باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

* These authors contributed equally
Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Icha, J., Schmied, C., Sidhaye, J., Tomancak, P., Preibisch, S., Norden, C. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. J. Vis. Exp. (110), e53966, doi:10.3791/53966 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

التشكل هو عملية التي تشكل الجنين وجنبا إلى جنب مع نمو وتمايز يدفع تطور الجنين من بويضة مخصبة إلى متعددة الخلايا الناضجة. عمليات التخلق خلال تطوير حيوان يمكن تحليلها بشكل أفضل من خلال التصوير عينات حية سالمة 1-3. وذلك لأن مثل هذا التصوير الجنين كله يحافظ على جميع العناصر التي تدفع وتنظيم التنمية بما في ذلك التدرجات من جزيئات الإشارة، المصفوفة خارج الخلية، الأوعية الدموية، الغدد العرقية وكذلك الخواص الميكانيكية للأنسجة المحيطة بها. لسد المقاييس، والذي يحدث التشكل، لديها الأحداث التحت خلوية سريعة ليتم القبض على فترة زمنية دقيقة في سياق تطوير النسيج كله على مدى ساعات أو أيام. لتلبية جميع هذه المتطلبات، وقد تم تطوير تطبيق الحديث 4 من متعامد إضاءة الطائرة المجهر 5. في الأصل، كان اسمه والانتقائية طائرة الإضاءة المجهري (SPIM) الآن يستخدم عادة مصطلح شاملة لجميع ورقة ضوء مضان المجهر (LSFM). LSFM تمكن التصوير في قرار الأوان، في حين حمل الضيائية أقل من المسح بالليزر أو الغزل قرص المجاهر مبائر 6،7. في الوقت الحاضر، وهناك بالفعل العديد من تطبيقات مبدأ رقة ضوء الإضاءة الأساسية وتم استخدامه لصورة مجموعة كبيرة ومتنوعة من النماذج والعمليات التي يتعذر الوصول إليها من قبل الباحثين 8-11.

نود أولا لتسليط الضوء على العديد من المزايا الرئيسية لLSFM على نهج متحد البؤر المجهري التقليدية:

للحصول على نتائج ذات مغزى من التجارب المجهرية التصوير الحي، من المهم أن الملاحظة يؤثر فقط على الحد الأدنى من العينة. ومع ذلك، فإن العديد من الكائنات الحية بما فيها الزرد معرضة جدا للتعرض للضوء الليزر، مما يجعل من الصعب على صورة لهم في المجهر متحد البؤر لقرار الأوان دون EF الضيائيةتأثيرات سلبية مثل 6،7 تطوير المتعثرة أو المتأخرة. LSFM حاليا تقنية التصوير مضان بأقل الآثار المدمرة على العينة 7. منذ ورقة رقيقة من ضوء الليزر تضيء فقط جزء من العينة التي تم تصويرها في نقطة زمنية معينة، ورقة المجهر الضوئي هو استخدام الفوتونات بكفاءة عالية. وبالتالي، فإن التعرض للضوء المنخفض يسمح للملاحظات مرور الزمن أطول من العينات صحية، على سبيل المثال 12-17. وعلاوة على ذلك، وذلك بفضل الغازية الحد الأدنى من LSFM، لم يعد يملي عدد من الصور التي حصل عليها كمية الضوء العينة يمكن أن يتسامح، ولكن بدلا من مقدار البيانات يمكن معالجتها وتخزينها.

وعلى نفس المنوال من الحفاظ على العينة في الظروف الفسيولوجية القريب، LSFM يأتي مع استراتيجيات عينة تصاعد بديلة مناسبة تماما لأجنة حية. في تقنيات LSFM، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من الأجنة داخل عمود رقيقة من انخفاض نسبة الاغاروز. ومونتينز في اسطوانات الأغاروس يسمح للحرية كاملة للدوران، وبالتالي فإن عينة يمكن ملاحظتها من زاوية مثالية (في LSFM يشار إلى رأي) ومن عدة جهات في وقت واحد. التصوير بطرق عرض متعددة والانصهار بطرق عرض متعددة لاحق هو مفيد بشكل خاص للالكبيرة، عينات نثر ويسمح القبض عليهم مع ارتفاع، القرار الخواص. ملخص استراتيجيات تصاعد LSFM أخرى محتملة يمكن العثور عليها في دليل المجهر التشغيل الرسمي، في الفصل المتعلق إعداد العينات كتبه المختبر من E. رينو. ومن قراءة الموصى بها، وخاصة إذا كان الهدف هو صورة عينات مختلفة من وصفها هنا.

الحصول على الصور في LSFM هو مجال واسع، تقوم الكاميرا، بدلا من المسح الضوئي ليزر المجهر متحد البؤر. وهذا يؤدي إلى ارتفاع إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) للصور المكتسبة، ويمكن أن تكون سريعة جدا (عشرات ومئات من لقطة في الثانية). حساسية عالية من LSFM يتيح المزيد من التصوير من عصيدة الفلورسنت ضعيفليه، مثل عوامل النسخ التي أعرب عنها في المستويات المحلية 18 أو، في المستقبل القريب، البروتينات الذاتية الموسومة باستخدام كريسبر / Cas9. وSNR عالية المهم لنجاح تحليل الصور المصب أيضا. مطلوب سرعة عالية ليس فقط للقبض على العمليات داخل الخلايا السريعة، ولكن أيضا لصورة الجنين كله من وجهات نظر متعددة بسرعة كافية. والانصهار السلس من وجهات نظر متعددة لا يمكن أن يتحقق إلا إذا لم تتغير هذه الظاهرة لوحظت خلال الاستحواذ على هذه عدة أكوام ض القادمة من جهات مستقلة.

لا تأتي مزايا LSFM عادة على حساب جودة الصورة. القرار الوحشي LSFM هو أسوأ قليلا من دقة المجهر متحد البؤر. وذلك لأن أهداف الكشف المستخدمة في LSFM لها أقل الفتحة العددية (عادة 1.0 أو أقل) مقارنة مع 1،2-1،3 الأهداف المياه أو الغمر السيليكون على الاجهزة متحد البؤر القياسية. بالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى الكشف عن حقل واسع في LSFM (أبسينم من الثقب)، وهناك المزيد من الضوء خارج نطاق التركيز مقارنة مع المجهر متحد البؤر. يتم تحديد كمية من خارج تركيز الضوء من قبل ورقة سماكة خفيفة. ومع ذلك، يتم تعويض هذه العيوب من قبل SNR العالي في LSFM. في الممارسة العملية، وهذا يؤدي في صور ذات جودة مماثلة مقارنة على سبيل المثال الغزل القرص مبائر اقتناء 15. ونتيجة لذلك، وهذا يتيح استخراج موثوق من الميزات مثل أغشية الخلايا أو نوى، على سبيل المثال، عن نسب خلية تتبع 15،19.

يتم تحديد القرار المحوري LSFM، بالإضافة إلى هدف الكشف، من قبل ورقة سماكة خفيفة. القرار المحوري يمكن LSFM في بعض الحالات تجاوز القرار المجاهر مبائر. أولا، التحسن في قرار يأتي عندما ورقة الخفيفة هو أرق من القرار المحوري للهدف الكشف، والذي يحدث عادة لعينات كبيرة المصورة مع هدف تضخم منخفض. والطريقة الثانية، كيف يمكن للLSFM منظمة العمل ضد الجوعieve قرار المحوري أفضل، هو الانصهار بطرق عرض متعددة، يتم فيه الجمع بين قرار المعلومات عالية س ص من وجهات نظر مختلفة في كومة صورة واحدة. كومة اندمجت مما أدى لديه قرار موحد الخواص يقترب من قيم قرار في الاتجاه الجانبي 20،21. وتقوم استراتيجية لتسجيل وجهات نظر متعددة على بعضها البعض وصفها في هذه المقالة على استخدام الخرز البوليسترين الفلورسنت كعلامات الائتمانية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز حول العينة 20،21.

ونتيجة لتسويق LSFM، هذه التقنية متاحة الآن لشريحة واسعة من العلماء 22. ولذلك، فإن الدافع لكتابة هذا البروتوكول هو لجعل هذه التكنولوجيا في متناول علماء البيولوجيا التطورية التي تفتقر إلى الخبرة العملية في LSFM والحصول بدأ هؤلاء العلماء استخدام هذه التكنولوجيا مع تلك العينات. يستخدم بروتوكول لدينا والتجاري ضوء المجهر ورقة، وهو ما يشكل المجهر ر بسيط من الناحية النظريةقبعة من السهل أن تعمل. ونود أن نذكر بالإضافة إلى غيرها من البروتوكولات الأخيرة لتصوير الزرد مع الاجهزة LSFM محلي الصنع، والتي قد تكون مناسبة للإجابة على الأسئلة معينة 23-25. خيار إدخال آخر لLSFM هي منصات مفتوحة 26،27، والتي تستخدم مبادئ النفاذ المفتوح لجلب ضوء المجهر ورقة إلى المجتمع الأوسع. يمكن العثور على وثائق في كل من الأجهزة والبرمجيات الجوانب في http://openspim.org وhttps://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم الزرد مكتملة العظام كنظام نموذج لدراسة العمليات التنموية مع LSFM. التشكل من العين الزرد هو مثال يؤكد العديد من الفوائد من LSFM. وقد تم بالفعل استخدام LSFM في الماضي لتحقيق تنمية العين في الميداكا 28 وفي الزرد 29،30. في مرحلة مبكرة من التنمية العين ومعقدة لتوجيه الجنين بشكل صحيح للفحص المجهري التقليدي،كما صفار ضخمة لا يسمح للجنين أن يكذب على الجانب مع مركزه تواجه الهدف. ومع ذلك، مع LSFM تصاعد في عمود الاغاروز، وعينة يمكن وضعه بتكاثر. بالإضافة إلى ذلك، خلال فترة الانتقال من الحويصلة البصرية إلى مرحلة كوب البصرية، والعين تخضع إعادة ترتيب تخلقية الرئيسية يرافقه نمو، والتي تتطلب تسجيل ض كومة كبيرة وحقل كبير من الرأي. أيضا لمواجهة هذه التحديات LSFM متفوقة على التصوير متحد البؤر التقليدية. عملية تشكيل كوب الضوئية هي ثلاثية الأبعاد، وبالتالي فإنه من الصعب فهم وتصور فقط عن طريق التصوير من رأي واحد. وهذا يجعل التصوير بطرق عرض متعددة لقرار موحد الخواص مفيدة. بعد تشكيل كوب البصري والشبكية تصبح حساسة على نحو متزايد للتعرض ليزر. وهكذا، فإن الضيائية المنخفضة المصاحبة LSFM هي الميزة الرئيسية للتصوير على المدى الطويل.

هنا نقدم بروتوكول الأمثل للتصوير من 1-3 أيام الزرد القديم الأجنة لالثانية اليرقات مع التركيز على تطوير العين. يسمح أسلوبنا تسجيل الوقت الفاصل بين الأفلام تغطي ما يصل إلى 12-14 ساعة مع القرار المكانية والزمانية عالية. الأهم من ذلك، وتبين لنا أيضا خط أنابيب لمعالجة البيانات، وهي خطوة أساسية في LSFM، وهذا الأسلوب يولد دائما مجموعات البيانات الكبيرة، وغالبا في نطاق تيرابايت.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ كافة أعمال الحيوانية وفقا للاتحاد الأوروبي (EU) التوجيه 2011/63 / الاتحاد الأوروبي وقانون رعاية الحيوان الألماني. ويهدف البروتوكول الواجب اتباعها دون انقطاع، من تصاعد لتصوير العينة. اعتمادا على الخبرة العملية، وسوف يستغرق 2-3 ساعة لبدء تجربة مرور الزمن. لم يتم تضمين معالجة البيانات في هذا الحساب الوقت. جميع المواد المطلوبة للتجربة يمكن العثور عليها في قائمة من المواد اللازمة قبل البدء التي يتم توفيرها وثيقة تكميلية. ارتداء قفازات مسحوق الحرة خلال الخطوات 1 و 2 و 3 و 4. للحصول على الخطوات 2 و 3 و 4 و 5 من البروتوكول تشير أيضا إلى دليل تشغيل المجهر الرسمي.

1. العمل التحضيري قبل تجربة التصوير

  1. نيون الخرزة الحل المالية
    1. لهذا البروتوكول، استخدم نانومتر الخرز قطر البوليسترين 500 أو 1000 (المسمى مع أحمر ينبعث منها صبغة الفلورسنت). التخفيف العمل من الخرز هو 1: 4،000. الأولى، دوامة الحل الأسهم حبة لمدة 1 دقيقة. تمييع 10 ميكرولتر من الخرز في 990 ميكرولتر من ده 2 O. تخزين الحل في الظلام عند 4 درجات مئوية، واستخدام هذا 1: 100 التخفيف هو الحل الأسهم لمزيد من التخفيف في 01:40.
  2. إعداد الحل للغرفة عينة
    1. في كوب مزيج 100 مل 38.2 مل من E3 المتوسطة دون الميثيلين الأزرق، 0.8 مل من 10 ملي N -phenylthiourea و 1 مل من 0.4٪ MS-222. ومن المفيد استخدام تصفيتها المتوسطة E3 لتجنب جزيئات صغيرة من الغبار أو بلورات غير منحل العائمة في حجرة العينة في وقت لاحق.
  3. اختيار الأجنة السمك الفلورسنت
    1. في الأيام التي سبقت التجربة، وإعداد الأجنة معربا عن البروتينات الفلورية. الحق قبل التجربة، فرز الأجنة تحت المجسام الفلورسنت لقوة مرغوب فيه من إشارة الفلورسنت. تأخذ 5-10 الأجنة السليمة وdechorionate لهم باستخدام الملقط.
      ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول ل16-72 ساعة من العمرالأجنة.

2. إعداد غرفة عينة

  1. تجميع ثلاثة الغرفة ويندوز
    1. هناك 4 النوافذ في حجرة العينة، واحد لهدف وثلاثة لتكون مختومة مع لل coverslips (قطر 18 مم، اختار سماكة 0.17 مم). تخزين هذه coverslips في 70٪ من الإيثانول. تصفيتهم نظيفة قبل الاستخدام مع الأثير: الإيثانول (1: 4).
    2. إدراج ساترة في إطار باستخدام ملقط غرامة، وتأكد من أنه يتماشى مع أصغر الأخدود. تغطية ذلك مع 17 مم المطاط يا الدائري والمسمار في حلقة محول الإضاءة باستخدام أداة نافذة الغرفة. كرر هذه العملية لمدة النوافذ الأخرى.
  2. ربط أجزاء الغرفة المتبقية
    1. المسمار محول للهدف المناسب في الجانب المتبقي الرابع من الغرفة. إدراج 15 مم يا الدائري في وسط محول.
    2. المسمار في الأبيض محول لور للقفل في افتتاح الأيمن السفلي في تشاmber وموصل استنزاف الرمادي في افتتاح الأيسر العلوي. منع جميع الفتحات الثلاث المتبقية مع المقابس العمياء السوداء.
    3. تعلق الكتلة بلتيير وتتوافق معدنية أسفل الشريحة من الغرفة باستخدام وجع ألين. نعلق خرطوم مع حقنة 50 مل إلى محول لور للقفل. إدراج التحقيق في درجة الحرارة في الغرفة.
  3. إدراج أهداف وغرفة في مجهر
    1. الاختيار تحت المجسام أن جميع أهداف نظيفة. استخدام أهداف الإضاءة 10X / 0.2 والهدف كشف خطة-امزيغ 20X / 1.0 W، وتأكد من أن يتم تعيين الانكسار طوق تصحيح مؤشره إلى 1.33 للمياه. المسمار الهدف كشف في المجهر، مع الحفاظ على الأهداف إلقاء الضوء على تغطيتها.
    2. تنزع الأغطية البلاستيكية الواقية التي تغطي الأهداف إلقاء الضوء. بعناية بتحريك الدائرة في المجهر وتشديد عليه مع المسمار تأمين.
    3. توصيل الحرارة المواليةأن تكون وكتلة بلتيير مع المجهر.
      ملاحظة: أنابيب اللذين تعميم التبريد السائل لكتلة بلتيير متوافقة مع كل من الموصلات. وتشكل هذه الدائرة تعمل بغض النظر عن التوجه للاتصال.
    4. تملأ الغرفة من خلال حقنة مع حل أعدت في الخطوة 1.2 حتى الحافة العليا من نوافذ الغرفة. تأكد من أن الغرفة لا تسرب.
    5. بدء تشغيل المجهر، حضانة وأجهزة مراقبة وتخزين. بدء تشغيل برامج تشغيل المجهر وضبط درجة حرارة الحضانة إلى 28.5 درجة مئوية.
      ملاحظة: سوف يستغرق 1 ساعة لكي تتوازن تماما. تحضير العينة في هذه الأثناء.

إعداد 3. عينة

  1. إعداد مزيج الاغاروز
    1. 15 دقيقة قبل اتخاذ من مزيج الاغاروز، تذوب واحد 1 مل قسامة من 1٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز (المنحلة في E3 المتوسطة) في كتلة التدفئة لتعيين 70 درجة مئوية. وبمجرد أن الاغاروز هو MOL تماماعشر، ونقل 600 ميكرولتر في أنبوب 1.5 مل الطازجة، إضافة 250 ميكرولتر من E3 المتوسطة، 50 ميكرولتر من 0.4٪ MS-222 و 25 ميكرولتر من vortexed حل الأسهم حبة.
      ملاحظة: هذا يجعل 925 ميكرولتر من المزيج، بينما يتم احتساب 75 ميكرولتر إضافية للسائل وأضاف في وقت لاحق مع الأجنة.
    2. الحفاظ على أنبوب في كتلة التدفئة الثانية في 38-40 درجة مئوية أو ضمان الاغاروز قريب جدا من نقطة التبلور لها قبل وضع الأجنة العينة إلى ذلك.
  2. تصاعد الأجنة
    1. يستغرق خمس الزجاج الشعيرات الدموية من 20 حجم ميكرولتر (مع علامة سوداء، ~ 1 مم القطر الداخلي) وإدراج الغطاسون تفلون مطابقة طرف فيها. دفع المكبس من خلال الشعيرات الدموية بحيث غيض تفلون في الجزء السفلي من الشعيرات الدموية.
    2. نقل خمسة أجنة (وهو العدد الذي يمكن تركيبه في وقت واحد) مع كوب أو ماصة بلاستيكية في أنبوب من vortexed 37 ° C مزيج الاغاروز الدافئ.
      ملاحظة: في محاولة لحمل أكثر من حجم الحد الأدنى من الذكاء سويا السائلةح الأجنة.
    3. تضاف الشعرية في مزيج وتمتص جنين واحد داخل عن طريق سحب المكبس حتى. تأكد من أن رأس الجنين يدخل الشعرية قبل الذيل. تجنب أي فقاعات الهواء بين المكبس والعينة. يجب أن تكون هناك ± 2 سم من الاغاروز فوق الجنين و± 1 سم أقل من ذلك. كرر الأجنة المتبقية.
    4. انتظر حتى يتصلب تماما agarose، والذي يحدث في غضون بضع دقائق ثم تخزين العينات في E3 المتوسطة، من خلال التمسك بها على جدار كوب مع البلاستيسين أو الشريط. افتتاح الجزء السفلي من الشعرية يجب أن تكون معلقة الحرة في حل يسمح تبادل الغاز للعينة.
      ملاحظة: بروتوكول مماثل إلى الأقسام 3.1 و 3.2 يمكن العثور أيضا على http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation OpenSPIM صفحة ويكي.

تحديد المواقع 4. عينة

  1. الجمعية حامل عينة
    1. إدراج 2 كم بلاستيكي من الحجم الصحيح (أسود)ضد بعضها البعض في الجذعية صاحب العينة. لديها الجانبين فتحة لمواجهة الخارج. نعلق المسمار المشبك فضفاضة بتحويلها 2-3 جولات. تضاف الشعرية من خلال المسمار المشبك ودفعها من خلال حامل حتى تصبح الفرقة اللون الأسود واضحة على الجانب الآخر. تجنب لمس الغطاس.
    2. تشديد المسمار المشبك. دفع الزائدة 1 سم من الاغاروز أدناه الجنين من شعري وقطع عليه. إدراج الجذعية إلى القرص صاحب العينة.
    3. تأكيد في البرنامج أن المرحلة المجهر هي في موقف الحمل. استخدام القضبان توجيه لزحلقة صاحب كله مع العينة رأسيا إلى أسفل إلى المجهر. بدوره، بحيث المغناطيسي أقفال القرص حامل في الموقف.
  2. تحديد موقع شعري
    1. من الآن فصاعدا، والسيطرة على المواقع عينة من قبل البرنامج. في علامة التبويب حدد اختيار الخيار الشعرية للموقع ووضع الشعرية في x و y و z إلى التركيز فقط فوق الكائن كشفعدسة إيف. استخدام تمثيل رسومي في الملاح عينة للاسترشاد بها.
    2. دفع الجنين بلطف من شعري حتى يصبح أمام التلميذ للهدف الكشف.
      ملاحظة: "حدد موقع الشعرية" هي الخطوة الوحيدة المتبقية في البروتوكول، وخلالها يجب فتح الغطاء العلوي من المجهر ودفعت العينة بها.
  3. تحديد مكان وجود عينة
    1. التبديل إلى الخيار "تحديد موقع العينة وبنسبة 0.5 التكبير جعل العين الزرد في مركز مجال الرؤية. تدوير الجنين، بحيث الورقة الضوء لا يمر أي أجزاء الانكسارية للغاية أو امتصاص للعينة قبل أن تصل إلى العين. وبالمثل، فإن مضان المنبعثة يحتاج إلى مسار واضح للخروج من العينة. انقر على 'تعيين الوظيفة الرئيسية.
    2. فتح الباب الأمامي للالمجهر ووضع غطاء من البلاستيك مع افتتاح 3 مم على رأس الغرفة لتجنب التبخر.
      ملاحظة: في حالة انخفاض مستوى السائل أدناهمستوى التصوير، والتجربة سوف يثير الشبهة.
    3. تحقق ضربات القلب للجنين وكيلا للصحة العامة. إذا كانت بطيئة للغاية، واستخدام عينة أخرى (مقارنة مع الضوابط غير محمولة، قيم معينة تعتمد على مرحلة تنموية). التبديل إلى وضع التكبير النهائي وتعديل موقف الجنين.

5. إعداد ومتعددة الأبعاد اكتساب

  1. معلمات اكتساب
    1. التبديل إلى علامة التبويب "الاستحواذ". تحديد مسار الضوء بما في ذلك خطوط الليزر، والهدف كشف، مرشح ليزر حظر، شعاع الخائن والكاميرات.
    2. تنشيط خانة الاختيار مسح محور. تحديد إعدادات اكتساب الأخرى مثل عمق بت، على شكل صورة، وعلى ضوء ورقة سمك واختيار الإضاءة جانب واحد.
    3. اضغط على "مستمر" واعتمادا على كثافة الصورة التي تم الحصول عليها تغيير الوقت قوة الليزر والتعرض الكاميرا.
      ملاحظة: للحصول على ضبط استخدام جميع إعدادات التصوير ليهمحطات الطاقة ليزر (0.5٪ من 100 ليزر ميغاواط، 30 مللي ثانية وقت التعرض)، من أجل التجربة الفعلية لتجنب الضرر صورة غير ضروري للعينة.
  2. ضوء ورقة التعديل
    1. التبديل إلى "الإضاءة الوجهين المزدوج" و تفعيل "مربع اون لاين ثنائي الجانب Fusio'n. بدء تشغيل "Lightsheet لصناعة السيارات في ضبط المعالج. اتبع خطوة تعليمات خطوة.
      ملاحظة: المعالج يتحرك ورقة خفيفة في المستوى البؤري للهدف الكشف، ويضمن أنه لا يميل والخصر لها في مركز مجال الرؤية. بعد الانتهاء من الضبط التلقائي، ويتم تحديثها مواقف الأوراق ضوء اليسار واليمين تلقائيا في البرنامج. تحسن في جودة الصورة الآن يجب أن يكون واضحا. تفعيل مربع 'Z كومة ".
    2. تحقق من تعديل ورقة خفيفة بتفقد التماثل وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية) التي قدمها الخرز الفلورسنت في XZ وYZ عرض أورثو. إذا كان لار متماثل، يدويا ضبط ضوء موقف المعلمة ورقة صعودا ونزولا حتى تحقيق الرملية متماثل شكل قوات الأمن الفلسطينية (الشكل 1A).
  3. إعدادات اقتناء متعددة الأبعاد
    1. تحديد كومة ض مع 'شريحة الأولى "وخيارات" شريحة آخر "وتعيين خطوة ض إلى 1 ميكرون.
      ملاحظة: ورقة الخفيفة في هذا المجهر هي ثابتة ويتحقق ض باجتزاء عن طريق تحريك العينة من خلال. دائما استخدام الخيار "محرك المستمر" لسرعة اكتساب ض مداخن.
    2. تفعيل مربع الاختيار "السلاسل الزمنية". تحديد عدد من النقاط الزمنية والفاصل بينهما.
    3. تفعيل "بطرق عرض متعددة" مربع. إضافة العرض الحالي إلى قائمة بطرق عرض متعددة، حيث يتم تخزين المعلومات س، ص، ض وزاوية. استخدام وحدة تحكم مرحلة لتدوير الشعرية وتحديد وجهات النظر الأخرى المطلوبة. اقامة ض المكدس في كل عرض وإضافتها إلى قائمة بطرق عرض متعددة.
      لاحظ الالبرنامج بفرز الآراء بطريقة المسلسل، بحيث يتم تشغيل الشعرية باتجاه و، في حين يتم الحصول على الصورة.
  4. تصحيح الانحراف وبدء التجربة
    1. مرة واحدة في اكتساب اقامة كاملة، الانتظار 15-30 دقيقة قبل بدء التجربة الفعلية.
      ملاحظة: العينة الانجرافات في البداية قليلة ميكرومتر في x و y و z، ولكن يجب أن تتوقف في غضون 30 دقيقة. إذا تحافظ على عينة الانجراف لفترة أطول، واستخدام عينة أو الفرس البديل آخر.
    2. التبديل إلى علامة التبويب "المحافظة" وخيار "مباشر 'تحديد الكيفية التي ينبغي أن يتم حفظ البيانات، على سبيل المثال، ملف واحد في نقطة زمنية أو ملف منفصل لكل رأي والقناة. العودة إلى علامة التبويب "الاستحواذ"، اضغط على "ابدأ تجربة" وتحديد اسم الملف، المكان الذي يجب حفظه وتنسيق ملف (استخدام .czi).
    3. مراقبة الاستحواذ على نقطة لأول مرة للتأكد من أن كل شيء يسير على خير ما يرام. الشروع فورا مع تسجيلوانصهار نقطة لأول مرة كما هو موضح في الخطوات 6 و 7، للتأكد من أنه سيكون من الممكن معالجة بيانات كاملة.

6. بطرق عرض متعددة التسجيل

  1. بطرق عرض متعددة التعمير التطبيق
    1. في نهاية الدورة والتصوير، ونقل البيانات من الكمبيوتر تخزين البيانات على المجهر لجهاز كمبيوتر معالجة البيانات. استخدام 'بطرق عرض متعددة ReconstructionApplication "20،21،31 تنفيذها في فيجي 32 لمعالجة البيانات (الشكل 1B).
  2. تحديد الإدراجات
    1. تحديث فيجي: فيجي> مساعدة> تحديث يماغيج وفيجي> مساعدة> تحديث فيجي. استخدام يماغيج الرئيسي والمواقع تحديث فيجي.
    2. نقل بيانات كامل في مجلد واحد. سيتم حفظ النتائج والملفات وسيطة للمعالجة في هذا المجلد. بدء إعادة إعمار تطبيق بطرق عرض متعددة: فيجي> ملحقات> بطرق عرض متعددة إعادة الإعمار> Multiviمصريات تطبيق إعادة الإعمار.
    3. اختر 'تحديد مجموعة بيانات جديدة ". كنوع من مجموعة البيانات حدد الخيار MEU "زايس Lightsheet Z.1 الإدراجات (الامكنه Bioformats)" وإنشاء اسم للملف. xml. ثم حدد الملف .czi الأول من ورقة العمل (أي ملف دون رقم قياسي). أنه يحتوي على بيانات الصورة وكذلك البيانات الوصفية للتسجيل.
      ملاحظة: بمجرد فتح البرنامج أول ملف .czi، يتم تحميل بيانات التعريف في البرنامج.
    4. تأكد من أن عدد من الزوايا، والقنوات، إضاءات ومراقبة حجم فوكسل من البيانات الوصفية. على الضغط على موافق، ومراقبة ثلاث نوافذ منفصلة المفتوحة (الشكل 1C): نافذة السجل، والتي تبين التقدم للتجهيز ونتائجها، و"ViewSetup إكسبلورر" وحدة التحكم، تظهر رسائل الخطأ من فيجي.
      ملاحظة: "ViewSetup إكسبلورر 'هي واجهة سهلة الاستخدام التي تظهر كل عرض، قناة والإضاءة، ويسمح لاختيار الملفات ذات الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك، فإن "ViewSetup إكسبلورر يتيح توجيه كل خطوات المعالجة.
    5. حدد الملفات التي تحتاج إلى معالجة واضغط على زر الفأرة الأيمن في المستكشف. مراقبة نافذة مفتوحة مع خطوات المعالجة المختلفة (الشكل 1C).
    6. على تحديد مجموعة البيانات، نلاحظ أن يتم إنشاء ملف. xml في المجلد الذي يحتوي على البيانات.
      ملاحظة: هذا الملف يحتوي على البيانات الوصفية التي تم تأكيدها من قبل.
    7. في الزاوية اليمنى العليا مراقبة 'معلومات' اثنين من الأزرار و "حفظ". الضغط على 'المعلومات' يعرض ملخصا لمحتوى ملف. xml. الضغط على 'حفظ' سيوفر نتائج المعالجة.
      ملاحظة: أثناء معالجة في 'بطرق عرض متعددة التعمير التطبيق، بحاجة إلى خطوات المعالجة المختلفة ليتم حفظها في. XML قبل أن يغلق فيجي.

OAD / 53966 / 53966fig1.jpg "/>
الشكل 1: بطرق عرض متعددة التعمير سير العمل ونقطة اهتمام كشف (A) ضوء رقة محاذاة القائم على التصوير حبة الفلورسنت. يتم محاذاة النظام (في الوسط)، عندما تكون الصورة حبة لديها شكل الساعة الرملية متناظرة في التوقعات XZ وYZ. وتظهر الأمثلة من ورقة الخفيفة المنحرفة في أي من الاتجاهين على اليسار واليمين. ، وتظهر التوقعات كثافة القصوى للحبة 500 نانومتر في XZ محاور YZ وس ص. لاحظ أن نسبة كثافة الذروة المركزية من القرص إيري (في س ص) لفصوص الجانب هو أكبر، وعندما يتم محاذاة lightsheet بشكل صحيح مقارنة بالوضع المنحرفة. واتخذت صورة مع 20X / 1.0 الهدف W بنسبة 0.7 التكبير. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (ب) يتم تعريف مجموعة البيانات ثم resaved في شكل HDF5. وقد تم تقسيم حبات ثم تسجيله. لسلسلة زمنية يتم تسجيل كل نقطة زمنية على نقطة زمنية مرجعية. وتنصهر البيانات أخيرا إلىحجم الخواص واحد. (C، العلوي) مستكشف ViewSetup يبين مختلف نقاط وقت والزوايا والقنوات وجوانب الإضاءة من ورقة العمل. (C، غادر الزاوية السفلى) يبين الإطار BigDataViewer الرأي الذي تم تحديده في مستكشف ViewSetup. (C، في الوسط إلى اليمين) انقر بزر الماوس الأيمن في مستكشف ViewSetup يفتح خيارات المعالجة. (C، وانخفاض الزاوية اليمنى) يتم عرض التقدم ونتائج المعالجة في ملف السجل. (D و E) والهدف من هذا الكشف هو جزء العديد من النقاط الفائدة (الخرز) مع الكشف كما يذكر في عينة وقت ممكن هو موضح هنا كما قطات من تجزئة حبة التفاعلية. (D و الزاوية اليسرى العليا) ويعرف تجزئة من قبل اثنين من المعلمات، والقيم الفرق من بين جاوس سيغما 1 وعتبة. (D) مثال على كشف ناجحة بهدف تضخيم حبة الكشف بشكل صحيح. (E) الإنقسام مع عدد كبير جدا من ايجابيات كاذبة واكتشافات متعددة من حبة واحدة. شريط النطاق في (C) يمثل 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قم بإعادة حفظ الإدراجات في تنسيق HDF5
    1. لإعادة حفظ بيانات بأكمله، حدد كافة الملفات مع السيطرة / أبل + لوفوق الحق. ثم حدد مجموعة البيانات بإعادة حفظ وكما HDF5.
    2. سوف تظهر نافذة عرض تحذير من شأنها أن يكون resaved جميع وجهات النظر من مجموعة البيانات الحالية. اضغط نعم.
      ملاحظة: سوف يستمر البرنامج لإعادة حفظ الملفات .czi إلى hdf5 من خلال فتح كل الملفات وresaving مستويات دقة مختلفة من التنسيق hdf5. وسوف نؤكد مع "تم" عند الانتهاء. Resaving usuallذ يأخذ دقائق قليلة في timepoint (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: منذ الملفات في شكل hdf5 يمكن تحميل سريع جدا، فمن الممكن الآن لعرض مجموعة بيانات غير مسجلة من قبل "فوق الحق" في مستكشف وتبديل "عرض في BigDataViewer (تشغيل / إيقاف). سوف تظهر نافذة BigDataViewer مع العرض المحدد (الشكل 1C). يتم شرح المهام الأساسية للBigDataViewer 33 في الجدول 2 وhttp://fiji.sc/BigDataViewer.
  2. كشف نقاط الاهتمام
    1. تحديد كافة النقاط الزمنية مع السيطرة / أبل + لوانقر على الحق حدد الكشف عن نقاط الاهتمام.
    2. حدد الفرق من بين جاوس 34 لنوع من الكشف عن نقطة اهتمام. منذ يستخدم تسجيل القائم على حبة هنا، اكتب "الخرز" في حقل للحصول على نقاط الاهتمام التسمية. تفعيل "باختزال الصور قبل تجزئة".
    3. في الإطار التالي، لاحظ ديتإعدادات ection. ل 'البكسل الفرعي توطين "استعمال" نوبة من الدرجة الثانية 3-الأبعاد "34 وتحديد القيم الفرق من بين التمويه ونصف قطرها لاستخدام حبة تجزئة" التفاعلية "في مواصفات نقطة i'nterest".
    4. ل 'باختزال XY "استعمال" المباراة Z قرار (أقل الاختزال) "وبأنه" باختزال Z' استخدام 1 ×. حجم ض خطوة أكبر من حجم س ص بكسل، وبالتالي ببساطة أسفل أخذ عينات من س ص لتتناسب مع قرار z غير كافية. اختر 'حساب على وحدة المعالجة المركزية (JAVA). اضغط على "موافق".
    5. في إطار المنبثقة، حدد جهة نظر واحدة لاختبار المعلمات من القائمة المنسدلة. بمجرد أن يتم تحميل عرض، وضبط السطوع والتباين من النافذة مع فيجي> صورة> ضبط> السطوع / التباين أو على Ctrl + Shift + مربع جيم القراد "نظرة عن ماكسيما (الخضراء)" للكشف عن حبة.
    6. مراقبة تجزئة في 'viewSetup "حلقات كما الخضراء أروند على المكتشفة عندما تبحث عن ماكسيما والأحمر للدنيا. يتم تعريف تجزئة من قبل اثنين من المعلمات، والفرق من بين التمويه قيم سيغما 1 وعتبة (1D الشكل). تعديلها وفقا لشريحة أكبر عدد ممكن من الخرز حول العينة وعدد قليل من اكتشافات إيجابية كاذبة ضمن عينة وقت ممكن (1D الشكل). كشف كل حبة مرة واحدة فقط وليس عدة مرات (الشكل 1E). بعد تحديد المعايير المثلى، اضغط على "فعل".
      ملاحظة: يبدأ الكشف عن طريق تحميل كل رأي فردي من نقطة زمنية وبتجزئة الخرز. في ملف السجل، إخراج البرنامج عدد من الخرز انها رصدت في الرأي. وينبغي أن يتم الكشف في بضع ثوان (انظر الجدول 1).
    7. الصحافة حفظ عندما كمية المكتشفة غير المناسب (600 إلى عدة آلاف في رأي).
      ملاحظة: سيتم إنشاء مجلد في دليل البيانات، والتي سوف تحتوي على المعلومات!ن عن إحداثيات حبات الكشف.
  3. تسجيل عن طريق نقاط الاهتمام
    1. تحديد كافة النقاط الزمنية مع السيطرة / أبل + A، انقر بزر الماوس الأيمن واختيار 'التسجيل باستخدام نقاط الفوائد ".
    2. استخدام "التجزئة سريع 3D هندسية (دوران ثابتة)" للكشف عن حبة ب "خوارزمية التسجيل".
      ملاحظة: تفترض هذه الخوارزمية أي معرفة مسبقة عن التوجيه وتحديد المواقع من وجهات نظر مختلفة مع الاحترام لبعضهما البعض.
    3. لتسجيل وجهات النظر على بعضها البعض، اختر 'تسجيل timepoints فردي "على أنه" نوع من التسجيل ". ل"نقاط اهتمام" في القناة المختارة، الآن يجب أن تكون التسمية المحددة سابقا لنقاط الاهتمام مرئية (أي "الخرز").
    4. في الإطار التالي، استخدم القيم المحددة مسبقا للتسجيل. إصلاح القول الأول عن طريق تحديد "البلاط فيكس: إصلاح البلاط الأول والاستخدام لا خريطة عودة '(استخدم هذا إذا سمسمليست ثابتة وفاق) في قسم 'خريطة الظهر البلاط.
    5. استخدام "نموذج التحول أفيني 'مع' تسوية '.
      ملاحظة: الخطأ المسموح به للتوافق العينات العشوائية يكون 5px وأن 'أهمية عن مباراة واصف "يكون 10. بالنسبة إلى" تسوية "استخدام" نموذج جامد' مع امدا من 0.10، مما يعني أن التحول هو 10٪ جامدة و90 ٪ أفيني 35. اضغط على موافق لبدء التسجيل.
      ملاحظة: كما عرض في نافذة سجل أولا تلاءم كل عرض مع كل وجهات النظر الأخرى. ثم التوافق عينة عشوائية (توافق العينات العشوائية) 36 اختبارات المراسلات ويستبعد ايجابيات كاذبة. لتسجيل قوي، يجب أن تكون القيمة توافق العينات العشوائية أعلى من 90٪. عندما يتم العثور على عدد كاف من المرشحين صحيح المقابلة بين وجهتي نظر، يتم احتساب نموذج التحول بين كل مباراة مع متوسط ​​النزوح في بكسل. يتم بعد ذلك إجراء التحسين العالمي تكرارية بها وجميع وجهات النظر تم تسجيلها على وجهة نظر ثابتة. مع نجاح عملية التسجيل، ويتم احتساب نموذج التحول وعرض مع التحجيم وتشريد بالبكسل. يجب أن يكون متوسط ​​الخطأ على النحو الأمثل أقل من 1 بكسل والتحجيم للتحول بالقرب 1. يتم تنفيذ التسجيل في ثوان (انظر الجدول 1).
    6. تأكد من وجود أي تحول بين وجهات نظر مختلفة كما لوحظ على الهياكل الدقيقة داخل العينة، مثل أغشية الخلايا. ثم حفظ التحول لكل رأي في ملف. xml.
      ملاحظة: الآن آراء مسجلة متداخلة بعضها البعض في BigDataViewer (الشكل 2A) والصور حبة يجب أن تتراكب وكذلك (الشكل 2B).
    7. إزالة التحولات عن طريق تحديد نقاط الوقت انقر بزر الماوس الأيمن عليها ثم حدد إزالة التحولات> آخر / الأحدث التحول.

إعادة 2 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>

الشكل 2: نتائج إعادة الإعمار بطرق عرض متعددة (A) مضافين عدد المشاهدات المسجلة، كل بلون مختلف للتدليل على تداخل بينهما. (ب) تضخمت رأي يظهر تداخل PSFs من الخرز تصوير من وجهات نظر مختلفة. (C) قرب من حبة بعد الانصهار، وقوات الأمن الفلسطينية في المتوسط ​​من وجهات نظر مختلفة. (D) قوات الأمن الفلسطينية من نفس حبة كما في (C) بعد بطرق عرض متعددة deconvolution تبين أن قوات الأمن الفلسطينية تنهار في نقطة واحدة. (E) قسم س ص و (F) قسم YZ من عرض واحد من الحويصلة البصرية، والتي وصفت الأغشية مع GFP تبين تدهور في إشارة ض أعمق في الأنسجة. (G) قسم س ص و (H) قسم YZ من وجهة النظر نفسها بعد المتوسط ​​المرجح لمزيج من 4 وجهات النظر ما يقرب من 20 درجة على حدة مع أكثر قليلا degraقرار س ص دائرة التنمية الاقتصادية بشكل عام ولكن زيادة ض القرار. (I) قسم س ص و (J) قسم YZ من نفس البيانات بعد deconvolution بطرق عرض متعددة، مما يدل على زيادة كبيرة في القرار وعلى النقيض من إشارة في كل من س ص وض. الصور في (EJ) هي شرائح ضوئية واحدة. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون (A، B، EJ) و 10 ميكرون (C، D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. التسجيل مرور الزمن
    1. تحديد الفاصل الزمني كله، انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "تسجيل باستخدام الفائدة نقاط" لتحقيق الاستقرار في الوقت الفاصل مع مرور الوقت.
    2. في 'نافذة معلمات التسجيل الأساسي تحديد مباراة ضد نقطة زمنية إشارة واحدة (لا التحسين العالمية) لنوع من التسجيل ". كه الجيش الشعبي انه ر الإعدادات الأخرى نفس كما هو الحال في تسجيل النقاط وقت الفردية.
    3. في القادمالنافذة، حدد نقطة زمنية لاستخدامها كمرجع، وعادة نقطة زمنية في منتصف الوقت الفاصل. وضع علامة في مربع "النظر في كل timepoint كوحدة جامدة، منذ آراء فردية في كل نقطة زمنية يتم تسجيل بالفعل على بعضها البعض.
    4. وضع علامة في المربع 'عرض متسلسلة زمنية الإحصاءات. لا تزال المعلمات تسجيل أخرى كما كان من قبل بما في ذلك تسوية. اضغط موافق.
      ملاحظة: في إطار السجل، سوف يتم عرض نفس الناتج كما في تسجيل نقطة زمنية الفردية. إذا كان التسجيل لنقطة زمنية فردية ناجحة وقوية، وتوافق العينات العشوائية هو الآن 99-100٪ ومتوسط، والحد الأدنى والحد الأقصى الخطأ هو عادة أقل من 1 بكسل. حفظ هذا التسجيل قبل المتابعة.

7. بطرق عرض متعددة فيوجن

ملاحظة: يترتب على التحولات من خطوات التسجيل وتستخدم لحساب كومة الخواص تنصهر من وجهات نظر متعددة. هذا المكدس هكتارق زيادة عدد شرائح ض مقارنة البيانات الأصلية، لأن ض التباعد هو الآن يساوي حجم البكسل الأصلي في س ص. الانصهار يمكن أن يقوم بها إما على المحتوى بطرق عرض متعددة الانصهار 21،31 أو على أساس النظرية الافتراضية، بطرق عرض متعددة deconvolution 31، وكلاهما تنفيذها في تطبيق بطرق عرض متعددة إعادة الإعمار.

  1. المربع المحيط
    ملاحظة: الانصهار هو عملية مكلفة حسابيا (انظر الجدول 1)، وبالتالي تقليل كمية البيانات عن طريق تحديد المربع المحيط إلى زيادة كبيرة في سرعة المعالجة.
    1. تحديد كافة النقاط الزمنية انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر تحديد "المربع المحيط. استخدام 'تحديد مع BigDataViewer "واختيار اسم للمربع المحيط.
    2. حرك مربع التمرير ل"دقيقة" و "ماكس" في كل محور لتحديد المنطقة ذات الاهتمام ومن ثم اضغط على "موافق". سيتم عرض المعلمات من المربع المحيط.
      ملاحظة: سيتم المربع المحيط يحتوي على كل ما فيالمربع الأخضر الذي غطى بطبقة أرجواني شفافة.
  2. على المحتوى بطرق عرض متعددة فيوجن
    ملاحظة: تستند المحتوى بطرق عرض متعددة الانصهار 21 يأخذ الخلافات جودة الصورة عبر كومة (أي تدهور في إشارة ض) في الحسبان، وينطبق أوزانا أكبر لتحسين جودة الصورة بدلا من استخدام المتوسط ​​البسيط.
    1. تحديد نقطة زمنية (ق) التي يجب أن تنصهر في 'ViewSetup إكسبلورر "، انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر" صورة فيوجن / Deconvolution ".
    2. في صورة نافذة فيوجن، اختر 'المتوسط ​​المرجح لانصهار' من القائمة المنسدلة، واختيار "استخدام محددة مسبقا المربع المحيط لالمربع المحيط. لإخراج صورة تنصهر حدد "إلحاق مشروع XML الحالي، الذي يكتب الملفات hdf5 جديدة إلى الملفات الموجودة بالفعل hdf5 ويسمح باستخدام وجهات نظر غير مدمجة مسجل وصورة تنصهر معا. اضغط على "موافق".
    3. ثم في "قبل تحديد المربع المحيط & #39؛ يطفو على السطح النافذة، حدد اسم المربع المحيط المحددة سابقا واضغط على "موافق".
    4. مراقبة المعلمات من المربع المحيط في الإطار التالي. للاندماج سريع، وتطبيق عينة أسفل على مجموعة البيانات تنصهر فيها.
      ملاحظة: إذا كانت المجموعة تنصهر فوق حجم معين، وسوف يوصي البرنامج باستخدام أكثر الذاكرة فعالة "ImageLib2 containe'r. التحول من "ArrayImg 'إلى' PlanarImg (صور كبيرة، وسهلة لعرضه) أو CellImg (صور كبيرة) 'حاوية، والتي تسمح بمعالجة البيانات الكبيرة. على خلاف ذلك استخدام إعدادات محددة مسبقا وتطبيق "الانصهار مزج والقائمة على المحتوى". المضي قدما عن طريق الضغط على "موافق".
    5. مراقبة إعدادات hdf5 في الإطار التالي. استخدام المعلمات محددة سلفا، وبدء عملية الاندماج. تأكد من أن فيجي كلف ذاكرة كافية في تحرير> خيارات> ذاكرة والمواضيع.
  3. بطرق عرض متعددة Deconvolution
    ملاحظة: بطرق عرض متعددة Deconvolution 31 غير anotلها نوع من الانصهار بطرق عرض متعددة. هنا بالإضافة إلى الانصهار، يؤخذ قوات الأمن الفلسطينية من نظام التصوير في الاعتبار من أجل deconvolve دقة وضوح الصورة والعائد زيادة وعلى النقيض من إشارة (مقارنة في الشكل 2C-J، الرقم 5 وفيلم 3).
    1. تحديد نقطة زمنية (ق) إلى أن deconvolved، انقر بزر الماوس الأيمن ثم اضغط على "صورة فيوجن / Deconvolution".
    2. اختر 'بطرق عرض متعددة Deconvolution "واستخدام" المربع المحيط محددة مسبقا وإلحاق المشروع XML الحالي ". حدد المربع المحيط ومتابعة.
      ملاحظة: المعلمات محددة مسبقا لdeconvolution هي نقطة انطلاق جيدة. لاستخدام المحاكمة الأولى '20 التكرار "وتقييم تأثير deconvolution باستخدام" وضع التصحيح ". أخيرا تعيين حساب إلى 512 × 512 × 512 الكتل.
    3. في الإطار التالي، استخدم إعدادات محددة مسبقا. تعيين "وضع التصحيح" لعرض نتائج كل "5 الفنارالحصص ".
      ملاحظة: إخراج deconvolution هي بيانات 32 بت، ولكن BigDataViewer حاليا يعتمد فقط بيانات 16 بت. من أجل إلحاق إخراج deconvolution إلى مجموعة البيانات hdf5 القائمة، فإنه لا بد من تحويلها إلى 16 بت.
    4. لتحويل، تشغيل "استخدام دقيقة / ماكس من الصورة الأولى (قد تشبع شدة مع مرور الوقت).
      ملاحظة: سوف deconvolution تبدأ بعد ذلك عن طريق تحميل الصور وإعدادهم للdeconvolution.
  4. BigDataServer
    1. من أجل تقاسم XML كبير جدا / مجموعات البيانات HDF5 استخدام المتشعب الخادم BigDataServer 33. مقدمة لكيفية إعداد والاتصال على هذا الخادم ويمكن الاطلاع على http://fiji.sc/BigDataServer.
    2. للاتصال BigDataServer القائمة مفتوحة فيجي> ملحقات> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
    3. أدخل عنوان URL بما في ذلك ميناء في النافذة.
      ملاحظة: الأفلام الموضحة في هذا الكتاب يمكن الوصول إليها من خلال هذا الإعلاناللباس: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
    4. مراقبة النافذة التي تتيح اختيار الأفلام المتاحة. انقر نقرا مزدوجا فوق لفتح نافذة BigDataViewer وعرض البيانات كما هو موضح سابقا.

التكميلية: المرجعية للمواد المطلوبة قبل البدء

  • الأجنة الزرد / اليرقات التعبير عن البروتينات الفلورية (الحفاظ على الأجنة في المتوسط ​​E3 الزرد دون الميثيلين الأزرق. لمراحل أقدم من 24 ساعة تلغي تصبغ بإضافة PTU إلى تركيز النهائي من 0.2 ملم).
  • المجسام الفلورسنت
  • الشعيرات الدموية (20 حجم ميكرولتر، مع علامة سوداء) والغطاسون المناسبة (لا إعادة استخدام الشعيرات الدموية، والغطاسون، من ناحية أخرى، يمكن إعادة استخدامها لعدة تجارب.)
  • 1.5 مل أنابيب بلاستيكية
  • ملاقط حادة
  • الزجاج (النار مصقول) أو الماصات البلاستيكية (البلاستيك يمكن أن تستخدم لمدة 24 ساعة والأجنة القديمة)
  • الزجاج أو أطباق بلاستيكية قطرها 60 ملم (البلاستيك يمكن أن يكونتستخدم لمدة 24 ساعة والأجنة القديمة)
  • اثنين 100 مل الأكواب
  • (يجب أن تبقى خرطوم وحقنة جافة تماما بين التجارب لتجنب التلوث بواسطة الكائنات الحية الدقيقة.) 50 مل لور للقفل المحاقن مع خرطوم تمديد 150 سم للتسريب
  • مادة لدائنية
  • انخفاض درجة انصهار (آخر دورة شهرية) الاغاروز
  • E3 المتوسطة (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 0.33 ملي MgSO 4)
  • MS-222 (تريكين)
  • الفنيل (PTU)
  • المجهرية الفلورسنت (هنا يشار إلى الخرز)
  • المزدوج المقطر H 2 O ([ده 2 O)

Representative Results

LSFM هو الأسلوب الأمثل لتصوير العمليات التنموية عبر المقاييس. يتم تجميع العديد من التطبيقات هنا يظهر التصوير على المدى الطويل على المديين القصير وهياكل داخل الخلايا، وكذلك الخلايا والأنسجة بأكملها. وتبين هذه الأمثلة أيضا أن LSFM هو أداة مفيدة في مراحل مختلفة من تطور العين من تشكيل كوب البصري إلى تكوين الخلايا العصبية في شبكية العين. الفيلم 1 بمثابة مثال على النهج LSFM العام، لأول مرة يظهر عرض التصغير للجنين سليمة في دمج اسطوانة الأغاروس في brightfield وتبين في وقت لاحق على عرض تفصيلي لشبكية العين في القناة مضان.

فيلم 1
فيلم 1: LSFM من شبكية العين الزرد لتوضيح نهج LSFM، هذا الفيلم يظهر لأول مرة في brightfield الذي تصوير الجنين سليما داخل لgarose اسطوانة قبل ان ينتقل الى مضان. في وقت لاحق وتبين أن حقل كبير من الرأي يتيح مراقبة شبكية العين بأكملها. بعد ذلك، يظهر الفيلم منطقة صغيرة تضخيم الشبكية لتسليط الضوء على قرار التحت خلوية جيد. وقد استخدم الفجوة GFP 37 المعدلة وراثيا الجنين الزرد للتصوير: لAth5. هذا التحوير التسميات الخلايا العصبية المختلفة في شبكية العين (أساسا خلايا العقدة والسلائف مبصرة). تم القبض على جزء مضان من الفيلم كما عرض واحد مع تسجيل إضاءة جانب ومزدوجة باستخدام الهدف W 40X / 1.0 مع 5 فترات دقيقة. يظهر أقصى الإسقاط كثافة حجم سميكة 30 ميكرون. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

فيلم 2 يوضح كيف يمكن التقاط الأحداث داخل الخلية وسريعة جدا مع ارتفاع القرار. في هذه الحالة نمو الأنابيب الدقيقة فيبالإضافة إلى نهايتهما في الخلايا الاولية العصبية في شبكية العين. المعلومات الواردة في الفيلم تسمح لتتبع وتقدير من أنيبيب بالإضافة إلى نهاية النمو.

فيلم 2
فيلم 2: ديناميات أنيبيب في خلية واحدة هذا الفيلم يلتقط ينمو نصائح زائد من الأنابيب الدقيقة وصفت من قبل بالإضافة إلى معلومات سرية البروتين علامة EB3-GFP 38. يتم التعبير عن البروتين في خلية سلفية الشبكية واحدة. ميكروتثبول تنمو غالبا في الاتجاه من قمية لالقاعدية (الأعلى إلى الأسفل). وقد تم قياس متوسط ​​سرعة المذنبات EB3 كما 0.28 ± 0.05 ميكرون / ثانية. نقطة مضيئة في الجانب قمية من الخلايا العارضة النشاط التنوي عالية أنيبيب هي الجسيم المركزي. تم حقن نوع الجنين البرية مع HSP70: EB3-GFP DNA البلازميد. وقد اكتسب الفيلم 4 ساعات بعد الصدمة الحرارية (15 دقيقة عند 37 درجة مئوية) في حوالي 28 hrpost الاسمدةأوجه (HPF) كما عرض واحد مع تسجيل إضاءة جانب واحد باستخدام 63X / 1.0 فترات موضوعي و1 ثانية الوقت W. تم اقتصاص خلية واحدة من مجال الرؤية تغطي غالبية شبكية العين. الحد الأقصى لكثافة يرد إسقاط شريحتين. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

3 يبين الشكل، كيف هياكل داخل الخلايا يمكن اتباعها على مدى عدة ساعات. هنا، يتم التقاط الجسيم المركزي في translocating خلايا الشبكية العقدة (RGCs).

الشكل (3)
الرقم 3: توطين الجسيم المركزي خلال شبكية العين النبات الخلايا العقدية هذا المونتاج من تجربة مرور الزمن يبين موقف الجسيم المركزي في جميع أنحاء نضوج خلايا الشبكية العقدة (RGC).في الأسلاف العصبية ومترجمة الجسيم المركزي في الطرف جدا من عملية قمي (01:00). خلال الانقسام الخلوي، وجسيم مركزي اثنين بمثابة أقطاب لمغزل الإنقسامية (02:25). وقد أدى هذا الانقسام في الخلية ابنة واحدة الذي يميز إلى RGC وخلية ابنة الثانية التي يصبح السلائف خلية مستقبلة للضوء. بعد الانقسام، وخلايا الجسم من RGC translocates إلى الجانب القاعدي من شبكية العين، في حين تراوح عملية قمي تعلق في الجانب قمي. مرة واحدة تصل إلى RGC الجانب القاعدي، يفصل عملية قمية لها والجسيم المركزي يسافر معها (06:15). يمكن أن يتبع الجسيم المركزي في حين يتراجع تدريجيا جنبا إلى جنب مع عملية قمي (06:50، 07:20، 08:10). في الإطار الأخير (08:55) من الخلايا العقدية ينمو محور عصبي من جانبها القاعدية، في حين لا يزال المترجمة الجسيم المركزي apically. وقد تحقق هذا التعبير الفسيفساء عن طريق الحقن DNA البلازميد في نوع الجنين البرية في مرحلة خلية واحدة. وتصور الخلايا التي Ath5: GFP-caax (الأخضر) CONSTruct، التي تصف RGCs والخلايا العصبية الأخرى. وصفت جسيم مركزي (السهام) من خلال Centrin-tdTomato 29 التعبير (أرجواني). الجانب قمية من شبكية العين في الجزء العلوي من الصورة والجانب القاعدي في القاع. يظهر أقصى الإسقاط كثافة حجم سميكة 30 ميكرون. تم اقتصاص الصور من فيلم تغطية شبكية العين بأكملها. يبدأ الفيلم في حوالي 34 ساعة بعد الإخصاب (HPF). تم اقتناء ض كومة كل 5 دقائق بهدف W 40X / 1.0. ويظهر مرة في HH: MM. يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في الشكل (4) يتم عرضها، وكيفية سلوك الخلية احد يمكن استخلاصها من بيانات الاستيلاء على النسيج كله مثل في الفيلم 1. يمكن تتبع إزفاء من RGC بسهولة وعملية قمي والقاعدية لوجاءت العناوين.

الشكل (4)
الرقم 4: إزفاء من الخلايا العقدية للشبكية واحدة يحدث النبات RGC من قمي إلى الجانب القاعدي من شبكية العين بعد الانقسام الطرفي كما هو موضح في الشكل (3) هو المسمى RGC من التعبير عن Ath5: الفجوة GFP 37 التحوير. يظهر أقصى الإسقاط كثافة حجم سميكة 30 ميكرون. تم اقتصاص الصور من فيلم تغطية شبكية العين بأكملها. يبدأ الفيلم في حوالي 34 HPF. تم اقتناء ض كومة كل 5 دقائق بهدف W 40X / 1.0. ويظهر مرة في HH: MM. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوضح الشكل (5) قدرة LSFM بطرق عرض متعددة لالتقاط الشوري الأنسجةعمليات التخلق البيرة مع قرار الخلوي على سبيل المثال من التشكل كوب البصري خلالها الحويصلة البصرية يتحول إلى كوب البصري. جودة الصورة يمكن تحسينها بشكل كبير عن طريق التصوير بطرق عرض متعددة، عندما يتم الجمع بين الصورة النهائية من المعلومات من 5 جهات نظر مختلفة (في هذه الحالة) إلى كومة ض واحد مع قرار موحد الخواص. يوضح هذا الرقم تحسنا في جودة الصورة بعد الانصهار المتوسط ​​المرجح لومزيد من المكاسب في المقابل صورة وقرار بعد deconvolution بطرق عرض متعددة. يوضح الشكل شريحتين البصرية في اتجاهات مختلفة من خلال ورقة العمل. بالإضافة إلى ذلك، المونتاج من مجموعة البيانات deconvolved يظهر التشكل كوب البصري مع مرور الوقت. ثم يتم عرض جميع النقاط مرة في فيلم 3.

الرقم 5
الرقم 5: مقارنة بين جودة الصورة بين عرض واحد واثنين من أساليب multiview الانصهار. (A) شريحة واحدة البصرية للعرض البيانات واحد هو مبين من جهة النظر الجانبي و (ب) عرض الظهرية. التحف شريط وتدهور إشارة أعمق داخل عينة واضحة. أيضا لم استولت على جزء من الصورة واضحة في البيانات تنصهر (CF) في هذا الرأي خاص. (ج) نفس شريحة البصرية، والآن كما هو مبين البيانات بطرق عرض متعددة تنصهر من جهة النظر الجانبي و (D) عرض الظهرية. لاحظ أن القطع الأثرية شريط يتم منعها والبنى العميقة في العينة هي حل أفضل. (E) نفس شريحة البصرية الآن كما بطرق عرض متعددة deconvolved البيانات الواردة من جهة النظر الجانبي و(F) عرض الظهرية. لاحظ زيادة التباين والدقة بحيث أغشية الخلايا الفردية ونوى يمكن تمييزها بشكل جيد. إن القرار لا تتدهور ولا سيما أعمق داخل العينة. تم الحصول على بيانات مع إضاءة جانب ومزدوجة من 5 وجهات النظر ما يقرب من 20 درجة على حدة. مداخن ض أ بمن 100 ميكرون مع 1.5 ميكرومتر حجم الخطوة تم الحصول عليها في كل عرض في 10 دقيقة فترات لمدة 10 ساعة بهدف W 20X / 1.0. صور مدخلا للانصهار بطرق عرض متعددة وdeconvolution تم أخذ عينات بانخفاض 2 × لتسريع معالجة الصور. تم تشغيل 15 تكرارات من deconvolution بطرق عرض متعددة. (G) ويبين المونتاج والمساحة المزروعة من وجهة نظر الظهرية من البيانات deconvolved لتسليط الضوء على أحداث التخلق خلال تطوير العين في وقت مبكر من الحويصلة البصرية إلى مرحلة كوب البصرية. طبقات اثنين من الحويصلة البصرية، والتي هي ظهائر عمودية مماثلة في البداية، تفرق في السكان خلية متميزة. الطبقة البعيدة قريبة من البشرة تصبح الظهارة العصبية في شبكية العين (RN) والطبقة القريبة القريبة من الأنبوب العصبي تصبح الظهارة الصبغية الشبكية (RP). الخلايا في استطال RN وينغلف لتشكيل الكأس البصري (1:40 حتي 05:00)؛ في الوقت نفسه الخلايا RP تتسطح. هو فعل الأديم الظاهر سطح لتشكيل عدسة (01:40)، ذوي الخوذات البيضاءفي وقت لاحق invaginates التراث الثقافي غير المادي (05:00). يبدأ الفيلم في 17 HPF. ويظهر مرة في HH: MM. وصفت كل الأغشية الخلوية من قبل β-الأكتين: التحوير رأس GFP ووصفت كل نواة من قبل HSP70: H2B-طلب تقديم العروض التحوير. يمثل مقياس شريط 30 ميكرون. FB الدماغ الأمامي، عدسة جنيه، OP اللوحاء حاسة الشم، RN الظهارة العصبية في شبكية العين، RP الشبكية الظهارة الصبغية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 3
فيلم 3: البصري كوب التشكل أظهرت مع رأي واحد واثنين من طرق الاندماج بطرق عرض متعددة يوضح الفيلم الوقت الفاصل بين عملية كاملة من التشكل كوب البصري من الحويصلة البصرية إلى مرحلة كوب البصرية. ويظهر شريحة ضوئية واحدة من وجهة النظر الجانبي (أعلى) وشريحة ضوئية واحدة من وجهة النظر ظهري (القاع). خلايا الحويصلة البصرية تطوير الخضوع لإعادة ترتيب معقدة لتشكيل أخيرا الكأس البصرية نصف كروية مع الظهارة العصبية في شبكية العين الداخلية والخارجية الشبكية الظهارة الصبغية. يتم تشكيل العدسة من الأديم الظاهر السطح. ومن invaginates جنبا إلى جنب مع الظهارة العصبية ويجلس في كوب البصري. وصفت كل الأغشية الخلوية من التعبير عن β-الأكتين: رأس GFP (الأخضر) التحوير ووصفت نوى مع HSP70: H2B-طلب تقديم العروض (أرجواني). يبدأ الفيلم في نحو 17 HPF. تم الحصول على بيانات مع إضاءة جانب ومزدوجة من 5 وجهات النظر ما يقرب من 20 درجة، وبصرف النظر من الألف إلى الياء أكوام من حوالي 100 ميكرون تم الحصول عليها كل 10 دقيقة بهدف W 20X / 1.0. ويظهر مرة في HH: MM. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

1. الخطوات الهامة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على البيانات

يمكن العثور على إعدادات التصوير نموذجية لGFP وطلب تقديم العروض التعبير عن عينة في الجدول 3. في الإعداد المجهر وصف ورقة الخفيفة الثابتة، التي شكلتها عدسة اسطوانية. أهداف الإضاءة هما العدسات الهواء والهدف الكشف عدسة المياه غمس. تكبير 1.0 مع 20X / 1.0 أو 40X / 1.0 الأهداف يعطي 230 نانومتر و 115 نانومتر حجم بكسل ومجال الرؤية من 441 س 441 ميكرون أو 221 س 221 ميكرون على التوالي. فمن المستحسن استخدام ضوء ورقة سمك الافتراضي مع المركز إلى الحدود نسبة 1: 2. ل20X / 1.0 هذا السمك يتوافق مع 4.5 ميكرون ول40X / 1،0-3،2 ميكرون في المركز. إذا كانت سرعة التصوير ليست هي الأولوية الأساسية، استخدام مسارات منفصلة في حالة وجود عينة متعدد الألوان لتجنب الحديث المتبادل من الانبعاثات مضان بين القنوات. أعلى سرعة اكتساب يقتصر على 50 ميللي ثانية لكل ض خطوة من قبلسرعة الحركة للسائق ض. إذا كان الهدف هو تحقيق أقصى سرعة التصوير في حالة، على سبيل المثال، مسارين مع إضاءة جانب ومزدوجة، يجب تعيين وقت التعرض ذلك أن مجموع كل الصور التي التقطت في ض الخطوة هو أقل من 50 مللي ثانية. من ناحية أخرى، إذا تم الحصول عليها سوى صورة واحدة لكل ض الخطوة، فإنه ليس من المفيد لضبط وقت التعرض أقصر من 50 مللي ثانية.

حجم 1920 x 1920 صورة
16-بت
محور مسح على
إضاءة جانب ومزدوجة مع الانصهار على الانترنت
10X الهدف / 0.2 إضاءة
20X الهدف كشف / 1.0 W خطة-امزيغ
المسار 1: الإثارة 488 نانومتر عادة 2٪ من 100 ليزر ميغاواط، 550 نانومتر تصفية الانبعاثات SP
المسار 2: الإثارة 561 نانومتر عادة 3٪ من 75 ليزر ميغاواط، 585 نانومتر تصفية الانبعاثات ليرة لبنانية
التعرض لفترة تصل إلى 100 مللي ثانية
Z سماكة كومة 50-100 ميكرون
1-1.5 ميكرون ض حجم الخطوة في وضع ض حملة مستمرة
حضانة في 28.5 درجة مئوية

الجدول 3: التصوير الإعدادات.

فحص العينة بعد التجربة

ومن المهم التأكد من أن العينة لا تزال سليمة في نهاية التجربة. كما قراءات الأولى، والتحقق من نبضات القلب للعينة تحت المجسام. مع زوج من الملقط حادة العينة التي يمكن اتخاذها للخروج من الاغاروز ونقلها إلى حاضنة لمواصلة تطوير من أجل معرفة ما إذا كان تأثره التصوير. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون ثابتة لتلوين الأجسام المضادة.

تصاعد والانجراف

ومن الضروري للحفاظ على الأسمولية من غرفة الصورةolution بالقرب من الأسمولية من الاغاروز التضمين، وتورم غير ذلك / تقلص من الاغاروز وعدم الاستقرار لاحق من ستحدث العينة. ولذلك، استخدم نفس الحل (E3 المتوسطة دون الميثيلين الأزرق) لملء الغرفة ولإعداد 1٪ انصهار منخفضة قسامات نقطة الاغاروز. بالإضافة إلى ذلك، لا تترك الاغاروز في 70 ° C كتلة التدفئة لأكثر من 2 ساعة، لأنها يمكن أن تفقد خصائص التبلور لها.

لا تضمين الأسماك في الاغاروز حار جدا، وهذا يمكن أن يؤدي إلى رد فعل الصدمة الحرارية أو وفاة الجنين. إذا لم تكن متأكدا حول تأثير الاغاروز دافئة على الأجنة، تأكد من أن الذيل لا ينحني وأن معدل ضربات القلب ولا يبطئ. إذا حدث هذا، استخدم جنين مختلفة للتجربة.

الحفاظ على الطول الإجمالي للعمود الاغاروز مع عينة قصيرة (حوالي 2 سم) وجبل الزرد مع رئيسها موجهة نحو رأس المكبس. وبالمثل، فإن اسطوانة الأغاروس مقذوف من capillيجب أن تبقى آرى قصيرة قدر الإمكان. ومن شأن هذه التدابير ضمان الاستقرار من العينة طوال الفيلم. في الوقت نفسه، يجب أن يكون عمود الاغاروز طويلة بما فيه الكفاية بحيث الزجاج الشعرية نفسها لا تصل في مسار الضوء، وهذا من شأنه أن يسبب انكسار كبير والتأمل.

ويتسبب الانحراف الأولي للعينة التي كتبها التغييرات حجم الاسطوانة الأغاروس نفسها. انزلاق المكبس ليست سبب لذلك. وبالتالي، فإنه لا يساعد على إصلاح المكبس مع البلاستيسين أو طلاء الأظافر. الجنين قد تغير موقفها خلال الفيلم بسبب النمو الطبيعي للغاية. وفقا لذلك، فإنه من المستحسن لتوسيط المنطقة من اهتمام في منتصف مجال الرؤية والحفاظ على بعض غرفة على حواف لاستيعاب هذه الحركات.

المبلغ المخفض من تضمين المتوسطة في مسار الضوء

توجيه العينة بشكل صحيح يساعد على تحقيق أفضل جودة ممكنة صورة 15. جينةتجمع، يجب أن الإثارة وانبعاث ضوء السفر من خلال الأنسجة كما تذكر وسائل الإعلام تصاعد ممكن. الحل الأمثل هو التركيب مجانا الاغاروز. وقد تحقق ذلك على سبيل المثال في الإعداد للتصوير نبات الأرابيدوبسيس الجذر الوحشي 14، والذي أقيم في الجذر الرئيسي إلى phytagel وكانت الجذور الجانبية في وقت لاحق السماح للتخلص من العمود هلام تماما. وقد وضعت تصاعد خالية من الاغاروز أيضا للتصوير من التطور الجنيني الكامل لكونفيوسم خنفساء على مدى يومين 12. كان تحسين جودة الصورة ليست الدافع الرئيسي في هذه الحالة. الأجنة كونفيوسم ببساطة لا البقاء على قيد الحياة داخل الاغاروز طويلة بما فيه الكفاية. لم يتم التوصل الى تصاعد خالية من وسائل الاعلام التضمين تماما للتصوير على المدى الطويل في الزرد. ومع ذلك، يمكننا الاستفادة من حقيقة أنه عندما يتصلب الاغاروز، وتتمركز معظم الأجنة قطريا في شعري مع عين واحدة تقع في عمق الاغاروز والعين الثانية يجري على مقربة من سطح العمود التضمين. تانه كثب على السطح توفر جودة صورة متفوقة، وبالتالي ينبغي تصويرها بشكل تفضيلي.

تركيز الاغاروز والتصوير على المدى الطويل

تركيز الاغاروز لتركيب تمثل حلا وسطا بين الاستقرار من العينة وإمكانية لاستيعاب نمو الجنين ونشر الأكسجين إليه. ليس هناك ربح إضافي في استقرار العينة عند استخدام تركيزات الأغاروس أعلى من 1٪. كنقطة انطلاق لتحقيق الاستفادة المثلى من التجارب نوصي 0.6٪ الاغاروز، الذي هو أيضا مناسبة للالأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 HPF التي هي حساسة جدا ليتم تحميلها إلى 1٪ الاغاروز. لتخدير الأجنة القديمة واليرقات، وتركيز MS-222 يمكن أن تثار إلى 200 ميكروغرام / مل من دون آثار جانبية (13).

في حالة يتم تصوير الأجنة النامية لفترة أطول من ± 12 ساعة، لا ينصح الاغاروز تصاعد، لأنه يحد من نمو الجنين ومركز دراساتوفاق ذيل تشوه. تم حل هذه المشكلة لالزرد من تصاعد الأجنة في أنابيب البوليمر محطة إثراء الوقود مع معامل الانكسار مماثل لمياه 13،39. أجنة الفئران، من ناحية أخرى، يمكن أن يجمد في اسطوانات الأغاروس جوفاء 40 أو في ثقوب قضيب الاكريليك تعلق على حقنة 41. لا ينصح محطة إثراء الوقود أنبوب تصاعد كطريقة الافتراضي وذلك لأن جدار الأنبوب ينكسر الضوء أكثر قليلا من الاغاروز.

محاذاة ورقة الخفيفة

للحصول على جودة صورة جيدة من المهم جدا لأداء التلقائي محاذاة ورقة خفيفة قبل كل تجربة. خاصة إذا تم تغيير إعدادات التكبير، اتخذت أهداف خارج، أو استخدمت سائل مختلفة في الغرفة.

إضاءة

وينبغي دائما أن تنشيط المسح محور ورقة الخفيفة. لعينات نثر كبيرة، فمن الضروري تطبيق الإضاءة جانب ومزدوجة مع و الانترنتusion لتحقيق الإضاءة حتى عبر مجال الرؤية. يقلل إضاءة جانب ومزدوجة أيضا مشكلة محددة من التصوير العين، وهو انكسار ورقة الخفيفة واردة من خلال عدسة الجنين. أصغر، عينات أقل نثر ولا يمكن تصوير كفاءة استخدام الإضاءة جانب واحد، والذي يقصر وقت التصوير بمقدار النصف ويمكن أن يؤدي في أفضل قليلا جودة الصورة بالمقارنة مع إضاءة جانب ومزدوجة. وذلك لأن مسارات الخفيفة لمدة الأسلحة إضاءة مختلفة دائما واحدة أكثر كفاءة ويمكن اختيار. بالإضافة إلى ذلك، واثنين من الأوراق الخفيفة القادمة من كل جانب أبدا تماما في طائرة واحدة، والذي يسبب خفيفة وضوح بعد الانصهار. للأحداث داخل الخلايا سريعة جدا، مثل الأنابيب الدقيقة تبعها (فيلم 2)، وإضاءة جانب ومزدوجة ليست مناسبة، لأن الصور مع الإضاءة من اليسار واليمين وحصلت بالتتابع، مما قد يؤدي إلى الضبابية.

photobleaching منوالضيائية

وكثيرا ما يذكر أقل photobleaching من fluorophore كما ميزة كبيرة للLSFM. ونحن يمكننا القول أن الهدف يجب أن يكون هناك photobleaching من على الإطلاق. إذا كان هناك photobleaching من الملاحظ في تجربة التصوير الحية، العينة هو على الارجح بالفعل خارج نطاق الفسيولوجية تعرضه ليزر السكوت عليها. عندما تصوير الأجنة الزرد في المجهر القرص الغزل، في تجربتنا، يمكن الضيائية عالية المماطلة تطور الجنين حتى قبل التبييض إشارة الفلورسنت بشكل ملحوظ. ولذلك، ينبغي تعديل إعدادات التصوير في LSFM بحيث لوحظ ضئيلة أو معدومة photobleaching من. على الرغم من LSFM هو لطيف على العينة، فإنه من الحكمة أن تستخدم فقط بقدر قوة الليزر والتعرض الوقت حسب الحاجة لتحقيق إشارة إلى نسبة الضوضاء كافية لتحليل البيانات لاحقا.

Z المكدس، فترات زمنية وحجم البيانات

الملفات التي تم إنشاؤها من قبل LSFM عادة ما تكون كبيرة جدا. أحيانا في نطاق تيرابايت. غالبا ما يكون من الضروري تقديم حل وسط بين جودة الصورة وحجم البيانات. هذا هو الحال بالنسبة لض المباعدة بين أكوام وفترات في الاستحواذ مرور الزمن بشكل خاص. لتحديد فترات ض، زر الأمثل في علامة التبويب أداة Z كومة ينبغي من الناحية المثالية أن تستخدم، وخاصة إذا كان سيتم deconvolved مجموعة البيانات في وقت لاحق. وتحسب المسافات لتحقيق التداخل 50٪ بين شرائح الضوئية المجاورة. لا يزال، وفترات ض أكبر إلى حد ما وعادة ما تكون مقبولة. أنها تقلل من الوقت اللازم للحصول على ض كومة فضلا عن حجم الملف النهائي. أخذ العينات الوقت الأمثل تعتمد على عملية الفائدة. العيون الشاملة فترات تطوير 5-10 دقيقة مقبولة عادة. وإذا كان بعض الهياكل هي لتعقبها تلقائيا، يجب أن تكون نقطة زمنية لاحقة مماثلة بما فيه الكفاية.

حبات الفلورسنت

حبات الفلورسنت تخدم في المقام الأول علامات كما الإيمانية لتسجيل وجهات نظر مختلفةمجموعة بيانات بطرق عرض متعددة على بعضها البعض. دوامة دائما الحلول حبة جيدا قبل الاستعمال. لا تسخن حبات لأن ذلك يمكن أن يؤدي إلى فقدان صبغة الفلورسنت. تركيز حبة الأمثل لتسجيل بطرق عرض متعددة لابد من تحديد تجريبيا. البرنامج المساعد وصفها يعمل بشكل أفضل مع حوالي 1000 الخرز الكشف خلال كل عرض. تم الكشف عن أكبر (500 نانومتر أو 1000 نانومتر) حبات نحو أقوى من (أقل من 500 نانومتر) حبات صغيرة. وذلك لأن حبات أكبر وأكثر إشراقا وأسهل لقطاع بدون المكتشفة إيجابية كاذبة من الهياكل في العينة. العيب من الخرز أكبر هو أن تكون بارزة جدا في الصورة تنصهر وdeconvolved النهائية. لكل علامة الفلورسنت الجديدة، وحجم حبة المناسب والانبعاثات مضان أن يكون الأمثل. لإعطاء مثال على عينة من الشكل (5) وفيلم 3، وقدم 100 نانومتر حبات الانبعاثات الخضراء كثيرة جدا المكتشفة إيجابية كاذبة في قناة غشاء GFP، ولكن 1000 نتم الكشف عن م حبات الانبعاثات الأحمر بقوة في القناة H2B-طلب تقديم العروض مع عدد قليل جدا من اكتشافات الإيجابية داخل العينة. إذا فشل الكشف حبة في القناة مع علامة فلوري، قناة منفصلة تحتوي فقط حبات يمكن الحصول عليها، ولكن هذا ليس عملي جدا. حبات-قرار اللجنة الفرعية الحجم تعطي قراءات مباشرة وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية) للمجهر، والتي يمكن استخدامها لdeconvolution (الشكل 2C-D). إذا كان التسجيل والانصهار يعمل بشكل أفضل مع حبات أكبر (على سبيل المثال 1000 نانومتر)، صورة منفصلة من قوات الأمن الفلسطينية يمكن الحصول عليها مع قرار من الباطن، وعلى سبيل المثال، 100 الخرز نانومتر. باستخدام الخرز متعدد الألوان غير مفيدة أثناء تسجيل اكتساب متعددة والتحقق من أن تراكب قنوات تماما.

إضافة الخرز الفلورسنت ليست ضرورية عند التصوير من عرض واحد من دون تسجيل بطرق عرض متعددة لاحق والانصهار. ولكن، حتى في تلك الحالات حبات يمكن أن تكون مفيدة خلال initiaل تعديل ورقة ضوء للتحقق من جودة ورقة الخفيفة وبشكل عام للكشف عن الانحرافات البصرية. هذه الانحرافات البصرية قد تنشأ من مصادر مختلفة مثل الأهداف التالفة أو القذرة، والنوافذ القذرة من غرفة أو التجانس في الاغاروز. ويمكن أيضا أن تستخدم حبات لتصحيح الانحراف عن طريق تسجيل بطرق عرض متعددة فيجي المساعد 20.

بطرق عرض متعددة

لغرض بطرق عرض متعددة إعادة الإعمار، فمن الأفضل للحصول على عدد فردي من وجهات النظر 3 و 5 و هلم جرا، والتي لا تعارض بعضها البعض. هذا يحسن deconvolution حيث يتم تصويرها في PSFs من اتجاهات مختلفة. ومن المهم أيضا أن يؤكد في بداية اكتساب مرور الوقت أن هناك ما يكفي من التداخل بين وجهات النظر. من الأفضل القيام هذا تجريبيا، أي يؤكد على الفور أن وجهات النظر في نقطة لأول مرة يمكن تسجيلها بنجاح. عندما يكون الهدف من عملية الاستحواذ بطرق عرض متعددة هو لزيادة دقةمن صورة لعينة نثر كبيرة، ومن غير المستحسن لصورة العينة بأكملها في كل عرض، ولكن لوقف حول مركز العينة، حيث تتدهور الإشارة. ان اكتساب منخفضة الجودة من النصف الثاني من العينة لا تضيف معلومات مفيدة لإعادة إعمار بطرق عرض متعددة.

2. خطوات حاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتجهيز البيانات

حاليا، توجد عدة احتمالات لمعالجة البيانات بطرق عرض متعددة من المجهر ورقة خفيفة التي تم توثيقها جيدا وسهلة نسبيا لاعتماده. نحن نستخدم تطبيق بطرق عرض متعددة إعادة الإعمار، وهو برنامج مفتوح المصدر تنفيذها في فيجي 32 (ستيفان Preibisch غير منشورة، 1A لينك و Link1b في قائمة المواد). هذا البرنامج المساعد هو اعادة تصميم كبير من SPIM السابق التسجيل المساعد 20، استعرضبواسطة شميد وآخرون. 42، وإدماج BigDataViewer وXML، وشكل HDF5 33 مع سير العمل تسجيل SPIM (1B الشكل، وصلة 2 ، لينك 3 ). ويمكن تكييف هذا التطبيق أيضا لمجموعة الحوسبة عالية الأداء، مما يسرع بشكل ملحوظ تجهيز 43. تم تطوير هذا التطبيق تسجيل بطرق عرض متعددة بنشاط أبعد من ذلك ويبقى في التحسن. في حالة وجود مشاكل أو طلبات الميزات للبرنامج وصفها، يرجى تقديم القضايا في صفحة جيثب منها ( لينك 4 للبطرق عرض متعددة إنشاء و صلة 5 لBigDataViewer).

الخيار الثاني هو استخدام البرمجيات التجارية المتاحة مع المجهر. هذا الحل يعمل بشكل جيد ويعمل نفس مبدأ استخدام الخرز الفلورسنت لتسجيل وجهات نظر مختلفة. ومع ذلك، فإنه يفتقر إلى الخيار لتصور بيانات كاملة بسرعة كما هو الحال مع BigDataViewer. أيضا البرنامج لا يمكن أن تتكيف مع الكتلة وعلاوة على ذلك الكتل معالجة المجهر للمستخدمين الآخرين، ما لم يتم شراء رخصة إضافية للبرنامج.

أما الخيار الثالث، الذي هو أيضا برمجيات المصدر المفتوح، نشرت مؤخرا من قبل مختبر كيلر 44 وتقدم إطارا شاملا لمعالجة وتحليل المصب من بيانات ورقة الخفيفة. هذا البرنامج يستخدم معلومات من داخل العينة لأداء الانصهار بطرق عرض متعددة، وبالتالي فإنه لا يتطلب وجود حبات الفلورسنت حول العينة. ولكن في الوقت نفسه أنه يفترض التوجه متعامد من آراء التصوير (الأهداف)، لذلك لا يمكن استخدامها لبيانات تم الحصول عليها من زوايا التعسفية 44.

متطلبات الأجهزة

ntent "> الأجهزة المستخدمة لمعالجة يمكن العثور عليها في الجدول رقم 4. يجب أن يكون هناك سعة تخزين كافية وخطوط الأنابيب واضحة لمعالجة البيانات المتاحة، قبل التجربة الفعلية. اقتناء الصور أسرع من تحليل لاحقة وأنه من السهل للحصول على غمرت مع البيانات غير المعالجة. وغالبا ما يكون غير واقعي لتخزين جميع الصور الخام، ولكن بدلا نسخة اقتصاص أو الصور المجهزة مثل وجهات النظر تنصهر، توقعات كثافة القصوى أو إسقاطات كروية 45.

المعالج اثنين من المعالجات Intel® Xeon® E5-2630 (ستة الأساسية، 2.30 توربو غيغاهرتز، 15 ميغابايت، 7.2 GT / ثانية)
ذاكرة 128 غيغابايت (16 × 8 GB) 1600 ميغاهيرتز DDR3 ECC RDIMM
القرص الصلب 4 × 4 السل ATA التسلسلي 3.5inch شاشة (7.200 دورة في الدقيقة) القرص الصلب
HDD المراقب المالي PERC H310 SATA / SAS كونالمراقب المالي لالدقة ديل
تكوين الأقراص الصلبة C1 SATA 3.5 بوصة، 1-4 أقراص صلبة
الرسومات المزدوج 2 GB NVIDIA كوادرو 4000 (2 بطاقات ث / 2 موانئ دبي و1 DVI-I لكل منهما) (2 DP-DVI و 2 محول DVI-VGA) (MRGA17H)
شبكة إنتل X520-T2 المزدوج ميناء 10 جيجابت إيثرنت بطاقة واجهة الشبكة

الجدول 4: متطلبات الأجهزة.

سرعة معالجة البيانات

الوقت اللازم لمعالجة البيانات يعتمد على أبعاد البيانات وعلى الأجهزة المستخدمة. في الجدول 1، ونحن نقدم لمحة عامة عن الوقت اللازم للخطوات الرئيسية في معالجة مثال 8.6 GB مجموعة البيانات بطرق عرض متعددة التي تتألف من 1 نقطة زمنية مع 4 جهات النظر و2 القنوات.

معالجة الصورةفاتر مرة خطوة بروتوكول
إعادة الحفظ كما HDF5 6 دقائق و 30 ثانية 63
كشف نقاط الاهتمام 20 ثانية 6.4
تسجيل باستخدام نقاط الاهتمام 3 ثانية 6.5
الانصهار بطرق عرض متعددة على المحتوى 4 ساعة 7.2
deconvolution بطرق عرض متعددة (CPU) 8 ساعة 7.3
deconvolution بطرق عرض متعددة (GPU) 2 ساعة 7.3

الجدول 1: معالجة البيانات في الوقت.

صيغ إدخال البيانات لإعادة الإعمار بطرق عرض متعددة

فيجي المساعد بطرق عرض متعددة التعمير يمكن أن تدعم .czi و TIF والأشكال ome.tiff. ويرجع ذلك إلى بنية البيانات من شكل .czi، قواعد البيانات المتقطعة ليستبدعم من دون ما قبل المعالجة. متقطع يعني أن التسجيل كان لا بد من إعادة تشغيل (على سبيل المثال لتعديل المواقف بسبب الانجراف من العينة). في هذه الحالة تحتاج إلى أن يكون resaved كما. TIF الملفات .czi. لملفات .tif كل رأي ويحتاج الاتجاه الإضاءة ليتم حفظها كملف منفصل.

معايرة حجم بكسل

البرنامج المجهر التشغيل بحساب المعايرة لحجم س ص بكسل على أساس الهدف المحدد. ومع ذلك، يتم تعريف حجم بكسل في ض بشكل مستقل من قبل حجم الخطوة. إذا تم تحديد الهدف الخطأ في البرنامج س ص ض إلى نسبة غير صحيح وسيفشل تسجيل.

التسجيل الأولي

بعد تحديد مجموعة البيانات عدد التسجيلات ستكون 1 ووعدد من نقاط الاهتمام يكون 0 في مستكشف ViewSetup. يمثل التسجيل الأولي معايرة البيانات. كل من عدد سسوف التسجيلات و ونقاط الاهتمام تزيد أثناء معالجة.

أخذ العينات باستمرار للكشف عن نقاط الاهتمام

عن طريق أخذ العينات باستمرار ينصح، لأن تحميل الملفات وسوف تجزئة سيكون أسرع بكثير. غير أنه من المهم أن نلاحظ أن المعلمات الكشف ستتغير تبعا لأخذ العينات أسفل، وبالتالي نقل إعدادات الكشف بين مختلف إعدادات عينة أسفل غير ممكن.

الكشف عن نقاط الاهتمام

فإنه من المستحسن أن القطاع عن العديد من الخرز حقيقية ممكن في كل عرض، حتى لو كان الثمن للحصول على بعض المكتشفة إيجابية كاذبة، لأنها لا تعيق تسجيل إلى حد كبير. المكتشفة زائفة، إذا قليل في الأرقام، يتم استبعاد أثناء التسجيل (انظر تسجيل نقاط الاهتمام). ومع ذلك، المكتشفة إيجابية كاذبة ضخمة تشكل مشكلة لالخوارزمية. فهو يقلل من الأداء للكشف ليس فقط والتسجيل، لأنه يأخذ وقتا أطول لجزء من الصورة وكذلك مقارنة هذه الخرز بين وجهات النظر، كما أنه يقلل من دقة تسجيل. يمكن معالجة هذه الحالة باستخدام المعلمات كشف أكثر صرامة. بالإضافة إلى ذلك، على تجزئة من الخرز (أي اكتشافات متعددة على واحد حبة الشكل 1E) غير ضارة للتسجيل ويجب تجنبها.

تسجيل نقاط الاهتمام

لتسجيل وجهات النظر على بعضها البعض، ووصف موقع كل حبة في كل عرض من قبل موقفها فيما يتعلق ثلاثة أقرب الخرز المجاورة لها. هذه الأبراج هي التي تشكل واصف الهندسي المحلي ومحددة لمقارنة كل حبة بين وجهات النظر. ثم تعتبر الخرز مع مطابقة اصف بين وجهتي نظر كما المراسلات مرشح. لاحظ أن هذا يعمل فقط لحبات موزعة بشكل عشوائي، والتي واصفات المحلية هي فريدة من نوعها لكل حبة عادة.يمكن للمرء أن استخدام هياكل أخرى مثل نوى في العينة للتسجيل. ومع ذلك، من أجل الكشف عن نوى، والتي يتم توزيعها بشكل عشوائي غير في العينة، يتم تطبيق أساليب أخرى 20،21.

ثم يتم اختبار المراسلات مرشح ضد توافق العينات العشوائية 36 من أجل استبعاد ايجابيات كاذبة. كل المراسلات يقترح نموذج التحول للتتراكب وجهات النظر على بعضها البعض. أن المراسلات الحقيقية يوافق على الأرجح على نموذج التحول واحدة، في حين أن القيم المتطرفة سيكون كل نقطة إلى واحد آخر. ثم يتم استخدام المراسلات الحقيقية لحساب نموذج تحويل تآلفي بين الرأيين مقارنة. ثم يتم تنفيذ التحسين العالمية مع خوارزمية الأمثل متكررة من خلالها تسجيل جميع الآراء على وجهة النظر الأولى بهدف الحد الأدنى من النزوح بين وجهات النظر 20،21.

تسجيل مرور الزمن

بسبب نقلمنة من حركة السيارات الأغاروس وغير دقيقة للمرحلة المجهر، وموقف كل كومة يختلف بشكل معتدل مع مرور الوقت. في حين أن تسجيل نقطة زمنية الفردية يزيل الفرق بين وجهات نظر هذه النقطة الوقت، يحتاج الوقت الفاصل بين أيضا أن تكون مسجلة ككل. تحقيقا لهذه الغاية، يتم تسجيل كل نقطة زمنية الفردية على نقطة زمنية مرجعية.

نقطة زمنية مرجعية

إذا تم معالجة سلسلة زمنية مع العديد من النقاط الزمنية، يتم تحديد نقطة زمنية تمثيلية كمرجع عادة من منتصف السلسلة الزمنية منذ شدة حبة يمكن أن تتحلل بمرور الوقت نتيجة للتبييض. على هذا المرجع، والمعلمات للكشف عن نقطة اهتمام والتسجيل والمربع المحيط والانصهار يمكن تحديدها. ثم يتم تطبيق هذه المعايير على الفاصل الزمني كله لحساب نموذج التحول محددة لكل نقطة زمنية الفردية. أثناء تسجيل الوقت الفاصل بين كل نقطة زمنية أخرى هي أيضا regist آخرالدو مكانيا على هذه النقطة في الوقت المحدد المرجعية. وهكذا المعلمات المربع المحيط للتسجيل بأكمله واعتمادا على هذه النقطة زمنية محددة.

تسجيل متعدد القنوات

عند التصوير قنوات متعددة، من الناحية المثالية يجب أن تكون نفس الخرز الفلورسنت واضحة في جميع القنوات تصويرها. كشف وتسجيل ويمكن بعد ذلك تجرى على كل قناة على حدة، والتي تأخذ في الاعتبار تأثير موجات الضوء المختلفة على هذا التحول. في كثير من الأحيان لم يكن ذلك ممكنا، لأن حبات تكون غير مرئية في كل القنوات أو الخرز وتهيمن على صورة الكثير في قناة واحدة وقاتمة جدا في قناة أخرى (ق). الحل النموذجي هو استخدام حبات مرئية فقط في قناة واحدة للكشف والتسجيل ونموذج التحول المكتسب (أي بعد الكشف والتسجيل وتسجيل الوقت الفاصل) ثم يتم تطبيقها على القنوات الأخرى التي فيجي> ملحقات> بطرق عرض متعددة Reconstruction> تجهيز الدفعات> أدوات> المكررة التحولات. في القائمة المنسدلة لتطبيق التحول من اختيار قناة واحدة إلى قنوات أخرى. في النافذة التالية حدد XML ثم انقر فوق موافق. ثم اختر القناة التي تحتوي على حبات كقناة المصدر وكقناة الهدف حدد القناة (ق) من دون الخرز. لالمكررة التي تستخدم التحولات استبدال كل التحولات واضغط موافق. ثم يتم نسخ التحولات لجميع القنوات الأخرى، وحفظها في XML. لنرى التحولات الجديدة في مستكشف ViewSetup، إعادة إعمار تطبيق بطرق عرض متعددة.

المربع المحيط

الانصهار من وجهات نظر متعددة وحسابيا مكثفة جدا. ومع ذلك، عادة ما يتم الحصول على الصور كبيرة لاستيعاب ليس سوى عينة، ولكن أيضا حبات من حوله. مرة واحدة المعلمة تسجيليتم استخراج الصورة من الخرز، وأنها لم تعد مفيدة كجزء من الصورة. لذلك، لزيادة كفاءة الانصهار، يجب أن تنصهر فقط أجزاء من مداخن صورة تحتوي على عينة معا. ينبغي تحديد المنطقة ذات الاهتمام (وثاب مربع) لاحتواء عينة وأقل قدر من الاغاروز المحيطة ممكن. على سبيل المثال في الشكل 2 متوسط ​​الانصهار المرجح على وحدة التخزين بالكامل مع 2229 × 2136 × 2106 بكسل يتطلب 38196 ميغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي، في حين مع المربع المحيط هو خفض مستوى الصوت إلى 1634 × 1746 × 1632 بكسل ويتم تخفيض متطلبات الذاكرة إلى 17729 ميغا بايت.

الانصهار بطرق عرض متعددة على المحتوى

ويتمثل التحدي في دمج البيانات بطرق عرض متعددة غير أن الآراء وعادة ما تنتهي فجأة ولا تحتوي على نفس جودة الصورة لنفس voxels. ولذلك فإن المتوسط ​​البسيط للآراء يؤدي إلى مزج القطع الأثرية وتدهور صورة لا لزوم له. على المحتوى بطرق عرض متعددة فو سيون يأخذ كل من هذه المشاكل بعين الاعتبار. أولا، أنه يمزج بين وجهات النظر المختلفة، حيث ينتهي صورة واحدة ويبدأ الآخر، وثانيا، تقوم بتقييم جودة الصورة المحلية وتنطبق أوزان أعلى لأعلى جودة الصورة في الانصهار 21. مقارنة إلى وجهة نظر واحدة هناك تحسنا القرار في ض مع تدهور طفيف للإشارة في س ص (الشكل 2E-H، الشكل 5A-D).

بطرق عرض متعددة deconvolution

deconvolution بطرق عرض متعددة هو نهج آخر لتحقيق الانصهار في وجهات النظر. مع هذا الأسلوب تؤخذ أيضا PSFs من وجهات النظر المختلفة في الاعتبار من أجل استعادة الصورة التي تم convolved من قبل البصريات المجهر. هذه الطريقة بشكل كبير على تحسين جودة الصورة من خلال إزالة صورة طمس وزيادة القرار، وعلى النقيض من إشارة 31 (الشكل 2C-D، الشكل 2I-J، الشكل 5E-G، فيلم 3).

ve_content "> Deconvolution هو حسابيا مكثفة جدا (انظر الجدول 1)، وبالتالي استخدام الجرافيك لمعالجة يزيد من سرعة هذه العملية. كما قد يكون من الضروري إجراء deconvolution على البيانات أسفل عينات. لعينة أسفل، استخدم التعمير فيجي> بطرق عرض متعددة > تجهيز الدفعات> أدوات> تطبيق التحولات وهذا من شأنه تطبيق نموذج التحول الجديد في وجهات النظر التي سيتم حفظها في ملف. xml.

تنسيق ملف HDF5 لBigDataViewer وBigDataServer

وBigDataViewer 33 يسمح التصور سهل من البيانات تيرابايت الحجم. كيفية السيطرة على BigDataViewer تتلخص في الجدول 2. سكرينكست العملية الأساسية للبرنامج متاح أيضا كملحق في المنشور الأصلي 33. وتتركز BigDataViewer على ملف. xml، الذي يحتوي على البيانات الوصفية، وملف hdf5، الذي يحتوي على بيانات الصورة. بيانات الصورة هي بريهوالأنف والحنجرة في hdf5 في مستويات القرار متعددة في كتل 3D. مستويات القرار متعددة تسمح لتصور البيانات بشكل أسرع مع دقة أقل، وذلك قبل قرار الكامل هو تحميل. يتم تحميل القطع الفردية فقط في الذاكرة عند الحاجة. وبالتالي، يسمح للشكل صورة hdf5 التصور المباشر والسريع للبيانات عبر BigDataViewer 33. فإنه يسرع أيضا معالجة منذ يتم تحميل الملفات بشكل أكثر كفاءة. ولذلك، فإننا نوصي resaving مجموعة البيانات في هذا الشكل، على الرغم من أنه ليس مطلوبا بشكل صارم لتجهيز. لمزيد من التوضيح من تنسيق البيانات، يرجى الرجوع إلى رابط 3 . بالإضافة إلى ذلك، قواعد البيانات يمكن أن تكون مشتركة مع المتعاونين أو الجمهور باستخدام BigDataServer 33 ( لينك 6 ).

تأثير
مفتاح
F1 يدل على مساعدة وصفا موجزا للBigDataViewer والعملية الأساسية
<> أو عجلة الماوس الحركة في ض
السهم صعودا وهبوطا تكبير والتصغير
انقر بزر الماوس الأيمن واسحب يتحرك عينة في المشاهد
غادر انقر واسحب تدور عينة حول المؤشر
المنزلق في الجزء السفلي من المشاهد أو تبويب والسهم إلى اليسار أو اليمين التحركات على محور الزمن
الضغط بالإضافة إلى التحول حركة أسرع أو دوران على طول أي محور
س ثم اليسار واليمين السهم تدور حول محور س
السهم ذ ثم اليسار واليمين تدور حول المحور ص
ض ثم سهم لليسار واليمين تدور حول المحور z
التحول و x يوجه الرأي على طول محور س
التحول و y يوجه الرأي على طول المحور ص
التحول و z يوجه الرأي على طول محور ض
أنا التبديل بين وسائط مختلفة الاستيفاء (أي أقرب جار وثلاثي الخطوط)
الصورة أو إعدادات> السطوع والتباين يعدل لون القنوات والسطوع والتباين
F6 أو إعدادات> الرؤية والتجميع يغير المجموعات المعروضة، تمكن تجمع لتتراكب مجموعات مختلفة ويدعو المجموعات عن طريق مفاتيح الأرقام
F10 أو أدوات> سجل الفيلم تستحوذ على سلسلة زمنية من شريحة المعروضة حاليا

الجدول 2: عارض البيانات الكبيرة.

3. القيود المفروضة على تنفيذ وصفها من LSFM

الإنتاجية المنخفضة

في تجربة نموذجية LSFM فقط هو تصوير نموذج واحد لكل تجربة. ومع ذلك، في تجربتنا، والكثير من المعلومات المفيدة يمكن استخراجها من أن عينة واحدة. وقد تحقق التصوير عالية الإنتاجية من أجنة متعددة في الآونة الأخيرة في منزل بنيت الاجهزة LSFM 46-48، على الرغم من أن عادة على حساب حرية تحديد المواقع عينة والتناوب.

غير كافية عمق تغلغل في الأنسجة

على الرغم من وشفافة الأجنة الزرد، وجودة الصورة التي تم الحصول عليها يتدهور بسرعة عندما التصوير أعمق في النسيج نظرا لتشتتها والامتصاص. جزئيا هذا هو تأثير تشتت وامتصاص مضان المنبعثة من عينة ولا يمكن تصحيحه في الإعداد الحالي. مصدر آخر من جودة الصورة غير المتوازنة هو إضاءة غير النظامية. توقال انه ورقة الخفيفة الحادث من الجانب الأيسر أو الأيمن وأية كائنات في طريقها ينكسر، والذي يؤدي إلى القطع الأثرية شريط وطمس. الإضاءة وبطرق عرض متعددة جانب مزدوج الانصهار يمكن أن يقلل من القطع الأثرية في الصورة النهائية. وأخيرا، فإن جودة الصورة تميل إلى أن تكون أسوأ قليلا نحو هامش مجال الرؤية بسبب هندسة الطبيعية من ورقة الخفيفة، التي أصبحت أكثر سمكا نحو الحواف.

التلاعب الكيميائية محدود

استخدام المخدرات أو المؤثرات على نطاق واسع في مجال البحوث الزرد. في هذا الاستخدام المجهر المخدرات مقيدة، نظرا لحجم كبير من حجرة العينة والاعتبارات المستخدمين الآخرين من الصك، الذين يشتركون في نفس الغرفة. يمكن استخدام غرفة اضافية مخصصة لتجارب المخدرات حل هذه المسألة. ملء الغرفة جزئيا مع الخرز الزجاجي يقلل من حجم السائل ما هو مطلوب.

لا photomanipulation

حاليTLY ليس هناك إمكانية للتلاعب البصرية المترجمة مثل photoconversion، أو الاستئصال بالليزر في هذا المجهر. ومع ذلك، الاجهزة منزل بنيت يمكن استخدامها لمثل هذه التطبيقات المحددة.

4. تطبيقات أهمية والمستقبلية

LSFM هو أفضل وسيلة متاحة حتى الآن للتصوير سريع كميات كبيرة من الأجنة الحية. معظم التجارب التي يمكن تصورها على المجهر متحد البؤر يمكن أيضا أن يؤديها على المجهر ورقة خفيفة مع المزايا المذكورة أعلاه. في حالة التصوير التنمية العين، وسرعة LSFM ليست المعلمة حاسمة. بدلا من ذلك، وانخفاض الضيائية والمرونة في عينة المواقع هي فوائد حاسمة.

البيانات LSFM لها SNR عالية، مما يساعد على تحقيق نتائج جيدة deconvolution وأيضا مفيدة لتحليل الصور الآلي وتتبع الكائن. في الختام، LSFM هو أداة عظيمة لتوليد بيانات قابلة للقياس على التطور الجنيني وoveraخلية ليرة لبنانية وخصائص الأنسجة لنمذجة لاحق والأوصاف المادية للعمليات في السؤال.

Disclosures

ويدعم نشر هذا الفيديو المقال الذي زايس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose Roth 6351.1
Low melting point agarose Sigma A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) Sigma E10521
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 Millipore (Estapor) 80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries Brand 701904 sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries Brand 701932 sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55 Dumont 0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes Becton Dickinson 300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes Becton Dickinson 397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration
http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer http://fiji.sc/BigDataServer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (5), 327-339 (2014).
  2. Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49, (7), 555-569 (2011).
  3. Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340, (6137), 1234168-1234168 (2013).
  4. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  5. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170, (Pt 3), 229-236 (1993).
  6. Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6, (11-12), 920-928 (2012).
  7. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12, (1), 23-26 (2015).
  8. Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998-1257998 (2014).
  9. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  10. Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360, (1), 129-141 (2015).
  11. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. Elsevier Inc. 193-215 (2014).
  12. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, (11), 2361-2361 (2014).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, (17), 3242-3247 (2012).
  14. Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68, (2), 377-385 (2011).
  15. Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4, (1-2), 122-134 (2010).
  16. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  17. Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (43), 17708-17713 (2011).
  18. Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. 028308 (2015).
  19. Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11, (9), 951-958 (2014).
  20. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7, (6), 418-419 (2010).
  21. Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12, (1), 30-34 (2015).
  23. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (10), (2011).
  24. Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. (2013).
  25. Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. 1-11 (2013).
  26. Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10, (7), 598-599 (2013).
  27. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10, (7), 599-600 (2013).
  28. Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136, (13), 2165-2175 (2009).
  29. Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32, (2), 203-219 (2015).
  30. Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
  31. Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11, (6), 645-648 (2014).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, (7), 676-682 (2012).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12, (6), 481-483 (2015).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).
  35. Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9, (7), 717-720 (2012).
  36. Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24, (6), 381-395 (1981).
  37. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, (1), 2 (2006).
  38. Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23, (7), 2655-2664 (2003).
  39. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
  40. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, (22), 4406-4414 (2014).
  41. Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9, (3), 575-585 (2014).
  42. Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
  43. Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. Available from: http://arxiv.org/abs/1507.08575 (2015).
  44. Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10, (11), 1679-1696 (2015).
  45. Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
  46. Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6, (11), 4447-4456 (2015).
  47. McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23, (12), 16142-16153 (2015).
  48. Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5, (6), e01751-14-8 (2014).

Comments

1 Comment

  1. How to find the distances

    1. between the illumination objective and sample
    2. between the detective objective and sample

    There is a maximum and a minimum image distance for Gaussian beam, how to find that one?

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Nava S.
    April 16, 2019 - 9:12 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics