Använda ljus Sheet fluorescensmikroskopi till bild Zebrafish Eye utveckling

* These authors contributed equally
Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Icha, J., Schmied, C., Sidhaye, J., Tomancak, P., Preibisch, S., Norden, C. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. J. Vis. Exp. (110), e53966, doi:10.3791/53966 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Morfogenes är den process som formar embryot och tillsammans med tillväxt och differentiering driver ontogeni från ett befruktat ägg till en mogen multicellulär organism. De morfogenetiska processer under djur utveckling kan analyseras bäst genom avbildning av intakta levande exemplar 1-3. Detta beror på att en sådan helt embryo avbildning bevarar alla komponenter som driver och reglerar utveckling, inklusive gradienter av signalmolekyler, extracellulär matris, kärl, innervation samt mekaniska egenskaperna hos den omgivande vävnaden. För att överbrygga vågen, vid vilken morfogenes inträffar, snabba subcellulära händelser måste fångas på en minut tidsskala inom ramen för utvecklingen av hela vävnaden över timmar eller dagar. För att uppfylla alla dessa krav, var en modern tillämpning 4 av det ortogonala planet belysningsmikroskop 5 utvecklats. Ursprungligen var det namnet Selektiv Plane Belysning Microscopy (SPIM) 4; nu en allomfattande term Ljusblad fluorescensmikroskopi (LSFM) används typiskt. LSFM möjliggör avbildning med hög tidsupplösning, medan inducera mindre fototoxicitet än laserscanning eller roterande skiva konfokala mikroskop 6,7. Numera finns det redan många implementationer av den grundläggande principen för ljus ark belysning och det har använts för att avbilda en mängd olika prover och processer som tidigare otillgängliga för forskare 8-11.

Vi vill först belysa flera viktiga fördelar LSFM över konventionella konfokalmikroskopi metoder:

Att förvärva meningsfulla resultat från levande avbildning mikroskopiska experiment, är det viktigt att observationen endast minimalt påverkar provet. Men många organismer, inklusive zebrafisk är mycket känsliga för laserljusexponering, vilket gör det svårt att avbilda dem i en konfokalmikroskop med hög tidsupplösning utan fototoxicitet effekter som avstannat eller försenad utveckling 6,7. LSFM är för närvarande fluorescens bildteknik med de minst störande effekter på prov 7. Eftersom den tunna laserljus blad belyser endast den del av provet som avbildas vid en viss tidpunkt, är ljus ark mikroskop med hjälp fotoner mycket effektivt. Följaktligen tillåter den låga ljusexponering under längre tidsförlopp observationer av sund prover, t ex 12-17. Dessutom, tack vare den minimala invasivitet av LSFM antalet förvärvade bilder inte längre styrs av hur mycket ljus provet kan tolerera, utan snarare av hur mycket data kan bearbetas och lagras.

På samma sätt för att hålla provet i nära fysiologiska förhållanden, kommer LSFM med alternativa strategier väl lämpade för levande embryon provmontering. I LSFM tekniker är embryona typiskt inbäddade i en tunn kolonn av låg andel agaros. den mounting in i agaros cylindrar medger fullständig frihet för rotation, så provet kan observeras från den perfekta vinkeln (i LSFM kallat vy) och från olika vyerna samtidigt. Multiview imaging och efterföljande multiview fusion är till nytta särskilt för stora, spridnings prover och gör det möjligt att fånga dem med hög, isotrop upplösning. En sammanfattning av andra möjliga LSFM monterings strategier kan hittas i den officiella mikroskop bruksanvisningen, i kapitlet om provberedning skriven av labbet av E. Reynaud. Det är en rekommenderad läsning, speciellt om målet är att bild olika prover än vad som beskrivs här.

Bilden förvärvet i LSFM är brett fält, kamerabaserat, i motsats till laserskanning konfokalmikroskop. Detta resulterar i en högre signal-brusförhållande (SNR) för förvärvade bilder och kan vara mycket snabb (tiotals till hundratals bilder per sekund). Den höga känsligheten hos LSFM möjliggör avbildning av svagt fluorescerande samp ytterligareles, som transkriptionsfaktorer uttryckta på endogena nivåer 18 eller, inom en snar framtid, endogena proteiner taggade med hjälp crispr / Cas9. Den höga SNR är också viktigt för framgångsrik nedströms bildanalys. Den höga hastigheten krävs inte bara att fånga snabba intracellulära processer, men också för att avbilda hela embryot från flera vyer tillräckligt snabbt. En sömlös sammansmältning av de flera vyer kan endast uppnås, om det observerade fenomenet inte förändras under förvärv av dessa flera z stackar som kommer från separata vyer.

Fördelarna med LSFM vanligtvis inte ske på bekostnad av bildkvaliteten. Den laterala upplösning LSFM är något sämre än upplösningen av en konfokalmikroskop. Detta beror på att målen detektions används i LSFM har lägre numerisk öppning (vanligen 1,0 eller mindre) jämfört med 1,2-1,3 i vatten eller kisel dopp mål för standard konfokala inställningar. Dessutom, på grund av det breda detekteringsfältet i LSFM (absence av ett nålhål), det finns mer out-of-focus ljus jämfört med ett konfokalt mikroskop. Mängden av out-of-focus ljus bestäms av den ljusplåttjockleken. Ändå är dessa nackdelar kompenseras av högre SNR i LSFM. I praktiken resulterar detta i liknande kvalitetsbilder jämfört med t ex roterande skiva konfokala förvärv 15. Följaktligen möjliggör detta tillförlitlig utvinning av funktioner som cellmembran eller kärnor, t ex för cellinje spåra 15,19.

Den axiella upplösning på LSFM bestäms, förutom detekteringsmålet, av ljuset plåttjockleken. Den axiella upplösning på LSFM kan i vissa fall överträffar lösningen av konfokala mikroskop. Först, förbättringen i upplösning kommer när ljuset arket är tunnare än den axiella upplösningen hos detekteringsmålet, vilket vanligtvis inträffar för stora prover avbildas med en låg förstoring mål. Det andra sättet, hur LSFM kan ACHieve bättre axiell upplösning, är multiview fusion, i vilken upplösning information av hög xy från olika vyer kombineras i en bildstapel. Den resulterande sammanslagna stapeln har en isotropisk upplösning närmar värdena för upplösning i sidled 20,21. Strategin för registrering av flera vyer på varandra som beskrivs i denna artikel är baserad på användning av fluorescerande polystyrenpärlor som förvaltnings markörer inbäddade i agarosen runt provet 20,21.

Som ett resultat av LSFM kommersialisering, är denna teknik nu tillgänglig för en bred publik av forskare 22. Därför är motivationen för att skriva detta protokoll för att göra denna teknik tillgänglig för utvecklingsbiologer som saknar praktisk erfarenhet LSFM och att få dessa forskare börjat använda denna teknik med sina prover. Vår protokoll använder kommersiella ljus ark mikroskop, som utgör en konceptuellt enkel mikroskop thatt är lätt att använda. Vi skulle dessutom vilja nämna andra nya protokoll för avbildning zebrafisk med hembyggda LSFM uppställningar, som kan vara lämpliga för att svara på vissa frågor 23-25. En annan post alternativ till LSFM är de öppna plattformarna 26,27, som använder de öppna principer tillgång till bringa ljus ark mikroskop till en bredare gemenskap. Dokumentationen av både hårdvara och mjukvaruaspekter kan hittas på http://openspim.org och https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

I detta protokoll använder vi teleost zebrafisk som ett modellsystem för att studera utvecklingsprocesser med LSFM. Morfogenes av zebrafisk ögat är ett exempel som understryker många av fördelarna med LSFM. LSFM har redan använts tidigare för att undersöka ögonens utveckling i medaka 28 och i zebrafisk 29,30. I ett tidigt skede av ögonens utveckling är det komplicerat att orientera embryot korrekt för konventionell mikroskopi,som skrymmande äggula inte tillåter embryot att ligga på sidan med ögat mot målet. Men med LSFM montering i en agaroskolonn, provet kan reproducerbart placerade. Dessutom, under övergången från optisk vesikel till den optiska koppen stadiet genomgår ögat stora morfogenetiska omflyttningar tillsammans med tillväxt, vilket kräver att fånga en stor z stack och en stor synfält. Även för dessa utmaningar LSFM är överlägsen konventionell konfokal avbildning. Processen för optiska kopp bildning är tredimensionell, därför är det svårt att förstå och visualisera enbart genom avbildning från en vy. Detta gör multiview avbildning med isotrop upplösning fördelaktigt. Efter optisk kopp bildning, blir näthinnan allt känsligare för laserexponering. Således är den låga fototoxicitet i samband med LSFM en stor fördel för långsiktig avbildning.

Här presenterar vi en optimerad protokoll för avbildning av en till tre dagar gammal zebrafisk embryon ennd larver med fokus på ögonens utveckling. Vår metod möjliggör inspelning av tidsförlopp filmer som täcker upp till 12-14 timmar med hög spatial och temporal upplösning. Viktigt, visar vi också en rörledning för databehandling, som är ett viktigt steg i LSFM, eftersom denna teknik ger alltid stora datamängder, ofta i terabyte intervallet.

Protocol

OBS: Alla djur har även gjorts i enlighet Europeiska unionen (EU) direktiv 2011/63 / EU och den tyska djurskyddslagen med. Protokollet är tänkt att följas utan avbrott, från montering till avbildning av provet. Beroende på praktiska erfarenheter, kommer det att ta 2-3 timmar att starta en time-lapse experiment. Databehandling ingår inte i den här tidsberäkning. Allt material som krävs för experimentet kan hittas i den checklista över material som behövs innan det tillhandahålls som ett tilläggsdokument. Bär puderfria handskar under stegen 1, 2, 3 och 4. För steg 2, 3, 4 och 5 i protokollet hänvisar också till den officiella mikroskopet bruksanvisningen.

1. Förberedande arbete innan Imaging Experiment

  1. Fluorescerande Bead Stock Solution
    1. För detta protokoll använder 500 eller 1000 nm polystyren diameter pärlor (märkta med rött avger fluorescerande färgämne). Arbetsspädning av pärlorna är 1: 4,000. För det första virvel vulsten stamlösning under 1 min. Späd 10 pl pärlor i 990 pl DDH 2 O. Förvara lösningen i mörker vid 4 ° C och använda denna 1: 100 spädning som stamlösningen för ytterligare spädning i 01:40.
  2. Förbereda lösning för provkammaren
    1. I en 100 ml-glasbägare mix 38,2 ml E3 medium utan metylenblått, 0,8 ml av 10 mM N -phenylthiourea och 1 ml av 0,4% MS-222. Det är fördelaktigt att använda filtrerad E3 medium för att undvika små partiklar av damm eller oupplösta kristaller flytande i provkammaren senare.
  3. Fluorescerande Fish Embryo Selection
    1. I dagarna före experimentet förbereda embryon som uttrycker fluorescerande proteiner. Strax innan experimentet sortera embryon under fluorescerande stereoskopet för önskvärd styrka fluorescenssignalen. Ta 5-10 friska embryon och dechorionate dem med pincett.
      OBS: Detta protokoll är optimerad för 16-72 timmar gammalembryon.

2. Installera provkammaren

  1. Montering av trekammar Windows
    1. Det finns 4 fönster i provkammaren, en för målet och tre tätas med täck (18 mm diameter, utvalda tjocklek 0,17 mm). Lagra dessa täck i 70% etanol. Torka dem rena före användning med eter: etanol (1: 4).
    2. Sätt täck i fönstret med fin pincett och se till att den passar in i minsta spåret. Täck den med 17 mm gummi diameter O-ringen och skruva i belysningsadapterring med hjälp av kammarfönstret verktyget. Upprepa processen för de andra två fönstren.
  2. Montera återstående kammardelarna
    1. Skruva fast adapter för ett lämpligt mål i den fjärde återstående sidan av kammaren. Sätt i 15 mm diameter O-ringen in i centrum av adaptern.
    2. Skruva i den vita Luer-Lock adapter i det nedre högra öppningen i chamber och den grå drain-kontakten i det övre vänstra öppningen. Blockera alla de tre återstående öppningarna med de svarta blindpluggar.
    3. Fäst Peltier blocket och metall laxstjärt glid botten av kammaren med hjälp av en insexnyckel. Fäst slangen med 50 ml sprutan till Luer-Lock adapter. Sätt temperatursonden i kammaren.
  3. Sätta i mål och kammaren i mikroskopet
    1. Kontrollera under stereoskop som alla mål är rena. Använd 10X / 0.2 belysnings mål och Plan-Apochromat 20X / 1.0 W upptäckt mål och se till att dess brytningsindex korrekturringen sätts till 1,33 för vatten. Skruva detekteringsmålet i mikroskopet, samtidigt som de lysande mål som omfattas.
    2. Ta bort plastlocket som täcker de lysande mål. Skjut försiktigt kammaren i mikroskop och dra åt den med fästskruven.
    3. Anslut temperatur provara och Peltier block med mikroskop.
      OBS: De två rören som cirkulerar kylvätskan för Peltier-blocket är kompatibla med båda kontakterna. De bildar en fungerande krets oberoende av orienteringen av anslutning.
    4. Fylla kammaren genom sprutan med lösningen som framställts i steg 1,2 upp till den övre kanten av kammarfönstren. Kontrollera att kammaren inte läcker.
    5. Starta mikroskop, inkubation och de styrande och lagrings datorer. Starta mikroskop-operativprogrammet och ställa inkubationstemperaturen till 28,5 ° C.
      OBS: Det kommer att ta en timme att helt jämvikt. Förbered provet under tiden.

3. Provberedning

  1. Förbereda Agarose Mix
    1. 15 min innan av agarosen mix, smälta en 1 ml alikvot av 1% lågsmältande agaros (upplöst i E3-medium) i ett värmeblock inställt på 70 ° C. När agarosen är helt moltio, överföra 600 l till ett nytt 1,5 ml rör, tillsätt 250 pl E3-medium, 50 pl 0,4% MS-222 och 25 pl virvlades pärla stamlösning.
      OBS: Detta gör 925 | il av blandningen, medan ytterligare 75 | j, l beräknas för den vätska som tillsätts senare tillsammans med embryona.
    2. Håll röret i en andra värmeblock vid 38-40 ° C eller se till att agarosen är mycket nära sin gelbildande punkt innan prov embryon i den.
  2. Montering av embryon
    1. Ta fem glas kapillärer av 20 pl volym (med ett svart märke, ~ 1 mm inre diameter) och sätt i matchande Teflon spets kolvar i dem. Tryck in kolven genom kapillären så att Teflon spetsen är på botten av kapillären.
    2. Överför fem embryon (ett antal som kan monteras på en gång) med ett glas eller plast pipett in i röret av virvlades 37 ° C varmt agaros mix.
      OBS: Försök att föra över en minimivolym av vätska tillsammans with embryona.
    3. Sätt kapillär i mixen och suger ett embryo inuti genom att dra upp kolven. Se till att chefen för embryot in i kapillär innan svansen. Undvika eventuella luftbubblor mellan kolven och provet. Det bör vara ± 2 cm av agaros ovanför embryot och ± 1 cm under den. Upprepa för de återstående embryon.
    4. Vänta tills agarosen stelnar fullständigt, vilket händer inom ett par minuter och sedan lagra proverna i E3-medium, genom att hålla dem till en vägg i en bägare med model eller tejp. Bottenöppningen av kapillären bör hänga fritt i lösningen som tillåter gasutbyte till provet.
      OBS: Ett liknande protokoll till avsnitten 3.1 och 3.2 kan också hittas på OpenSPIM wikisidan http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

4. Prov Positionering

  1. Provhållare Montering
    1. Sätt 2 plasthylsor av rätt storlek (svart)mot varandra in i provhållaren stammen. Deras slits sidor måste vara vänd utåt. Fäst klämskruven löst genom att vrida den 2-3 rundor. För in kapillären genom klämskruven och tryck den genom hållaren tills det svarta färgband blir synlig på andra sidan. Undvik att röra kolven.
    2. Dra åt klämskruven. Tryck överskotts 1 cm agaros under embryot ut ur kapillären och skär den. Sätt in spindeln in i provhållaren skivan.
    3. Bekräfta i programvaran som mikroskop scenen är i belastningsläget. Använd styrskenorna för att glida hela hållaren med provet vertikalt nedåt in i mikroskopet. Vända den, så att de magnetiska hållaren skiv låses i läge.
  2. Lokalisering av Kapillär
    1. Från och med nu, styr provpositioneringen av programvaran. På fliken Lokalisera väljer Lokalisera kapillär alternativ och positionera kapillären i x, y och z i fokus precis ovanför detekteringsobjektetive lins. Använd den grafiska representationen i provet navigator för vägledning.
    2. Tryck embryot försiktigt ut ur kapillären tills det är framför pupillen i detekteringsmålet.
      OBS: Den "Leta kapillär 'är det enda steget i den återstående protokoll, under vilken det övre ögonlocket mikroskopets bör öppnas och provet trycks ut.
  3. Lokalisera Sample
    1. Växla till "Leta prov alternativet och på 0,5 zoom föra zebrafisk ögat i mitten av synfältet. Rotera embryot, så att ljuset arket inte kommer att passera genom några mycket brytnings eller absorberande delar av provet innan det når ögat. På samma sätt behöver den emitterade fluorescensen en tydlig väg ut ur provet. Klicka på "Inställning av utgångsposition".
    2. Öppna dörren av mikroskopet och placera plastlocket med en 3 mm öppning på toppen av kammaren för att undvika avdunstning.
      OBS: Om vätskenivån sjunker underavbildnings nivå kommer experimentet att äventyras.
    3. Kontrollera hjärtslag av embryot som en proxy för den allmänna hälsan. Om det är för långsam, använd ett annat prov (jämför med icke-monterade kontroller, särskilda värden beror på utvecklingsstadiet). Växla till sista zoom inställning och justera positionen av embryot.

5. Ställa in en Multidimensional Acquisition

  1. förvärvs~~POS=TRUNC
    1. Växla till fliken "förvärv". Definiera ljusvägen inklusive laserlinjer, upptäckt mål, laser blockerar filtret, stråldelare och kamerorna.
    2. Aktivera sväng scan kryssrutan. Definiera övriga förvärvs inställningar som bitdjupet, bildformat, lätt plåttjocklek och välj enkelsidig belysning.
    3. Tryck "Kontinuerlig" och beroende på intensiteten av den erhållna bilden ändra lasereffekt och kameraexponeringstiden.
      OBS: För att justera alla avbildningsinställningar använder less lasereffekt (0,5% av 100 mW laser, 30 ms exponeringstid), än för själva experimentet för att undvika onödig bild skada på provet.
  2. Ljus Sheet Justering
    1. Växla till "dubbelsidig belysning" och aktivera "Online Dual Side Fusio'n kryssrutan. Starta "Lightsheet Auto justera guiden". Följ instruktionerna steg för steg.
      OBS: Guiden flyttar ljus arket i fokalplanet av detekteringsmålet, och ser till att det inte lutar och midja är i centrum av synfältet. Efter avslutad automatisk justering, är positionerna för de vänstra och högra ljus blad uppdateras automatiskt i programvaran. En förbättring av bildkvaliteten bör nu vara uppenbart. Aktivera "Z-stack" kryssrutan.
    2. Kontrollera ljusjusteringsarket genom att inspektera symmetrin i punktspridningsfunktion (PSF) som ges av de fluorescerande pärlor i xz och yz orto vy. Om det inte finns någont symmetrisk, manuellt justera ljus ark parameterläge upp och ner tills uppnå en symmetrisk timglasformad PSF (Figur 1A).
  3. Multidimensional Förvärvs Inställningar
    1. Definiera z-stack med "Första skiva" och "Sista Slice" alternativ och ställa z steg till 1 pm.
      OBS: Ljus arket i detta mikroskop är statisk och z sektione uppnås genom att förflytta provet genom. Använd alltid "Kontinuerlig Drive alternativet för snabbare förvärv av z-stackar.
    2. Aktivera kryssrutan "Time Series". Definiera det totala antalet tidpunkter och intervallet mellan dem.
    3. Aktivera "Multiview" kryssrutan. Lägg den aktuella vyn i multiview listan, där x, y, z och vinkelinformation lagras. Använd scenen ansvarige att rotera kapillär och definiera de andra önskade vyer. Inrätta ett z-stack vid varje vy och lägga till dem i multiview listan.
      OBS!programvara sorterar vyerna i seriellt, så att kapillär vrids i en riktning, medan bilden förvärvas.
  4. Korrigering och starta experimentet
    1. När förvärvet som inrättats är klar, vänta 15-30 minuter innan det verkliga experimentet.
      OBS: Provet driver initialt några mikrometer i x, y och z, men bör sluta inom 30 minuter. Om provet håller drivande längre använda ett annat prov eller montera dem igen.
    2. Växla till fliken "Underhåll" och i "Streaming alternativet definierar hur data ska sparas, t ex en fil per tidpunkt eller separat fil för varje vy och kanal. Gå tillbaka till fliken "Förvärv" trycker "Starta Experiment" och definiera filnamnet, platsen där det ska sparas och filformat (användning .czi).
    3. Observera förvärvet av den första tidpunkten för att bekräfta att allt körs felfritt. Omedelbart fortsätta med registreringenoch fusion av den första tidpunkten som beskrivs i steg 6 och 7, för att bekräfta att det kommer att vara möjligt att bearbeta hela datamängden.

6. Multiview Registrering

  1. Multiview återuppbyggnad Application
    1. Vid slutet av den avbildning session, överför datan från datalagringsdator vid mikroskopet till en databehandlings dator. Använd "Multi ReconstructionApplication "20,21,31 implementeras i Fiji 32 för databehandling (Figur 1B).
  2. definiera datamängd
    1. Uppdatera Fiji: Fiji> Hjälp> Uppdatera ImageJ och Fiji> Hjälp> Uppdatera Fiji. Använd huvud ImageJ och Fiji uppdateringsplatser.
    2. Överföra hela datamängden i en mapp. Resultaten och mellan filer för behandlingen kommer att sparas i den här mappen. Starta Multi återuppbyggnad Application: Fiji> Plugins> Multiview återuppbyggnad> Multiview återuppbyggnad Application.
    3. Välj "definiera en ny datauppsättning". Som typ av dataset välja meu alternativet "Zeiss Lightsheet Z.1 datamängd (LOCI Bioformats)" och skapa ett namn på XML-fil. Välj sedan den första .czi filen i dataset (dvs. fil utan index). Den innehåller bilddata samt metadata inspelningen.
      OBS: När programmet öppnas första .czi filen är metadata laddas in i programmet.
    4. Kontrollera att antalet vinklar, kanaler, belysningar och observera voxelstorleken från metadata. När du trycker på OK, observera tre separata fönster öppna (figur 1C): ett loggfönstret, som visar utvecklingen av behandlingen och dess resultat, "ViewSetup Explorer" och en konsol, som visar felmeddelanden i Fiji.
      OBS: 'ViewSetup Explorer "är ett användarvänligt gränssnitt som visar varje vy, kanal och belysning och möjliggör val av filer av intresse. Dessutom "ViewSetup Explorer" möjliggör styrning av alla processteg.
    5. Välj de filer som ska bearbetas och tryck på höger musknapp i Utforskaren. Observera ett fönster öppet med olika processteg (Figur 1C).
    6. Vid definiera datamängden, observera att en XML-fil i mappen med data skapas.
      OBS: Denna fil innehåller metadata som bekräftades innan.
    7. I det övre högra hörnet observera två knappar "info" och "rädda". Trycka på "info" visar en sammanfattning av innehållet i XML-fil. Trycka på "spara" kommer att spara behandlingsresultat.
      OBS: Även om bearbetning i "Multi återuppbyggnad Application" de olika processteg måste sparas i xml före stängning Fiji.

OAD / 53.966 / 53966fig1.jpg "/>
Figur 1: Multiview återuppbyggnad arbetsflöde och räntepunkt upptäckt (A) Ljus ark inriktning baserad på fluorescerande pärla avbildning.. Systemet är i linje (i mitten), när pärlan bilden har en symmetrisk timglasform i xz och yz prognoser. De exempel på felinriktad ljusarket i endera riktningen är visade till vänster och höger. Den maximala ljusstyrkan projektioner av en 500 nm pärla i xz är YZ och xy axlar visas. Notera att förhållandet mellan intensiteten hos den centrala toppen av Airy skivan (i xy) till sidolober är större, när lightsheet är korrekt inriktad i förhållande till den felinriktade situationen. Bilder togs med 20X / 1.0 W mål på 0,7 zoom. Skala stapel representerar 5 pm. (B) dataset definieras och sedan omsparade i hdf5 format. Pärlorna segmenteras och därefter registreras. För en tidsserie varje tidpunkt registreras på en referenstidpunkten. Uppgifterna slutligen samman till enenda isotrop volym. (C, överst) Den ViewSetup Explorer visar olika tidpunkter, vinklar, kanaler och belysnings sidor av datamängden. (C, nedre vänstra hörnet) Den BigDataViewer fönstret visar vyn som väljs i ViewSetup Explorer. (C, mitten till höger) Högerklicka i ViewSetup Explorer öppnar alternativ behandlings. (C, högra nedre hörnet) Framstegen och resultaten av bearbetningen visas i loggfilen. (D och E) Syftet med upptäckt är att segmentera så många intressepunkter (kulor) med så lite detektering i provet som möjligt här visas som skärmbilder från den interaktiva pärla segmentering. (D och E, övre vänstra hörnet) Segmenteringen definieras av två parametrar, skillnaden-of-gaussiska Värden för Sigma ett och tröskeln. (D) Ett exempel på en framgångsrik detektering med en förstorad vy av en korrekt detekterad vulst. (E) Segmentering med alltför många falska positiva och multipla detekteringar av en enda pärla. Skala bar i (C) representerar 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Spara om datamängd i hdf5 Format
    1. Att spara om hela datamängden, markera alla filer med Ctrl / Apple + a och högerklicka. Välj sedan Spara om datamängd och som hdf5.
    2. Ett fönster öppnas visas en varning om att alla synpunkter från den aktuella datauppsättningen ska sparas om. Tryck på Ja.
      OBS: Programmet kommer att fortsätta att spara om de .czi filer till hdf5 genom att öppna varje fil och spara om de olika upplösningsnivåer hdf5 format. Det kommer att bekräfta med "gjort" vid färdigställandet. spara om usually tar några minuter per tidpunkt (se tabell 1).
      OBS: Eftersom filerna i hdf5 format kan laddas mycket snabbt, är det nu möjligt att se den oregistrerade dataset med "högerklicka" i utforskaren och växla "visas i BigDataViewer (on / off). En BigDataViewer fönster visas med den valda vyn (Figur 1C). Kärn funktioner BigDataViewer 33 förklaras i tabell 2 och http://fiji.sc/BigDataViewer.
  2. Identifiera räntepunkter
    1. Välj alla tidpunkter med Ctrl / Apple + a och högerklicka välj upptäcka räntepunkter.
    2. Välj Skillnad-of-Gaussian 34 för typ av räntepunkt upptäckt. Eftersom pärlan baserad registrering används här, typ "pärlor" i fältet för etiketträntepunkter. Aktivera "Nedsampla bilder före segmente".
    3. I nästa fönster, observera Detvsnitt inställningar. För "subpixel lokalisering" användning "3-dimensionell kvadratisk passning" 34 och att bestämma skillnaden-of-Gauss värderingar och radie för pärla segmente användning "interaktiva" i i'nterest punkten specifikation.
    4. För "Nedsampla XY" användning "Match Z upplösning (mindre nedsampling)" och för "Nedsampla Z" användning 1 ×. Z stegstorleken är större än xy pixelstorlek, alltså helt enkelt ner provtagning xy för att matcha z resolutionen tillräcklig. Välj "beräkna på CPU (JAVA). Tryck på "OK".
    5. I ett popup-fönster, välj en vy för att testa parametrar från rullgardinsmenyn. När visa laster, justera ljusstyrka och kontrast i fönstret med Fiji> Bild> Justera> Ljusstyrka / Kontrast eller Ctrl + Skift + C. Markera kryssrutan "leta efter maxima (grön) för pärla upptäckt.
    6. Observera segmentering av "viewSetup" som gröna ringar around detektering när vi letar efter maxima och rött för minima. Segmenteringen definieras av två parametrar, skillnaden-of-Gauss Värden för Sigma ett och tröskel (figur 1D). Justera dem till segmentet så många pärlor runt provet och så få falska positiva upptäckter inom provet som möjligt (Figur 1D). Identifiera varje pärla bara en gång och inte flera gånger (figur 1E). Efter bestämning av optimala parametrar, tryck på "gjort".
      OBS! Detektering startar genom att ladda varje enskild bild av tidpunkt och segmentera pärlorna. I loggfilen, matar programmet antalet kulor det upptäckts per view. Detekteringen bör ske på några sekunder (se tabell 1).
    7. Tryck spara när mängden upptäckter är lämpligt (600 till flera tusen per view).
      OBS: En mapp kommer att skapas i datakatalogen, som kommer att innehålla INFORMATIOn om koordinaterna för de detekterade pärlor.
  3. Registrera Använda intressepunkter
    1. Välj alla tidpunkter med Ctrl / Apple + en, högerklicka och välj "Register med hjälp av räntepunkter".
    2. Använd "snabb 3d geometriska hash (rotation invariant) för pärla upptäckt som" registreringsalgoritm ".
      OBS: Denna algoritm förutsätter inga förkunskaper om orientering och placering av de olika syn på varandra.
    3. För registrering av de synpunkter på varandra, välj "registrera tidpunkter individuellt" som "typ av registrering". För "intressepunkter" i den valda kanalen, bör den tidigare angivna etiketten för räntepunkter nu vara synliga (dvs. "pärlor").
    4. I nästa fönster, använd pre inställda värdena för registrering. Fäst den första vyn genom att välja "Fix plattor: Fix första plattan och användning inte tillbaka kartan" (använd detta om tiles är inte fast) i "Sätt tillbaka kakel sektion.
    5. Använd en "relaterad transformation modell" med "legalisering".
      OBS: Den tillåtna felet för RANSAC blir 5px och "betydelse för en deskriptor match" kommer att vara 10. För "reglering" använda en 'stel modell "med ett lambda av 0,10, vilket betyder att omvandlingen är 10% stel och 90 % affine 35. Tryck OK för att starta registreringen.
      OBS: Som visas i loggfönstret, först varje vy matchas med alla andra vyer. Då det slumpmässiga urvalet konsensus (RANSAC) 36 testar motsvarighet och utesluter falska positiva. För en robust registrering bör RANSAC värdet vara högre än 90%. När ett tillräckligt antal riktiga kandidater som motsvarar mellan två vyer hittas en omvandling modell beräknas mellan varje match med den genomsnittliga förskjutning i pixlar. Sedan den iterativa global optimering genomförs och alla åsikter är registrerade på den fasta vy. Med framgångsrik registrering, är en omvandling modell beräknas och visas med sin skalning och förskjutning i pixlar. Det genomsnittliga felet bör vara optimalt under en px och skalningen av omvandlingen nära 1. Registreringen utförs i sekunder (se tabell 1).
    6. Kontrollera att det inte finns någon förskjutning mellan olika vyer som observeras på fina strukturer i provet, t.ex. cellmembran. Spara sedan omvandlingen för varje vy i XML-fil.
      OBS: Nu de registrerade vyer är överlappande varandra i BigDataViewer (Figur 2A) och däckfots bilderna ska överliggande samt (Figur 2B).
    7. Ta omvandlingarna genom att välja tidpunkter högerklicka på dem och välj Ta bort Transformationer> Senaste / Nyaste Transformation sedan.

re 2 "src =" / filer / ftp_upload / 53.966 / 53966fig2.jpg "/>

Figur 2:. Resultat av multiview återuppbyggnad (A) som överdras registrerade vyer, var och en i en annan färg för att visa överlappningen mellan dem. (B) Förstorad vy som visar överlappningen mellan vävda av pärlor avbildade från de olika vyerna. (C) Nära upp av en pärla efter fusion, är PSF: ett genomsnitt av de olika vyerna. (D) polyesterstapelfibrer av samma vulst som i (C) efter multiview deconvolution visar att polyesterstapelfibrer kollapsar till en enda punkt. (E) xy sektion och (F) yz avsnitt av en enda bild av en optisk vesikel, i vilken membranen är märkta med GFP visar nedbrytning av signalen i z djupare i vävnaden. (G) xy avsnitt och (H) yz del av samma uppfattning efter vägda genomsnittliga fusion av 4 visningar ungefär 20 grader från varandra med något fler Degraded xy upplösning övergripande men ökade z-upplösning. (I) xy avsnitt och (J) yz delen av samma data efter multiview avfaltning, visar en betydande ökning av upplösning och kontrast av signalen både i xy och z. Bilder i (EJ) är enkla optiska skivor. Skala stapel representerar 50 pm (A, B, EJ) och 10 pm (C, D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Time-lapse Registrering
    1. Välj hela tiden förflutit, högerklicka och välj "Registrera dig med intressepunkter" för att stabilisera time-lapse över tiden.
    2. I "Grundläggande registreringsparametrar fönstret väljer Match mot ett referenstidpunkten (ingen global optimering) för typ av registrering". Ke ep t han andra inställningar på samma sätt som i registreringen av de enskilda tidpunkter.
    3. I nästafönstret väljer tidpunkt för att användas som en referens, typiskt en tidpunkt i mitten av time-lapse. Kryssa i rutan "överväga varje tidpunkt som stel enhet", eftersom de enskilda åsikter inom varje tidpunkt redan är registrerad på varandra.
    4. Kryssa för "Visa tidsserier statistik". De andra parametrar registrerings kvar som tidigare bland annat reglering. Tryck på OK.
      OBS: I loggfönstret, kommer samma utgång visas som i den individuella tidpunkten registrering. Om registreringen för de enskilda tidpunkter var framgångsrik och robust, är RANSAC nu 99-100% och den genomsnittliga, minsta och största fel är vanligtvis under en px. Spara denna registrering innan du fortsätter.

7. Multiview Fusion

OBS: De resulterande omvandlingar från registreringsstegen används för att beräkna en kondenserad isotrop stack ut ur flera vyer. Denna stack has ökade antalet z skivor jämfört med de ursprungliga uppgifterna, eftersom z avståndet är nu lika med den ursprungliga pixelstorleken i xy. Fusionen kan utföras genom antingen en innehållsbaserad multiview fusion 21,31 eller Bayesian baserade multiview avfaltning 31, som båda är implementerad i multiview uppbyggnaden ansökan.

  1. Markeringsram
    OBS: Fusion är ett beräkningsmässigt dyr process (se tabell 1) och därigenom minska den mängd data genom att definiera en begränsningsram signifikant ökar bearbetningshastigheten.
    1. Välj alla tidpunkter högerklicka och välj Definiera "Markeringsram. Använd 'Definiera med BigDataViewer "och välja ett namn för markeringsramen.
    2. Flytta reglaget för "min" och "max" i varje axel för att bestämma regionen av intresse och sedan trycka på "OK". Parametrarna för markeringsramen visas.
      OBS! Markeringsramen kommer att innehålla allt inomden gröna rutan som är belagd med en transparent magenta skikt.
  2. Innehållsbaserad Multiview Fusion
    OBS: Innehållsbaserad multiview fusion 21 tar bildkvalitetsskillnader över stapeln (dvs nedbrytnings av signalen i z) hänsyn och tillämpar högre vikter för bättre bildkvalitet istället för att använda en enkel medelvärdes.
    1. Välj tidpunkt (er) som ska sammansmälta i "ViewSetup Explorer", högerklicka och välj "Image Fusion / Deconvolution".
    2. I bild Fusion fönstret, välj "Weighted genomsnittet fusion" från rullgardinsmenyn och välj "Använd fördefinierade Markeringsram för Markeringsram. För produktionen av smält bilden väljer "Lägg till aktuell XML Project", som skriver nya hdf5 filer till de redan befintliga hdf5 filer och tillåter användning av de registrerade ofusionerade vyer och den kondenserade bilden tillsammans. Tryck på "OK".
    3. Sedan i "Pre-definiera Markeringsram & #39; pop up-fönster väljer du namnet på den tidigare definierade markeringsramen och tryck "OK".
    4. Beakta parametrarna för markeringsramen i nästa fönster. För snabb fusion, tillämpa en ned provtagning på smält dataset.
      OBS: Om den smälta stapeln ligger över en viss storlek, kommer programmet att rekommendera att använda en mer minne effektiv "ImageLib2 containe'r. Växla från "ArrayImg" till "PlanarImg (stora bilder, lätt att visa) eller CellImg (stora bilder)" behållare, som möjliggör behandling av större uppgifter. Annars använder fördefinierade inställningar och tillämpa "blandning och innehållsbaserade fusion". Fortsätt genom att trycka på "OK".
    5. Beakta hdf5 inställningarna i nästa fönster. Använd de fördefinierade parametrar och starta fusionsprocessen. Se till att Fiji har tilldelats tillräckligt med minne i Redigera> Alternativ> Minnen & trådar.
  3. Multiview Deconvolution
    OBS: Multiview Deconvolution 31 är ANOThennes typ av multiview fusion. Här dessutom till fusionen är PSF av avbildningssystemet beaktas för att deconvolve bilden och avkastning ökad upplösning och kontrast signalen (jämfört i figur 2C-J, Figur 5 och Movie 3).
    1. Välj tidpunkt (er) som ska dekonvolvering, högerklicka och tryck på "Image Fusion / Deconvolution".
    2. Välj "Multiview Deconvolution" och användning "den fördefinierade markeringsramen och lägga till den aktuella XML-projektet". Välj markeringsramen och fortsätta.
      OBS: De fördefinierade parametrar för avfaltning är en bra utgångspunkt. För det första provanvändning '20 iterationer "och bedöma effekterna av avfaltning genom att använda" Debugläge ". Slutligen sätta beräkna på i 512 x 512 x 512 block.
    3. I nästa fönster kan du använda fördefinierade inställningar. Ställ in "debug läge" för att visa resultat varje "5 iteransoner ".
      OBS: Utgången av avfaltning är 32-bitars data, men BigDataViewer stöder för närvarande endast 16-bitars data. I syfte att lägga till utgången hos avfaltning till den befintliga hdf5 datamängd, måste den omvandlas till 16-bitars.
    4. För omvandlingen, kör "Använd min / max av den första bilden (kan mätta intensiteter med tiden).
      OBS! Avfaltning kommer då börja med att läsa in bilderna och förbereda dem för avfaltning.
  4. BigDataServer
    1. För att dela mycket stora XML / hdf5 dataset använder http-server BigDataServer 33. En introduktion till hur att installera och ansluta till en sådan server kan hittas på http://fiji.sc/BigDataServer.
    2. För att ansluta till ett befintligt BigDataServer öppen Fiji> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
    3. Ange webbadressen, inklusive hamnen i fönstret.
      OBS: Filmerna som beskrivs i denna publikation är tillgängliga via denna annonsdress: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
    4. Observera ett fönster som tillåter att välja tillgängliga filmer. Dubbelklicka för att öppna BigDataViewer fönstret och visa data som tidigare beskrivits.

Kompletterande: Checklista över material som behövs innan du börjar

  • zebrafisk embryon / larver som uttrycker fluorescerande proteiner (Håll embryon i zebrafisk E3 medium utan metylenblått. För stegen som är äldre än 24 timmar motverka pigmente genom att tillsätta PTU till en slutlig koncentration av 0,2 mM.)
  • fluorescerande stereoskop
  • kapillärer (20 ul volym, med ett svart märke) och lämpliga kolvar (Återanvänd inte kapillärerna. Kolvarna, å andra sidan, kan återanvändas för flera experiment.)
  • 1,5 ml plaströr
  • skarpa pincett
  • glas (eld polerade) eller plastpipetter (plast kan användas för 24 h och äldre embryon)
  • glas eller plastskålar diameter 60 mm (plast kan varaanvänds för 24 timmar och äldre embryon)
  • två 100 ml bägare
  • 50 ml Luer-Lock spruta med 150 cm förlängningsslang för infusion (Slangen och sprutan bör hållas helt torr mellan experiment för att undvika kontaminering av mikroorganismer.)
  • model
  • låg smältpunkt (LMP) agaros
  • E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4)
  • MS-222 (Tricaine)
  • fenyltiokarbamid (PTU)
  • fluorescerande mikrosfärer (här kallade pärlor)
  • dubbeldestillerat H2O (DDH 2 O)

Representative Results

LSFM är en idealisk metod för avbildning av utvecklingsprocesser över fjäll. Flera ansökningar sammanställs här visar både kort och lång sikt avbildning av intracellulära strukturer, liksom celler och hela vävnader. Dessa exempel visar också att LSFM är ett användbart verktyg i olika stadier av ögonens utveckling från optiska kopp bildning till neurogenes i näthinnan. Film 1 tjänar som en illustration av den allmänna LSFM tillvägagångssätt första visar en zoomat ut vy av en intakt embryot i inbäddning agaros cylinder i bright och senare visar en detaljerad vy av näthinnan i fluorescenskanalen.

filmen 1
Film 1:. LSFM av zebrafisk näthinnan att illustrera LSFM tillvägagångssätt visar den här filmen först i ljusfält som embryot avbildas intakt inne i engarose cylinder innan du byter till fluorescens. Senare har visat att det stora synfältet möjliggör observation av hela näthinnan. Därefter visar filmen en förstorad liten region av näthinnan för att markera den goda subcellulära upplösning. En Ath5: gap-GFP 37 transgena zebrafisk embryo användes för avbildning. Denna transgen etiketter olika nervceller i näthinnan (främst ganglieceller och fotoreceptor prekursorer). Fluorescensen del av filmen fångades som en enda vy inspelning med dubbelsidig belysning med hjälp av 40X / 1.0 W mål med 5 minuters intervall. Den högsta tillåtna projektion av en 30 pm tjock volym visas. Klicka här för att ladda ner filen.

Film 2 visar, hur mycket snabba intracellulära händelser kan fångas med hög upplösning; i detta fall tillväxten av mikrotubuli vidderas plus slutar i näthinnans neuronala stamceller. Den information som finns i filmen möjliggör spårning och kvantifiering av mikrotubuli plus slut tillväxt.

film 2
Film 2:. Mikrotubuli dynamik i en enda cell Denna film fångar växande plus tips av mikrotubuli märkta med plus tips markörproteinet EB3-GFP 38. Proteinet uttrycks i en enda retinal progenitorcell. Mikrotubuli växer främst i riktning från apikala till basala (topp till botten). Medelhastigheten för de EB3 kometer mättes som 0,28 ± 0,05 | j, m / sek. Den ljuspunkt på den apikala sidan av cellen som uppvisar hög mikrotubuli kärnverksamhet är centrosom. Vildtyp embryo injicerades med hsp70: EB3-GFP plasmid-DNA. Filmen förvärvades 4 h efter värmechock (15 min vid 37 ° C) vid omkring 28 hrpost fertilization (HPF) som en enda vy inspelning med enkelsidig belysning med hjälp av 63x / 1.0 W mål och en sek tidsintervall. Den enda cell klipptes från ett synfält som täcker större delen av näthinnan. Den högsta tillåtna projektion av två skivor visas. Klicka här för att ladda ner filen.

Figur 3 visar, hur intracellulära strukturer kan följas över många timmar. Här är centrosom inom translokerande retinala ganglionceller (RGC) fångas.

Figur 3
Figur 3:. Centrosom lokalisering under näthinneganglieceller sloka Detta montage av ett tidsförlopp experiment visar positionen för centrosom hela näthinneganglieceller (RGC) mognad.I de neuronala progenitorer den centrosom är lokaliserad i den yttersta spetsen av den apikala process (01:00). Under celldelning, de två centrosom fungera som stolpar för den mitotiska spindeln (2:25). Denna uppdelning resulterar i en dottercell som skiljer i en RGC och andra dottercell som blir en ljusmätare cellföregångare. Efter division, cellkroppen av RGC translokerar till den basala sidan av näthinnan, medan den apikala process förblir fäst vid den apikala sidan. När RGC når den basala sidan lossnar dess apikala process och centrosom färdas med det (6:15). Den centrosom kan följas medan gradvis dras tillbaka tillsammans med den apikala process (6:50, 7:20, 8:10). I den sista bildrutan (08:55) gangliecell växer en axon från dess basala sida, medan centrosom fortfarande lokaliserad apikalt. Mosaiken uttryck uppnåddes genom plasmid-DNA-injektion in i vildtyp embryo i ett cellstadiet. Cellerna visualiseras av Ath5: GFP-CAAX (grön) construct, vilka etiketter RGC och andra nervceller. De centrosom (pilspetsar) är märkta av Centrin-tdTomato 29 uttryck (magenta). Den apikala sidan av näthinnan är vid toppen av bilden och den basala sidan längst ner. Den högsta tillåtna projektion av en 30 pm tjock volym visas. Bilderna beskärs från en film som täcker hela näthinnan. Filmen börjar på runt 34 h efter befruktning (HPF). En z stacken förvärvades varje 5 min med 40X / 1,0 W mål. Tiden visas i hh: mm. Skala stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I fig 4 visas det, hur enkelcellbeteende kan extraheras från datainsamlings hela vävnad såsom i film 1. Translokation av en RGC lätt kan spåras och dess apikala och basala processes följde.

figur 4
Figur 4:. Translokation av en enda näthinneganglieceller Den RGC translokeringen från apikala till basalsidan av näthinnan sker efter den terminala mitos såsom beskrivs i figur 3 Den RGC är märkt genom uttryck av Ath5:. Gapet-GFP 37 transgenen. Den högsta tillåtna projektion av en 30 pm tjock volym visas. Bilderna beskärs från en film som täcker hela näthinnan. Filmen börjar på runt 34 HPF. En z stacken förvärvades varje 5 min med 40X / 1,0 W mål. Tiden visas i hh: mm. Skala stapel representerar 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 visar förmågan hos multiview LSFM att fånga vävnad scale morfogenetiska processer med cellulär upplösning på exemplet med optisk kopp morfogenes, under vilken optisk vesikel förvandlas till en optisk kopp. Bildkvaliteten kan avsevärt förbättras genom multiview avbildning, när den slutliga bilden kombineras från information från 5 olika vyer (i detta fall) i en z stack med isotrop upplösning. Denna figur illustrerar förbättringen i bildkvalitet efter vägda genomsnittliga fusion och ytterligare förstärkning i bildkontrast och upplösning efter multiview avfaltning. Figuren visar två optiska skivor i olika riktningar genom dataset. Dessutom, ett montage från dekonvolvering dataset visar den optiska koppen morfogenes över tiden. Alla tidpunkter sedan visas i Movie 3.

figur 5
Figur 5: Jämförelse av bildkvalitet mellan enda vy och två metoder för multiview fusion. (A) En optisk skiva Enkelvy data som visas från sidovy och (B) rygg vy. Rand artefakter och nedbrytning av signalen djupare inne i provet är uppenbara. Också en del av bilden som visas i de sammansmälta data (CF) inte fångades i detta särskilda vy. (C) Samma optiska skiva, nu som multiview smält data visas från sidovy och (D) rygg vy. Observera att rand artefakter undertrycks och strukturer djupt i provet är bättre lösas. (E) Samma optiska skiva nu som multiview dekonvolvering data som visas från sidovy och (F) rygg vy. Notera ökad kontrast och upplösning så de enskilda cellmembran och kärnor kan vara väl urskiljas. Resolutionen inte försämras särskilt djupare inuti provet. Den datamängd förvärvades med dubbelsidig belysning från 5 visningar ungefär 20 grader från varandra. Z staplar av abut 100 pm med 1,5 pm steg storlek förvärvades vid varje vy i 10 minuters intervall under 10 timmar med 20X / 1.0 W mål. Inmatningsbilder för multiview fusion och deconvolution var ned samplas två × att påskynda bildbehandling. 15 iterationer av multiview dekonvolution kördes. (G) Montaget visar en beskuren del av rygg utsikten från dekonvolvering uppgifter för att markera de morfogenetiska händelser under tidig ögonens utveckling från den optiska vesikeln till den optiska koppen scenen. De båda skikten av den optiska vesikeln, som från början är likartad kolumnär epitel, differentierar till distinkta cellpopulationer. Den distala skiktet nära epidermis blir det retinala neuroepithelium (RN) och den proximala skiktet nära neuralröret blir det retinala pigmentepitelet (RP). Cellerna i RN långsträckta och invaginate för att bilda den optiska koppen (1:40 till 5:00); samtidigt RP cellerna platta. Ytan ektoderm induceras att bilda en lins (1:40), WHich invaginates senare (05:00). Filmen börjar kl 17 HPF. Tiden visas i hh: mm. Alla cellmembran är märkta med β-aktin: ras-GFP transgenen och alla kärnorna är märkta med hsp70: H2B-RFP transgen. Skala stapel representerar 30 um. FB framhjärnan, LE lins, OP lukt placode, RN retinal neuroepithelium, RP retinal pigmentepitel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

film 3
Film 3: Optic kopp morfogenes visas med samma vy och två metoder för multiview fusion time-lapse film illustrerar hela processen av optisk kopp morfogenes från den optiska vesikeln till den optiska koppen scenen.. Den visar en enda optisk skiva från den laterala vy (överst) och en enda optisk skiva från den dorsala vyn (botten). Cellerna i den utveckla optiska vesikeln undergår komplexa omlagringar för att slutligen bilda den halvsfäriska optiska kopp med den inre retinal neuroepitelet och yttre retinal pigmentepitel. En lins är bildat från ytan ektoderm. Det invaginates tillsammans med neuroepithelium och sitter i den optiska koppen. Alla cellmembran är märkta genom expression av β-aktin: ras-GFP (grön) transgenen och kärnorna märks med hsp70: H2B-RFP (magenta). Filmen börjar på runt 17 HPF. Den datamängd förvärvades med dubbelsidig belysning från 5 visningar ungefär 20 grader från varandra och az högar av cirka 100 um förvärvades var 10 min med 20X / 1.0 W mål. Tiden visas i hh: mm. Skala stapel representerar 50 um. Klicka här för att ladda ner filen.

Discussion

1. Kritiska steg och felsökning för datainsamling

De typiska avbildnings inställningar för en GFP och RFP som uttrycker prov återfinns i tabell 3. I det beskrivna mikroskopet inställningsljus arket är statisk, som bildas av en cylindrisk lins. De två belysnings målen är luft linser och detekteringsmålet är en vatten-dopplins. Zoom 1,0 med 20X / 1.0 eller 40X / 1.0 mål ger 230 nm och 115 nm pixelstorlek och ett synfält på 441 x 441 pm eller 221 x 221 pm respektive. Det rekommenderas att använda standardljusplåttjocklek med centrum till gräns förhållandet 1: 2. För 20X / 1,0 denna tjocklek motsvarar 4,5 | im och för 40X / 1,0-3,2 | j, m i mitten. Om utskriftshastighet är inte det primära prioritet, använda separata spår i händelse av en flerfärgad prov för att undvika överhörning av fluorescensemission mellan kanalerna. Den högsta hastigheten för förvärv är begränsat till 50 msek per z steg avrörelsehastighet z-drivrutinen. Om målet är att uppnå maximal utskriftshastighet i fallet med exempelvis två spår med dubbelsidig belysning, exponeringstiden måste ställas in så att summan av alla bilder som tas per z steg är under 50 msek. Å andra sidan, om bara en enda bild förvärvas per z steg, är det inte fördelaktigt att ställa in exponeringstiden kortare än 50 ms.

1920 x 1920 bildstorlek
16-bitars
Pivot skanna på
Dubbelsidig belysning online fusion
10X / 0,2 belysnings mål
20X / 1.0 W Plan-Apochromat upptäckt mål
Spår 1: Excitation 488 nm typiskt 2% av 100 mW laser, 550 nm SP emissionsfilter
Spår 2: Excite 561 nm typiskt 3% av 75 mW laser, 585 nm LP emissionsfilter
Exponeringstid på upp till 100 ms
Z stack tjocklek 50-100 um
1-1,5 um z stegstorlek i den kontinuerliga z körläge
Inkubation vid 28,5 ° C

Tabell 3: Imaging inställningar.

Kontroll av provet efter försöket

Det är viktigt att säkerställa att provet är fortfarande frisk vid slutet av experimentet. Som en första avläsning, kontrollera hjärtslag av provet under ett stereoskop. Med ett par vassa pincett provet kan tas ut ur agarosen och flyttade till inkubatorn att utveckla ytterligare för att kontrollera om det påverkades av avbildning. Alternativt kan det fastställas för antikroppsfärgning.

Montering och drift

Det är viktigt att hålla osmolaritet av kammaren sÖSNING nära osmolaritet inbäddning agaros, annars svullnad / krympning av agaros och efterföljande instabilitet av provet kommer att uppträda. Därför använder samma lösning (E3 medium utan metylenblått) för att fylla kammaren och att förbereda ett% låg smältpunkt agaros portioner. Dessutom, inte lämnar agaros i 70 ° C värmeblock under mer än två timmar, eftersom det kan förlora sina gelningsegenskaper.

Behöver inte bädda fisken i för varm agaros, eftersom detta kan leda till värmechocksvar eller död av embryot. Om du är osäker om effekten av varma agaros på embryon, kontrollera att svansen inte böjer och att hjärtfrekvensen inte blir långsammare. Om detta inträffar, använda en annan embryo för experimentet.

Hålla den totala längden av den agaroskolonn med provet kort (omkring 2 cm) och montera zebrafisk med huvudet orienterat mot kolvspetsen. Likaså agarosen cylindern sprutas från CAPILLAry bör hållas så kort som möjligt. Dessa åtgärder kommer att garantera stabilitet av provet genom hela filmen. Samtidigt måste agaroskolonnen vara tillräckligt lång så att glas kapillär själv inte når in i ljusbanan, eftersom detta skulle orsaka stor refraktion och reflektion.

Den initiala drift av provet förorsakas av volymförändringar för agarosen själva cylindern. Glidning av kolven är inte orsaken till den. Därför hjälper det inte att fastställa kolven med modellera eller nagellack. Embryot kan ändra sin ståndpunkt under filmen på grund av dess naturliga tillväxt också. Följaktligen är det lämpligt att centrera regionen av intresse i mitten av synfältet och hålla ett visst utrymme vid kanterna för att rymma dessa rörelser.

Reducerad mängd inbäddningsmedium i ljusbanan

Orientera provet korrekt bidrar till att uppnå bästa möjliga bildkvalitet 15. Genrally, bör excitation och emissionsljus färdas genom så lite vävnad och montering media som möjligt. Den optimala lösningen är agaros-fri montering. Detta uppnåddes exempelvis i en inställning för Arabidopsis lateral rot avbildning 14, där huvud roten monterades i Phytagel och sidorötter därefter låta växa ut ur gelén kolumnen helt. Agaros-fri montering utvecklades också för avbildning av hela embryogenes av Tribolium skalbagge under två dagar 12. förbättra bildkvaliteten var inte en primär motivation i det fallet. Tribolium embryon helt enkelt inte överlever i agarosen tillräckligt länge. En absolut inbäddning media-fri montering har inte uppnåtts för långsiktig avbildning i zebrafisk. Ändå kan vi dra fördel av det faktum att när agarosen stelnar, är de flesta embryon placerade diagonalt i kapillären med ett öga ligger djupt i agaros och det andra ögat vara nära ytan av inbäddning kolonnen. Than öga närmare ytan ger överlägsen bildkvalitet och därför bör avbildas företrädesvis.

Agaros koncentration och långsiktig imaging

Koncentrationen av agaros för montering är en kompromiss mellan stabilitet av provet och möjligheten för att rymma tillväxt av embryot och diffusion av syre till den. Det finns ingen ytterligare förstärkning i stabilitet av provet vid användning av agaros koncentrationer högre än 1%. Som utgångspunkt för att optimera experimenten vi rekommenderar 0,6% agaros, som också lämpar sig för embryon yngre än 24 HPF som är alltför känsliga för att monteras i 1% agaros. Att söva äldre embryon och larver, kan MS-222 koncentration höjas till 200 | ig / ml utan biverkningar 13.

Vid utvecklings embryon avbildas längre än ± 12 timmar, agaros montering rekommenderas inte, eftersom det begränsar tillväxten av embryot och Causes svans deformation. Denna fråga löstes för zebrafisk genom att montera embryon i FEP polymer rör med brytningsindex som liknar vatten 13,39. Musembryon, å andra sidan, kan immobiliseras i ihåliga agaros cylindrarna 40 eller i hål av en akrylstav fäst till en spruta 41. FEP röret montering rekommenderas inte som standardmetod men eftersom väggen av röret bryter ljuset drygt agaros.

Ljus ark uppriktning

För god bildkvalitet är det viktigt att utföra den automatiska ljus ark anpassning före varje experiment. Särskilt om zoominställningarna ändrades var målen tas ut, eller en annan vätska användes i kammaren.

Belysning

Vrid skanning av ljuset arket bör alltid vara aktiverad. För stora spridnings prover, är det nödvändigt att tillämpa dubbelsidig belysning online fusion att uppnå jämn belysning tvärs över synfältet. Dubbelsidig belysning minskar också ett specifikt problem i ögat avbildning, som är brytning av det infallande ljuset arket genom linsen av embryot. Mindre, spridnings prover kan effektivt avbildas med enkelsidig belysning, vilket förkortar avbildningstiden med hälften och kan resultera i något bättre bildkvalitet jämfört med dubbelsidig belysning. Detta beror på att ljusbanorna för de två belysnings armarna är alltid olika och desto effektivare en kan väljas. Dessutom är de två ljus ark som kommer från varje sida är aldrig perfekt i ett plan, som orsakar mild suddighet efter fusionen. För mycket snabba intracellulära händelser, som de växande mikrotubuli (Film 2) är dubbelsidig belysning inte är lämpligt, eftersom bilderna med belysning från vänster och höger förvärvas sekventiellt, vilket kan resultera i rörelseoskärpa.

fotoblekningoch fototoxicitet

Mindre fluoroforen fotoblekning nämns ofta som en stor fördel med LSFM. Vi vill hävda att målet bör vara någon fotoblekning alls. Om det märks fotoblekning i live imaging experiment, är provet förmodligen redan ut ur dess fysiologiska området tolererade laserexponering. När avbildning av zebrafisk embryon i den snurrande skivan mikroskop, i vår erfarenhet, kan hög fototoxicitet stall embryoutveckling redan innan de fluorescerande signal blekmedel markant. Därför bör bildinställningarna i LSFM justeras så att lite eller ingen fotoblekning observeras. Även om LSFM är skonsam till provet, är det klokt att använda bara så mycket lasereffekt och exponeringstid som behövs för att åstadkomma en signal till brusförhållandet är tillräcklig för den efterföljande dataanalys.

Z-stack, tidsintervall och datastorlek

De filer som genereras av LSFM är vanligtvis mycket stora; ibland i terabyte intervallet. Det är ofta nödvändigt att göra en kompromiss mellan bildkvalitet och datastorlek. Detta gäller särskilt för z avståndet mellan staplar och intervaller i time-lapse förvärv. Att definiera z intervall bör Optimal på fliken Z-stack verktyg helst användas, särskilt om datamängden kommer att dekonvolvering senare. Det beräknar avståndet för att uppnå 50% överlappning mellan angränsande optiska skivor. Ändå något större z intervall är vanligtvis acceptabelt. De minskar den tid som behövs för att förvärva z stacken liksom den slutliga filstorleken. Den optimala samplingstiden beror på processen av intresse. För övergripande ögonens utveckling 5-10 minuters intervall är vanligtvis acceptabelt. Om vissa konstruktioner skall automatiskt spåras, måste de efterföljande tidpunkter vara tillräckligt lika.

fluorescerande pärlor

Fluorescerande pärlor tjänar främst som referensmarkörer för registrering olika vyerav en multiview dataset på varandra. virvel alltid pärla lösningar noggrant före användning. Värm inte kulorna, eftersom detta kan leda till förlust av fluorescerande färgämne. Den optimala vulsten koncentrationen för den multiview registrering måste bestämmas experimentellt. Den beskrivna plugin fungerar bäst med cirka 1000 upptäckta pärlor hela varje vy. Större (500 nm eller 1000 nm) pärlor upptäcks mer robust än mindre (mindre än 500 nm) pärlor. Detta beror på att större kulor är ljusare och är lättare att segment utan falska positiva upptäckter av strukturer i provet. Nackdelen med de större pärlorna är att de är mycket framträdande i den slutliga smält och dekonvolvering bild. För varje ny fluorescerande markör, den lämpliga pärlstorlek och fluorescensemission måste optimeras. För att ge ett exempel på prov från figur 5 och Movie 3, 100 nm grön utsläpps pärlor gav alltför många falska positiva upptäckter i membran GFP kanal, men 1000 nM Red utsläpps pärlorna kraftigt detekteras i H2B-RFP kanal med mycket få positiva upptäckter inuti provet. Om pärlan detektering misslyckas i kanalen med fluorescerande markör, kan en separat kanal som endast innehåller pärlor förvärvas, men detta är inte särskilt praktiskt. De sub-upplösning stora pärlor ger en direkt avläsning av punktspridningsfunktionen (PSF) av mikroskopet, vilket kan användas för avfaltning (Figur 2C-D). Om registreringen och fusion fungerar bättre med större pärlor (t.ex. 1000 nm), kan en separat bild av PSF förvärvas med sub-upplösning, t.ex. 100 nm pärlor. Använda multicolor pärlor är användbart under registrering av flerkanalig förvärv och för att verifiera att kanalerna overlay perfekt.

Tillsats av fluorescerande pärlor är inte nödvändigt vid avbildning från en enda vy utan efterföljande multiview registrering och fusion. Men även i dessa fall pärlor kan vara till hjälp under inil justering ljus ark för att kontrollera kvaliteten på ljuset arket och i allmänhet att avslöja optiska aberrationer. Sådana optiska aberrationer kan härröra från olika källor som skadade eller smutsiga mål, smutsiga fönster i kammaren eller inhomogenitet i agarosen. Pärlor kan även användas för drift korrigering av multiview registrering Fiji plugin 20.

Multiview

För multiview rekonstruktion ändamål, är det bättre att få ett udda antal visningar 3, 5 och så vidare, som inte är motsatta varandra. Detta förbättrar avfaltning sedan PSFS avbildas från olika håll. Det är också viktigt att bekräfta vid början av den tid förflutit förvärvet att det finns tillräcklig överlappning mellan vyerna. Detta görs bäst empiriskt, dvs omedelbart bekräfta att vyerna i den första tidpunkten kan registrerats. När målet för multiview förvärvet är att öka upplösningenav en bild av en stor spridnings exemplar, är det inte tillrådligt att bilden hela provet i varje vy, men att sluta runt mitten av provet, där signalen försämras. Den låga kvaliteten förvärv från den andra halvan av provet skulle inte tillföra användbar information till multiview återuppbyggnad.

2. Kritiska steg och felsökning för databehandling

För närvarande, finns det flera möjligheter för behandling av multiview data från en ljus ark mikroskop som är väl dokumenterade och relativt lätt att anta. Vi använder multiview återuppbyggnads ansökan, som är en öppen källkod implementeras i Fiji 32 (Stephan Preibisch opublicerad, Länk 1a och Link1b i förteckningen över material). Denna plugin är en stor redesign av den tidigare SPIM registrerings plugin 20, sesav Schmied et al. 42, integrera BigDataViewer och dess XML och hdf5 format 33 med SPIM registreringsflödet (Figur 1B, Länk 2 , Link 3 ). Denna ansökan kan även anpassas för högprestandaberäkningar kluster, vilket avsevärt snabbar upp behandlingen 43. Denna multiview registreringsansökan aktivt vidareutvecklas och håller på att förbättras. Vid problem eller funktioner förfrågningar om den beskrivna programvaran, skicka in frågor på respektive github sidor ( Länk 4 för Multiview återuppbyggnad och Link 5 för BigDataViewer).

Det andra alternativet är att använda kommersiell programvara tillgänglig tillsammans med mikroskop. Denna lösning fungerar bra och sysselsätter samma princip om att använda fluorescerande pärlor att registrera de olika vyerna. Den saknar dock möjlighet att visualisera hela dataset snabbt som med BigDataViewer. Även programvaran kan inte anpassas till klustret och dessutom behandlingsblock mikroskop för andra användare, om inte ytterligare licens för programvaran köps.

Det tredje alternativet, som också är en öppen källkod, har nyligen publicerats av Keller lab 44 och ger en övergripande ram för bearbetning och nedströms analys av ljusdatablad. Denna programvara är med hjälp av information från i provet för att utföra multiview fusion, därför att den inte kräver närvaron av fluorescerande pärlor runt provet. Men samtidigt är det förutsätter ortogonala orienteringen av bild vyer (mål), så det kan inte användas för data som samlats in från godtyckliga vinklar 44.

hårdvaru~~POS=TRUNC krav~~POS=HEADCOMP

ntent "> Den hårdvara som används för bearbetning kan hittas i tabell 4. Det måste finnas tillräcklig lagringskapacitet och en tydlig rörledning för databehandling tillgängliga, före det faktiska experimentet. Förvärv av bilderna är snabbare än efterföljande analys och det är lätt att få översvämmade med obearbetade uppgifter. Det är ofta orealistiskt att lagra alla råbilder, utan snarare den beskurna eller bearbetade bilder som sammanslagna vyer, maximal intensitet projektioner eller sfäriska utsprång 45.

processor Två Intel Xeon processor E5-2630 (Six Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / s)
Minne 128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM
Hårddisk 4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7,200 rpm) hårddisk
HDD Controller PERC H310 SATA / SAS Concontroller för Dell Precision
HDD-konfiguration C1 SATA 3,5 tum, 1-4 hårddiskar
Grafik Dubbla 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 kort w / 2 DP och en DVI-I vardera) (2 DP-DVI och två DVI-VGA-adapter) (MRGA17H)
Nätverk Intel X520-T2 Dual Port 10 GbE-nätverkskort

Tabell 4: Hårdvarukrav.

Databehandlingshastighet

Den tid som behövs för databehandling beror på dimensionerna hos de uppgifter och om det används hårdvara. I tabell 1, ger vi en översikt över den tid som krävs för de viktigaste stegen i att behandla ett exempel 8,6 GB multiview dataset som bestod av en tidpunkt med 4 vyer och 2 kanaler.

bearbetning sTEP Tid protokoll~~POS=TRUNC steg~~POS=HEADCOMP
Spara om som hdf5 6 min 30 sek 6,3
Identifiera räntepunkter 20 sek 6,4
Registrera sig med intressepunkter 3 sek 6,5
Innehållsbaserad multiview fusion 4 tim 7,2
Multiview avfaltning (CPU) 8 tim 7,3
Multiview avfaltning (GPU) 2 tim 7,3

Tabell 1: Data Processing Time.

Indataformat för multiview rekonstruktion

Fiji Plugin Multi återuppbyggnad kan stödja .czi, Tif och ome.tiff format. På grund av datastruktur .czi format, diskontinuerliga datamängder är intestöds utan förbearbetning. Diskontinuerliga innebär att inspelningen skulle startas (t.ex. för att justera positionerna på grund av driften av provet). I det här fallet behöver .czi filer som ska sparas om som .tif. För .tif-filer varje vy och belysningsriktningen måste sparas som en separat fil.

Kalibrering av pixelstorlek

Mikroskopet-operativsystem beräknar kalibrering för xy pixelstorlek baserad på den valda målet. Emellertid är bildpunktstorleken i z definieras oberoende med stegstorleken. Om fel mål som anges i programmet xy z förhållande är felaktig och registrering kommer att misslyckas.

ursprungliga registreringen

Efter att definiera dataset antalet registreringar blir ett och antalet räntepunkter kommer att vara 0 i ViewSetup Explorer. Den första registreringen representerar kalibrering av datamängden. Både antalet of registreringar och intressepunkter kommer att öka under bearbetningen.

Ner provtagning för detektering av intressepunkter

Använda ned provtagning rekommenderas, eftersom laddningen av filerna och segmente kommer att vara mycket snabbare. Det är dock viktigt att notera att de detektionsparametrar kommer att ändras beroende på ned provtagning, alltså överföra inställningar upptäckt mellan olika ned prov inställningar är inte möjlig.

Detektering av intressepunkter

Det är lämpligt att segmentera så många riktiga pärlor som möjligt i varje vy, även till priset av att få några falska positiva upptäckter, eftersom de inte hindrar registrering avsevärt. Falska detektioner, om få till antalet, är uteslutna under registrering (se Registrering av räntepunkter). Emellertid massiva falska positiva detekteringar utgöra ett problem för algoritmen. Det minskar inte bara prestanda för att upptäcka ochregistrering, eftersom det tar mycket längre tid att segmentera bilden samt jämföra dessa pärlor mellan vyerna, men det minskar också riktigheten i registreringen. Detta kan åtgärdas genom att använda strängare detektionsparametrar. Dessutom, under segmentering av pärlorna (dvs. multipla detekteringar på en pärla Figur 1E) är skadlig för registrering och bör undvikas.

Registrering av räntepunkter

Att registrera utsikt till varandra, är placeringen av varje pärla i varje vy beskrivs av sin position i förhållande till de tre närmaste grann pärlor. Dessa konstellationer bildar en lokal geometrisk deskriptor och tillåter att jämföra varje pärla mellan vyerna. Pärlor med matchande deskriptor mellan två vyer sedan betraktas som kandidat motsvarigheter. Observera att detta bara fungerar för slumpmässigt fördelade kulor, för vilka lokala beskrivningar är typiskt unik för varje pärla.Man kan använda andra strukturer som kärnor i provet för registrering. Men för att upptäcka kärnor, som är fördelade icke slumpmässigt i provet, andra metoder tillämpas 20,21.

Kandidat överensstämmelser testas sedan mot RANSAC 36 för att utesluta falska positiva. Varje korrespondens föreslår en omvandling modell för överlagring synpunkter på varandra. Sanna överensstämmelser skulle sannolikt komma överens om en omvandling modell, medan extremvärden skulle varje punkt till en annan. De sanna överensstämmelser används sedan för att beräkna en affin transformation modell mellan de två jämförda vyer. En global optimering med en iterativ optimeringsalgoritm genomförs sedan, under vilken alla synpunkter registreras på den första vyn i syfte att minimal förskjutning mellan vyerna 20,21.

Time-lapse registrering

På grund av att flyttalingen av agarosen och oprecisa motorrörelse av mikroskop scenen, positionen av varje stapel varierar måttligt över tiden. Medan registreringen av enskilda tidpunkt avlägsnar skillnaden mellan synpunkter från denna tidpunkt, måste tidsförlopp också att bli registrerad som en helhet. För detta ändamål är varje enskild tidpunkt registreras på referenstidpunkten.

Referenstidpunkten

Om en tidsserie med många tidpunkter behandlas, är en representativ tidpunkt vald som referens vanligtvis från mitten av tidsserierna eftersom pärla intensitet kan försämras med tiden på grund av blekning. På denna referens, kan parametrarna för räntepunkt upptäckt, registrering, markeringsramen och fusion fastställas. Dessa parametrar appliceras sedan på hela tiden förflutit för att beräkna en specifik transformationsmodell för varje enskild tidpunkt. Under tidsförlopp registrering alla andra tidpunkter är också registställda rums på denna referenstidpunkten. Således begränsnings box parametrar för hela inspelningen är beroende av denna specifika tidpunkt.

flerkanalig registrering

När avbildning flera kanaler, helst samma fluorescerande pärlor ska synas i alla avbildade kanaler. Detekteringen och registreringen kan sedan utföras på varje kanal för sig, som tar hänsyn till inverkan av de olika ljusvåglängderna på transformationen. Ofta är detta inte möjligt, eftersom pärlorna inte är synliga i alla kanaler eller pärlorna dominerar bilden för mycket i en kanal och är alltför svagt i den andra kanalen (-erna). Den typiska lösningen är att använda pärlor synliga endast i en kanal för detektering och registrering och förvärvad transformationsmodellen (dvs efter upptäckt, registrering och time-lapse registrering) appliceras sedan på de andra kanalerna från Fiji> Plugins> Multiview Reconstruktion> Gruppbearbetning> Verktyg> Duplicate Transformationer. I rullgardinsmenyn för Apply omvandling av väljer en kanal till andra kanaler. I följande fönster väljer XML och klicka på OK. Välj sedan den kanal som innehåller pärlorna som Källa kanal och som Target kanal välj kanal (s) utan pärlor. För Duplicate som transformationer använder Ersätt alla transformationer och tryck på OK. De transformationer sedan kopieras till alla andra kanaler och sparas i XML. Om du vill se de nya förändringarna i ViewSetup Explorer, starta om Multi återuppbyggnad Application.

begränsningsram

Sammansmältningen av flera vyer är beräknings mycket intensiv. Men stora bilder typiskt förvärvas för att rymma inte bara provet, men också pärlor runt den. När registreringen parameterns extraheras från pärlorna, är de inte längre användbara som en del av bilden. Därför, för att öka effektiviteten i fusion, bör endast de delar av bildstaplar som innehåller provet smält samman. En region av intresse (avgränsande box) bör definieras för att innehålla provet och så lite av det omgivande agaros som möjligt. För exemplet i figur 2 ett vägt genomsnitt fusion på hela volymen med 2229 × 2136 × 2106 px skulle kräva 38,196 MB RAM, medan med en markeringsramen volymen minskas till 1634 × 1746 × 1632 px och minneskraven minskar till 17,729 MB.

Innehållsbaserad multiview fusion

Utmaningen i fusing multiview data är att åsikterna slutar vanligtvis abrupt och inte innehåller samma bildkvalitet för samma voxlar. Enkel medelvärdes av åsikter skulle därför leda till blandnings artefakter och onödig bildförsämring. Innehållsbaserad multiview fu sionen tar båda dessa problem i beaktande. Först blandar det olika vyer där en bild slutar och den andra börjar och andra bedömer den lokala bildkvalitet och tillämpar högre vikter till högre bildkvalitet i fusions 21. Jämfört med en enda anser att det är en förbättring av upplösningen i z med en liten försämring av signalen i xy (Figur 2E-H, figur 5A-D).

Multiview deconvolution

Multi avfaltning är en annan metod för att uppnå fusion av vyerna. Med denna metod också PSFS av de olika synpunkter beaktas i syfte att utvinna den bild som har faltas av optiken i mikroskop. Denna metod drastiskt förbättrar bildkvaliteten genom att avlägsna oskärpa och öka upplösning och kontrast av signalen 31 (Figur 2C-D, figur 2I-J, Figur 5E-G, Movie 3).

ve_content "> Deconvolution är beräknings mycket intensiv (se tabell 1), vilket med hjälp av en GPU för bearbetning ökar hastigheten på denna process. Det kan också vara nödvändigt att utföra avfaltning på ner samplade data. För ned prov, använd Fiji> Multi återuppbyggnad > Gruppbearbetning> Verktyg> tillämpa Transformationer. Detta kommer att gälla en ny transformation modell på de åsikter som kommer att sparas i XML-fil.

Hdf5 filformat för BigDataViewer och BigDataServer

Den BigDataViewer 33 möjliggör enkel visualisering av terabyte-storlek data. Hur man styr BigDataViewer sammanfattas i tabell 2. En screencast av den grundläggande hanteringen av programmet finns även som ett komplement i sin ursprungliga publikation 33. Den BigDataViewer är centrerad på en XML-fil, som innehåller metadata och en hdf5 fil som innehåller bilddata. Bilddata är present i hdf5 i multipla upplösningsnivåer i 3D-block. De multipla upplösningsnivåer möjliggör visualisering av data snabbare med lägre upplösning, innan full upplösning är laddad. Enskilda block är endast laddas in i minnet när det behövs. Således tillåter hdf5 bildformat direkt och snabb visualisering av data via BigDataViewer 33. Det snabbar också upp bearbetning eftersom laddningen av filerna utförs mer effektivt. Därför rekommenderar vi spara om datamängden i detta format, även om det inte är absolut nödvändigt för behandlingen. För ytterligare förklaring av dataformatet, se länk 3 . Dessutom kan datamängderna delas med medarbetare eller allmänheten med hjälp av BigDataServer 33 ( länk 6 ).

effekt
nyckel-
F1 visar Hjälp med en kort beskrivning av BigDataViewer och dess grundläggande funktion
<> Eller mushjulet rörelse i z
upp och ner pil zooma in och ut
högerklicka och dra förflyttar provet i betraktaren
vänster klicka och dra roterar prov runt markören
reglaget längst ner på betraktaren eller Tab och vänster eller höger pil flyttar på tidsaxeln
dessutom trycka skift snabbare rörelse eller rotation längs någon axel
x och sedan vänster och höger pil roterar kring x-axeln
y och sedan vänster och höger pil roterar kring y-axeln
z och sedan vänster och höger pil roterar runt z-axeln
skift och x orienterar vy längs x-axeln
skift och y orienterar vy längs y-axeln
skift och z orienterar vy längs z-axeln
jag växlar mellan de olika interpole lägen (dvs. närmaste granne och Trilinjär)
s eller Inställningar> Ljusstyrka och kontrast modifierar färgen på kanaler, ljusstyrka och kontrast
F6 eller Inställningar> Synlighet och gruppering ändrar de visade grupperna möjliggör gruppering till liggande olika grupper och ringa grupperna via siffertangenterna
F10 eller Verktyg> Spela in film förvärvar en tidsserie av den visade skiva

Tabell 2: Big Data Viewer.

3. Begränsningar av den beskrivna genomförandet av LSFM

låg genomströmning

I en typisk LSFM experiment endast ett prov per experiment avbildas. Ändå vår erfarenhet, en hel del användbar information kan extraheras från den enda prov. Hög genomströmning avbildning av flera embryon har nyligen gjorts i hemmet byggt LSFM uppställningar 46-48, men typiskt på bekostnad av frihet prov positionering och rotation.

Otillräcklig penetration djupt in i vävnader

Även om zebrafiskembryon är genomskinliga, är den erhållna bildkvaliteten försämras snabbt vid avbildning djupare i vävnaden på grund av spridning och absorption. Delvis är detta en effekt av spridning och absorption av den emitterade fluorescensen av provet och kan inte rättas till i den aktuella installationen. En annan källa till den ojämna bildkvaliteten är oregelbunden belysning. Than lätt ark infaller från vänster eller höger sida och alla föremål i dess väg bryta det, vilket resulterar i rand artefakter och oskärpa. Den dubbla sidiga belysning och multiview fusion kan minska artefakterna i den slutliga bilden. Slutligen tenderar bildkvaliteten att vara något sämre mot kanten av synfältet på grund av den naturliga geometrin hos det ljus arket, som blir tjockare mot kanterna.

Begränsad kemisk manipulation

Användningen av läkemedel eller inhibitorer är utbredd i zebrafisk forskning. I detta mikroskop användning av droger är begränsad, på grund av den stora volymen av provkammaren och hänsyn till andra användare av instrumentet, som delar samma kammare. Använda en extra kammare tillägnad drogexperiment kan lösa det här problemet. delvis fylla kammaren med glaspärlor minskar den vätskevolym som krävs.

ingen photomanipulation

Currently det finns ingen möjlighet till lokaliserad optisk behandlig som photoconversion, eller laserablation i detta mikroskop. Ändå kan hembyggda inställningar användas för sådana specifika tillämpningar.

4. betydelse och framtida tillämpningar

LSFM är den bästa metoden hittills tillgänglig för snabb avbildning av stora volymer av levande embryon. De flesta av experimenten tänkbara på ett konfokalt mikroskop kan också utföras på en ljus ark mikroskop med ovannämnda fördelarna. I fallet med avbildning av ögonens utveckling, är hastigheten på LSFM inte den avgörande parametern. Istället låg fototoxicitet och flexibilitet i prov placering är avgörande fördelar.

De LSFM uppgifter har en hög SNR, vilket bidrar till att uppnå goda deconvolution resultat och är också bra för automatiserad bildanalys och spårning objekt. Sammanfattningsvis är LSFM ett bra verktyg för att generera mätbara uppgifter om embryonal utveckling och Overall cell och vävnadsegenskaper för efterföljande modellering och fysiska beskrivningar av processerna i fråga.

Disclosures

Offentliggörandet av denna video-artikeln stöds av Zeiss.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose Roth 6351.1
Low melting point agarose Sigma A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) Sigma E10521
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 Millipore (Estapor) 80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries Brand 701904 sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries Brand 701932 sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55 Dumont 0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes Becton Dickinson 300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes Becton Dickinson 397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration
http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer http://fiji.sc/BigDataServer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (5), 327-339 (2014).
  2. Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49, (7), 555-569 (2011).
  3. Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340, (6137), 1234168-1234168 (2013).
  4. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  5. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170, (Pt 3), 229-236 (1993).
  6. Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6, (11-12), 920-928 (2012).
  7. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12, (1), 23-26 (2015).
  8. Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998-1257998 (2014).
  9. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  10. Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360, (1), 129-141 (2015).
  11. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. Elsevier Inc. 193-215 (2014).
  12. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, (11), 2361-2361 (2014).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, (17), 3242-3247 (2012).
  14. Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68, (2), 377-385 (2011).
  15. Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4, (1-2), 122-134 (2010).
  16. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  17. Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (43), 17708-17713 (2011).
  18. Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. 028308 (2015).
  19. Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11, (9), 951-958 (2014).
  20. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7, (6), 418-419 (2010).
  21. Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12, (1), 30-34 (2015).
  23. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (10), (2011).
  24. Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. (2013).
  25. Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. 1-11 (2013).
  26. Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10, (7), 598-599 (2013).
  27. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10, (7), 599-600 (2013).
  28. Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136, (13), 2165-2175 (2009).
  29. Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32, (2), 203-219 (2015).
  30. Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
  31. Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11, (6), 645-648 (2014).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, (7), 676-682 (2012).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12, (6), 481-483 (2015).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).
  35. Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9, (7), 717-720 (2012).
  36. Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24, (6), 381-395 (1981).
  37. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, (1), 2 (2006).
  38. Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23, (7), 2655-2664 (2003).
  39. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
  40. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, (22), 4406-4414 (2014).
  41. Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9, (3), 575-585 (2014).
  42. Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
  43. Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. Available from: http://arxiv.org/abs/1507.08575 (2015).
  44. Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10, (11), 1679-1696 (2015).
  45. Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
  46. Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6, (11), 4447-4456 (2015).
  47. McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23, (12), 16142-16153 (2015).
  48. Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5, (6), e01751-14-8 (2014).

Comments

1 Comment

  1. How to find the distances

    1. between the illumination objective and sample
    2. between the detective objective and sample

    There is a maximum and a minimum image distance for Gaussian beam, how to find that one?

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Nava S.
    April 16, 2019 - 9:12 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics