Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani e produce livelli di peptide superiori e consente la valutazione della forma molecolare corretta. Pertanto, questo metodo sarà uno strumento prezioso nella ricerca del peptide.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La ricerca nel campo della regolazione dell'assunzione di cibo sta guadagnando importanza. Questo spesso include la misurazione dei peptidi che regolano l'assunzione di cibo. Per la corretta determinazione della concentrazione di un peptide, dovrebbe essere stabile durante il trattamento del sangue. Tuttavia, questo non è il caso di diversi peptidi che vengono rapidamente degradati da peptidasi endogene. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo di trattamento del sangue che impiegano temperature R educed, A cidification, P rotease inibizione, ho sotopic controlli esogeni e D ilution (RAPID) per l'utilizzo nei ratti. Qui, abbiamo stabilito questa tecnica per l'uso nell'uomo e indagato recupero, forma molecolare e circolanti concentrazione di cibo ormoni regolatori. Il metodo RAPID ha migliorato significativamente il recupero per 125 I-marcato somatostatina-28 (+ 39%), glucagone-like peptide-1 (+ 35%), acile grelina e glucagone (+ 32%), l'insulina e kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), la leptina(+ 21%) e peptide YY 3-36 (+ 19%) rispetto al trattamento standard (sangue EDTA su ghiaccio, p <0.001). cromatografia liquida ad alte prestazioni ha mostrato l'eluizione di endogena grelina acile nella posizione prevista dopo l'elaborazione RAPID, mentre dopo il trattamento standard di 62% di acil grelina sono stati degradato con conseguente un picco precedente probabile che rappresenta desacyl grelina. Dopo l'elaborazione del rapporto RAPID grelina acil / desacyl nel sangue di soggetti normali di peso è stato di 1: 3 rispetto al 01:23 dopo trattamento standard (p = 0,03). Anche i livelli endogeni Kisspeptin erano più alti dopo RAPID rispetto al trattamento standard (+ 99%, p = 0,02). Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani, produce peptide superiori e permette di valutare la forma molecolare corretta.

Introduction

Alla luce della crescente diffusione in tutto il mondo di obesità 1,2, la ricerca nel campo della regolazione dell'assunzione di cibo sta guadagnando importanza. Mentre finora solo un peptide noto che perifericamente prodotta e azione centrale per stimolare l'assunzione di cibo, cioè grelina 3, negli ultimi decenni, una vasta gamma di peptidi è stato identificato che riducono l'assunzione di cibo, ad es. leptina, peptide YY (PYY) ed anche glucagone-like peptide-1 (GLP-1) e insulina 4, Pertanto, negli studi in meccanismi regolatori di livelli di fame e sazietà peptidici sono spesso valutata e, allo stesso tempo, si presume che il peptide studiato è stabile e recuperato con rese elevate durante la formazione del plasma. Spesso, tuttavia, questo non è il caso a causa della rapida composizione endogena come indicato in precedenza per es. grelina che viene degradata da acile a desacyl grelina 5. Pertanto, abbiamo recentemente descritto il metodo rapido per proces sanguecantare in ratti che impiegano temperature R educed, A cidification, P rotease inibizione, ho sotopic controlli esogeni e D ilution 6. Questo metodo migliorato recupero per 6 11 di 12 peptidi testati e consentiti per la determinazione della forma molecolare circolante corretta rispetto al trattamento del sangue standard (sangue EDTA su ghiaccio). Questo metodo è stato utilizzato in diversi studi successivi 7-12 per la rilevazione di grelina circolante e dal fattore di rilascio della corticotropina 13. Pertanto, il metodo si è dimostrato utile per la ricerca peptide nei roditori. Tuttavia, dal momento che studi su roditori non sono sempre traducibili ad un'altra specie, il metodo deve essere stabilito per l'uso nel sangue umano pure.

Lo scopo del presente studio è stato quello di testare il metodo rapido per il trattamento del sangue negli esseri umani rispetto al trattamento del sangue normale, il sangue EDTA sul ghiaccio, che è ampiamente consigliata 14 e frequentemente used nel così come ambiente di ricerca clinica. Abbiamo testato il recupero di una selezione di 125 peptidi I-etichettati coinvolti nella regolazione dell'assunzione di cibo tra cui peptidi stabiliti così come nuovi candidati recentemente suggerito di svolgere un ruolo nell'alimentare regolamento (effetti sulla assunzione di cibo sono riportati nella tabella 1) dopo la trasformazione con entrambi i metodi. Ormoni stati scelti anche rappresentare peptidi di lunghezza e di carica (Tabella 2) differente. Inoltre, per grelina abbiamo studiato la forma molecolare (s) seguendo il metodo standard e RAPID. Infine, abbiamo valutato la grelina endogena (acil e desacyl grelina), così come i livelli di kisspeptin, un peptide anche recentemente suggerito di svolgere un ruolo nella regolazione dell'assunzione di cibo 15,16 seguente trasformazione RAPID o standard. Inoltre, abbiamo anche studiato questi livelli di peptide in una popolazione di soggetti con una vasta gamma di indice di massa corporea (che vanno 10,2-67,6 kg / m 2) per studiare possibLe differenze relative al peso corporeo cronicamente alterato.

Tabella 1

Tabella 2

La diagnosi, valutazione, e Piano:
I partecipanti allo studio
Tutti i partecipanti allo studio sono stati recentemente pazienti ricoverati (inclusione era entro due giorni di ricovero in ospedale) della Divisione di Medicina Psicosomatica a Charité-Universitätsmedizin Berlino e ha dato consenso informato scritto. Per evitare qualsiasi impatto del genere solo pazienti di sesso femminile sono stati inclusi. Un totale di 42 soggetti hanno partecipato a questo studio e sono stati divisi in tre gruppi: peso normale (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anoressia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) e obesità (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). pazienti obesi Anorexic e sono statidiagnosticata secondo la classificazione internazionale delle malattie-10 e ricoverati in ospedale per l'aumento di peso (anoressia nervosa) o la riduzione del peso (obesità), rispettivamente. Tutti i pazienti di peso normale sono stati ricoverati esclusivamente a causa di sintomi somatoformi senza rilevanti disturbi somatici. Sono stati esclusi i pazienti con sintomi somatoformi gastrointestinali o una storia di chirurgia gastrointestinale. I criteri di esclusione comprendevano anche un'età <18 anni, gravidanza in corso e le malattie psicotiche non trattati. Il prelievo di sangue è stata eseguita il giorno 2 o 3 dopo il ricovero in ospedale prima del trattamento dietetico per aumentare o ridurre il peso corporeo, rispettivamente. parametri antropometrici sono stati valutati nello stesso giorno.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Il protocollo è stato approvato dal comitato etico locale per la ricerca umana (numero di protocollo EA1 / 114/10).

Processing 1. Sangue

  1. Raccogliere il sangue venoso 7:00-08:00 al mattino a digiuno da una vena e il processo avambraccio in base alla procedura standard o il metodo rapido. Istruire i soggetti di non esercitare o di fumo prima di prelievo di sangue.
  2. Per l'elaborazione di serie, raccogliere il sangue in provette EDTA contenenti refrigerati e centrifugare entro 10 min a 3.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare a -80 ° C fino ad ulteriore lavorazione con metodo radioimmunologico.
  3. Per l'elaborazione RAPID, subito diluire il sangue (entro 1 minuto dopo il ritiro del sangue) 1:10 in tampone ghiacciato (pH 3.6) contenente 0,1 M di acetato di ammonio, 0,5 M NaCl ed enzimi inibitori (diprotin A, E-64-D, antidolorifica , leupeptina, Chymostatin, 1 mg / ml). Poi, centrifugare entro 10 min a 3000 xg per 10 min a 4 ° C raccogli noi surnatanteing una pipetta in tubi di polipropilene come dettagliato prima nei ratti 6.
    1. cartucce cromatografia di carica (360 mg, 55-105 micron) con 100% di acetonitrile (tasso di 10 ml / min), equilibrare con 0,1% trifluoroacetato (TFA, tasso di 10 ml / min) e carico con il surnatante a una velocità costante di 1 ml / min utilizzando una pompa a siringa.
    2. Successivamente, lavare cartucce con 3 ml di 0,1% TFA (tasso di 10 ml / min) e lentamente eluire con 2 ml di 70% acetonitrile contenente 0,1% TFA (2 ml / min).
    3. campioni secchi eluiti mediante centrifugazione vuoto e conservare a -80 ° C fino ad ulteriore trasformazione da parte radioimmunoassay.
      NOTA: Esegue tutte le fasi in polipropilene (elaborazione RAPID) e borosilicato (radioimmunologico) tubi che presentano superficie significativamente inferiore proprietà vincolante e quindi ridurre al minimo la perdita di peptide per la maggior parte dei peptidi studiati prima del 26.

2. Misure

NOTA: I passaggi in questa sezione deve essere effettuata in un laboratoriocertificato per lavorare con materiale radioattivo. Precauzioni standard per il lavoro con 125 mi dovrebbe essere presa.

  1. Recupero di marcata radioattivamente Peptidi
    1. Ottenere 125 peptidi umani I-radioattivi (ad es. Acil-grelina, GLP-1, il glucagone, l'insulina, kisspeptin, leptina, nesfatin-1, PYY 3-36 e somatostatina-28).
    2. Mantenere peptidi in polvere fino dell'esperimento, poi appena diluito in 0,1% di acido acetico (~ 100.000 cpm per ml).
    3. Per il trattamento del sangue normale, subito dopo il prelievo di sangue in EDTA refrigerata contenente tubi, trasferire 1 ml di sangue in una provetta con 50 ml di radiomarcato contenente 3,000-6,000 cpm (contato direttamente prima dell'esperimento inizia).
    4. Per l'elaborazione RAPID, trasferire 1 ml di sangue di EDTA contenente sangue in una provetta contenente 9 ml di tampone RAPID (per la composizione vedi 1.3) e 500 microlitri radiomarcato contenente 30,000-60,000 cpm. A causa dell'uso diluizione 1:10 10 volte maggiori volumi di radiolabel per l'elaborazione RAPID.
    5. In seguito, i campioni di processo come descritto nei punti 1.2 a 1.3.2.
    6. Per gli esperimenti di recupero, fare i campioni non secchi per centrifugazione vuoto e non conservare a -80 ° C. Invece, valutare il recupero dei peptidi marcati radioattivamente subito dopo, utilizzando un contatore gamma.
    7. Misurare tutta surnatante in campioni standard, mentre in RAPID campioni analizzano 1/10 del volume totale di ottenere la comparabilità della quantità di radiomarcato utilizzato. Per la misurazione, trasferire il surnatante in tubi montaggio nel contatore gamma e valutare i conteggi per minuto
    8. Come standard 100%, utilizzare due campioni con 50 ml di 125 peptide I-radiomarcato che non sono sottoposti ad elaborazione. Misurare allo stesso tempo con altri campioni come descritto in 2.1.7.
    9. Eseguire l'esperimento cinque a sei volte per ogni peptide.
  2. Cromatografia liquida ad alte prestazioni di marcata radioattivamente grelina
    1. Prelevare il sangue in cEDTA hilled contenente tubi e trasferimento 1 ml di provette contenenti 200 ml grelina radiomarcato-acile contenente 15.000-20.000 cpm (contati direttamente prima dell'esperimento inizia).
    2. Per l'elaborazione RAPID, trasferire 1 ml di sangue in una provetta contenente 9 ml di tampone RAPID (per la composizione vedi 1.3) e 200 ml radiomarcato acile grelina contenente 15.000-20.000 cpm.
    3. In seguito, i campioni di processo come descritto nei punti 1.2 a 1.3.2.
    4. Per ulteriori analisi mediante HPLC in fase inversa, caricare direttamente i campioni su una colonna stabile legame C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,8 micron) equilibrata nel 17% acetonitrile in acqua (sia completato con 0,1% TFA).
    5. Dopo 5 minuti di equilibrio, usare un gradiente 17-40% acetonitrile per eluire il campione in 40 minuti (velocità di 1 ml / min).
    6. Raccogliere frazioni di 1 ml ogni minuto e analizzare la radioattività in un contatore gamma.
    7. In un esperimento separato, carico di 200 l radioattivo acile grelina contenente 15.000-20.000cpm sulla colonna direttamente ed eseguire HPLC come descritto nei punti 2.2.4 a 2.2.6.
  3. radioimmunoassay
    1. Per radioimmunoassay, scongelare supernatanti congelati (Processing Standard) e aspirare la polvere secca (metodo rapido) a temperatura ambiente.
    2. Immediatamente prima radioimmunoassay, risospendere campioni Rapid Dry a doppia H 2 O distillata in base al volume originale di plasma (500 microlitri).
    3. Valutare kisspeptin e totale (includendo sia desacyl e acile grelina), così come acile grelina come descritto in precedenza 12,27 utilizzando radioimmunologici commerciali secondo i protocolli dei produttori. Utilizzare tubi borosilicato che consentono la formazione di pellet stabile.
      1. Il primo giorno, incubare i campioni con tampone e anticorpo primario (es. Anti-grelina) in diluizione fornite dal produttore per un periodo di 24 ore.
      2. Il secondo giorno, aggiungere il 125 I tracciante (per esempio, 125 I-grelina), voRTEX e incubare per un periodo di 24 ore.
      3. Il terzo giorno, aggiungere il reagente precipitante, vortex e incubare come raccomandato dal produttore. Poi, provette per centrifuga a 3000 xg per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e contare la radioattività nel pellet utilizzando un contatore gamma
    4. Calcolare desacyl grelina come la differenza del totale grelina meno acile. Valutare il rapporto grelina acil / desacyl dividendo acile da desacyl grelina per ogni singolo campione.
    5. Elaborare tutti i campioni - se possibile - in un unico lotto per evitare la variabilità inter-saggio. La variabilità intra-saggio nel presente esperimento è stato <8% per kisspeptin, <7% per il totale e <9% per acile grelina.

3. Analisi statistica

  1. Determinare la distribuzione dei dati utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov. Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM).
  2. Valutare le differenze tra i duegruppi di t-test. Valutare le differenze tra più gruppi di tutte le procedure a coppie multiple di confronto (Tukey di test post hoc) o ANOVA a due vie seguita da metodo Holm-Sidak.
  3. Considerare p <0.05 significativa ed effettuare analisi utilizzando un programma di statistiche.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Trattamento del sangue RAPID aumenta il rendimento di 125 peptidi I-radiomarcato nel sangue umano rispetto al trattamento del sangue standard.
Dopo il trattamento del sangue standard (sangue EDTA su ghiaccio), il recupero dei peptidi radiomarcati era ~ 60% in 9/9 peptidi (che vanno dal 48-68%, Figura 1A - K). Trattamento rapido migliore la resa in tutte le 125 peptidi I-etichettati, vale a dire la somatostatina-28 (+ 39%, figura 1A), glucagone-like peptide-1 (+ 35%, figura 1B), acile grelina (n-ottanoil grelina, + 32%, figura 1C), glucagone (+ 32%, figura 1D), insulina (+ 29%, figura 1E), kisspeptin (+ 29%, figura 1F), nesfatin-1 (+ 28%, figura 1G), leptina (+ 21%, figura 1H) e peptide YY 3-36 (+ 19%, figura 1K) rispetto al trattamento standard (p <0.001). In questi 9 peptidi, il recupero dopo il metodo RAPID era ~ 90% (dal 71-98%, Figura 1A - K).

Figura 1
Figura 1:. Recupero di 125 peptidi I-etichettati nel sangue umano seguente standard o RAPID di lavorazione del sangue marcata radioattivamente peptide è stato aggiunto al sangue umano ed elaborato in base alle procedure standard (sangue EDTA su ghiaccio) o il metodo rapido (temperature ridotte, l'acidificazione, proteasi inibizione, controlli esogeni isotopiche e diluizione). I supernatanti sono stati raccolti e contati per la radioattività. Ogni colonna rappresenta la media ± SEM di cinque o sei esperimenti. *** P <0.001 vs elaborazione standard. Cliccate qui per viewa più grande versione di questa figura.

A seguito di un trattamento rapido, grelina eluisce alla posizione prevista.
Dopo l'elaborazione RAPID di sangue umano, 125 grelina I-marcato eluito nella posizione prevista, mentre dopo procedura standard un picco anteriore è stato osservato molto probabilmente corrispondente desacyl grelina (Figura 2). Ciò ha rappresentato una degradazione 62% del peptide.

figura 2
Figura 2:. Eluizione Profilo di marcato 125 I Acil grelina nel sangue umano seguente standard o RAPID di lavorazione del sangue marcata radioattivamente peptide è stato aggiunto al sangue umano ed elaborato in base alle procedure standard o il metodo rapido. Successivamente, il supernatante è stato caricato su una colonna per cromatografia liquida ad alte prestazioni. L'eluato era colzionato ogni minuto e contati per la radioattività. Dopo l'elaborazione RAPID maggior parte del peptide eluito al momento previsto, mentre dopo standard di elaborazione di una grande proporzione eluito precedenza, molto probabilmente rappresentano grelina desacyl. Abbreviazione:. Cpm, conteggi per minuto Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

RAPID di lavorazione del sangue migliora il rapporto grelina Acil / Desacyl e si traduce in aumento dei livelli ematici endogena Kisspeptin Rispetto al trattamento standard.
Il sangue è stato prelevato da anoressica, normopeso e obesi ed elaborati secondo la procedura standard o RAPID. grelina endogena (grelina totale e acile) è stata valutata mediante radioimmunologico. Antropometrici e comorbidità / farmaco dei gruppi di studio sono riportati nelle tabelle 3 e 4. Dopo l'elaborazione RAPID il rapporto grelina acil / desacyl nel sangue di soggetti normali di peso è stato di 1: 3 rispetto a 1:23 seguente elaborazione standard sangue (p = 0,03; Figura 3A). Risultati simili sono stati osservati sotto anoressico (1: 3 vs 1:19 p <0,001) e condizioni obesi (1: 3 vs 1,13; p = 0,04; Figura 3A.). Non sono state osservate differenze tra i tre diversi gruppi di trattamento standard o rapido (Figura 3A). Due ANOVA indicato un signi fi cativo L'influenza del metodo di elaborazione (F 1,64 = 15,3, p <0.001), mentre il peso corporeo / condizione metabolica non ha avuto effetto (F 2,64 = 0.5, p = 0,62).

Tabella 3

tp_upload / 53959 / 53959table4.jpg "/>

I livelli circolanti Kisspeptin endogeni erano significativamente più alti dopo RAPID rispetto al trattamento standard nella anoressica (+ 60%, p = 0,02) e soggetti normopeso (+ 99%, p = 0,02), mentre la differenza non ha raggiunto la significatività in condizioni di obesità ( 23%, p = 0,39; Figura 3B). Non sono state osservate differenze significative tra i tre diversi gruppi BMI (p> 0.05; Figura 3B). Due ANOVA indicato un signi fi cativo L'influenza del metodo di elaborazione (F 1,74 = 10,8, p = 0,002), mentre il peso corporeo / condizione metabolica non ha avuto effetto (F 2,74 = 0.5, p = 0,60).

Figura 3 Figura 3: circolazione Rapporto Acil / Desacyl grelina e livelli circolanti Kisspeptin in diverse condizioni metaboliche dopo RAPID o standard di lavorazione del sangue Il sangue è stato prelevato da anoressica, di peso normale o soggetti obesi dopo il digiuno notturno e trattati secondo le procedure standard o il metodo rapido.. Il surnatante è stato raccolto e acile così come i livelli di grelina totale o Kisspeptin livelli (B) valutato dal radioimmunoassay. Desacyl grelina è stata ottenuta sottraendo acile da ghrelin totale. Il rapporto è stato calcolato dividendo acile da desacyl grelina (A). La dimensione del gruppo è indicato nella parte inferiore delle colonne. I dati sono espressi come media ± SEM. * P <0.05, ** p <0.01 e *** p <0,001 vs. l'elaborazione di serie. Cliccate qui per vedere una versione più grandequesta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Abbiamo segnalato in precedenza che il metodo rapido per il trattamento del sangue migliorato il recupero per 11/12 peptidi rispetto al trattamento del sangue standard per ratti 6. Nel presente studio abbiamo dimostrato che questo metodo è anche adatto per l'uso nell'uomo. Dopo l'elaborazione RAPID, il recupero per 9 di 9 125 peptidi marcati I-testato è stato migliorato rispetto al trattamento del sangue standard (EDTA di sangue sul ghiaccio). Il miglioramento osservato variava 19-39% che rischia di essere rilevante, specialmente in condizioni in cui si prevede solo sottili differenze che potrebbero essere mascherati quando la resa del peptide è basso.

Abbiamo anche dimostrato che dopo RAPID grelina trattamento del sangue viene rilevato nella posizione corretta eluizione dopo HPLC che indica la forma molecolare corretta (acil grelina), mentre dopo il trattamento del sangue standard di 2/3 sono degradati a desacyl grelina. Poiché il gruppo acilico è essenziale per il legame al recettore grelina 28, de-acilazione dovrebbe alterare notevolmente la funzione biologica del peptide. Tuttavia, anche desacyl grelina è sempre più riconosciuto come un peptide biologicamente attivo 29. È interessante notare che, desacyl grelina è stata suggerita per contrastare gli effetti della grelina, come indicato in precedenza per l'assunzione di cibo 30 o 31 motilità del colon. Questo evidenzia ulteriormente l'importanza di indagare la forma molecolare corretta.

Quando si studia livelli endogeni di kisspeptin in soggetti normopeso, abbiamo mostrato notevolmente aumentati livelli (+ 99%) a seguito RAPID rispetto al trattamento del sangue standard. Tuttavia, nessun miglioramento è stato osservato in condizioni di obesità, che può essere a causa di un aumento dei livelli Kisspeptin complessivi (+ 50% nei pazienti obesi vs. Peso normale). Tra i gruppi BMI (anoressia nervosa, normopeso e l'obesità) nel sangue trattati con entrambi i metodi, non sono state osservate differenze significative che può essere dovuto al fatto che i livelli di digiuno solo were valutata. Le differenze possono essere evidente postprandially, una ipotesi che deve essere studiata in studi futuri.

Kisspeptin è stato misurato prima in studi utilizzando solo provette EDTA su ghiaccio 32 (nel presente studio denominato trasformazione come standard) o con l'aggiunta di inibitori della proteasi 33. Sulla base di questo studio la refrigerazione dei tubi non è sufficiente per evitare la degradazione del peptide. Sia acidificazione da soli o singolo inibitori della proteasi sono sufficienti a preservare la kisspeptin dovrebbe essere valutata in studi futuri.

Analogamente, l'elaborazione RAPID aumenta anche la resa di endogena grelina acile come indicato da un notevolmente aumentato rapporto acil / desacyl grelina (1: 3) rispetto al trattamento del sangue standard (1,23). Questo risultato mostra una buona concordanza con studi su roditori in cui abbiamo riportato un rapporto grelina acil / desacyl di 1: 5 a proposito della trasformazione RAPID prima (rispetto al 01:19 dopo l'elaborazione di serie).Le ampie gamme del rapporto grelina / desacyl acile di 1:15-01:55 34,35 riportato prima erano quindi molto probabilmente a causa di una elevata percentuale de-acilazione-dipendente di desacyl grelina. Come descritto sopra per kisspeptin, nessuna alterazione del rapporto grelina acil / desacyl sono stati osservati in diverse condizioni di peso corporeo cronicamente alterato (anoressia nervosa vs. Peso normale vs. Obesità). Questo può anche essere dovuto al fatto che solo il digiuno livelli di acil / desacyl grelina sono stati valutati e la regolazione post-prandiale è più importante. D'altro canto, questo indica anche che, nonostante il peso corporeo cronicamente alterata la proporzione di acile e desacyl grelina non viene modificata in condizioni basali e non può giocare un ruolo importante nei cambiamenti adattativi osservati in queste condizioni. Tuttavia, gli studi futuri utilizzando protocolli standardizzati pasto e applicando il metodo rapido contribuiranno a rispondere a questa domanda ulteriormente.

Il RAPID meThOD utilizza i seguenti componenti: Da reazioni chimiche principalmente dipendono dalla temperatura 36 una riduzione della temperatura mediante una soluzione ghiacciata rallenta la degradazione del peptide. Quindi, anche una diminuzione del pH (acidificazione) diminuisce la velocità della degradazione 37. Inoltre, una riduzione del pH diminuisce l'assorbimento di peptidi ad altre superfici e quindi riduce anche il rischio di perdita peptide. Gli inibitori della proteasi usati qui sono state scelte in modo da coprire un ampio spettro di peptidasi endogene: (es. Catepsina B / H) diprotin A come un inibitore della dipeptidil peptidasi IV, E-64-D come un inibitore per proteasi tiolo, antidolorifica come un inibitore per tripsina, papaina e catepsina a / B, leupeptina come un inibitore per tripsina, plasmina, papaina e catepsina e Chymostatin come un inibitore per chimotripsina, papaina e catepsina B / G. Inoltre, peptidi isotopiche sono utili per valutare il miglioramento del recupero dal metodo. Infine, come il tasso of la formazione del complesso enzima-substrato dipende dalla concentrazione dell'enzima (peptidasi) e il substrato (peptide ormone) 38 diluizione del plasma riduce il tasso di formazione e quindi la degradazione (una diluizione di dieci volte riduce il tasso di cento volte secondo l'Michaelis cinetica -Menten).

Nonostante i vantaggi del metodo RAPID, diverse limitazioni del metodo dovrebbe essere riconosciuto come bene. La fase più critica del protocollo è il tempo. I campioni di sangue devono essere diluiti nel buffer di RAPID immediatamente dopo il prelievo di sangue, che può essere difficile in ambito clinico. Inoltre, il metodo richiede più tempo, richiede un livello elevato di formazione ed è anche più costoso di trattamento del sangue standard. Anche se può essere difficile da attuare nella routine clinica, sarà utile per scopi di ricerca, soprattutto quando si prevede solo differenze sottili, e quindi un alto rendimento del peptide è auspicabile.

Anche se il metodo rapido è descritto e consigliato con tutte le sue componenti (temperature educed R, A cidification, P rotease inibizione, ho sotopic controlli esogeni e D ilution) nel presente lavoro, gli studi futuri possono utilizzare le modifiche di questa tecnica. L'uso di controlli esogeni isotopici non può essere obbligatorio e quindi limitato a studi pilota al fine di valutare quali peptidi mostrano il più grande miglioramento nel recupero utilizzando l'elaborazione RAPID. Inoltre, anche la composizione del cocktail inibitore di proteasi può essere modificato quando altri peptidi vengono valutati. Tuttavia, questo dovrebbe essere testato quando un nuovo peptide viene misurato.

In sintesi, il metodo RAPID di trattamento del sangue può essere utilizzato per sangue umano e notevolmente migliorato il recupero di 9/9 peptidi testati rispetto al trattamento del sangue standard. Dal momento che per alcuni peptidi solo una piccola di moderato miglioramento del recupero è stato osservato, la necessitàdel metodo può essere testato quando un nuovo peptide viene analizzato. Inoltre, il metodo RAPID consente la rilevazione della forma molecolare corretta come mostrato ad acil grelina e anche aumenta notevolmente il rendimento di livelli endogeni circolanti di peptidi come kisspeptin rispetto al trattamento del sangue standard. Pertanto, questo metodo dovrebbe essere uno strumento utile negli studi sull'uomo che valutano i livelli di peptide circolante, per esempio. coloro che sono coinvolti nella regolazione della fame e della sazietà.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca STE 1765 / 3-1 (AS) e Ministero tedesco dell'Istruzione e della ricerca 03IPT614A (CG). Ringraziamo Reinhard Lommel e Petra Buße per la loro eccellente supporto tecnico, così come Karin Johansson e Christina Hentzschel aiuto per l'organizzazione e l'esecuzione di misure antropometriche

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377, (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263, (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14, (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37, (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50, (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150, (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31, (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23, (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306, (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93, (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45, (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22, (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147, (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86, (12), 5992 (2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11, (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92, (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20, (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282, (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349, (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42, (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414, (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28, (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402, (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18, (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22, (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88, (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9, (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279, (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21, (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34, (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14, (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics