एक पूरी माउंट
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
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Biology

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Summary

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Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

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Abstract

सीटू संकरण में पूरे माउंट (WMISH) एक तकनीक है कि ब्याज की (जैसे एक भ्रूण या लार्वा के रूप में) न्यूक्लिक एसिड अणुओं (अक्सर mRNAs) के स्थानिक संकल्प एक 'पूरे माउंट' ऊतक तैयारी के भीतर, या विकास मंच के लिए अनुमति देता है। WMISH अत्यंत शक्तिशाली है क्योंकि यह काफी जटिल metazoan जीनोम के कार्यात्मक विशेषताओं, एक चुनौती है कि अगली पीढ़ी के अनुक्रम डेटा की बाढ़ के साथ एक टोंटी के अधिक होता जा रहा है करने के लिए योगदान कर सकते हैं। तकनीक में ज्यादा समय अक्सर उपन्यास मॉडल प्रणाली के लिए WMISH प्रयोगों के लिए निहित विभिन्न मापदंडों का अनुकूलन करने की जरूरत है की वैचारिक सादगी के बावजूद; प्रकार के ऊतकों और विकास के चरणों के बीच सेलुलर और जैव रासायनिक गुणों में सूक्ष्म अंतर का मतलब यह है कि एक ही WMISH विधि सभी परिस्थितियों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। हम फिर से उभरते gastropod मॉडल Lymnaea stagnalis कि लगातार पैदा करते हैं और के लिए WMISH तरीकों का एक सेट विकसित किया हैएक सीमा के जीन की है, और सभी विकास के चरणों भर के लिए स्पष्ट WMISH का संकेत है। इन तरीकों में एक व्यष्टिविकास खिड़की के पास अज्ञात कालानुक्रमिक उम्र के लार्वा का काम है, उनके अंडा कैप्सूल से भ्रूण के कुशल हटाने और लार्वा, प्रत्येक व्यष्टिविकास खिड़की के लिए एक उपयुक्त Proteinase कश्मीर उपचार के आवेदन, और संकरण, बाद संकरण और immunodetection शामिल कदम। इन तरीकों में एक नींव है जिस से एक दिया शाही सेना प्रतिलेख के लिए परिणामस्वरूप संकेत जांच विशिष्ट समायोजन (मुख्य रूप से एकाग्रता और संकरण तापमान जांच) के साथ आगे परिष्कृत हो सकता है प्रदान करते हैं।

Introduction

मोलस्क जानवरों है कि वैज्ञानिक विषयों की एक व्यापक विविधता के हित पकड़ के एक समूह रहे हैं। उनकी रूपात्मक विविधता 1 के बावजूद, प्रजातियों (दूसरा केवल Arthropods प्रजातियों नंबर 2 के संदर्भ में) और प्रासंगिकता वाणिज्यिक 3, 4 और चिकित्सा वैज्ञानिक मुद्दों 5-8 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए समृद्धि, वहाँ अपेक्षाकृत कुछ मोलस्का की प्रजाति है कि करने के लिए दावा कर सकते हैं दोनों वैज्ञानिक मॉडलों और एक प्रयोगशाला वातावरण में बनाए रखने के लिए आसान अच्छी तरह से सुसज्जित हो। एक सीप है कि ज्यादा इस तरह के तंत्रिका जीव विज्ञान 9, ईकोटोकसीकोलौजी 10 और अधिक हाल ही में विकासवादी जीव विज्ञान 11,12 के रूप में विषयों से इस्तेमाल किया है, मुख्य रूप से अपने बड़े पैमाने पर वितरण और रखरखाव के चरम आसानी के कारण, Lymnaea stagnalis है। एक 'मॉडल' जीव के रूप में इसकी लोकप्रियता और विकासात्मक जीव 13-19, रेंज और आणविक उपकरणों की शक्ति एल के लिए उपलब्ध द्वारा प्रयोग के अपने लंबे इतिहास के बावजूद stagnAlis वैज्ञानिक समुदाय में कहीं अधिक परंपरागत पशु मॉडल (ड्रोसोफिला, माउस, समुद्री साही, नेमाटोड) के पीछे निहित है।

हमारी इच्छा Lymnaea विकसित करने के लिए एक आणविक मॉडल है कि खोल गठन मार्गदर्शन आणविक तंत्र में रुचि की वजह से उपजी है। यह तकनीक है कि Lymnaea के विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति की, कुशल संगत और संवेदनशील दृश्य के लिए अनुमति होगी के एक सेट को परिष्कृत करने के लिए हमें प्रेरित किया। सीटू संकरण में पूरे माउंट (WMISH) व्यापक रूप से मॉडल जीवों की एक किस्म के लिए कार्यरत है और 40 से अधिक वर्षों 20 के लिए उपयोग में किया गया है। अपनी अलग guises में, ईश स्थानिक गुणसूत्रों, rRNA, mRNA और माइक्रो आरएनए पर विशेष लोकी स्थानीयकरण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

चुनौतियों में से एक हम एल के लिए एक WMISH विधि को परिष्कृत करने से पहले संबोधित करने की जरूरत stagnalis धीरे से और कुशलता से निकालने भ्रूण और टी से अलग-अलग चरणों के लार्वा का मुद्दा थावह अंडा कैप्सूल जिसमें वे जमा कर रहे हैं। यह निकासी, या 'decapsulation', आदेश के लिए पर्याप्त सामग्री इकट्ठा करने में कुशलता हासिल करने की जरूरत है एक, सीटू प्रयोग में दी गई है, जबकि एक ही समय में रूपात्मक और सेलुलर अखंडता को बनाए रखने। जबकि अन्य मॉडल जीवों को भी समझाया विकास से गुजरना है, हमारे हाथ में तरीकों उन प्रजातियों के लिए सूचना का कोई भी सफलतापूर्वक एल में नियोजित किया जा सकता stagnalis।

इस विधि के समग्र लक्ष्यों इसलिए कर रहे हैं: एल निकालने के लिए stagnalis भ्रूण और एक उच्च throughput फैशन में अपने कैप्सूल, लार्वा से पूर्व संकरण उपचार है कि WMISH संकेत अनुकूलन, इमेजिंग के लिए संतोषजनक WMISHsignals के साथ भ्रूण और लार्वा तैयार करने के लिए लागू करने के लिए।

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Protocol

नोट: निम्नलिखित कदम एल के भ्रूण और लार्वा चरणों पर सीटू प्रयोग में एक के संचालन के लिए हमारे विधि की रूपरेखा तैयार stagnalis। जहां एक कदम के लिए एक खतरनाक रासायनिक इस शब्द 'चेतावनी' और सभी उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं ने संकेत दिया है का इस्तेमाल शामिल है अपनाया जाना चाहिए। खतरनाक रसायनों के लिए प्रतिनिधि एमएसडीएस चादरों के लिए लिंक अनुपूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की जाती हैं। सभी अभिकर्मकों के लिए व्यंजनों अनुपूरक फ़ाइल 2 में प्रदान की जाती हैं।

1. Decapsulation उपकरण के विधानसभा

  1. ऐसा करने के लिए, के रूप में चित्रा 2A में दिखाया गया एक उचित लंबाई के लिए एक P1,000 टिप कटौती का उपयोग कर (1 मिमी की एक आंतरिक व्यास और 3 मिमी के बाहरी व्यास के साथ) सिलिकॉन टयूबिंग के लिए एक 20 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज कनेक्ट।
  2. एक औंधा बड़े पेट्री डिश के लिए एक मानक खुर्दबीन स्लाइड टेप। सिलिकॉन टयूबिंग तुरंत खुर्दबीन स्लाइड से सटे टेप के रूप में चित्र में दिखाया गया60; -2 और 2 डी।
  3. खुर्दबीन स्लाइड पर एक खींच लिया गिलास सुई आराम और धीरे सिलिकॉन टयूबिंग में डालने तक सुई की नोक ट्यूबिंग के भीतरी व्यास भर में जिस तरह का लगभग 20% protrudes (देखें चित्र -2 और 2 डी)। एक बार सुई की स्थिति टेप इसे नीचे पेट्री डिश में है।
  4. सिलिकॉन टयूबिंग के मुक्त अंत में एक और पेट्री डिश है कि Decapsulated सामग्री एकत्रित करेगा में आराम करने की अनुमति दें।

2. नमूना संग्रह, फिक्सेशन और Decapsulation

नोट: सभी कदम आरटी पर बाहर किया जाता है जब तक अन्यथा नोट।

  1. ध्यान से एक मछलीघर की दीवारों से अंडे तार इकट्ठा। ऐसा करने के लिए, अंडा स्ट्रिंग सब्सट्रेट बंद परिमार्जन करने के लिए एक रंग के रूप में लचीला प्लास्टिक का एक फ्लैट टुकड़ा का उपयोग करें, और पानी से बाहर चल अंडा स्ट्रिंग मछली के लिए एक प्लास्टिक की चाय का झरनी का उपयोग करें। स्टेज और एक माइक्रोस्कोप गाइड का उपयोग कर के तहत सामग्री चित्रा में प्रदान सुलझा1।
  2. अंडा स्ट्रिंग एक कागज तौलिया पर रखें और फेदरवेट संदंश का उपयोग अंडा जन के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाते हैं। अंडा स्ट्रिंग से बाहर अंडा कैप्सूल रोल और फेदरवेट संदंश का उपयोग कागज तौलिया के आसपास उन्हें धक्का द्वारा प्रत्येक कैप्सूल से संभव के रूप में जेली सामग्री की बहुत दूर।
  3. फेदरवेट संदंश का प्रयोग, पानी के नल के 5 मिलीलीटर युक्त एक पेट्री डिश में अंडे कैप्सूल हस्तांतरण। इस डिश में वांछित विकास के चरणों के डी-जेली का सा अंडा कैप्सूल को इकट्ठा करने के लिए आगे बढ़ें। सभी विकास के चरणों से पर्याप्त कैप्सूल ले लीजिए के लिए योजना बनाई WMISH प्रयोग तो अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
  4. जब अधिक विकसित लार्वा के साथ काम करने के लिए उन्हें निर्धारण करने से पहले चतनाशून्य (5 दिन पहले दरार (dpfc) और पुरानी पोस्ट)।
    नोट: इस करार जो सीटू धुंधला पैटर्न बहुत मुश्किल में की व्याख्या करता है से मांसपेशियों को रोकने जाएगा।
    1. आराम से लार्वा (वे अपने Capsu में अब भी कर रहे हैं, जबकिलेस) एक 2% w / v निर्धारण करने से पहले 30 मिनट के लिए 2 MgCl • 6H 2 ओ के समाधान में।
    2. लगानेवाला समाधान में अपने अंडे कैप्सूल में अभी भी कई लार्वा जबकि जलमग्न और एक खुर्दबीन के नीचे अपनी प्रतिक्रिया की निगरानी के द्वारा 30 मिनट के बाद विश्राम की डिग्री का आकलन करें। अधूरे आराम लार्वा, उनके गोले में वापस लेना है, जबकि पूरी तरह से आराम लार्वा का जवाब नहीं देंगे। अगले कदम के लिए आगे बढ़ना एक बार इन लार्वा छूट दी गई है।
  5. एक sealable ट्यूब है कि 10 बार अंडा कैप्सूल की मात्रा प्रदान करता है में एक विस्तृत बोर प्लास्टिक पिपेट का उपयोग अंडा कैप्सूल स्थानांतरण (जैसे।, बसे कैप्सूल के 1 मिलीलीटर एक 10 + मिलीलीटर ट्यूब की आवश्यकता होगी)।
  6. महाप्राण ट्यूब से जितना संभव हो उतना तरल और लगानेवाला समाधान का एक मात्रा है कि 10x बसे अंडा कैप्सूल की मात्रा के साथ बदलें। धीरे प्रत्येक विकास मंच (चित्रा 1 देखें) के लिए उपयुक्त समय के लिए आरटी पर लगानेवाला में अंडा कैप्सूल को घुमाएगी।
  7. DiscontinUE रोटेशन और कैप्सूल सिंक और एक उचित अपशिष्ट कंटेनर में लगानेवाला समाधान निकालना अनुमति देते हैं।
  8. 5 मिनट के लिए 0.1% बीच 20 (PBTw) के साथ बफर फॉस्फेट खारा के साथ लगानेवाला समाधान की जगह और आरटी पर घूर्णन द्वारा अंडा कैप्सूल धो लें। PBTw Aspirate और दो बार दोहराएँ।
  9. भ्रूण और उनके कैप्सूल तंत्र का उपयोग करने से लार्वा निकालें (जानकारी के लिए खंड 1 देखें) चित्रा 2 में दिखाया गया है। 20 मिलीलीटर सिरिंज में कैप्सूल ड्रा, ट्यूबिंग के माध्यम से और अतीत बाहर में कांच सुई ट्यूबिंग देते हैं और फिर कैप्सूल दूर संग्रह पकवान।
    नोट: आम तौर पर, सभी कैप्सूल के बहुमत (> 90%) डिवाइस के माध्यम से केवल एक पास की जरूरत होनी चाहिए। कई मामलों में कैप्सूल झिल्ली क्षतिग्रस्त है लेकिन भ्रूण और लार्वा उठी कैप्सूल के अंदर रहते हैं। बस यह सिरिंज में ड्राइंग अप और इसे फिर दूर से इस सामग्री पुनर्संसाधन।
  10. decapsulated भ्रूण और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में लार्वा एक mic का उपयोग कर लीजिएropipette (0 के लिए एक P20 - 3 दिन पुराने लार्वा, और टिप के अंत के साथ पुराने लार्वा के लिए एक P200 काट)।
    नोट: (के लिए कई महीनों के लिए) प्रोटोकॉल में इस स्तर पर किया जा सकता है एक विराम। यदि यह आवश्यक है, decapsuled सामग्री के भंडारण के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (अगले कदम के लिए जारी) में एकत्र किया जाना चाहिए। अन्यथा प्रोटोकॉल 3 करने के लिए तुरंत जारी है।
  11. भ्रूण और लार्वा ट्यूब के नीचे डूब और सतह पर तैरनेवाला aspirate करने की अनुमति दें। 33% इथेनॉल (EtOH) PBTw में साथ बदलें और 5 के लिए बैठते हैं - 10 मिनट। PBTw में 66% EtOH और 100% EtOH के साथ दोहराएँ। आरटी पर 100% EtOH में दो बार लार्वा धो लें। 100% EtOH में -20 डिग्री सेल्सियस पर सामग्री स्टोर।
  12. 10 मिनट - जारी रखने के लिए तैयार है, फिर से हाइड्रेट 100% EtOH को दूर करने और PBTw में 66% EtOH के साथ जगह से नमूने, 5 के लिए बैठते हैं। PBTw में 33% EtOH के साथ दोहराएँ, 5 के लिए बैठते हैं - 10 मिनट। अंत में PBTw की 3x 5 मिनट washes के साथ धोने सुनिश्चित करने के लिए सभी EtOH निकाल दिया जाता है।

3. Proteinase-कश्मीर, चाय और पोस्ट-फाईxation

नोट: हम छोटी टोकरी में निम्न चरणों के एक जाल फर्श के साथ सबसे कुशल और कोमल विधि जल्दी से आदान प्रदान के समय महत्वपूर्ण समाधान के लिए प्रदर्शन कर पाते हैं। जबकि इन घर बनाया जा सकता है, हम बास्केट (मध्यम आकार के) कि Intavis InSituPro -Vsi तरल से निपटने रोबोट (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc) के साथ संगत कर रहे हैं का उपयोग करें। इस तरह की टोकरियों जल्दी और आसानी से आदान-प्रदान समाधान करने के क्रम में एक 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान (टीसीडी) के कुओं के बीच ले जाया जा सकता है, या समाधान अच्छी तरह से एक पिपेट का उपयोग करने से aspirated जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सभी समाधान एक्सचेंजों बस लार्वा से सतह पर तैरनेवाला aspirating द्वारा इन टोकरियों के बिना किया जा सकता है। इस मामले में एक सज्जन घूमता गति सतह पर तैरनेवाला अच्छी तरह के किनारे से हटाया जा करने की इजाजत दी पकवान के केंद्र के लिए सभी भ्रूण और लार्वा ध्यान देना होगा। उपयोक्ता के बाद समाधान के आदान-प्रदान के लिए बास्केट रोजगार को मान लिया गया।

  1. एक विंदुक का प्रयोगएक टोकरी PBTw के 2 मिलीलीटर के साथ एक 12 अच्छी तरह से टीसीडी में बैठे में हस्तांतरण भ्रूण और लार्वा।
    नोट:। भ्रूण और / या लार्वा जोड़ा जा सकता है कि विकास के चरण पर निर्भर करता है की संख्या की जांच की जा रही है, हालांकि अंगूठे का एक सामान्य नियम के फर्श अंतरिक्ष भ्रूण / लार्वा (यानी की मुफ्त के कम से कम 25% बनाए रखने के लिए है, नहीं है टोकरी पल्ला झुकना)।
  2. उचित Proteinase कश्मीर समाधान (चित्रा 1 देखें) के 2 मिलीलीटर, और 0.2% के 2 मिलीलीटर ग्लाइसिन प्रत्येक के साथ एक और 2 कुओं के साथ अच्छी तरह से एक बगल तैयार करें। Proteinase-कश्मीर की उचित एकाग्रता अच्छी तरह से युक्त टोकरी में प्रत्येक ले जाएँ और तुरंत समय शुरू करते हैं।
  3. 10 मिनट के बाद एक अच्छी तरह से युक्त 0.2% ग्लाइसिन में प्रत्येक टोकरी के लिए कदम और 5 मिनट के लिए सेते हैं। फिर 0.2% ग्लाइसिन के साथ दूसरे को अच्छी तरह से प्रत्येक में टोकरी के लिए कदम और 5 मिनट के लिए सेते हैं। 3 मिलीग्राम PBTw की 3x 5 मिनट के आदान-प्रदान के साथ ग्लाइसिन बाहर धो लें।
  4. PBTw समाधान निकालें और हौसले से तैयार triethanolamine (चाय) सोल के साथ एक बार नमूने का इलाज5 मिनट सावधानी के लिए संविधान! आंदोलन नहीं। 5 मिनट के लिए हौसले से तैयार चाय समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें। आंदोलन नहीं। नमूनों से चाय समाधान के बहुमत aspirate। एसिटिक एनहाइड्राइड (TEAAA) समाधान के साथ हौसले से तैयार triethanolamine जोड़ें और 5 मिनट। सावधानी के लिए सेते हैं! आंदोलन नहीं।
  5. वैकल्पिक - ऊपर चरण incubating है, वहीं TEAAA समाधान का एक और ताजा बैच तैयार है और ऊपर चरण दोहराएँ।
    नोट: TEAAA के साथ यह दूसरी उपचार वैकल्पिक है, लेकिन पूरी तरह से पृष्ठभूमि पैदा होने का खतरा जांच के साथ सभी पृष्ठभूमि को खत्म करने में मदद मिल सकती है।
  6. अच्छी तरह से यह श्वास द्वारा TEAAA समाधान निकालें और PBTw के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें। आंदोलन नहीं। PBTw निकालें और PBTw में 3.7% formaldehyde के 3 मिलीलीटर लागू होते हैं। धीरे से एक 30 मिनट ऊष्मायन के दौरान कभी कभी ज़ुल्फ़।
  7. अच्छी तरह से यह श्वास द्वारा लगानेवाला निकालें और PBTw के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सामग्री हस्तांतरण। आरसंकरण बफर के साथ PBTw eplace और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं - सावधानी।
  8. नलियों आरटी पर एक गर्म ब्लॉक में रखें, और वांछित संकरण तापमान के तापमान की स्थापना की।
    नोट: संकरण तापमान विशिष्ट जांच है और अनुभव से अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी, लेकिन हम 55 डिग्री सेल्सियस शुरू में परीक्षण करने के लिए एक अच्छा तापमान हो पाते हैं। ब्लॉक संकरण तापमान के लिए आते हैं, और नमूने लगभग 15 मिनट के लिए पूर्व संकरण की अनुमति के लिए अनुमति देते हैं (यानी, समय यह riboprobes तैयार करने के लिए ले जाता है, लंबे समय तक आवश्यक नहीं है)। पर्याप्त मात्रा में पतला riboprobes का (सामान्य रूप से 100 μl) तैयार करें। हम एक प्रारंभिक सीमा के रूप में 100 और 500 एनजी / एमएल के लिए आम तौर पर परीक्षण जांच सांद्रता। हम 12 के अनुसार riboprobes तैयार करते हैं।
  9. नमूनों से संकरण बफर निकालें और नमूने के संकरण बफर में जांच जोड़ने। 100 μl (या एक पर्याप्त मात्रा के साथ ओवरले संकरण buffe ऊपर एक चरण के लिए फार्मआर) खनिज तेल का।
    ध्यान दें: खनिज तेल व्यापक संक्षेपण कि लंबा संकरण चरण के दौरान बनेगी रोकता है। व्यापक संक्षेपण काफी दोनों संकरण समाधान के रसायन शास्त्र और जांच की एकाग्रता बदल जाएगा।
  10. जांच और 10 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूने हीटिंग द्वारा लक्ष्य शाही सेना denature, फिर वांछित संकरण तापमान से गर्मी कम। (- 48 घंटा 24) संकरण 12 घंटा (ओ / एन) या उससे अधिक समय की एक न्यूनतम के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
  11. संकरण के दौरान, गर्मी ब्लॉक से एक एकल ट्यूब को हटाने के लिए यह तेजी से बारी बारी से अंगूठे और तर्जनी के बीच तेल चरण के बिना परेशान लार्वा को निलंबित करने, और गर्मी ब्लॉक में बदलें। 12 घंटा या तो - इस बार हर 6 दोहराएँ।

4. हॉट Washes और Immunodetection

नोट: हम निम्न चरणों के लिए एक तरल से निपटने रोबोट का इस्तेमाल करते हैं, ये भी आसानी से मैन्युअल रूप से किया जा सकता है। इस मामले में, भ्रूण और लार्वा थानेदारULD 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों वे में संकरित गया में रखा जाए। बाद के सभी समाधान के आदान-प्रदान से aspirated और एक P1,000 विंदुक के साथ जोड़ रहे हैं। जब मैन्युअल रूप से प्रदर्शन निम्न चरणों में से प्रत्येक के लिए प्रत्येक समाधान के 1 मिलीलीटर काम करना चाहिए।

  1. हीट पर्याप्त मात्रा में 4x, 2x की (प्रत्येक नमूने के लिए प्रत्येक 3 एमएल) और संकरण तापमान को 1x धोने समाधान।
  2. सभी नमूनों संकरण के तापमान पर 15 मिनट प्रत्येक के लिए 4x धो बफर में तीन बार धोएं। सभी नमूनों संकरण के तापमान पर 15 मिनट प्रत्येक के लिए 2x धो बफर में तीन बार धोएं। सभी नमूनों संकरण के तापमान पर 15 मिनट प्रत्येक के लिए 1x धो बफर में तीन बार धोएं।
  3. 1x सोडियम क्लोराइड सोडियम साइट्रेट बफर + 0.1% बीच (एसएससी + 0.1% के बीच) संकरण के तापमान पर के साथ एक बार सभी नमूनों को धो लें। नमूने आरटी को शांत करने की अनुमति दें।
  4. सभी नमूनों Maleic एसिड बफर (एमएबी) के साथ इस 1x एसएससी समाधान बदलें 15 मिनट के लिए 1x एसएससी + 0.1% बीच में दो बार धोएं और 10 मिनट के लिए बैठते हैं एमएबी डब्ल्यू दोहराएँराख। ब्लॉक समाधान के साथ एमएबी बदलें और 1.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. (1: ब्लॉक समाधान में एंटीबॉडी के 10,000 कमजोर पड़ने) एंटीबॉडी समाधान के लिए ब्लॉक समाधान के आदान प्रदान और कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर 12 घंटा (ओ / एन) के लिए सेते हैं।

5. रंग विकास और बढ़ते

  1. एंटीबॉडी समाधान Aspirate और 10 मिनट प्रत्येक के लिए PBTw के साथ 15 बार धो लो। 1x alkaline फॉस्फेट बफर (एपी) के साथ PBTw बदलें और 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. सावधानी - जबकि उपरोक्त ऊष्मायन कदम आय, एपी धुंधला समाधान तैयार (अनुपूरक फ़ाइल 2 देखें)। अच्छी तरह से एक टीसीडी में सामग्री हस्तांतरण और एपी धुंधला समाधान के साथ 1x एपी समाधान की जगह। नोट अब समय तो यह है कि समय की लंबाई रंग प्रतिक्रिया दर्ज किया जा सकता है के लिए जगह लेता है। धुंधला पैटर्न के विकास पर नजर रखने तक पृष्ठभूमि अनुपात संकेत हो सकता है।
  3. रंग विकास को रोकने के लिए, 1x एपी धुंधला समाधान निकालने (उचित wast में निपटानेई कंटेनर), और PBTw के 2 मिलीलीटर लागू करते हैं और अब समय ध्यान दें। 5 मिनट प्रत्येक के लिए PBTw के साथ दो बार अधिक कुल्ला। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सामग्री हस्तांतरण करने के लिए इन rinses में से एक का प्रयोग करें।
  4. PBTw निकालें और PBTw में 3.7% formaldehyde के 1 मिलीलीटर लागू करते हैं और आंदोलन या आरटी पर कम से कम 30 मिनट के लिए बारी बारी से (यह भी हे / एन किया जा सकता है)।
  5. पीबीटी के 3 washes (एक उचित अपशिष्ट कंटेनर में अपशिष्ट निपटान के लगानेवाला) के साथ लगानेवाला बाहर धो लें। नमूने de-ionized पानी में 50 डिग्री सेल्सियस पर 3 बार धोएं।
    नोट: इन washes लवण की वर्षा कि समाशोधन और दृश्य चरणों के दौरान दृष्टिगोचर हो सकता है समाप्त।
  6. तय नमूने बेंजाइल बेंजोएट में रखा जाना चाहिए या नहीं: बेंजाइल अल्कोहल (बी बी: ​​बीए, भी मूर्रे स्पष्ट रूप में जाना जाता है) या ग्लिसरॉल।
    नोट: एल के रूप में बीए: हम और अधिक शक्तिशाली समाशोधन एजेंट बी बी पसंद करते हैं stagnalis भ्रूण कुछ हद तक अपारदर्शी हैं। नमूने बी बी में रखा जाएगा: बीए प्रथम एक इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से निर्जलित करने की आवश्यकता होगी। नमूने 60% में रखा जाएगाग्लिसरॉल तुरंत रखा जा सकता है।
  7. (: बीए या 60% ग्लिसरॉल बी बी) एक पिपेट का उपयोग बढ़ते समाधान में नमूने स्थानांतरण।
    नोट: जब बी बी में बढ़ते: बीए यह एक गिलास में अच्छी तरह से किया जाना चाहिए (बी बी: ​​बीए पॉली कार्बोनेट प्लास्टिक पिघल जाएगा)।
  8. 10 मिनट के लिए, और फिर spacers के रूप में खड़ी coverslips का एक उचित संख्या (1 नमूने <1 dpfc, लिए नमूने 2 coverslips> 1 dpfc के लिए coverslip) का उपयोग कर एक स्लाइड पर उन्हें माउंट - नमूने 5 के लिए स्पष्ट करने की अनुमति दें।
    नोट: पूरे mounts अब डीआईसी प्रकाशिकी के साथ एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged किया जा सकता है।

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Representative Results

प्रतिनिधि WMISH धुंधला 3 चित्र में दिखाया पैटर्न तकनीक ऊपर वर्णित का उपयोग कर उत्पन्न हुए थे, और आणविक खोल गठन से लेकर प्रक्रियाओं की एक श्रेणी में शामिल जीनों के लिए स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न की एक किस्म को प्रतिबिंबित (उपन्यास जीन 1, 2, 3 और 4), प्रतिलेखन विनियमन (Brachyury) विकास के चरणों की एक सीमा के पार करने के लिए सेल सेल संकेतन (डीपीपी) के लिए। हम इन जीनों हम उम्मीद करते हैं कि वे भी होगा की अभिव्यक्ति के स्तर मात्रा निर्धारित नहीं किया है जबकि काफी भिन्नता है, यह दर्शाता है कि हमारे विधि विभिन्न स्तरों पर विकास के सभी चरणों में व्यक्त जीन उत्पादों की एक व्यापक विविधता के खिलाफ लागू किया जा सकता है। केवल यहां प्रस्तुत जीन (डीपीपी) में से एक पहले से एल में वर्णित किया गया है stagnalis 21,22। परिणाम हम यहाँ मौजूद इन पिछली रिपोर्टों के साथ रखने में काफी हद तक कर रहे हैं, लेकिन काफी अधिक स्थानिक Reso साथ lution। Brachyury के स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न का सीप 23 में वर्णित किया गया है और 24 लंगड़ाहट और दोनों ही मामलों में भी विरासत कोशिकाओं में पाया गया था के रूप में हम एल के लिए मिल stagnalis (चित्रा 3F)। सीधे खोल गठन में शामिल जीन उत्पादों की पहचान करने के लिए बनाया गया एक प्रोटिओमिक स्क्रीन से 4 (और इसलिए उनके स्थानिक अभिव्यक्ति खोल ग्रंथि (चित्रा 3 ए और बी) या खोल क्षेत्र (चित्रा -3 सी और डी के साथ जुड़े पैटर्न) कर रहे हैं - हम उपन्यास जीन पृथक 1 पूरी तरह से खोल बनाने के कार्यों के साथ अनुकूल। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि उच्च throughput तकनीक हम अंडा कैप्सूल से भ्रूण और लार्वा को दूर करने के लिए विकसित किया है, और बाद में मंच-विशिष्ट permeabilization उपचार, पूरे माउंट नमूने है कि सीटू धुंधला में उच्च गुणवत्ता निकलेगा उत्पन्न भ्रूण और लार्वा विकास के सभी चरणों के लिए जीन की एक विस्तृत विविधता के लिए पैटर्न।

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चित्रा 1. एक संक्षिप्त Lymnaea stagnalis की ontogeny और इसी फिक्सेशन और Proteinase कश्मीर उपचार। विकास के पहले 7 दिनों से भ्रूण और लार्वा की छवियों प्रतिनिधि आकार (पंक्ति 1) में एक उल्लेखनीय वृद्धि और रूपात्मक जटिलता को समझाना (पंक्तियों 2 और 3) । ये विकासात्मक परिवर्तन और proteinase कश्मीर सांद्रता कि इष्टतम WMISH संकेतों को उत्पन्न उचित निर्धारण समय में बड़े मतभेद में अनुवाद। WMISH के लिए सभी चरणों उनकी अंडा कैप्सूल के भीतर कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर पीबीएस में 3.7% formaldehyde में तय की जानी चाहिए। सभी चरणों तो 10 मिनट के लिए उचित Proteinase कश्मीर एकाग्रता के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए। ध्यान दें कि हम अपने आपूर्तिकर्ता से Proteinase-कश्मीर की गतिविधि में महत्वपूर्ण अंतर-बैच भिन्नता निरीक्षण करते हैं। इस बदलाव performi के हिसाब से किया जाना चाहिएएनजी 'औजार' WMISH प्रयोगों के एक दौर में जहां नए Proteinase-कश्मीर की गतिविधि अनुभव से निर्धारित किया जाता है। चित्रा में कहा गया है Proteinase कश्मीर सांद्रता इसलिए एक प्रारंभिक गाइड, हालांकि विकास के चरणों के बीच सापेक्ष सांद्रता के रूप में व्यवहार किया जाना चाहिए सेट कर रहे हैं (उदाहरण के लिए 2 दिन पुराने भ्रूण एक Proteinase कश्मीर एकाग्रता 3 गुना दिन की तुलना में अधिक 1 भ्रूण की आवश्यकता होती है)। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. उपकरण Decapsule एल के लिए प्रयुक्त stagnalis भ्रूण। (ए) तंत्र का अवलोकन है कि कुशलतापूर्वक एल दूर कर सकते हैं stagnalis भ्रूण और लार्वा उनकी कैप्सूल से। (बी) के एक बढ़ाया देखेंमें पीले बॉक्सिंग क्षेत्र (ए)। एक तेज गिलास सुई खुर्दबीन स्लाइड पर रखा गया है और डाला सिलिकॉन टयूबिंग में (भीतरी व्यास 1 मिमी, बाहरी व्यास 3 मिमी) ऐसी है कि टिप ट्यूबिंग की गुहा में जिस तरह का लगभग 20% protrudes है। कांच सुई तो भी खुर्दबीन स्लाइड और पेट्री डिश के लिए टेप है। (सी) ए अंडे तय भ्रूण और लार्वा युक्त कैप्सूल में पीले बॉक्सिंग अनुभाग का एक योजनाबद्ध 'योजना' को देखने के पहले 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं। सिरिंज तो सिलिकॉन टयूबिंग से जुड़ा हुआ है और कैप्सूल ट्यूबिंग के माध्यम से और सुई अतीत निष्कासित कर दिया। अंडा कैप्सूल झिल्ली सुई द्वारा फाड़ रहे हैं और मुक्त भ्रूण और लार्वा सामग्री एक micropipette का उपयोग संग्रह पकवान से एकत्र किया जा सकता है। (डी) ए में पीले बॉक्सिंग अनुभाग का एक योजनाबद्ध 'क्रॉस सेक्शन' देखें खुर्दबीन स्लाइड सुनिश्चित करता है कि सुई सही ऊंचाई पर सिलिकॉन टयूबिंग में प्रवेश करती है। (एफ) कि तंत्र के माध्यम से एक भी पास कर दिया है लार्वा का एक प्रतिनिधि देखें। सामग्री के 90% से अधिक प्रभावी ढंग से और धीरे उनकी कैप्सूल से हटा दिया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
जीन की एक किस्म के खिलाफ WMISH अभिव्यक्ति पैटर्न के चित्रा 3. प्रतिनिधि छवियाँ एल की एक सीमा से बीए (मूर्रे स्पष्ट):। उपरोक्त विधि में वर्णित के रूप में और बढ़ गया है और imaged बी बी में यहाँ वर्णित विधि द्वारा उत्पन्न stagnalis विकास के चरणों सभी विकास के चरणों प्रोसेस किया गया। अनुमानित उम्र के लिए संकेत कर रहे हैंप्रत्येक पैनल और ओरिएंटेशन के पी सही निचले सही में संकेत दिया है। जीन orthology (जब जाना जाता है) प्रत्येक पैनल के निचले बाएँ में संकेत दिया है। लघुरूप: खोल ग्रंथि (एसजी); खोल क्षेत्र (एस एफ); मेंटल (एमटी); पैर (एफटी); Decapentaplegic (डीपीपी); dpfc (दिनों के बाद पहली दरार)। सभी स्केल सलाखों 20 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विधि यहाँ वर्णित Lymnaea stagnalis के सभी विकास के चरणों के भीतर अभिव्यक्ति के स्तर शायद बदलती के साथ शाही सेना टेप के कुशल दृश्य के लिए अनुमति देता है। उनकी कैप्सूल से भ्रूण और लार्वा को दूर करने के लिए हम अन्य encapsulated- के लिए सूचना दी रासायनिक, आसमाटिक सदमे और शारीरिक उपचार की एक किस्म trialed मॉडल जीवों का विकास। हालांकि, हमारे हाथों में विधि हम यहाँ वर्णन केवल उच्च throughput तकनीक है कि भ्रूण और लार्वा को नुकसान पहुँचाए बिना कठिन सम्पुटी झिल्ली को दूर करता है। decapsulation के बाद, सामग्री या तो संग्रहित किया जा सकता है, या Proteinase-कश्मीर के एक मंच के विशिष्ट आहार के साथ व्यवहार किया जाता है और फिर एक riboprobe संकरित। अतिरिक्त अनुभवजन्य अनुकूलन के प्रयासों (आमतौर पर जांच एकाग्रता और संकरण तापमान पर ध्यान केंद्रित) हर जांच / लक्ष्य के लिए आवश्यक हो सकता है। इन मानकों (निर्धारण आहार और proteinase कश्मीर उपचार के अलावा) आम तौर पर सबसे प्रभावशाली मानकों हैंसीटू प्रयोग में किसी भी (यह मानते हुए कि निर्धारित सामग्री की गुणवत्ता और आरएनए जांच एक उच्च स्तर के हैं)।

सीटू प्रयोग में एक के अंतिम परिणाम के लिए एक उपयुक्त Proteinase कश्मीर उपचार के महत्व एल के लिए सर्वोपरि है stagnalis। इस Proteinase कश्मीर अलग विकास के चरणों (0 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से 500 माइक्रोग्राम / एमएल से लेकर) द्वारा अपेक्षित सांद्रता की व्यापक रेंज में दिखाई देता है। इसलिए यह एक व्यष्टिविकास खिड़की करने के लिए एक दिया अंडा स्ट्रिंग आवंटित करने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रयोजन के लिए दिशानिर्देश कि हम चित्र 1 में प्रदान अज्ञात उम्र के विकासात्मक सामग्री के मंचन के लिए अनुमति देता है (यह आंकड़ा का एक प्रिंट के अनुकूल संस्करण उपयोगकर्ताओं माइक्रोस्कोप में है जब सामग्री के मंचन उपयोगी मिल सकता है कि अनुपूरक फ़ाइल 3 में उपलब्ध है) । हम ध्यान दें कि WMISH के लिए gastropods Proteinase कश्मीर उपचार की अन्य प्रजातियों के लिए या तो विकास की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए स्थिर रखा जा सकता हैpmental चरणों 8,25,26, या पूरी तरह से 27 छोड़ा जा सकता है। इस एल में स्थिति के विपरीत में है stagnalis। इसके अलावा, जबकि अन्य अनुसंधान समूहों में पहले एल में कई जीनों के लिए WMISH अभिव्यक्ति पैटर्न को सूचित किया है stagnalis लार्वा (22,28,29 देखें) तरीका है कि हम यहाँ वर्णन काफी अधिक स्थानिक संकल्प के पैटर्न अर्जित करता है। अंत में, हम हमारे सप्लायर से Proteinase-कश्मीर की गतिविधि में महत्वपूर्ण अंतर-बैच बदलाव देखा है। इस बदलाव 'औजार' WMISH प्रयोगों जहां नई Proteinase-कश्मीर की गतिविधि अनुभव से निर्धारित किया जाता है के एक दौर के प्रदर्शन के हिसाब से किया जाना चाहिए। कि बैच से Proteinase-कश्मीर की aliquots के साथ बाद के सभी प्रयोगों तो स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है।

हम पहले एल के लिए एक वैकल्पिक विधि वर्णित WMISH stagnalis भ्रूण और लार्वा कहीं और 12। यही कारण है कि विधि mucolyt के उपयोग में विस्तृतआईसी एजेंट एन एसिटाइल-एल सिस्टीन (एनएसी), इस तरह के dithiothreitol (डीटीटी) और सोडियम सल्फेट dodecyl के साथ एक पूर्व संकरण उपचार (एसडीएस) के रूप में एक एजेंट को कम करने। हम उन उपचार कुछ विकास के चरणों के लिए बढ़ाया कुछ जीनों के धुंधला पैटर्न पाया। निर्धारण रणनीति (उनके कैप्सूल के भीतर लार्वा फिक्सिंग) कि हमने हाल ही में विकसित की है और यहाँ का वर्णन सरल और सीटू प्रयोग में एक के लिए सामग्री तैयार करने के लिए आवश्यक कदम expedites, और जाहिरा तौर पर अनुभव से एनएसी, डीटीटी के साथ अतिरिक्त इष्टतम पूर्व संकरण उपचार का निर्धारण करने के लिए जरूरत नकारती या एसडीएस। तकनीक यहां बताया करने के लिए भविष्य शोधन (निम्न मानक WMISH प्रोटोकॉल पहले 30 सूचना के लिए संशोधन) microRNAs के दृश्य, mRNA की डबल या ट्रिपल लेबलिंग 31 लक्षित करता है, और WMISH संकेतों 32 के फ्लोरोसेंट दृश्य शामिल हो सकते हैं। यकीनन तकनीक की सबसे बड़ी सीमा समय की कुल लंबाई यह collectin से जाने के लिए लेता हैजी सामग्री, एक डिजिटल छवि है कि किसी जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का प्रतिनिधित्व करने के लिए। जैव रासायनिक और biophysical घटनाओं है कि इस तरह के एक प्रक्रिया के दौरान जगह ले जाना होगा की प्रकृति के कारण इस सीटू संकरण प्रोटोकॉल में सबसे का एक अंतर्निहित सुविधा है।

Lymnaea Metazoa है कि अत्यंत मॉडल जीवों के मामले में कम प्रतिनिधित्व के भीतर एक स्थान रखता है। एक प्रतिनिधि Spiralian के रूप में, इस तरह के Lymnaea खोल गठन के 12 और शरीर मनमानी 33-35 के रूप में अलग रूपात्मक सुविधाओं के विकास में अंतर्दृष्टि लाने के लिए और भी एक मूल्यवान neuroethology 36 और neurophysiology मॉडल 9,37 है सकते हैं। इस तरह की क्षमता कुशलता बगल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न कल्पना करने के लिए के रूप में शक्तिशाली तकनीक एक मॉडल जीव के रूप में Lymnaea की कार्यक्षमता बढ़ जाती है, और सवाल है कि यह पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की विविधता broadens। ऐसे समय में जब बड़े अनुक्रम Dat की पीढ़ीasets (पूरा transcriptomes और यहां तक ​​कि जीनोम) अपेक्षाकृत दिनचर्या, इस तरह के तरीकों इस तरह के मॉडल से अनुक्रम डेटा की व्याख्या करने के लिए बधाई देने के लिए बाढ़ के शोधकर्ताओं के लिए और अधिक प्रासंगिक हो जाएगा। Lymnaea एक अपेक्षाकृत निकाली गई gastropod 38 है, और क्या अन्य मॉडल जीवों (1.22 जीबी 39) की तुलना में एक बड़े जीनोम पर विचार किया जाएगा पास है, यह कई व्यावहारिक और दिलचस्प सुविधाओं है कि यह एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाने की है। तरीकों कि हम यहाँ वर्णन टूलबॉक्स Lymnaea के लिए उपलब्ध विस्तार और अन्य प्रजातियों कि गुजरना विकास समझाया लिए उपयोग की जा सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

इस काम DFG परियोजना # JA2108 / 2-1 के माध्यम से DJJ को धन के द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

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References

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