Une méthode rapide pour le traitement du sang pour augmenter le rendement des niveaux peptidiques plasma dans le sang humain

Immunology and Infection

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Summary

La méthode de traitement du sang RAPID peut être utilisé chez l'homme et donne des niveaux de peptides plus élevés ainsi que permet l'évaluation de la forme moléculaire correct. Par conséquent, cette méthode sera un outil précieux dans la recherche de peptide.

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Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

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Abstract

La recherche dans le domaine de la régulation de la prise alimentaire gagne en importance. Cela comprend souvent la mesure des peptides de régulation de la prise alimentaire. Pour la détermination correcte de la concentration d'un peptide, il doit être stable au cours du traitement du sang. Cependant, ceci est pas le cas de plusieurs peptides qui sont rapidement dégradés par les peptidases endogènes. Récemment, nous avons développé une méthode de traitement du sang en utilisant des températures de R, A cidification éduqué, P rotease inhibition, je sotopic contrôles exogènes et ilution D (RAPID) pour l'utilisation chez les rats. Ici, nous avons établi cette technique pour l'utilisation chez l'homme et étudié la récupération, la forme moléculaire et concentration circulante d'hormones de régulation de la prise alimentaire. La méthode RAPID a considérablement amélioré la récupération pour 125 I-marqué somatostatine-28 (+ 39%), le glucagon-like peptide-1 (+ 35%), acyl ghréline et de glucagon (+ 32%), l' insuline et kisspeptin (+ 29% ) nesfatine-1 (+ 28%), la leptine(+ 21%) et le peptide YY 3-36 (+ 19%) par rapport à un traitement standard (EDTA de sang sur la glace, p <0,001). chromatographie en phase liquide à haute performance a montré l'élution endogène acyl ghréline à la position attendue après le traitement RAPID, alors qu'après traitement standard 62% des acyl ghréline ont été dégradés résultant en un pic plus tôt représentant probablement désacyl ghréline. Après le traitement RAPID le rapport de la ghréline acyl / désacyl dans le sang des sujets de poids normal est de 1: 3 par rapport à 1h23 suivant le traitement standard (p = 0,03). Aussi les niveaux kisspeptin endogènes étaient plus élevés après RAPID par rapport à un traitement standard (+ 99%, p = 0,02). Le procédé de traitement rapide de sang peut être utilisé chez les humains, on obtient des niveaux élevés de peptides et permet d'évaluer la forme moléculaire correcte.

Introduction

Compte tenu de la prévalence croissante de l' obésité dans le monde 1,2, la recherche dans le domaine de la régulation de la prise alimentaire gagne en importance. Alors que jusqu'à présent un seul peptide est connu qui est produit et périphériquement à action centrale pour stimuler la prise alimentaire, à savoir la ghréline 3, dans les dernières décennies, un large éventail de peptides a été identifié réduire l' apport alimentaire, par exemple. la leptine, le peptide YY (PYY) et aussi glucagon-like peptide-1 (GLP-1) et de l' insuline 4, donc, dans les études portant sur ​​les mécanismes de régulation des niveaux de la faim et de satiété peptidiques sont souvent évaluées et en même temps, il est supposé que le peptide étudié est stable et récupéré à des rendements élevés pendant la formation de plasma. Cependant, très souvent , ce n'est pas le cas en raison de pannes endogène rapide comme indiqué précédemment pour par exemple. ghréline qui est dégradé parmi les groupes acyle à 5 DÉSACYL ghréline. Par conséquent, nous avons décrit récemment la méthode RAPID pour procesus de sangchanter dans des rats employant des températures de R, A cidification éduqué, P rotease inhibition, je sotopic contrôles exogènes et D ilution 6. Cette méthode a amélioré la récupération pour 11 des 12 peptides testés et autorisés pour la détermination de la forme moléculaire de circulation correcte par rapport au traitement du sang standard (sang EDTA sur la glace) 6. Cette méthode a été utilisée dans plusieurs études ultérieures 7-12 pour la détection de la ghréline en circulation, ainsi que le facteur de libération de corticotrophine 13. Par conséquent, le procédé se sont révélées utiles pour la recherche de peptides chez les rongeurs. Cependant, étant donné que les études sur les rongeurs ne sont pas toujours traduisible à une autre espèce, le procédé doit être mis en place pour l'utilisation dans le sang humain.

Le but de la présente étude était de tester la méthode RAPID pour le traitement du sang chez l' homme par rapport au traitement du sang standard, le sang EDTA sur la glace, qui est largement recommandé 14 et fréquemment used dans le cadre ainsi que de la recherche clinique. Nous avons testé la reprise d'une sélection de 125 peptides I marqués impliqués dans la régulation de la prise alimentaire , y compris des peptides établis ainsi que de nouveaux candidats ont récemment suggéré de jouer un rôle dans l' alimentation régulation (effets sur la consommation alimentaire sont présentés dans le tableau 1) traitement suivant avec les deux méthodes. Hormones ont également été choisis pour représenter les peptides de longueur et de charge (tableau 2) différent. En outre, pour la ghréline, nous avons étudié la forme moléculaire (s) suivant la méthode standard et RAPID. Enfin, nous avons évalué la ghréline endogène (acyl et désacyl ghréline), ainsi que les niveaux de kisspeptin, un peptide aussi récemment proposé de jouer un rôle dans la régulation de la prise alimentaire 15,16 après traitement rapide ou standard. En outre, nous avons également étudié ces niveaux de peptides dans une population de sujets avec un large éventail de l' indice de masse corporelle (allant de 10,2 à 67,6 kg à partir de / m 2) pour étudier possibLe différences liées au poids corporel chroniquement modifié.

Tableau 1

Tableau 2

Diagnostic, évaluation et plan:
participants à l'étude
Tous les participants à l'étude ont été nouvellement patients hospitalisés (inclusion était dans les deux jours suivant l'admission à l'hôpital) de la Division de médecine psychosomatique à Charité-Universitätsmedizin Berlin et ont donné leur consentement éclairé écrit. Afin d'éviter tout impact du genre que les patientes ont été incluses. Un total de 42 sujets ont participé à cette étude et ont été divisés en trois groupes: un poids normal (IMC de 18,5 à 25 kg / m 2, n = 12), l' anorexie mentale (IMC <17,5 kg / m 2, n = 15) et de l' obésité (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorexic et les patients obèses étaientdiagnostiquée selon la Classification internationale des maladies-10 et hospitalisés pour un gain de poids (anorexie mentale) ou la réduction du poids (obésité), respectivement. Tous les patients de poids normal ont été hospitalisés exclusivement en raison de symptômes somatoformes sans troubles somatiques pertinents. Les patients présentant des symptômes somatoformes gastro-intestinaux ou des antécédents de chirurgie gastro-intestinale ont été exclus. Les critères d'exclusion également inclus un âge <18 ans, la grossesse actuelle et les maladies psychotiques non traitées. La collecte de sang a été effectuée sur 2 ou 3 jours après l'admission à l'hôpital avant de recevoir un traitement diététique afin d'augmenter ou de réduire le poids corporel, respectivement. paramètres anthropométriques ont été évalués sur le même jour.

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Protocol

Le protocole a été approuvé par le comité d'éthique local pour la recherche humaine (numéro de protocole EA1 / 114/10).

Traitement 1. Blood

  1. Recueillir le sang veineux 7:00-08h00 après une nuit dans une veine et le processus avant-bras selon la procédure standard ou la méthode RAPID. Instruire les sujets à ne pas exercer ou de fumée avant le retrait de sang.
  2. Pour le traitement standard, recueillir le sang dans des tubes contenant de l'EDTA réfrigérés et centrifuger à moins de 10 min à 3000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant et conserver à -80 ° C jusqu'à ce que le traitement ultérieur par radioimmunoessai.
  3. Pour le traitement rapide, on dilue immédiatement le sang (à moins de 1 min après le retrait du sang) 1:10 dans un tampon glacé (pH 3,6) contenant 0,1 M d'acétate d'ammonium, 0,5 M de NaCl et des inhibiteurs d'enzymes (diprotine A, E-64-d, antipaïne , la leupeptine, la chymostatine, 1 pg / ml). Ensuite, centrifuger à moins de 10 min à 3000 x g pendant 10 min à 4 ° C et on recueille le surnageant noustion d' une pipette dans des tubes en polypropylène comme détaillé avant chez les rats 6.
    1. cartouches de chromatographie de charge (360 mg, 55-105 pm) avec 100% d'acétonitrile (taux de 10 ml / min), équilibrent avec 0,1% de trifluoroacétate (TFA, débit 10 ml / min) et la charge avec le surnageant à un débit constant de 1 ml / min en utilisant une pompe à seringue.
    2. Par la suite, les cartouches de lavage avec 3 ml de TFA 0,1% (débit 10 ml / min) et éluer lentement avec 2 ml d'acétonitrile à 70% contenant 0,1% de TFA (2 ml / min).
    3. Des échantillons secs éluées à l'aide de centrifugation sous vide et conserver à -80 ° C jusqu'à un traitement ultérieur par radioimmunoessai.
      REMARQUE: Effectuer toutes les étapes en polypropylène (traitement RAPID) et borosilicate (radioimmunoessai) tubes qui présentent surface nettement inférieure des propriétés de liaison et donc de minimiser la perte de peptide pour la plupart des peptides étudiés avant le 26.

2. mesures

REMARQUE: Les étapes de cette section doit être effectuée dans un laboratoirecertifié pour le travail avec des matières radioactives. Les précautions standard pour le travail avec 125 I doivent être prises.

  1. Récupération de radiomarqué Peptides
    1. Obtenir 125 I-peptides humains radiomarqués (par ex. Acyl-ghréline, le GLP-1, le glucagon, l' insuline, kisspeptide, la leptine, nesfatine-1, PYY3.36 et la somatostatine-28).
    2. Gardez peptides sous forme de poudre jusqu'à ce que l'expérience, puis fraîchement dilué dans 0,1% d'acide acétique (~ 100.000 cpm par ml).
    3. Pour le traitement du sang standard, directement après le retrait du sang dans EDTA réfrigérés contenant des tubes, transfert 1 ml de sang dans un tube avec 50 ul de radiomarqueur contenant 3,000-6,000 cpm (compté directement avant l'expérience commence).
    4. Pour un traitement rapide, le transfert 1 ml de sang d'EDTA contenant du sang dans un tube contenant 9 ml de tampon RAPID (pour la composition voir 1.3) et 500 ul radiomarqueur contenant 30,000-60,000 cpm. volume due à l'utilisation de 1:10 dilution 10 fois plus élevé de radiolabel pour le traitement RAPID.
    5. Ensuite, les échantillons de procédés tels que décrits dans les étapes 1.2 à 1.3.2.
    6. Pour les expériences de récupération, faire des échantillons non secs par centrifugation sous vide et ne pas stocker à -80 ° C. Au lieu de cela, d'évaluer la récupération des peptides marqués radioactivement directement par la suite à l'aide d'un compteur gamma.
    7. Mesurer l'ensemble du surnageant dans des échantillons standards, tandis que les échantillons à analyser dans RAPID 1/10 du volume total afin d'obtenir la comparabilité de la quantité de marqueur radioactif utilisé. Pour la mesure, transférer le surnageant dans des tubes ajustés dans le compteur gamma et évaluer les comptes par minute
    8. En tant que standard de 100%, utiliser deux échantillons avec 50 ul de 125 I-radiomarqué peptide qui ne subissent le traitement. Mesurer simultanément avec d'autres échantillons comme décrit dans 2.1.7.
    9. Effectuer l'expérience de cinq à six fois pour chaque peptide.
  2. Chromatographie liquide haute performance de radiomarqué ghréline
    1. Prélever le sang dans cEDTA hilled contenant des tubes et de transfert de 1 ml dans des tubes contenant 200 ul ghréline radiomarqué-acyl contenant 15.000-20.000 cpm (comptabilisés directement avant l'expérience commence).
    2. Pour le traitement RAPID, transférer 1 ml de sang dans un tube contenant 9 ml de tampon RAPID (pour la composition voir 1.3) et 200 ul acyl radiomarqué ghréline contenant 15.000-20.000 cpm.
    3. Ensuite, les échantillons de procédés tels que décrits dans les étapes 1.2 à 1.3.2.
    4. Pour une analyse supplémentaire par HPLC en phase inverse, charger directement des échantillons sur une colonne stable liaison C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,8 um) équilibrée dans 17% d'acétonitrile dans de l'eau (à la fois complémenté avec 0,1% de TFA).
    5. Après 5 min équilibration, utilisez un gradient 17-40% d'acétonitrile pour éluer l'échantillon dans 40 min (débit de 1 ml / min débit).
    6. Recueillir des fractions de 1 ml par minute et à analyser la radioactivité en utilisant un compteur gamma.
    7. Dans une expérience séparée, la charge de 200 ul contenant un groupe acyle radiomarqué ghréline 15.000-20.000cpm sur la colonne directement et effectuer HPLC comme décrit dans les étapes 2.2.4 à 2.2.6.
  3. radioimmunologique
    1. Pour radioimmunoessai, dégeler surnageants congelés (traitement standard) et aspirer la poudre sèche (méthode RAPID) à la température ambiante.
    2. Immédiatement avant radioimmunoessai, remettre en suspension des échantillons RAPID secs dans le double H 2 O distillée selon le volume initial de plasma (500 pi).
    3. Évaluer kisspeptin et totale (y compris les désacyl et acyl ghréline), ainsi que acyl ghréline comme décrit précédemment en utilisant 12,27 radioimmunoessais commerciaux selon les protocoles du fabricant. Utiliser des tubes de borosilicate qui permettent la formation de granulés stables.
      1. Le premier jour, incuber les échantillons avec du tampon d'essai et l' anticorps primaire (par exemple. L' anti-ghréline) dans la dilution fourni par le fabricant pendant une période de 24 heures.
      2. Le deuxième jour, ajouter le traceur 125I (par exemple , 125 I-ghréline), VORTEX et laisser incuber pendant une période de 24 heures.
      3. Le troisième jour, ajouter le réactif de précipitation, vortex et incuber comme recommandé par le fabricant. Ensuite, des tubes de centrifugation à 3000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Enlever le surnageant et compter la radioactivité dans les pastilles à l'aide d'un compteur gamma
    4. Calculer désacyl ghréline comme la différence du nombre total ghréline moins acyle. Évaluer le rapport de la ghréline acyl / désacyl en divisant acyl par désacyl ghréline pour chaque échantillon individuel.
    5. Traiter tous les échantillons - si possible - en un seul lot pour éviter la variabilité inter-essai. La variabilité intra-essai dans la présente expérience était <8% pour kisspeptin, <7% pour le total et <9% pour les acyl ghréline.

3. Analyse statistique

  1. Déterminer la répartition des données en utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov. Exprimez données comme moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM).
  2. Évaluer les différences entre les deuxgroupes par le test t. Évaluer les différences entre plusieurs groupes par tous les multiples procédures de paires de comparaison (test Tukey post hoc) ou ANOVA à deux voies suivies par la méthode Holm-Sidak.
  3. Considérons p <0,05 significative et effectuer des analyses en utilisant un programme de statistiques.

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Representative Results

Le traitement du sang rapide augmente le rendement de 125 peptides I radiomarqués dans le sang humain par rapport au traitement du sang standard.
Après le traitement du sang standard (EDTA sang sur de la glace), la récupération des peptides radiomarqués était d' environ 60% en peptides (9/9 allant 48-68%, la Figure 1A - K). Le traitement rapide a amélioré le rendement dans tous les 125 peptides I marqués, à savoir la somatostatine-28 (+ 39%, figure 1A), le glucagon-like peptide-1 (+ 35%, figure 1B), un groupe acyle ghréline (n-octanoyle de la ghréline, + 32%, figure 1C), le glucagon (+ 32%, figure 1D), l' insuline (+ 29%, figure 1E), kisspeptin (+ 29%, figure 1F), nesfatine-1 (+ 28%, Figure 1G), leptine (+ 21%, Figure 1 H) et le peptide YY 3-36 (+ 19%, figure 1K) par rapport au traitement standard (p <0.001). Dans ces 9 peptides, la récupération après la méthode RAPID était ~ 90% (allant de 71 à 98%, Figure 1A - K).

Figure 1
Figure 1:. Récupération de 125 Peptides I marqués dans le sang humain après traitement standard ou RAPID sang radiomarqué peptide a été ajouté au sang humain et traité selon la procédure standard (EDTA de sang sur la glace) ou la méthode RAPID (températures réduites, l' acidification, la protéase inhibition, contrôles exogènes isotopiques et dilution). Les surnageants ont été recueillis et comptés pour la radioactivité. Chaque colonne représente la moyenne ± SEM de cinq à six expériences. *** P <0,001 par rapport au traitement standard. S'il vous plaît cliquer ici pour viewa version plus grande de cette figure.

Suite à un traitement rapide, ghréline élue à la position attendue.
Après un traitement rapide du sang humain, 125 ghréline marqué I élue à la position attendue, alors qu'après la procédure standard un pic plus tôt a été observé le plus probable correspondant à DÉSACYL ghréline (Figure 2). Cela représentait une dégradation de 62% du peptide.

Figure 2
Figure 2:. Elution Profil de 125 I-marqué Acyl ghréline dans le sang humain suivant Standard ou RAPID traitement du sang radiomarqué peptide a été ajouté au sang humain et traité selon la procédure standard ou la méthode RAPID. Ensuite, le surnageant a été chargé sur une colonne de chromatographie liquide à haute performance. L'éluat a coltionné chaque minute et comptés pour la radioactivité. Après le traitement RAPID la majeure partie du peptide élue à l'heure prévue, alors qu'après la norme du traitement d'une grande partie élue plus tôt, ce qui représente la plus probable ghréline désacyl. Abréviation:. Cpm, coups par minute S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

RAPID Traitement de sang améliore le rapport ghréline Acyl / DÉSACYL et des résultats dans l'augmentation des niveaux de sang Endogène kisspeptin Par rapport à traitement standard.
Le sang a été prélevé anorexique, un poids normal et les sujets obèses et traitées selon la procédure standard ou RAPID. ghréline endogène (ghréline totale et acyle) a été évaluée par dosage radio-immunologique. Anthropométrique et comorbidités / médicaments des groupes d'étude sont présentés dans les tableaux 3 et 4. Après le traitement RAPID le taux de ghréline acyl / désacyl dans le sang des sujets de poids normal est de 1: 3 par rapport à 1h23 suivant un traitement standard de sang (p = 0,03; Figure 3A). Des résultats similaires ont été observés sous anorexique (1: 3 par rapport à 1:19, p <0,001) et les conditions obèses (1: 3 par rapport 01:13, p = 0,04; figure 3A.). Aucune différence n'a été observée entre les trois groupes différents pour le traitement standard ou RAPID (figure 3A). Deux voies ANOVA indique un significatif fi in fl uence de la méthode de traitement (F 1,64 = 15,3, p <0,001), tandis que le poids corporel / état ​​métabolique n'a eu aucun effet (F 2,64 = 0,5, p = 0,62).

Tableau 3

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Les taux circulants de kisspeptin endogènes étaient significativement plus élevés suivant RAPID par rapport au traitement standard dans anorexiques (+ 60%, p = 0,02) et des sujets de poids normal (+ 99%, p = 0,02), alors que la différence ne soit pas significative dans les conditions de l' obésité ( 23%, p = 0,39; figure 3B). Aucune différence significative n'a été observée entre les trois groupes d' IMC différents (p> 0,05; Figure 3B). Deux voies ANOVA indique une signi fi cative in fl uence de la méthode de traitement (F 1,74 = 10,8, p = 0,002), tandis que le poids corporel / état ​​métabolique n'a eu aucun effet (F 2,74 = 0,5, p = 0,60).

Figure 3 Figure 3: Circulating Ratio Acyl / DÉSACYL ghréline et les taux circulants kisspeptin sous différentes conditions métaboliques suivant RAPID ou Standard traitement du sang Le sang a été prélevé anorexique, un poids normal ou les sujets obèses après une nuit de jeûne et traitée selon la procédure standard ou la méthode RAPID.. Le surnageant a été recueilli et acyle, ainsi que les niveaux de ghréline totales ou kisspeptin niveaux (B) évaluée par dosage radio - immunologique. DÉSACYL ghréline a été obtenu en soustrayant acyl de la ghréline totale. Le rapport a été calculé en divisant par un groupe acyle désacyl ghréline (A). La taille du groupe est indiqué au bas des colonnes. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 et *** p <0,001 vs. traitement standard. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandece chiffre.

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Discussion

Nous avons signalé avant que la méthode RAPID pour le traitement du sang a amélioré la récupération des 11/12 peptides par rapport à un traitement sanguin standard chez le rat 6. Dans la présente étude, nous avons montré que cette méthode est également approprié pour l'utilisation chez l'homme. Après un traitement rapide, la reprise pour 9 de 9 125 peptides I marqués testé a été améliorée par rapport à un traitement de sang standard (EDTA de sang sur la glace). L'amélioration observée variait 19-39%, ce qui est susceptible d'être utile, en particulier dans des conditions où seules différences subtiles sont attendus qui pourraient être masqués lorsque le rendement du peptide est faible.

Nous avons également montré que, après traitement du sang RAPID ghréline est détectée à la position d'élution correcte après HPLC indiquant la forme moléculaire correcte (acyl de ghréline), alors qu'après le traitement sanguin standard 2/3 sont dégradés en DÉSACYL ghréline. Etant donné que le groupe acyle est essentielle pour la liaison au récepteur de la ghréline 28, de acylation devrait grandement modifier la fonction biologique du peptide. Cependant, aussi désacyl ghréline est de plus en plus reconnu comme un peptide biologiquement actif 29. Il est intéressant de désacyl ghréline a été proposé de compenser les effets de la ghréline , comme indiqué précédemment pour la prise alimentaire 30 ou 31 motilité du côlon. Cela souligne en outre l'importance d'étudier la forme moléculaire correcte.

Lorsque l'on étudie les niveaux endogènes de kisspeptin chez des sujets de poids normal, nous avons montré des niveaux accrus fortement (+ 99%) suite à RAPID par rapport au traitement du sang standard. Cependant, aucune amélioration n'a été observée dans les conditions de l' obésité, qui peut être en raison des niveaux de kisspeptin globalement augmenté (+ 50% chez les obèses vs. Poids normal). Entre les groupes d'IMC (anorexie mentale, un poids normal et l'obésité) dans le sang traités avec soit la méthode, aucune différence significative n'a été observée qui peut être dû au fait que les niveaux ne jeûne were évaluée. Les différences pourraient être postprandiale apparent, une hypothèse qui devrait être étudiée dans les études futures.

Kisspeptine a été mesurée avant dans les études en utilisant uniquement des tubes EDTA sur la glace 32 (dans le présent étude mentionnée au traitement standard) ou par l'addition d'inhibiteurs de la protéase 33. Sur la base de la présente étude, le refroidissement des tubes est insuffisante pour empêcher la dégradation du peptide. Que ce soit des inhibiteurs d'acidification seul ou seule la protéase sont suffisantes pour préserver kisspeptin devrait être étudiée dans les études futures.

De même, un traitement rapide augmente également le rendement de la ghréline endogène acyle comme indiqué par un rapport acyle / désacyl ghréline considérablement augmenté (1: 3) par rapport au traitement du sang standard (01:23). Cette constatation montre une bonne concordance avec les études sur les rongeurs où nous avons rapporté un taux de ghréline acyl / désacyl de 1: 5 après traitement RAPID avant (par rapport à 1:19 après le traitement standard).Les larges gammes de l'acyl / désacyl rapport de ghréline de 34,35 1 heures et quart-1:55 signalé avant étaient donc très probablement en raison d'une forte proportion de-acylation dépendant de désacyl ghréline. Comme cela est décrit ci - dessus pour kisspeptide, aucune modification du rapport de la ghréline acyle / désacyl ont été observés dans des conditions différentes de poids corporel , de manière chronique modifié (anorexie mentale par rapport à. Un poids normal vs. Obésité). Cela peut aussi être dû au fait que les niveaux que le jeûne de acyl / désacyl ghréline ont été évalués et le règlement postprandiale est plus important. D'un autre côté, cela indique également que, malgré le poids corporel chroniquement modifié la proportion d'acyle et désacyl ghréline n'a pas été modifié dans des conditions basales et ne peut pas jouer un rôle important dans les changements adaptatifs observés dans ces conditions. Cependant, les études futures utilisant des protocoles de repas standardisés et l'application de la méthode RAPID aideront à répondre davantage cette question.

Le RAPID methode utilise les composants suivants: Etant donné que les réactions chimiques dépendent essentiellement de la température 36 d' une réduction de température à l' aide d' une solution glacée ralentit la dégradation du peptide. Ensuite, également une diminution du pH (acidification) diminue la vitesse de la dégradation 37. En outre, une réduction du pH diminue l'adsorption de peptides sur d'autres surfaces, et par conséquent, réduit également le risque de perte de peptide. Les inhibiteurs de protéase utilisés ici ont été choisis afin de couvrir un large éventail de peptidases endogènes: (. Par exemple , la cathepsine B / H) diprotine A titre d'inhibiteur de la dipeptidylpeptidase IV, E-64-d comme un inhibiteur des protéases thiol, antidouleur comme un inhibiteur pour la trypsine, la papaïne et de la cathepsine A / B, leupeptine comme inhibiteur pour la trypsine, la plasmine, la papaïne et de la cathepsine et de la chymostatine comme un inhibiteur de la chymotrypsine, la papaïne et de la cathepsine B / G. En outre, les peptides isotopiques sont utiles pour évaluer l'amélioration de la récupération par le procédé. Enfin, le taux of la formation du complexe enzyme-substrat dépend de la concentration de l'enzyme (peptidase) et le substrat (hormone peptidique) 38 de dilution du plasma réduit le taux de formation et donc la dégradation (une dilution de dix fois réduit le taux centuple selon la Michaelis cinétique -Menten).

Malgré les avantages de la méthode RAPID, plusieurs limites de la méthode devrait être reconnu aussi bien. L'étape la plus critique du protocole est le temps. Les échantillons de sang doivent être dilués dans le tampon RAPID immédiatement après prélèvement de sang qui peut être difficile dans le contexte clinique. En outre, la méthode est plus consommatrice de temps, exige un niveau de formation plus élevé et est également plus cher que le traitement du sang standard. Bien qu'il puisse être difficile à mettre en œuvre en routine clinique, il sera utile à des fins de recherche, en particulier lorsque les différences subtiles ne sont attendues et donc un rendement élevé du peptide est souhaitable.

Bien que la méthode RAPID est décrit et recommandé avec toutes ses composantes (R des températures, A cidification éduqué, P rotease inhibition, je sotopic contrôles exogènes et D ilution) dans le présent document, les études futures peuvent utiliser des modifications de cette technique. L'utilisation de contrôles exogènes isotopiques peut ne pas être obligatoire et donc limitée à des études pilotes afin d'évaluer quels peptides montrent la plus grande amélioration dans la récupération en utilisant un traitement RAPID. En outre, également la composition du cocktail inhibiteur de protease peut être modifiée lorsque d'autres peptides sont évalués. Toutefois, cela devrait être testé quand un nouveau peptide est mesurée.

En résumé, la méthode rapide de traitement du sang peut être utilisé pour le sang humain et a grandement amélioré la récupération des peptides testés 9/9 par rapport au traitement du sang standard. Étant donné que pour certains peptides seulement une petite à une amélioration modérée de la reprise a été observée, la nécessitédu procédé peut être testée quand un nouveau peptide est analysé. En outre, la méthode rapide permet la détection de la forme moléculaire correct comme représenté par un groupe acyle et ghréline augmente aussi considérablement le rendement des taux circulants endogènes de peptides tels que kisspeptide par rapport au traitement du sang standard. Par conséquent, cette méthode doit être un outil utile dans les études humaines évaluant les taux circulants de peptides, par exemple. ceux qui sont impliqués dans la régulation de la faim et de satiété.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche STE 1765 / 3-1 (AS) et le ministère allemand de l'éducation et de la recherche 03IPT614A (CG). Nous remercions Reinhard Lommel et Petra Buße pour leur excellent support technique, ainsi que Karin Johansson et Christina Hentzschel de l'aide à l'organisation et l'exécution des mesures anthropométriques

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
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References

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