Ved hjelp av lys Sheet Fluorescensmikroskopi til bilde Sebrafisk Eye Development

* These authors contributed equally
Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Icha, J., Schmied, C., Sidhaye, J., Tomancak, P., Preibisch, S., Norden, C. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. J. Vis. Exp. (110), e53966, doi:10.3791/53966 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Morphogenesis er prosessen som former embryoet og sammen med vekst og differensiering driver ontogeny fra et befruktet egg inn i en moden flercellet organisme. Morfogenetiske prosesser i løpet av dyr utvikling kan analyseres best ved avbildning av intakte levende eksemplarer 1-3. Dette er fordi en slik helhet embryo bildebehandling bevarer alle de komponentene som driver og regulerer utvikling inkludert graderinger av signalmolekyler, ekstracellulære matrise, blodkar, innervation samt mekaniske egenskapene til omkringliggende vev. Å bygge bro over skalaer, der morphogenesis oppstår, de raske subcellulære hendelser må være fanget på en liten tidsskala i sammenheng med utviklingen av hele vev i løpet av timer eller dager. For å oppfylle alle disse krav, er en moderne gjennomføring 4 i den ortogonale plan belysning mikroskop 5 utviklet. Opprinnelig ble det kåret til Selektiv Plane Illumination Mikroskopi (SPIM) 4; nå en altomfattende begrep Lys Sheet Fluorescensmikroskopi (LSFM) brukes vanligvis. LSFM gjør bildebehandling med høy tidsoppløsning, mens indusere mindre fototoksisitet enn laserskanning eller en roterende disk confocal mikroskoper 6,7. I dag er det allerede mange implementeringer av den grunnleggende lys ark belysning prinsipp, og det har blitt brukt til bilde et stort utvalg av prøver og prosesser tidligere utilgjengelige for forskere 8-11.

Vi vil først trekke frem flere viktige fordeler med LSFM over konvensjonelle konfokalmikroskopi tilnærminger:

For å skaffe meningsfulle resultater fra levende bilde mikroskopiske eksperimenter, er det viktig at den observasjonen bare minimalt påvirker prøven. Men mange organismer inkludert sebrafisk er svært utsatt for laserlys eksponering, noe som gjør det vanskelig å avbilde dem i en konfokal mikroskop med høy tidsoppløsning uten fototoksisitet effects som stoppet eller forsinket utvikling 6,7. LSFM er i dag den fluorescens avbildningsteknikk med minst forstyrrende effekter på prøven 7. Siden det tynne laserlys ark lyser bare den del av prøven som avbildes på et bestemt tidspunkt, er det lett arket mikroskop ved bruk av fotoner meget effektivt. Derfor lar lite lys eksponering for lengre tidsforsinkelse observasjoner av sunnere prøver, f.eks 12-17. Videre, takket være den minimale invasivitet av LSFM, antallet av ervervede bilder er ikke lenger bestemt av hvor mye lys som prøven kan tolerere, men snarere av hvor mye data som kan behandles og lagres.

Langs de samme linjene holde prøven i nærheten fysiologiske forhold, kommer LSFM med alternative prøvemontering strategier godt egnet for live embryoer. I LSFM teknikker, blir embryoene vanligvis innleiret i en tynn kolonne med lav prosentandel agarose. den mounting inn i agarose sylindere gjør det mulig for den fullstendige frihet for rotasjon, slik at prøven kan observeres fra den perfekte vinkel (i LSFM referert til som syn) og fra flere synspunkter samtidig. Den Multi bildebehandling og påfølgende Multi fusjon er gunstig spesielt for store, spredning prøver og tillater å fange dem med høy, isotrop oppløsning. Et sammendrag av andre mulige LSFM montering strategier kan bli funnet i den offisielle mikroskop bruksanvisningen, i kapittelet om prøveopparbeidelse skrevet av laboratoriet av E. Reynaud. Det er en anbefalt lese, spesielt hvis målet er å avbilde forskjellige prøver som er beskrevet her.

Bildet oppkjøpet i LSFM er bredt felt, kamerabasert, i motsetning til laserskanning confocal mikroskop. Dette resulterer i et høyere signal-til-støy-forhold (SNR) for ervervet bilder og kan være svært hurtig (titalls til flere hundre bilder per sekund). Den høye følsomheten LSFM muliggjør avbildning av svakt fluorescerende SAMP videreles, som transkripsjonsfaktorer uttrykt ved endogene nivåer 18 eller, i nær fremtid, endogene proteiner merket hjelp CRISPR / Cas9. Den høye SNR er også viktig for vellykket nedstrøms bildeanalyse. Den høye hastigheten er nødvendig ikke bare for å fange opp raske intracellulære prosesser, men også for å avbilde hele embryoet fra flere synspunkter hurtig nok. En sømløs sammensmelting av flere visninger kan bare oppnås dersom den observerte fenomenet ikke endres under oppkjøpet av disse flere z stabler fra separate visninger.

Fordelene med LSFM ikke vanligvis kommer på bekostning av bildekvaliteten. Den laterale oppløsning på LSFM er litt dårligere enn oppløsningen til et konfokal mikroskop. Dette skyldes at deteksjons målene som brukes i LSFM har lavere numerisk apertur (vanligvis 1,0 eller mindre) sammenlignet med 1,2 til 1,3 av vann eller silisium nedsenking mål på standard konfokale oppsett. I tillegg, på grunn av det brede betraktningsfeltets deteksjon i LSFM (absence av et pinhole), er det mer ut-av-fokus lys sammenlignet med et konfokalt mikroskop. Mengden av ut-av-fokus lett bestemmes av lyset platetykkelse. Ikke desto mindre er disse ulemper kompensert av den høyere SNR i LSFM. I praksis fører dette til liknende kvalitetsbilder sammenlignet med for eksempel roterende disk confocal oppkjøpet 15. Derfor gjør denne pålitelige utvinning av funksjoner som cellemembraner eller kjerner, for eksempel for celle avstamning sporing 15,19.

Den aksiale oppløsning av LSFM er bestemt, i tillegg til deteksjon objektiv, av lyset platetykkelse. Den aksiale oppløsning på kan LSFM i noen tilfeller overgå oppløsning på confocal mikroskoper. Først forbedringen i oppløsningen kommer når lyset ark er tynnere enn den aksielle oppløsning av deteksjons objektiv, som typisk forekommer for store prøver avbildes med en lav forstørrelse objektiv. Den andre måten, hvordan LSFM kanACHieve bedre aksial oppløsning, er det Multi fusjon, hvor den høye oppløsning xy informasjon fra forskjellige synspunkter er kombinert inn i en bildestabel. Den resulterende fusjonerte stabel har en isotrop oppløsning som nærmer seg verdiene av oppløsning i sideretning 20,21. Strategien for å registrere flere visninger på hverandre er beskrevet i denne artikkelen er basert på bruk av fluorescerende polystyrenkuler som forvaltnings markører innebygd i agarose rundt prøven 20,21.

Som et resultat av den LSFM kommersialisering, er denne teknikken nå tilgjengelig for et bredt fellesskap av forskere 22. Derfor er motivasjonen for å skrive denne protokollen er å gjøre denne teknologien tilgjengelig for utviklings biologer mangler praktisk erfaring i LSFM og for å få disse forskerne begynte å bruke denne teknologien med sine prøver. Vår protokollen bruker den kommersielle lys ark mikroskop, som utgjør et konseptuelt enkel mikroskop thatten er lett å betjene. Vi vil i tillegg nevne andre nylige protokoller for avbildning sebrafisk med hjemmebygde LSFM oppsett, som kan være egnet til å svare på bestemte spørsmål 23-25. En annen oppføring alternativ til LSFM er de åpne plattformer 26,27, som bruker open access prinsipper for å bringe lys ark mikroskopi til et større fellesskap. Dokumentasjonen av både maskinvare og programvare aspekter kan bli funnet på http://openspim.org og https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

I denne protokollen, bruker vi teleost sebrafisk som modellsystem for å studere utviklingsprosesser med LSFM. Morphogenesis av sebrafisk øyet er et eksempel som understreker mange av fordelene med LSFM. LSFM har allerede blitt brukt i det siste for å undersøke utviklingen øye killi 28 og i sebrafisk 29,30. I den tidlige fasen av øyet utviklingen er det komplisert å orientere embryo riktig for konvensjonell mikroskopi,som den voluminøse eggeplomme tillater ikke embryo å ligge på siden med sine øyne mot målet. Men med LSFM montering til en agarosekolonne, prøven kan reproduserbart posisjonert. I tillegg, under overgangen fra optikken vesikkel til den optiske koppen trinnet gjennomgår øyet store morfogenetiske rearrangementer ledsaget av vekst, som krever å fange et stort z stabel og et stort synsfelt. Også for disse utfordringene LSFM er overlegen til konvensjonell confocal bildebehandling. Prosessen med optisk cup formasjon er tredimensjonal, derfor er det vanskelig å forstå og visualisere utelukkende av bildebehandling fra én visning. Dette gjør Multi bildebehandling med isotrop oppløsning gunstig. Etter optisk cup formasjon, blir netthinnen stadig mer følsom for lasereksponering. Dermed blir lav fototoksisitet forbundet med LSFM er en stor fordel for langsiktig avbildning.

Her presenterer vi en optimalisert protokoll for avbildning av en til tre dager gamle sebrafisk embryoer ennd larver med fokus på øyet utvikling. Vår metode gjør opptak av tids-lapse filmer som dekker opp til 12-14 timer med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Viktigere, viser vi også en rørledning for databehandling, som er et viktig skritt i LSFM, som denne teknikken alltid genererer store datasett, ofte i terabyte-serien.

Protocol

MERK: All dyr arbeidet ble utført i samsvar med europeiske union (EU) direktiv 2011/63 / EU og den tyske dyrevernloven. Protokollen er ment å bli fulgt uten avbrudd, fra monterings til avbildning av prøven. Avhengig av praktisk erfaring, vil det ta 2-3 timer å starte en time-lapse eksperiment. Databehandling er ikke inkludert i denne tiden beregningen. Alt materialet som kreves for forsøket kan bli funnet i sjekklisten av materialet som trengs før du starter som er gitt som et supplerende dokument. Bruk pulverfrie hansker under trinn 1, 2, 3 og 4. For trinn 2, 3, 4 og 5 i protokollen også henvise til den offisielle mikroskop bruksanvisningen.

1. Forberedende arbeid før Imaging Experiment

  1. Fluorescent Bead lagerløsning
    1. For denne protokollen, bruker 500 eller 1000 nm diameter polystyrenkuler (merket med rød emitting fluorescerende fargestoff). Arbeids fortynning av kulene er 1: 4,000. Først vortex perlen stamløsning i 1 min. Fortynne 10 mL av perler i 990 mL av DDH 2 O. Oppbevar løsningen i mørket ved 4 ° C og bruk av denne 1: 100 fortynning som stamoppløsning for ytterligere fortynning på 1:40.
  2. Forbereder løsning for prøvekammeret
    1. I et 100 ml begerglass blanding 38,2 ml E3 medium uten metylenblått, 0,8 ml av 10 mM N -phenylthiourea og 1 ml 0,4% MS-222. Det er fordelaktig å bruke filtrert E3 medium for å unngå små partikler av støv eller uoppløste krystaller som flyter i prøvekammeret senere.
  3. Fluorescent Fish Embryo Selection
    1. I dagene før forsøket, forberede embryoer uttrykker fluorescerende proteiner. Rett før forsøket, sortere embryoene under fluoriserende stereoskop for ønskelige styrke av det fluorescerende signal. Ta 5-10 friske fostre og dechorionate dem ved hjelp av pinsett.
      MERK: Denne protokollen er optimalisert for 16-72 timer gamleembryoer.

2. Sette opp Sample Chamber

  1. Montering av tre Chamber Windows
    1. Det er 4 vinduer i prøvekammeret, en for formålet og tre som skal tettes med Dekkglass (diameter 18 mm, valgt tykkelse 0,17 mm). Lagre disse Dekk i 70% etanol. Tørk dem rene før bruk med eter: etanol (1: 4).
    2. Sett dekk inn vinduet med fin pinsett og sørge for at den passer inn i minste sporet. Dekk den med 17 mm gummi diameter O-ring og skru på belysning adapterring ved hjelp av kammeret vinduet verktøyet. Gjenta prosessen for de to andre vinduer.
  2. Feste Gjenværende Chamber Deler
    1. Skru adapter for en passende objektiv inn i fjerde gjenværende side av kammeret. Sett i 15 mm diameter O-ring inn i sentrum av adapteren.
    2. Skru den hvite Luer-Lock-adapter i nedre høyre åpningen i chamber og grå drain kontakten i øvre venstre åpning. Blokker alle de tre gjenværende hullene med de sorte blindplugger.
    3. Fest Peltier blokken og metallet svalehaleformede glide bunnen av kammeret ved hjelp av en sekskantnøkkel. Fest slangen med 50 ml sprøyte til Luer-Lock adapter. Sett temperatursonden inn i kammeret.
  3. Innsetting av Mål og Chamber i mikroskopet
    1. Sjekk under stereoskop at alle målene er rene. Bruk 10X / 0.2 belysning mål og Plan-Apochromat 20X / 1.0 W deteksjon mål og sørge for at dens brytningsindeks korreksjon krage er satt til 1,33 for vann. Skru påvisning målet i mikroskop, samtidig som belyser målene dekket.
    2. Fjern den beskyttende plastlokk som dekker belyse mål. Skyv kammeret i mikroskopet og stram den med festeskruen.
    3. Koble temperaturen provære og Peltier-blokk med mikroskop.
      Merk: De to rørene som sirkulerer kjølevæske for Peltier-blokken er kompatible med begge kontaktene. De danner en fungerende krets uten hensyn til orienteringen av forbindelsen.
    4. Fylle kammeret via sprøyte med oppløsningen fremstilt i trinn 1,2 opp til den øvre kant av kammer vinduene. Sjekk at kammeret ikke lekker.
    5. Start mikroskop, inkubasjon og kontrollerende og lagring datamaskiner. Start mikroskop-operativsystemer og sett inkubasjon temperaturen til 28,5 ° C.
      MERK: Det vil ta en time å fullstendig likevekt. Forbered prøven i mellomtiden.

3. Prøvepreparering

  1. Klar Agarose Mix
    1. 15 min før av agarosen blandingen, smelter en 1 ml aliquot av 1% lavt smeltepunkt agarose (oppløst i E3 medium) i en varmeblokk er satt til 70 ° C. Når agarose er helt molti, overfør 600 pl inn i en frisk 1,5 ml rør, tilsett 250 ul av E3-medium, 50 ul 0,4% MS-222 og 25 ul av virvles vulst stamløsning.
      MERK: Det gjør 925 mL av miksen, mens ytterligere 75 ul er beregnet for flytende lagt til senere sammen med embryoer.
    2. Holde røret i en andre varmeblokk ved 38-40 ° C, eller at den agarose er veldig nær sin geleringspunktet før setter eksempel embryoer inn i den.
  2. Montering av embryo
    1. Ta fem glasskapillærene i 20 ul volum (med et svart merke, ~ 1 mm indre diameter) og sette inn målrettet Teflon tippe stempler inn i dem. Skyv stempelet gjennom kapillæret slik at Teflon spissen er på bunnen av kapillaren.
    2. Overfør fem embryoer (et tall som kan monteres på en gang) med et glass eller plast pipette inn i røret av virvles 37 ° C varm agarose mix.
      MERK: Prøv å bære over minimum væskevolum sammen viddh embryoene.
    3. Sett kapillær inn i blandingen og suge en embryo inne ved å trekke stempelet opp. Sørg for at leder av embryoet inn i kapillær før halen. Unngå luftbobler mellom stempelet og prøven. Det bør være ± 2 cm av agarose ovenfor embryoet og ± 1 cm under den. Gjenta for de resterende embryoer.
    4. Vent til agarosen stivner helt, noe som skjer i løpet av få minutter, og deretter lagres prøvene i E3 medium, ved å stikke dem til veggen i et begerglass med leire eller tape. Bunnåpningen av kapillaren bør bli hengende fritt i oppløsningen, slik at gassutveksling til prøven.
      MERK: En lignende protokoll til avsnittene 3.1 og 3.2 kan også finnes på OpenSPIM wikiside http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

4. Prøve Posisjonering

  1. Eksempel Holder Assembly
    1. Sett 2 plasthylser av riktig størrelse (svart)mot hverandre inn i prøveholderen stammen. Deres slit sidene har til ansikt utad. Fest klemmen skruen løst ved å dreie den 2-3 runder. Sett kapillær gjennom klemskruen og skyv den gjennom holderen til den sorte fargen bandet blir synlig på den andre siden. Unngå å berøre stempelet.
    2. Stram klemmen skruen. Skyv overflødig 1 cm av agarose under embryo ut av kapillær og klippe den. Sett stangen inn i prøveholderen platen.
    3. Bekrefte i programvaren som objektbordet er i lastestilling. Bruk sporene å gli hele holderen med prøven vertikalt ned i mikroskopet. Slå den, slik at de magnetiske holderen plate låser på plass.
  2. Finne Capillary
    1. Fra nå av, kontrollere prøven posisjonering av programvaren. I Finn-kategorien velger Finn kapillær alternativet og posisjonere kapillær i x, y og z i fokus like over deteksjons objektetive linse. Bruk grafisk representasjon i prøven navigator for veiledning.
    2. Skyv embryo forsiktig ut av kapillær før det er foran pupillen av deteksjons objektiv.
      MERK: 'sted kapillære' er det eneste trinn i den gjenværende protokollen, i løpet av hvilken den øvre lokk av mikroskopet bør åpnes og prøven skjøvet ut.
  3. Finne Sample
    1. Bytt til «Lokal sample" alternativet, og på 0,5 zoom bringe sebrafisk øyet inn til sentrum av synsfeltet. Roter embryo, slik at lyset arket ikke vil passere gjennom alle høyt brytnings eller absorberende deler av prøven før den når øyet. Likeledes må den emitterte fluorescensen en klar vei ut av prøven. Klikk på "Set Utgangsposisjon".
    2. Åpne frontdekselet av mikroskopet og sette plastdekselet med en 3 mm åpning på toppen av kammeret for å unngå fordampning.
      MERK: Hvis væskenivået synker underbildenivå, vil forsøket bli kompromittert.
    3. Sjekk hjerterytme av embryoet som en proxy for generelle helse. Hvis det er for treg, bruke en annen prøve (sammenlignet med ikke-montert kontroller, bestemte verdier avhenge utviklingsstadiet). Bytt til endelig zoom innstillingen og justere plasseringen av embryo.

5. Sette opp en flerdimensjonal Acquisition

  1. anskaffelses~~POS=TRUNC Parametere
    1. Bytt til fanen Acquisition ". Definer lysbanen inkludert laserlinjer, gjenkjenning objektiv, laser blokkerer filteret, stråledeler og kameraene.
    2. Aktiver boksen pivot skanningen. Definer de andre oppkjøps innstillinger som bitdybde, bildeformat, lys platetykkelse og velge ensidig belysning.
    3. Trykk 'Kontinuerlig' og avhengig av intensiteten av den oppnådde avbildning endre lasereffekten og kameraeksponeringstiden.
      MERK: For å justere alle bildeinnstillingene bruker less lasereffekt (0,5% av 100 mW laser, 30 msek eksponeringstid), enn for det faktiske forsøket for å unngå unødvendig skade bildet til prøven.
  2. Lys Sheet Adjustment
    1. Bytt til "Dual Sided Illumination 'og aktivere "Online Dual Side Fusio'n boksen. Start 'Lightsheet Auto-justere veiviser ". Følg instruksjonene trinn for trinn.
      MERK: Veiviseren flytter lyset ark i fokalplanet av deteksjons objektiv, og sørger for at det ikke er skråstilt og dens midje er i midten av synsfeltet. Etter å ha fullført den automatiske justeringen, er posisjonene til venstre og høyre lys ark automatisk oppdatert i programvaren. En forbedring i bildekvalitet skal nå være synlig. Aktiver "Z-stack" boksen.
    2. Sjekk lys justering arket ved å inspisere symmetrien i punktspredefunksjon (PSF) gitt av fluoriserende perler i xz og yz orto utsikt. Hvis det ikke er noent symmetrisk, manuelt justere lyset arket parameter posisjon opp og ned til å oppnå en symmetrisk timeglassformet PSF (figur 1A).
  3. Flerdimensjonale Anskaffelses Innstillinger
    1. Definer z-stack med "First Slice 'og' siste stykket 'alternativer og sette z skrittet til en mikrometer.
      MERK: lys arket i denne mikroskop er statisk og z snitte oppnås ved å bevege prøven gjennom. Bruk alltid "Kontinuerlig Drive alternativet for raskere kjøp av z-stabler.
    2. Aktiver 'Time Series "boksen. Definere det totale antall av tids punkter og intervallet mellom dem.
    3. Aktiver 'Multiview "boksen. Legg til gjeldende visning i Multilisten, der x, y, z og vinkelinformasjon er lagret. Bruk scenen kontrolleren til å rotere kapillær og definere de andre ønskede utsikten. Sett opp en z-stack på hver visning og legge dem til i Multi listen.
      MERK:programvare sorterer utsikt i et serie mote, slik at kapillær er slått ensrettet, mens bildet er ervervet.
  4. Drift korreksjon og Starte Experiment
    1. Når oppkjøpet satt opp er fullført, må du vente 15-30 min før du starter selve eksperimentet.
      MERK: Utvalget utgangspunktet driver noen mikrometer i x, y og z, men skal slutte innen 30 min. Hvis prøven holder drivende lenger, bruke en annen prøve eller monteres igjen.
    2. Bytt til fanen 'Hold' og i 'Streaming alternativet definere hvordan dataene skal lagres, for eksempel en fil per tidspunkt eller separat fil for hver visning og kanal. Gå tilbake til fanen "Erverv", trykk "Start eksperiment 'og definere filnavnet, stedet der den skal lagres og filformatet (bruk .czi).
    3. Observer oppkjøpet av det første tidspunktet å bekrefte at alt går problemfritt. Umiddelbart fortsette registreringenog blanding av den første tidspunkt slik det er beskrevet i trinn 6 og 7, for å bekrefte at det vil være mulig å behandle hele datasettet.

6. Multi Registrering

  1. Multi Rekonstruksjon Application
    1. Ved slutten av den avbildning sesjon, overføre data fra datalagrings datamaskinen i mikroskopet til en dataprosesserings datamaskin. Bruk «Multi ReconstructionApplication '20,21,31 implementert i Fiji 32 for databehandling (figur 1B).
  2. Definer datasett
    1. Oppdater Fiji: Fiji> Hjelp> Oppdater ImageJ og Fiji> Hjelp> Oppdater Fiji. Bruk hoved ImageJ og Fiji oppdatere nettsider.
    2. Overføre hele datasettet inn i en mappe. Resultatene og mellomliggende filer av behandlingen vil bli lagret i denne mappen. Start Multi Rekonstruksjon Application: Fiji> Plugins> Multi Rekonstruksjon> Multiview Rekonstruksjon Application.
    3. Velg "definere et nytt datasett". Som type datasett velge meu alternativet "Zeiss Lightsheet Z.1 Datasett (loci Bioformats)" og skape et navn for XML-fil. Deretter velger du den første .czi fil av datasettet (dvs. fil uten indeks). Den inneholder bildedata, så vel som metadataene av opptaket.
      MERK: Når programmet åpner den første .czi fil, er metadata lastet inn i programmet.
    4. Bekreft at antallet vinkler, kanaler, belysning og observere voxel størrelse fra metadata. Ved å trykke OK, observere tre separate vinduer åpne (figur 1C): en logg vindu som viser fremdriften av behandlingen og dens resultater, den "ViewSetup Explorer" og en konsoll, og viser feilmeldinger av Fiji.
      MERK: 'ViewSetup Explorer "er et brukervennlig grensesnitt som viser hver visning, kanal og belysning og gir mulighet for valg av filer av interesse. I tillegg er den "ViewSetup Explorer 'gir mulighet for styring av alle behandlingstrinn.
    5. Velg filene som skal behandles, og trykk på høyre museknapp i utforskeren. Observer et åpent vindu med ulike behandlingstrinn (figur 1C).
    6. Ved å definere datasettet, observere at en XML-fil i mappen med data er opprettet.
      MERK: Denne filen inneholder metadata som ble bekreftet før.
    7. I øvre høyre hjørne observere to knapper 'info' og 'redde'. Ved å trykke 'info' viser en oppsummering av innholdet i XML-fil. Ved å trykke "Lagre" vil spare behandlingsresultatene.
      MERK: Mens behandling i 'Multi Rekonstruksjon Application "de ulike behandlingstrinn må lagres i XML før stengetid Fiji.

OAD / 53966 / 53966fig1.jpg "/>
Figur 1: Fler Rekonstruksjon arbeidsflyt og interesse punkt deteksjon (A) Lys ark justering basert på fluoriserende perle bildebehandling.. Systemet er justert (i midten), når perle bildet har en symmetrisk timeglass figur i XZ og YZ anslag. Eksemplene på feiljustert lys ark i begge retninger er vist på venstre og høyre. Maksimal intensitet projeksjoner av en 500 nm perle i xz, er yz og xy-aksene vist. Legg merke til at forholdet mellom intensiteten av den sentrale topp av Airy skiven (i xy) til sidelobene er større, når den lightsheet er riktig justert i forhold til feiljustert situasjon. Bilder ble tatt med 20x / 1,0 W målet på 0,7 zoom. Scale bar representerer fem mikrometer. (B) Datasettet er definert og deretter resaved inn i HDF5 format. Kulene er segmentert og deretter registrert. For en tidsserie hvert tidspunkt blir registrert på en referanse tidspunkt. Dataene er endelig smeltet inn i enenkelt isotropisk volum. (C, topp) Den ViewSetup Explorer viser forskjellige tidspunkter, vinkler, kanaler og belysning sider av datasett. (C, nedre venstre hjørne) Den BigDataViewer vinduet viser utsikten som er valgt i ViewSetup Explorer. (C, midten til høyre) Høyreklikk inn i ViewSetup Explorer åpner behandlingsalternativer. (C, høyre nedre hjørne) Fremdriften og resultatene av behandlingen vises i loggfilen. (D og E) Målet med deteksjon er å segmentere så mange interessepunkter (perler) med så lite deteksjon i prøven som mulig her vist som skjermbilder fra det interaktive perle segmentering. (D og E, øvre venstre hjørne) Inndelingen er definert av to parametre, forskjellen-of-Gaussian Verdier for Sigma 1 og Threshold. (D) Et eksempel på en vellykket påvisning med et forstørret bilde av en korrekt oppdaget perle. (E) Segmentering med for mange falske positiver og flere påvisninger av en enkelt perle. Scale bar i (C) representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Resave Datasett i HDF5 Format
    1. Du å lagre hele datasettet, velger du alle filene med Ctrl / Apple + en og høyreklikk. Deretter velger resave datasett og som HDF5.
    2. Et vindu vises med en advarsel om at alle visninger av den aktuelle datasettet vil bli resaved. Trykk ja.
      MERK: Programmet fortsetter du å lagre de .czi filene til hdf5 ved å åpne hver eneste fil og resaving de forskjellige oppløsnings nivåer av hdf5 format. Det vil bekrefte med "ferdig" ved ferdigstillelse. Resaving usually tar et par minutter per endepunktet (se tabell 1).
      MERK: Siden filene i hdf5 format kan lastes veldig fort, er det nå mulig å se den uregistrerte datasettet ved å "høyreklikke" i explorer og veksling 'skjerm i BigDataViewer (av / på)'. En BigDataViewer vindu vises med den valgte visningen (figur 1C). Kjernefunksjonene i BigDataViewer 33 er forklart i tabell 2 og http://fiji.sc/BigDataViewer.
  2. Oppdage Interessepunkter
    1. Velg alle tidspunkter med Ctrl / Apple + en og høyreklikk velg oppdage interessepunkter.
    2. Velg Difference-of-Gaussian 34 for type interesse punkt deteksjon. Siden perle-basert registrering brukes her, skriv "perler" i feltet for etiketten interessepunkter. Aktiver 'Reduser bildene før segmentering ".
    3. I det neste vinduet, observere FondetEL innstillinger. For 'underpiksel lokalisering "bruke" tre-dimensjonal kvadratisk fit' 34 og for å bestemme forskjellen-of-Gaussian verdier og radius for perle segmentering bruk "interaktiv" i i'nterest punkt spesifikasjonen '.
    4. For "downsample XY" bruke "Match Z oppløsning (mindre downsampling) 'og for' downsample Z use 1 ×. Z trinnstørrelsen er større enn xy pikselstørrelse, og dermed rett og slett ned prøvetaking xy å matche z oppløsningen er tilstrekkelig. Velg 'Compute på CPU (JAVA)'. Trykk "OK".
    5. I en pop-up vindu, velger du en visning for å teste parameterne fra rullegardinmenyen. Når view belastninger, justere lysstyrke og kontrast i vinduet med Fiji> Bilde> Juster> Lysstyrke / kontrast eller Ctrl + Shift + C Kryss av boksen "utseende for maxima (grønn)" for perle deteksjon.
    6. Observer segmentering i 'viewSetup' som grønne ringer around de påvisninger når vi leter etter maksimum og rødt for minima. Den segmentering er definert av to parametre, forskjellen-of-Gaussian verdier for Sigma 1 og terskelen (figur 1D). Juster dem til å segmentere så mange perler rundt prøven og så få falske positive oppdagelser i prøven som mulig (figur 1D). Oppdage hver perle bare en gang og ikke flere ganger (figur 1E). Etter å bestemme de optimale parametrene, trykk "ferdig".
      MERK: påvisning starter ved å laste hver enkelt visning av tidspunkt og segmentere perlene. I loggfilen, sender programmet antall perler det oppdages per visning. Deteksjonen bør utføres i et par sekunder (se tabell 1).
    7. Trykk lagre når mengden av påvisninger er hensiktsmessig (600 til flere tusen per view).
      MERK: En mappe vil bli opprettet i datakatalogen, som vil inneholde informasjonsn om koordinatene til de detekterte kulene.
  3. Registrer Bruke Interessepunkter
    1. Velg alle tidspunkter med Ctrl / Apple + A, høyreklikk og velg «Register bruk av interessepunkter".
    2. Bruk "rask 3d geometrisk hashing (rotasjon invariant)" for perle deteksjon som "registrering algoritme '.
      MERK: Denne algoritmen antar noen tidligere kjennskap om orienteringen og plasseringen av de forskjellige synspunkter med hensyn til hverandre.
    3. For registrering av utsikt mot hverandre, velg registrere tidspunkter individuelt 'som' type registrering '. For rentepunkter "i den valgte kanalen, bør den tidligere angitte etiketten for rentepunkter nå være synlige (dvs." perler ").
    4. I det neste vinduet kan du bruke de forhåndsinnstilte verdier for registrering. Fest den første visningen ved å velge 'Fix fliser: Fix første flisen og bruk Ikke kartlegge tilbake' (bruk dette hvis tiles er ikke faste) i "Kart tilbake fliser" -delen.
    5. Bruk en "affin transformasjon modell" med "regularisering".
      NB: Den tillatte feil for RANSAC vil være 5PX og 'betydning for en deskriptor kamp "vil være 10. For' regularisering 'bruke en" stiv modell "med en lambda på 0,10, noe som betyr at transformasjonen er 10% stiv og 90 % affine 35. Trykk OK for å starte registreringen.
      MERK: Som vist i loggvinduet, først hver visning er matchet med alle de andre visningene. Så tilfeldig utvalg konsensus (RANSAC) 36 tester korrespondanser og utelukker falske positiver. For en robust registrering, skal RANSAC verdi være høyere enn 90%. Når et tilstrekkelig antall virkelige kandidater tilsvarende mellom to synspunkter blir funnet, blir et transformasjonsmodellen beregnes mellom hver kamp med den gjennomsnittlige forskyvning i piksler. Da iterative global optimalisering er utført og alle visninger er registrert på den faste visning. Med vellykket registrering, er en transformasjon modell beregnes og vises med skalering og forskyvningen i piksler. Den gjennomsnittlige feilen skal være optimalt under en px og skaleringen av transformasjonen nær 1. Registrerings utføres i sekunder (se tabell 1).
    6. Kontroller at det ikke er noen skift mellom forskjellige visninger som observert på fine strukturer i prøven, f.eks cellemembraner. Deretter lagre transformasjon for hver visning i XML-fil.
      MERK: Nå registrerte utsikt overlapper hverandre i BigDataViewer (figur 2A) og perle bildene bør overliggende også (figur 2B).
    7. Fjern de transformasjoner ved å velge tidspunkter høyreklikk på dem og velg deretter Fjern Transformations> Siste / Nyeste Transformation.

re to "src =" / files / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>

Figur 2:. Resultatene av Multi rekonstruksjon (A) kledde registrerte utsikt, hver i en annen farge for å demonstrere overlapping mellom dem. (B) Forstørret visning som viser overlapping av de PSFs perler fotografert fra ulike visninger. (C) Nærbilde av en perle etter fusjon, er det PSF et gjennomsnitt av de ulike visningene. (D) PSF av den samme vulsten som i (C) for etter Multi dekonvolvering som viser at PSF kollapser inn i et enkelt punkt. (E) xy-delen og (F) yz seksjon av et enkelt riss av en optisk vesikkel, hvor membranene er merket med GFP viser degradering av signalet i z dypere i vevet. (G) xy delen og (H) YZ del av den samme utsikten etter vektet gjennomsnitt sammensmelting av 4 visninger ca 20 grader fra hverandre med litt flere Degraded xy oppløsning samlet, men økt z-oppløsning. (I) xy-delen og (J) YZ-delen av de samme data etter Multi dekonvolvering, som viser en betydelig økning i oppløsning og kontrast av signalet både i xy og i z. Bilder i (EJ) er enkle optiske skiver. Scale bar representerer 50 mikrometer (A, B, EJ) og 10 mikrometer (C, D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Time-lapse Registrering
    1. Velg hele tiden forfalle, høyreklikk og velg 'Registrer deg med interesse Points "for å stabilisere time-lapse over tid.
    2. I "Grunnleggende Registrering parametervinduet velger Kamp mot en referanse tidspunkt (ingen global optimalisering) for type registrering '. Ke ep t han andre innstillinger på samme måte som i registreringen av de enkelte tidspunkter.
    3. I det nestevinduet velger tidspunktet for å bli brukt som en referanse, typisk en tids punkt i midten av time-lapse. Kryss av boksen "vurdere hver endepunktet som rigid enhet", siden de individuelle visninger innen hvert tidspunkt allerede er registrert på hverandre.
    4. Kryss av boksen for 'Vis tidsserie statistikk'. De andre registreringsparametere forblir som før inkludert regularisering. Trykk på OK.
      MERK: I loggvinduet, vil det samme utgang vises som i det enkelte tidspunkt registrering. Hvis registreringen for de enkelte tidspunkter var vellykket og robust, er RANSAC nå 99-100% og gjennomsnittlig, minimum og maksimum feil er vanligvis under 1 px. Lagre denne registreringen før du fortsetter.

7. Multi Fusion

MERK: De resulterende transformasjoner fra registreringsmåten blir brukt til å beregne en smeltet isotrop stabel ut av flere visninger. Dette stack has økt antall z skiver sammenlignet med de opprinnelige dataene, fordi z avstanden er nå lik den originale pikselstørrelsen i xy. Fusjonen kan utføres enten ved en innholdsbasert Multi fusjon 21,31 eller Bayesian-baserte Multi deconvolution 31, som begge er implementert i Multioppbyggingen programmet.

  1. markerings~~POS=TRUNC
    MERK: Fusion er en beregningsmessig kostbar fremgangsmåte (se tabell 1), og dermed redusere mengden av data ved å definere en markeringsramme øker hastigheten av behandlingen signifikant.
    1. Velg alle tidspunkter høyreklikk og velg Definer 'markeringsramme ". Bruk "Define med BigDataViewer 'og velge et navn på markeringsrammen.
    2. Flytt glidebryteren for 'min' og 'max' i hver akse for å bestemme regionen av interesse, og trykk deretter på 'OK'. Parametrene for markeringsrammen vil bli vist.
      MERK: markeringsrammen vil inneholde alt innenden grønne boksen som er belagt med en gjennomsiktig magenta lag.
  2. Content-baserte Multi Fusion
    MERK: Innholdsbasert Multifusjons 21 tar bildekvalitetsforskjeller over stabelen (dvs. nedbrytning av signalet i z) i betraktning, og gjelder høyere vekter for bedre bildekvalitet stedet for å bruke en enkel midling.
    1. Velg tidspunkt (er) som skal smeltes i "ViewSetup Explorer", høyreklikk og velg "Bilde Fusion / Deconvolution '.
    2. I bilde Fusion-vinduet, velg 'veid gjennomsnitt fusion "fra rullegardinmenyen, og velg" Bruk forhåndsdefinerte markeringsramme for markeringsramme ". For produksjonen av smeltet bilde velger 'Tilføy til gjeldende XML-prosjektet ", som skriver nye hdf5 filer til de allerede eksisterende hdf5 filer og lar med de registrerte sammensmeltede utsikten og smeltet bilde sammen. Trykk "OK".
    3. Så i "Pre-definere markeringsramme & #39; pop up vindu velger du navnet på den tidligere definerte markeringsrammen og trykk "OK".
    4. Observer parametrene av markeringsrammen i neste vindu. For rask fusjon, gjelder en ned prøvetaking i smeltet datasett.
      MERK: Hvis smeltet stabelen er over en viss størrelse, vil programmet anbefale å bruke en mer minne effektiv 'ImageLib2 containe'r. Bytt fra 'ArrayImg' til 'PlanarImg (store bilder, lett å vise) eller CellImg (store bilder)' container, som tillater behandling av større data. Ellers bruker de forhåndsdefinerte innstillinger og bruke "blending og innholdsbasert fusion". Fortsett ved å trykke på "OK".
    5. Observer hdf5 innstillingene i det neste vinduet. Bruk forhåndsdefinerte parametere og starte fusjonsprosessen. Pass på at Fiji har tildelt nok minne i Rediger> Valg> Minne og tråder.
  3. Multi Deconvolution
    MERK: Multi Deconvolution 31 er anothennes type Multi fusjon. Her tillegg til fusjons, blir PSF av bildebehandlingssystemet tas i betraktning for å dekonvolvere bildet og utbyttet øket oppløsning og kontrast av signalet (sammenlignet i figur 2C-J, figur 5 og film 3).
    1. Velg tidspunkt (er) som skal dekonvolveres, høyreklikk og trykk "Bilde Fusion / Deconvolution '.
    2. Velg "Multi Deconvolution" og bruk "den forhåndsdefinerte markeringsrammen og legge til gjeldende XML-prosjektet". Velg markeringsrammen og fortsette.
      MERK: De forhåndsdefinerte parametere for deconvolution er et godt utgangspunkt. For første testbruk '20 gjentakelser 'og vurdere virkningen av deconvolution ved hjelp av "Debug mode'. Endelig satt den beregne på i 512 x 512 x 512 blokker.
    3. I det neste vinduet kan du bruke de forhåndsdefinerte innstillinger. Sett "debug modus 'for å vise resultatene hver" 5 iterasjoner ".
      MERK: Utgangen fra dekonvolveringen er 32-bits data, men BigDataViewer for tiden bare støtter 16-bits data. For å legge produksjonen av deconvolution til eksisterende hdf5 datasettet, har det å bli konvertert til 16-bit.
    4. For konvertering, kjøre "Bruk min / maks av det første bildet (kanskje mette intensiteter over tid) '.
      MERK: deconvolution vil da starte med å laste ned bildene og forberede dem for deconvolution.
  4. BigDataServer
    1. For å dele veldig stort XML / HDF5 datasett bruke http server BigDataServer 33. En innføring i hvordan du setter opp og koble til en slik server kan bli funnet på http://fiji.sc/BigDataServer.
    2. For å koble til et eksisterende BigDataServer åpen Fiji> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
    3. Skriv inn URL inkludert port inn i vinduet.
      MERK: Filmene som er beskrevet i denne publikasjonen er tilgjengelige via denne annonsenkjole: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
    4. Observer et vindu som lar velge de tilgjengelige filmer. Dobbeltklikk for å åpne BigDataViewer vinduet og se på dataene som beskrevet tidligere.

Supplerende: Sjekkliste for materiale som trengs før du starter

  • sebrafisk embryoer / larver som uttrykker fluorescerende proteiner (Oppbevar embryoene i sebrafisk E3 medium uten metylenblått. For trinn som er eldre enn 24 timer motvirke pigmenteringen ved tilsetning av PTU til en sluttkonsentrasjon på 0,2 mM.)
  • fluorescerende stereoskop
  • kapillærer (20 ul volum, med et svart merke) og egnede stempler (Ikke bruk kapillærene. Stemplene, på den annen side, kan gjenbrukes i flere eksperimenter.)
  • 1,5 ml plast rør
  • skarpe pinsett
  • glass (brann polert) eller plastpipetter (plast kan brukes i 24 timer og eldre embryoer)
  • glass eller plast retter diameter 60 mm (plast kan værebrukes i 24 timer og eldre embryoer)
  • to 100 ml begre
  • 50 ml Luer-Lock sprøyte med 150 cm forlengelsesslange til infusjon (Slangen og sprøyte bør holdes helt tørt i mellom eksperimenter for å unngå forurensning av mikroorganismer.)
  • plasticine
  • lavt smeltepunkt (LMP) agarose
  • E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)
  • MS-222 (Tricaine)
  • phenylthiourea (PTU)
  • fluorescerende mikrosfærer (her referert til som kuler)
  • dobbelt-destillert H2O (DDH 2 O)

Representative Results

LSFM er en ideell metode for å avbilde utviklingsprosesser over skalaer. Flere programmer er kompilert her viser både kort og lang sikt avbildning av intracellulære strukturer, samt celler og hele vev. Disse eksemplene viser også at LSFM er et nyttig verktøy på ulike stadier av øye utvikling fra optisk cup formasjon til nevrogenese i netthinnen. Movie en tjener som en illustrasjon av den generelle LSFM tilnærming, først viser en zoomet ut visning av en intakt embryo i embedding agarose sylinder i lysfelt og senere viser en detaljert oversikt over netthinnen i fluorescens kanal.

film 1
Film 1:. LSFM av sebrafisk netthinnen å illustrere LSFM tilnærming, viser denne filmen først i lysfelt at embryoet er avbildet intakt inne i engarose sylinder før du bytter til fluorescens. Senere er det vist at de store synsfelt muliggjør observasjon av hele netthinnen. Deretter viser filmen en forstørret lite område av netthinnen for å fremheve den gode subcellulære oppløsning. En Ath5: gap-GFP 37 transgen sebrafisk embryo ble brukt til bildebehandling. Denne transgenet etiketter ulike nerveceller i netthinnen (hovedsakelig ganglion celler og fotoreseptorlidelser forløpere). Fluorescens del av filmen ble tatt som en enkelt visning innspilling med dobbeltsidig belysning med 40X / 1.0 W objektiv med 5 minutters mellomrom. Maksimal intensitet projeksjon av en 30 mikrometer tykk volum vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Movie 2 viser hvordan svært raske intracellulære hendelser kan fanges med høy oppløsning; i dette tilfellet veksten av mikrotubuli vedderes pluss ender i netthinnens nevronale stamceller. Informasjonen i filmen gjør det mulig for sporing og kvantifisering av microtubule pluss slutten vekst.

Movie 2
Movie 2:. Mikrotubulidynamikk i en enkelt celle Denne filmen fanger voksende pluss tips av mikrotubuli merket med pluss spissen markør protein EB3-GFP 38. Proteinet blir uttrykt i en enkelt retinal stamceller. Mikrotubuli vokser hovedsakelig i retning fra apikal til basal (topp til bunn). Den gjennomsnittlige hastigheten på EB3 kometer ble målt som 0,28 ± 0,05 mikrometer / sek. Den lyse flekken på den apikale siden av cellen som viser høy microtubule kjerneaktivitet er sentrosomen. Villtype embryo ble injisert med hsp70: EB3-GFP plasmid DNA. Filmen ble kjøpt fire timer etter varmesjokk (15 min ved 37 ° C) på rundt 28 hrpost fertilizasjon (HPF) som en enkelt visning innspilling med ensidig belysning ved hjelp av 63X / 1,0 W objektiv og 1 sek tidsintervaller. Den eneste celle ble beskåret fra et synsfelt som dekker mesteparten av netthinnen. Maksimal intensitet projeksjon av to skiver vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur 3 viser hvordan intracellulære strukturer kan følges over mange timer. Her blir sentrosomen innen translocating gangliecelle (RGCs) fanget.

Figur 3
Fig. 3: sentrosomen lokalisering under gangliecelle trans Denne montasje av en time-lapse eksperiment viser posisjonen til sentrosomen hele gangliecelle (RGC) modning.I de nevrale stamceller den sentrosomen er lokalisert i selve spissen av apikale prosessen (01:00). Under celledeling, de to centrosomes tjene som stenger til mitotisk spindel (02:25). Denne divisjonen resulterer i en dattercelle som skiller seg til en RGC og en annen datter celle som blir en fotoreseptoren celle forløper. Etter delingen, celledelen av RGC translocates til basal side av netthinnen, samtidig som den apikale prosessen forblir festet på den apikale side. Når RGC når basal side, løsner det apikale prosessen og sentrosomen reiser med det (06:15). Den sentrosomen kan følges mens gradvis tilbaketrekking sammen med den apikale prosessen (06:50, 07:20, 08:10). I den siste rammen (08:55) ganglion cellen vokser en axon fra den basale side, mens den sentrosomen fremdeles er lokalisert apikalt. Mosaikken ekspresjon ble oppnådd ved plasmid-DNA-injeksjon inn i villtype embryo i en celle trinn. Cellene er visualisert ved Ath5: GFP-caax (grønn) construct, som etiketter RGCs og andre nerveceller. De centrosomes (pilspisser) er merket av Centrin-tdTomato 29 uttrykk (magenta). Den apikale side av netthinnen er ved toppen av bildet og de basale side nederst. Den maksimale intensitet projeksjon av en 30 mikrometer tykk volum er vist. Bildene ble beskjæres fra en film som dekker hele netthinnen. Filmen starter på rundt 34 timer etter befruktning (HPF). En z stabel ble kjøpt opp hvert 5 min med 40X / 1.0 W objektiv. Tiden er vist i hh: mm. Scale bar representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I figur 4 vises det hvordan enkelt celle atferd kan hentes ut fra data som fanger opp hele vev som i Movie 1. Translokasjon av en RGC kan lett spores og dens apikale og basal prosesses fulgt.

Figur 4
Fig. 4: translokasjon av en enkelt gangliecelle Den RGC translokasjon fra forenden til basal side av netthinnen skjer etter at terminalen mitose som beskrevet i figur 3 RGC er merket ved ekspresjon av Ath5:. Gap-GFP 37 transgenet. Den maksimale intensitet projeksjon av en 30 mikrometer tykk volum er vist. Bildene ble beskjæres fra en film som dekker hele netthinnen. Filmen starter på rundt 34 HPF. En z stabel ble kjøpt opp hvert 5 min med 40X / 1.0 W objektiv. Tiden er vist i hh: mm. Scale bar representerer fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 viser evnen Multi LSFM å fange vev scale morfogenetiske prosesser med mobilnettet oppløsning på eksempel på optikk cup morphogenesis, der optisk vesikkel forvandles til en optisk cup. Bildekvaliteten kan være vesentlig forbedret ved Multi bildebehandling, når det endelige bildet er kombinert fra informasjon ut av 5 forskjellige visninger (i dette tilfellet) i ett z stabel med isotrop oppløsning. Denne figuren illustrerer den forbedring av bildekvaliteten etter veid gjennomsnitt sammensmelting og ytterligere gevinst i bilde kontrast og oppløsning etter Multi dekonvolvering. Figuren viser to optiske skiver i ulike retninger gjennom datasettet. I tillegg er en montage fra dekonvolveres datasett viser optiske cup morphogenesis over tid. Alle tidspunkter blir så vist i Movie 3.

Figur 5
Figur 5: Sammenligning av bildekvalitet mellom enkeltvisning og to metoder for multivforhåndsvisning fusjon. (A) En optisk skive én visning data vist fra side utsikt og (B) dorsal visning. Stripe gjenstander og forringelse av signalet dypere inne i prøven er åpenbare. Også en del av bildet som er synlig i de sammensmeltede data (CF) ikke ble fanget i denne visningen. (C) Det samme optiske skive, nå som Multi smeltet data vist fra side utsikt og (D) dorsal visning. Merk at stripe gjenstander er undertrykt og strukturer dypt i utvalget er bedre løst. (E) Det samme optiske skive nå som Multi dekonvolveres data vist fra side utsikt og (F) dorsal visning. Legg merke til økt kontrast og oppløsning så de enkelte cellemembraner og kjerner kan være godt skilles. Vedtaket betyr ikke forringes særlig dypere inne i prøven. Datasettet ble kjøpt med dobbeltsidig belysning fra 5 visninger ca 20 grader fra hverandre. Z stabler av abut 100 mikrometer med 1,5 mikrometer trinnstørrelse ble kjøpt til hver visning i 10 min intervaller i 10 timer med 20X / 1.0 W objektiv. Input bilder for Multi fusion og deconvolution ble samplet 2 × å fremskynde bildebehandling. 15 gjentakelser av Multi deconvolution ble kjørt. (G) Montasjen viser en beskårne delen av rygg utsikten fra dekonvolveres data for å markere morfogenetiske hendelser under tidlig øye utvikling fra den optiske vesikkel på syns cup scenen. De to lag av den optiske vesikkel, som er i utgangspunktet lik spalte epitel, differensiere inn i forskjellige cellepopulasjoner. Den distale lag nær epidermis blir retinal neuroepithelium (RN) og den proksimale lag som er nær det nevrale røret blir retinalt pigmentepitel (RP). Cellene i den langstrakte RN og invaginate for å danne det optiske koppen (01:40 til 05:00); samtidig de RP cellene flate. Overflaten ektoderm blir indusert for å danne en linse (01:40), which invaginates senere (05:00). Filmen starter på 17 HPF. Tiden er vist i hh: mm. Alle de cellulære membraner er merket med β-actin: ras-GFP transgenet, og alle kjerner er merket med hsp70: H2B-RFP transgenet. Scale bar representerer 30 mikrometer. FB forhjernen, LE linse, OP lukte placode, RN retinal neuroepithelium, RP retinal pigment epitel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 3
Movie 3: Optikk kopp morphogenesis vist med enkeltvisning og to metoder for Multi fusjon time-lapse film viser hele prosessen med optisk kopp morphogenesis fra den optiske vesikkel på syns cup scenen.. Det viser en enkelt optisk stykke fra sideriss (øverst) og en enkelt optisk stykke fra den dorsale visning (nederst). Cellene i å utvikle optisk vesikkel gjennomgå komplekse rearrangementer for å danne det endelig halvkuleformet optiske koppen med den indre retinal neuroepithelium og ytre retinalt pigmentepitel. En linse er dannet fra overflaten ektoderm. Det invaginates sammen med neuroepithelium og sitter i den optiske cup. Alle cellemembraner merkes ved ekspresjon av β-actin: ras-GFP (grønt) transgenet, og kjernene er merket med hsp70: H2B-RFP (magenta). Filmen starter på rundt 17 HPF. Datasettet ble kjøpt med dobbeltsidig belysning fra 5 utsikt ca 20 grader fra hverandre og az stabler av ca 100 mikrometer ble kjøpt hvert 10 min med 20X / 1.0 W objektiv. Tiden er vist i hh: mm. Scale bar representerer 50 mikrometer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

1. Kritiske trinn og feilsøking for datainnsamling

De typiske bildeinnstillingene for en GFP og RFP uttrykke prøven kan finnes i tabell 3. I den beskrevne mikroskop oppsett lyset arket er statisk, dannet av en sylindrisk linse. De to belysning mål er luft linser og påvisning målet er en vann-dipping objektiv. Zoom 1.0 med 20X / 1,0 eller 40X / 1,0 mål gir 230 nm og 115 nm pikselstørrelse og et synsfelt på 441 x 441 nm eller 221 x 221 mikrometer henholdsvis. Det anbefales å bruke standard lys platetykkelse med sentrum til grensen forholdet 1: 2. For 20X / 1.0 denne tykkelsen tilsvarer 4,5 mikrometer og for 40X / 1,0 til 3,2 mikrometer i sentrum. Hvis bildehastighet ikke er den primære prioritet, bruker separate spor i tilfelle av en flerfarget prøve for å unngå krysstale for fluorescensemisjonen mellom kanalene. Den høyeste hastigheten av oppkjøpet er begrenset til 50 millisekunder per z trinn vedHastigheten på bevegelsen av z-driver. Hvis målet er å oppnå maksimal bildehastighet i tilfelle, for eksempel, to spor med dobbeltsidig belysning, eksponeringstiden må settes slik at summen av alle bildene som er tatt per z trinnet er under 50 ms. På den annen side, hvis bare en enkelt bilde er ervervet per z trinnet, er det ikke fordelaktig å stille inn eksponeringstiden er kortere enn 50 ms.

1920 x 1920 bildestørrelsen
16-bit
Pivot skanne på
Dobbeltsidig belysning med online fusjon
10X / 0.2 belysning objektiv
20X / 1.0 W Plan-Apochromat deteksjon objektiv
Spor 1: Eksitasjon 488 nm typisk 2% av 100 mW laser, 550 nm SP utslipp filter
Spor 2: Eksitasjon 561 nm typisk 3% av 75 mW laser, 585 nm LP utslipp filter
Eksponeringstid opp til 100 ms
Z stabelen tykkelse 50-100 mikrometer
1-1,5 mikrometer z trinnstørrelse i kontinuerlig z drive-modus
Inkubasjon ved 28,5 ° C

Tabell 3: Imaging innstillinger.

Inspeksjon prøven etter forsøket

Det er viktig å sikre at prøven er fremdeles friske ved slutten av forsøket. Som et første avlesning, sjekk hjerterytme av prøven under et stereoskop. Med et par skarpe tang prøven kan tas ut av agarose og flyttet til inkubatoren å utvikle seg videre for å sjekke om det var påvirket av bildebehandling. Alternativt kan den festes for antistoffarging.

Montering og drift

Det er viktig å holde osmolariteten av kammeret solution nær til osmolariteten av forsenkningen agarose, ellers svelling / krymping av agarose og påfølgende ustabilitet av prøven vil oppstå. Derfor bruker samme løsning (E3 medium uten metylenblått) for å fylle kammeret og for å forberede en% lavt smeltepunkt agarose porsjoner. I tillegg, ikke la agarose i 70 ° C oppvarming blokk i mer enn to timer, så det kan miste sine geleringsegenskaper.

Ikke legge fisken i for varmt agarose, da dette kan føre til varmesjokk respons eller død av embryo. Hvis du er usikker på effekten av varme agarose på embryoene, sjekk at halen ikke bøye og at pulsen ikke tregere. Hvis dette skjer, må du bruke en annen embryo for forsøket.

Hold den totale lengden på agarose kolonne med prøven kort (rundt 2 cm) og monter sebrafisk med hodet sitt orientert mot stempelet spissen. Likeledes, agarose sylinderen ekstruderes fra capillær bør holdes så kort som mulig. Disse tiltakene vil sikre stabilitet av prøven gjennom hele filmen. På samme tid må den agarosekolonne være lang nok, slik at glasskapillærer i seg selv ikke når inn i lysbanen, da dette ville forårsake store brytning og refleksjon.

Den innledende drift av prøven er forårsaket av volumendringer av agarose sylinderen selv. Sliding av stempelet er ikke årsaken til det. Derfor hjelper det ikke å fikse stempelet med plasticine eller neglelakk. Embryoet kan endre sin posisjon i løpet av filmen på grunn av den naturlige vekst også. Følgelig er det tilrådelig å sentrere regionen av interesse i midten av synsfeltet og holde noen rom på kantene for å imøtekomme disse bevegelsene.

Redusert mengde innstøpningsmediet i lysbanen

Orientere prøven riktig bidrar til å oppnå best mulig bildekvalitet 15. Generally, eksitasjon og emisjon lys bør reise gjennom så lite vev og montering media som mulig. Den optimale løsningen er agarose-fri montering. Dette ble oppnådd for eksempel i et oppsett for Arabidopsis lateral root bildebehandling 14, der hoved roten ble montert inn phytagel og lateral røtter ble senere utleid til å vokse ut av gel kolonne helt. Agarose-fri montering ble også utviklet for avbildning av hele embryogenese av Tribolium bille over to dager 12. Bildekvalitet forbedring var ikke en primær motivasjon i dette tilfellet. Tribolium embryoene rett og slett ikke overlever på innsiden av agarose lenge nok. En helt embedding media-fri montering er ikke nådd for langsiktig bildebehandling i sebrafisk. Likevel, kan vi ta fordel av det faktum at når agarose størkner, er de fleste embryoer plassert diagonalt i kapillaren med ett øye som ligger dypt i agarose, og det andre øyet å være nær overflaten av det innebygging kolonnen. Than øye nærmere overflaten gir overlegen bildekvalitet og derfor bør avbildes fortrinnsvis.

Agarose konsentrasjon og langsiktig bildebehandling

Konsentrasjonen av agarose for montering er et kompromiss mellom stabilitet av prøven og muligheten for å tilpasse vekst av embryoet og diffusjon av oksygen til den. Det er ingen ekstra forsterkning i stabiliteten av prøven ved bruk av agarose konsentrasjoner større enn 1%. Som et utgangspunkt for å optimalisere forsøkene anbefales 0,6% agarose, som også er egnet for embryoer yngre enn 24 HPF som er for skjøre til å monteres inn i 1% agarose. For å bedøver gamle befruktede egg og larver, kan MS-222-konsentrasjonen heves til 200 ug / ml uten bivirkninger 13.

Ved utvikling av embryo blir avbildet i mer enn ± 12 timer, agarose montering er ikke anbefalt, fordi det begrenser veksten av embryoet og causes hale deformasjon. Dette problemet ble løst for sebrafisk ved å montere embryoer til FEP polymer rør med brytningsindeks lik vann 13,39. Mus embryo, på den annen side, kan immobiliseres i hule sylindre agarose 40 eller i hull med en akryl stang er festet til en sprøyte 41. FEP rør montering er ikke anbefalt som standard metode, fordi veggen av røret refracts lyset litt mer enn agarose.

Lys ark justering

For god bildekvalitet er det viktig å utføre automatisk lys ark justering før hvert eksperiment. Spesielt hvis de zoom-innstillinger ble endret, ble målene tatt ut, eller en annen væske ble brukt i kammeret.

Belysning

Pivot skanning av lyset arket skal alltid være aktivert. For større sprednings prøver, er det nødvendig å anvende den dobbeltsidig belysning med nettet fusion å oppnå jevn belysning over hele synsfeltet. Dobbeltsidig belysning minsker også et spesifikt problem i øyet imaging, som er brytning av det innkommende lyset ark av linsen av embryoet. Mindre og mindre spredning prøvene effektivt kan avbildes ved hjelp av ensidig belysning, noe som forkorter avbildnings tid til det halve, og kan gi litt bedre bildekvalitet i forhold til dobbeltsidig belysning. Dette skyldes at lysbanene til de to belysnings armene er alltid forskjellige, og den mer effektive man kan velges. I tillegg er de to lys ark som kommer fra hver side er aldri fullstendig i et plan, noe som fører til mild sløring etter fusjon. For svært raske intracellulære hendelser, som den voksende mikrotubuli (Film 2), er det dobbeltsidig belysning ikke er hensiktsmessig, fordi bildene med belysning fra venstre og høyre er kjøpt i rekkefølge, noe som kan resultere i bevegelsesuskarphet.

fotoblekingog fototoksisitet

Mindre fluorophore bleking blir ofte nevnt som en stor fordel av LSFM. Vi vil hevde at målet bør være noen fotobleking i det hele tatt. Hvis det er merkbar fotobleking i live bildebehandling eksperimentet, er prøven sannsynligvis allerede ut av sin fysiologiske rekke tolerert laser eksponering. Når bildebehandling sebrafisk embryo i roterende disk mikroskop, i vår erfaring, kan høy fototoksisitet stall embryo utvikling selv før de fluorescerende signal blekemidler markert. Derfor bør de bildeinnstillingene i LSFM justeres slik at lite eller ingen fotobleking er observert. Selv om LSFM er skånsom mot prøven, er det klokt å bruke bare så mye lasereffekten og eksponeringstid som er nødvendig for å oppnå et signal-til-støy-forholdet er tilstrekkelig for den etterfølgende dataanalyse.

Z-stack, tidsintervaller og datastørrelse

De filer generert av LSFM er vanligvis meget store; noen ganger i terabyte-serien. Det er ofte nødvendig å gjøre et kompromiss mellom bildekvalitet og datastørrelse. Dette gjelder særlig for z avstanden mellom stabler og intervaller i time-lapse oppkjøp. Å definere z intervaller, bør Optimal knappen i kategorien Z-stack verktøy ideelt sett brukes, spesielt hvis datasettet vil bli dekonvolveres senere. Den beregner avstanden for å oppnå 50% overlapping mellom nabo optiske skiver. Likevel, litt større z intervaller er vanligvis akseptabelt. De reduserer tiden det tar å erverve z stabelen samt størrelsen den endelige filen. Den optimale tid prøvetaking avhenger av prosessen med interesse. For generelle øye utvikling 5-10 minutters intervaller er vanligvis akseptabelt. Hvis noen strukturer skal automatisk spores, må den påfølgende tidspunkter være tilstrekkelig like.

fluoriserende perler

Fluoriserende perler primært tjene som fiducial markører for å registrere ulike synav en Multi datasett på hverandre. vortex alltid perle løsninger grundig før bruk. Ikke varm perlene da dette kan føre til tap av fluorescerende fargestoff. Den optimale kulekonsentrasjonen for Multi registrering må bestemmes eksperimentelt. Den beskrevne plugin fungerer best med rundt 1000 oppdaget perler gjennom hver visning. Større (500 nm eller 1000 nm) perler oppdages mer robust enn mindre (mindre enn 500 nm) perler. Dette er fordi større perler er lysere og er lettere å segment uten falske positive påvisninger av strukturer i utvalget. Ulempen ved de større kulene er at de er meget fremtredende i det endelige smeltet og dekonvolvert bilde. For hver ny fluorescerende markør, passende kulestørrelse og fluorescensemisjonen må optimaliseres. For å gi et eksempel på prøve fra figur 5 og Movie 3, 100 nm grønne utslipps perler ga for mange falske positive påvisninger i membranen-GFP-kanal, men 1000 nm rød stråling perler ble robust detektert i H2B-RFP kanal med meget få positive deteksjoner inne i prøven. Dersom perle registrering mislykkes i kanalen med fluoriserende fargestoff, kan en egen kanal som bare inneholder perler bli kjøpt opp, men dette er ikke veldig praktisk. Den sub-oppløsning store perler gi en direkte avlesning av punktspredefunksjonen (PSF) til mikroskopet, som kan brukes for dekonvolvering (figur 2C-D). Hvis registreringen og fusjon fungerer bedre med større perler (f.eks 1000 nm), kan et eget bilde av PSF bli kjøpt med sub-oppløsning, for eksempel 100 nm perler. Bruke flerfarget perler er nyttig ved registrering av flerkanals oppkjøp og for å kontrollere at kanalene overlegg perfekt.

Tilsetting av fluoriserende perler er ikke nødvendig når avbildning fra en enkelt visning uten etterfølgende Multi registrering og fusion. Men selv i de tilfeller perler kan være nyttig under innledetl lys ark justering for å kontrollere kvaliteten på det lys arket og generelt for å avsløre optiske aberrasjoner. Slike optiske avvik kan stamme fra ulike kilder som er skadet eller skitten mål, skitne vinduer i kammer eller inhomogeneity i agarose. Perler kan også brukes for korreksjon av drifting av Multiregistrering Fiji plugin 20.

Multi

For Multi gjenoppbygging formål, er det bedre å kjøpe et ulikt antall visninger 3, 5 og så videre, som ikke er motstridende med hverandre. Dette forbedrer deconvolution siden PSFs er avbildet fra forskjellige retninger. Det er også viktig for å få bekreftet ved begynnelsen av tidsrommet anskaffelse at det er tilstrekkelig overlapping mellom visningene. Dette gjøres best empirisk, dvs. umiddelbart bekrefter at visningene i første tidspunktet kan være vellykket registrert. Når målet med Multi oppkjøpet er å øke oppløsningenav et bilde av en stor spredning prøven, er det ikke tilrådelig å avbilde hele prøven i hver visning, men for å slutte rundt sentrum av prøven, hvor signalet forringes. Oppkjøpet lav kvalitet fra annen halvdel av prøven ville ikke legge nyttig informasjon til Multi gjenoppbygging.

2. Kritiske trinn og feilsøking for databehandling

For tiden er det finnes flere muligheter for behandling av Multi data fra en lys ark mikroskop som er godt dokumentert og relativt lett å ta i bruk. Vi bruker Multioppbyggingen programmet, som er en åpen kildekode-programvare implementert i Fiji 32 (Stephan Preibisch upublisert, Link 1a og Link1b i List of Materials). Dette programtillegget er en stor redesign av forrige SPIM registrering plugin 20, anmeldtav Schmied et al. 42, integrere BigDataViewer og dens XML og HDF5 format 33 med SPIM registrering arbeidsflyten (figur 1B, Link to , Link 3 ). Dette programmet kan også tilpasses for databehandling med høy ytelse klynge, som i betydelig raskere behandling 43. Denne Multiregistrering programmet er aktivt utviklet videre og holder bedre. I tilfelle problemer eller funksjoner forespørsler om den beskrevne programvare, kan du sende inn spørsmål på de respektive GitHub sider ( Link 4 for Multi gjenoppbygging og Link 5 for BigDataViewer).

Det andre alternativ er å bruke kommersiell programvare som er tilgjengelig sammen med mikroskop. Denne løsningen fungerer godt, og sysselsetter det samme prinsippet om å bruke fluoriserende perler å registrere de ulike visningene. Imidlertid mangler det muligheten til å visualisere hele datasettet raskt som med BigDataViewer. Også programvaren kan ikke tilpasses klyngen og dessuten behandlings blokkerer mikroskop for andre brukere, med mindre ekstra lisens for programvaren er kjøpt.

Det tredje alternativet, som også er en åpen kildekode, ble nylig publisert av Keller lab 44 og gir et omfattende rammeverk for prosessering og nedstrøms analyse av lyset ark data. Denne programvaren ved hjelp av informasjon fra inne i prøven for å utføre Multi fusjon, derfor er det ikke krever tilstedeværelse av fluorescerende kuler rundt prøven. Men på samme tid antar det ortogonale orientering av imaging visninger (mål), så det kan ikke brukes til data innhentet fra vilkårlige vinkler 44.

maskinvare~~POS=TRUNC krav~~POS=HEADCOMP

ntent "> Den maskinvare som brukes for behandling kan finnes i tabell 4. Det må være tilstrekkelig lagringskapasitet og en klar rørledning for databehandling tilgjengelige, i forkant av selve forsøket. Anskaffelse av bildene er raskere enn etterfølgende analyse, og det er lett å bli oversvømmet med Rådata. Det er ofte urealistisk å lagre alle rAW-bilder, men heller en beskåret versjon eller behandlede bilder som smeltet utsikt, maksimal intensitet projeksjoner eller sfæriske anslag 45.

prosessor To Intel Xeon-prosessor E5-2630 (Six Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7.2 GT / s)
Hukommelse 128 GB (16 x 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM
Hard Drive 4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7200 RPM) Harddisk
HDD Controller PERC H310 SATA / SAS Controller for Dell Precision
HDD-konfigurasjon C1 SATA 3,5 tommer, 1-4 harddisker
grafikk Dobbel 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 kort m / 2 DP og 1 DVI-I hver) (2 DP-DVI og to DVI-VGA-adapter) (MRGA17H)
Network Intel X520-T2 Dual Port 10 GbE-nettverkskort

Tabell 4: Krav til maskinvare.

Databehandling hastighet

Den tid som er nødvendig for databehandling, er avhengig av dimensjonene av data og på den brukte maskinvare. I tabell 1 gir vi en oversikt over den tiden som kreves for de viktigste trinnene i å behandle et eksempel 8,6 GB Multi datasett som besto av en tidspunkt med 4 visninger og 2 kanaler.

Processing step Tid protokoll trinn
Resave som HDF5 6 min 30 sec 6.3
Oppdage Interessepunkter 20 sek 6.4
Registrere seg med interesse poeng 3 sek 6.5
Content-baserte Multi fusjon 4 timer 7.2
Multi deconvolution (CPU) 8 timers 7.3
Multi deconvolution (GPU) 2 timer 7.3

Tabell 1: Data Processing Tid.

Input dataformater for Multi rekonstruksjon

Den Fiji Plugin Fler Rekonstruksjon kan støtte .czi, TIF og ome.tiff formater. På grunn av datastrukturen i .czi format, diskontinuerlige datasett ikke erstøttes uten pre-prosessering. Diskontinuerlig betyr at opptaket måtte startes på nytt (for eksempel for å justere posisjonene på grunn av drift av prøven). I dette tilfellet .czi filer må lagres på nytt som TIF. For TIF-filer hver visning og belysning retning må lagres som en egen fil.

Kalibrering av pikselstørrelse

Mikroskopet-operativsystemet programvare beregner kalibrering for xy pikselstørrelse basert på den valgte målet. Imidlertid er pikselstørrelsen i z er definert uavhengig av trinnstørrelsen. Hvis en feil mål er angitt i programvaren xy til z-forholdet er feil og registreringen mislykkes.

førstegangsregistrering

Etter å definere datasettet antall registreringer vil være 1 og antallet interessepunkter vil være 0 i ViewSetup Explorer. Den første registreringen representerer kalibrering av datasettet. Både antall of registreringer og interessepunkter vil øke i løpet av behandlingen.

Ned prøvetaking for påvisning av interesse poeng

Bruke ned prøvetaking er mest hensiktsmessig, siden lasting av filer og segmentering vil være mye raskere. Det er imidlertid viktig å merke seg at deteksjonsparametrene endres avhengig ned prøvetaking, og dermed overføre deteksjonsinnstillinger mellom ulike ned prøve innstillinger er ikke mulig.

Påvisning av interessepunkter

Det anbefales å segment som mange sanne perler som mulig i hver visning, selv på pris for å skaffe noen falske positive oppdagelser, fordi de ikke hindrer registrering betraktelig. Falske deteksjoner, hvis noen i antall, er utelukket under registreringen (se Registrering av interessepunkter). Men massive falske positive oppdagelser utgjøre et problem for algoritmen. Det reduserer ikke bare ytelse for påvisning ogregistreringen, siden det tar mye lengre tid å segmentere bildet samt sammenligne disse perlene mellom visningene, men det reduserer også nøyaktigheten av registreringen. Dette kan løses ved hjelp av strengere deteksjonsparametere. I tillegg, i løpet segmentering av kulene (dvs. flere Sporing på én vulst figur 1E) er skadelig for registrering og bør unngås.

Registrering av interessepunkter

For å registrere utsikt mot hverandre, er plasseringen av hver perle i hver visning beskrevet av sin posisjon i forhold til sine tre nærmeste nabo perler. Disse konstellasjoner danner en lokal geometrisk descriptor og lar sammenligne hver perle mellom visningene. Perler med matchende descriptor mellom to synspunkter blir da regnet som kandidat korrespondanser. Merk at dette fungerer bare for tilfeldig fordelt perler, der de lokale beskrivelsene vanligvis er unik for hver perle.Man kan bruke andre strukturer som kjerner i utvalget for registrering. Men for å detektere kjerner, som er fordelt ikke-tilfeldig i prøven, andre metoder gjelder 20,21.

Kandidat korrespondanser blir så testet mot RANSAC 36 for å utelukke falske positiver. Hver korrespondanse er noe som tyder en transformasjon modell for å legge over utsikt mot hverandre. Sanne korrespondanser vil trolig bli enige om en transformasjon modell, mens uteliggere ville hvert punkt til et annet. Den sanne korrespondanser blir så brukt til å beregne en affin transformasjon modell mellom de to i forhold visninger. En global optimalisering med en iterativ optimaliseringsalgoritme utføres deretter, i løpet av hvilken alle visninger er registrert på den første vis med sikte på å minimale forskyvning mellom visningene 20,21.

Time-lapse registrering

På grunn til å flytteform av agarose og upresis motor bevegelse av objektbordet, posisjonen av hver stabel varierer moderat over tid. Mens registrering av den enkelte tidspunkt fjerner forskjellen mellom synspunktene til dette tidspunkt, må time-lapse også å bli registrert som en helhet. For dette formål blir hvert enkelt tidspunkt registrert på referanse tidspunkt.

Referanse tidspunkt

Dersom en tidsserie med mange tidspunkter bearbeides, har en representativ tid punkt som er valgt som referanse vanligvis fra midten av tidsserien ettersom listintensitetene kan brytes ned over tid på grunn av bleking. På denne referansen, kan parametrene for interesse punkt deteksjon, registrering, markeringsrammen og fusjon bestemmes. Disse parametrene blir deretter brukt til hele tidsforløp for å beregne en bestemt transformasjonsmodellen for hvert enkelt tidspunkt. Under time-lapse registrering alle andre tidspunkter er også registket romlig på denne referanse tidspunkt. Dermed markeringsrammen parametere for hele opptaket er avhengig av denne spesifikke tidspunkt.

Multichannel registrering

Når bildebehandling flere kanaler, ideelt sett de samme fluoriserende perler skal være synlig i alle fotografert kanaler. Deteksjon og registrering kan deretter utføres på hver enkelt kanal, noe som tar hensyn til innflytelsen av de forskjellige lysbølgelengder på transformasjon. Ofte er dette ikke mulig, fordi perlene er ikke synlig i alle kanaler eller perlene dominerer bildet for mye i en kanal og er for svak i den andre kanalen (e). Den typiske løsningen er å bruke perler synlige bare i en kanal for deteksjon og registrering og ervervet transformasjon modell (dvs. etter deteksjon, registrering og time-lapse registrering) brukes deretter til de andre kanalene ved Fiji> Plugins> Multi Reconstruction> Batch Processing> Verktøy> Duplicate Transformations. I rullegardinmenyen for Apply transformasjon av velge en kanal til andre kanaler. I det neste vinduet velger XML og klikk på OK. Deretter velger du kanal som inneholder perler som kilde kanal og som Target kanal velge kanalen (e) uten perler. For Duplicate som transformasjoner bruke Erstatt alle transformasjoner og trykk OK. De transformasjoner blir deretter kopiert til alle andre kanaler og lagret i XML. For å se de nye transformasjoner i ViewSetup Explorer, starter Multi Rekonstruksjon Application.

byksende boks

Sammensmeltingen av flere visninger er beregnings svært intensiv. Imidlertid er store bilder vanligvis anskaffet for å imøtekomme ikke bare prøven, men også perlene rundt den. Når registreringen parameters er hentet fra perlene, de er ikke lenger nyttig som en del av bildet. Derfor, for å øke effektiviteten av sammensmeltningen skal bare de deler av bildestakker inneholdende prøven være smeltet sammen. En region av interesse (markeringsramme) skal defineres til å inneholde prøven, og så lite av det omgivende agarose som mulig. For eksempel i figur 2 et vektet gjennomsnitt fusjon på hele volumet med 2229 × 2136 × 2106 px ville kreve 38,196 MB RAM, mens med en markeringsramme volumet er redusert til 1634 × 1746 × 1632 px og minnekravene er redusert til 17,729 MB.

Content-baserte Multi fusjon

Utfordringen i fusing Multidata er at utsikten vanligvis ender brått og inneholder ikke den samme bildekvalitet for de samme voxel. Enkel midling av visningene vil derfor føre til blending gjenstander og unødvendig bildeforringelse. Content-baserte Multi fu sion tar begge disse problemene i betraktning. Først blander det de ulike visningene, hvor ett bilde slutter og den andre begynner, og andre, det vurderer den lokale bildekvalitet og gjelder høyere vekter til høyere bildekvalitet i fusion 21. Sammenlignet med en enkelt vis det er en forbedring av oppløsning i z med en svak forringelse av signalet i xy (figur 2E-H, figur 5A-D).

Multi deconvolution

Multi deconvolution er en annen tilnærming for å oppnå fusjon av utsikten. Med denne metoden også PSFs av de ulike visningene blir tatt hensyn til for å gjenopprette bildet som har blitt foldet av optikken i mikroskop. Denne metoden forbedrer drastisk bildekvaliteten ved å fjerne bildene blir uskarpe og øke oppløsning og kontrast av signalet 31 (figur 2C-D, figur 2I-J, figur 5E-G, Movie 3).

ve_content "> Deconvolution er beregnings veldig intensiv (se tabell 1), og dermed bruke en GPU for prosessering øker hastigheten på denne prosessen. Det kan også være nødvendig å utføre deconvolution på ned samplede data. Å ned prøven, bruker Fiji> Multi Reconstruction > Batch Processing> Verktøy> bruke transformasjoner. Dette vil gjelde en ny transformasjon modell på visningene som vil bli lagret i XML-fil.

HDF5 filformat for BigDataViewer og BigDataServer

Den BigDataViewer 33 gir enkel visualisering av terabyte-sized data. Hvordan kontrollere BigDataViewer er oppsummert i tabell 2. En screencast av grunnleggende bruk av programmet er også tilgjengelig som et supplement i den opprinnelige utgivelsen 33. Den BigDataViewer er sentrert på en XML-fil, som inneholder metadata, og en hdf5 fil, som inneholder bildedata. Bildedataene er present i hdf5 i mange oppløsningsnivåer i 3D-blokker. De mange oppløsning nivåer tillate for å visualisere data raskere med lavere oppløsning, før full oppløsning er lastet. Individuelle blokker blir bare lastet inn i minnet når det er nødvendig. Dermed kan hdf5 bildeformat direkte og hurtig visualisering av data via BigDataViewer 33. Det også raskere behandling ettersom lasting av filene utføres mer effektivt. Derfor anbefaler vi resaving datasettet inn i dette formatet, selv om det ikke er strengt nødvendig for behandlingen. For nærmere forklaring av dataformat, se Link tre . I tillegg kan de datasett deles med samarbeidspartnere eller offentligheten med BigDataServer 33 ( Link 6 ).

effekt
nøkkel
F1 viser Hjelp med en kort beskrivelse av BigDataViewer og dens grunnleggende drift
<> Eller musehjulet bevegelse i z
opp og pil ned zoome inn og ut
høyreklikk og dra beveger prøven i betrakteren
venstre klikk og dra roterer prøven rundt markøren
glidebryteren nederst på betrakteren eller Tab og pil venstre eller høyre beveger seg på tidsaksen
i tillegg trykke shift raskere bevegelse eller rotasjon langs en akse
x og deretter til venstre og høyre pil roterer rundt x-aksen
y og deretter til venstre og høyre pil roterer rundt y-aksen
z og deretter til venstre og høyre pil roterer rundt z-aksen
skift og x orienterer utsikten langs x-aksen
skift og y orienterer utsikten langs y-aksen
shift og z orienterer utsikten langs z-aksen
jeg veksler mellom de ulike interpolering moduser (dvs. nærmeste nabo og Trilineær)
s eller Innstillinger> Lysstyrke og kontrast endrer fargen på kanaler, lysstyrke og kontrast
F6 eller Innstillinger> Synlighet og gruppering endrer de viste gruppene gjør gruppering til overliggende ulike grupper og ringer gruppene via talltastene
F10 eller Verktøy> Spill inn film kjøper en tidsserie av det viste skive

Tabell 2: Big Data Viewer.

3. Begrensninger av den beskrevne implementering av LSFM

lav gjennomstrømning

I et typisk eksperiment LSFM bare én prøve pr eksperiment avbildes. Likevel, i vår erfaring, mye nyttig informasjon kan hentes ut fra den enkelt prøve. Høy gjennomstrømning avbildning av flere embryoer har nylig blitt oppnådd i hjemmet inne LSFM oppsett 46-48, selv om vanligvis på bekostning av frihets av prøve posisjonering og rotasjon.

Utilstrekkelig penetrasjon dypt inn i vev

Selv om sebrafisk embryoer er gjennomsiktig, er det oppnådde bildekvaliteten svekkes raskt når avbildning dypere i vevet på grunn av spredning og absorpsjon. Delvis dette er en effekt av spredning og absorpsjon av den utsendte fluorescensen av prøven, og kan ikke rettes opp i den nåværende konfigurasjonen. En annen kilde til den ujevne bildekvaliteten er uregelmessig belysning. Than lys ark er hendelsen fra venstre eller høyre side og gjenstander på sin vei brekker den, noe som resulterer i stripe gjenstander og uskarphet. Den dobbeltsidig belysning og Multi fusjon kan minske artefakter i det endelige bildet. Til slutt, bildekvalitet har en tendens til å være litt dårligere mot kanten av synsfeltet grunn av den naturlige geometri av lys plate, som blir tykkere mot kantene.

Begrenset kjemisk manipulering

Bruken av narkotika eller hemmere er utbredt i sebrafisk forskning. I denne mikroskop bruk av medikamenter er begrenset, på grunn av det store volumet av prøvekammeret og hensynet til andre brukere av instrumentet, som deler det samme kammer. Ved hjelp av en ekstra kammer dedikert til narkotika eksperimenter kan løse dette problemet. Fylling av kammeret delvis med glassperler reduserer volumet av væske som er nødvendig.

Ingen fotomanipulasjon

Currently er det ingen mulighet for lokalisert optisk manipulasjon som photoconversion, eller laserablasjon i denne mikroskop. Likevel kan hjem bygget oppsett brukes til slike spesifikke applikasjoner.

4. Betydning og fremtidige applikasjoner

LSFM er den beste metoden tilgjengelig for å date for rask bildebehandling av store mengder levende embryoer. Mesteparten av forsøkene tenkelige på et konfokalt mikroskop kan også utføres på en lett ark mikroskop med tidligere nevnte fordeler. Når det gjelder avbildning av øyet utvikling, er hastigheten på LSFM ikke den avgjørende parameter. I stedet, den lave fototoksisitet og fleksibilitet i prøveposisjonerings er de avgjørende fordeler.

De LSFM data har en høy SNR, som bidrar til å oppnå gode dekonvolvering resultater og er også gunstig for automatisert bildeanalyse og objektsporing. I konklusjonen, er LSFM et flott verktøy for å generere kvantifiserbare data på embryoutvikling og Overall celle og vev egenskaper for påfølgende modellering og fysiske beskrivelser av prosesser i spørsmålet.

Disclosures

Publisering av denne video-artikkelen er støttet av Zeiss.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose Roth 6351.1
Low melting point agarose Sigma A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) Sigma E10521
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 Millipore (Estapor) 80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries Brand 701904 sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries Brand 701932 sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55 Dumont 0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes Becton Dickinson 300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes Becton Dickinson 397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration
http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer http://fiji.sc/BigDataServer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (5), 327-339 (2014).
  2. Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49, (7), 555-569 (2011).
  3. Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340, (6137), 1234168-1234168 (2013).
  4. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  5. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170, (Pt 3), 229-236 (1993).
  6. Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6, (11-12), 920-928 (2012).
  7. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12, (1), 23-26 (2015).
  8. Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998-1257998 (2014).
  9. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  10. Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360, (1), 129-141 (2015).
  11. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. Elsevier Inc. 193-215 (2014).
  12. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, (11), 2361-2361 (2014).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, (17), 3242-3247 (2012).
  14. Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68, (2), 377-385 (2011).
  15. Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4, (1-2), 122-134 (2010).
  16. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  17. Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (43), 17708-17713 (2011).
  18. Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. 028308 (2015).
  19. Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11, (9), 951-958 (2014).
  20. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7, (6), 418-419 (2010).
  21. Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12, (1), 30-34 (2015).
  23. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (10), (2011).
  24. Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. (2013).
  25. Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. 1-11 (2013).
  26. Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10, (7), 598-599 (2013).
  27. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10, (7), 599-600 (2013).
  28. Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136, (13), 2165-2175 (2009).
  29. Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32, (2), 203-219 (2015).
  30. Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
  31. Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11, (6), 645-648 (2014).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, (7), 676-682 (2012).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12, (6), 481-483 (2015).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).
  35. Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9, (7), 717-720 (2012).
  36. Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24, (6), 381-395 (1981).
  37. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, (1), 2 (2006).
  38. Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23, (7), 2655-2664 (2003).
  39. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
  40. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, (22), 4406-4414 (2014).
  41. Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9, (3), 575-585 (2014).
  42. Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
  43. Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. Available from: http://arxiv.org/abs/1507.08575 (2015).
  44. Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10, (11), 1679-1696 (2015).
  45. Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
  46. Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6, (11), 4447-4456 (2015).
  47. McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23, (12), 16142-16153 (2015).
  48. Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5, (6), e01751-14-8 (2014).

Comments

1 Comment

  1. How to find the distances

    1. between the illumination objective and sample
    2. between the detective objective and sample

    There is a maximum and a minimum image distance for Gaussian beam, how to find that one?

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Nava S.
    April 16, 2019 - 9:12 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics