und die postprandiale Regulierung ist wichtiger. Auf der anderen Seite zeigt dies auch, dass trotz der chronisch veränderten Körpergewicht der Anteil der Acyl- und Desacyl Ghrelin nicht unter basalen Bedingungen geändert wird und eine wichtige Rolle in der adaptiven Veränderungen können unter diesen Bedingungen nicht beobachtet spielen. zukünftige Studien mit standardisierten Mahlzeit Protokolle jedoch und die schnelle Methode Anwendung wird helfen, diese Frage weiter zu beantworten.

Der RAPID michthode verwendet die folgenden Komponenten: Da chemische Reaktionen meist auf 36 temperaturabhängig eine Reduktion der Temperatur einer eiskalten Lösung unter Verwendung verlangsamt den Abbau des Peptids. Als nächstes wird auch eine Abnahme der pH (Versäuerung) verringert sich die Geschwindigkeit des Abbaus 37. Außerdem verringert eine Verringerung des pH-Werts, die Adsorption der Peptide an andere Oberflächen und damit verringert sich auch die Gefahr des Peptidverlust. Die Proteaseinhibitoren hier verwendet wurden gewählt , um ein breites Spektrum von endogenen Peptidasen zu bedecken: ( , z. B. Kathepsin B / H) Diprotin A als Inhibitor der Dipeptidyl - peptidase IV, E-64-d als Inhibitor für Thiolproteasen, Antipain als ein Inhibitor für Trypsin, Papain und Cathepsin A / B, Leupeptin als Inhibitor für Trypsin, Plasmin, Papain und Cathepsin und Chymostatin als Inhibitor für Chymotrypsin, Papain und Cathepsin B / G. Außerdem sind Isotopen Peptide nützlich, um die Verbesserung der Rückgewinnung durch das Verfahren zu bewerten. Schließlich ist, wie die Geschwindigkeit of das Enzym-Substrat - Komplexes Bildung hängt von der Konzentration des Enzyms (Peptidase) und dem Substrat (Peptid - Hormon) 38 Verdünnung des Plasmas reduziert die Geschwindigkeit der Bildung und damit Abbau (ein zehnfacher Verdünnung reduziert die Rate verhundertfacht entsprechend der Michaelis -Menten Kinetik).

Trotz der Vorteile des schnellen Verfahrens mehrere Einschränkungen des Verfahrens sollte auch anerkannt werden. Der kritischste Schritt des Protokolls ist die Zeit. Die Blutproben sind in der RAPID Puffer unmittelbar nach der Blutentnahme verdünnt werden, die in der klinischen Umgebung schwierig sein kann. Darüber hinaus ist das Verfahren zeitaufwendig, erfordert ein höheres Maß an Ausbildung und ist auch teurer als Standard-Blutverarbeitung. Obwohl es in der klinischen Routine zu implementieren, kann eine Herausforderung sein, wird es für Forschungszwecke nützlich sein, insbesondere wenn nur kleine Unterschiede zu erwarten sind und somit eine hohe Ausbeute des Peptids erwünscht.

Obwohl die RAPID - Methode wird mit all seinen Komponenten beschrieben und empfohlen (R educed Temperaturen, A cidification, P rotease Hemmung, ich sotopic exogene Kontrollen und D ilution) in der vorliegenden Arbeit können zukünftige Studien Modifikationen dieser Technik verwenden. Die Verwendung von Isotopen exogene Kontrollen können nicht obligatorisch sein und daher auf Pilotstudien beschränkt, um zu beurteilen, welche Peptide, die die größte Verbesserung bei der Wiederherstellung unter Verwendung von RAPID Verarbeitung zeigen. Darüber hinaus auch die Zusammensetzung des Proteaseinhibitorcocktail kann modifiziert werden, wenn andere Peptide bewertet werden. Dies sollte jedoch überprüft werden, wenn ein neues Peptid gemessen wird.

Zusammenfassend kann die schnelle Methode der Blut Verarbeitung für den menschlichen Blut verwendet werden und erheblich verbessert die Rückgewinnung von 09.09 Peptide im Vergleich zu Standardblutverarbeitung getestet. Da für einige Peptide, die nur eine geringe bis moderate Verbesserung der Genesung beobachtet wurde, die Notwendigkeitdes Verfahrens müssen getestet werden kann, wenn ein neues Peptid analysiert. Darüber hinaus ermöglicht die schnelle Methode zum Nachweis des korrekten molekularen Form wie für Acyl Ghrelin gezeigt und erhöht auch die Ausbeute an endogenem zirkulierenden Spiegel von Peptiden wie kisspeptin Vergleich zu Standardblutverarbeitung. Daher sollte dieses Verfahren ein nützliches Werkzeug in Humanstudien werden Peptidspiegel Beurteilung Zirkulieren, z. B. diejenigen, die in der Regulation von Hunger und Sättigung beteiligt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Deutsche Forschungsgemeinschaft STE 1765 / 3-1 (AS) und Bundesministerium für Bildung und Forschung 03IPT614A (CG) unterstützt. Wir danken Reinhard Lommel und Petra Buße für ihre hervorragenden technischen Support sowie Karin Johansson und Christina Hentzschel für die Hilfe bei Organisation und Durchführung von anthropometrische Messungen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

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