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1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
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Biology

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Summary

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Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

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Abstract

整体原位杂交(WMISH)是一种技术,其允许核酸分子(通常的mRNA)的“整装'组织制剂内的空间分辨率,或发育阶段(例如胚胎或幼虫)的兴趣。 WMISH是非常强大的,因为它可以显著有助于复杂的后生动物基因组的功能特性,正在成为更多的瓶颈与下一代序列数据的泛滥是一个挑战。尽管该技术多的时间,通常需要以优化固有为新颖模型系统WMISH实验的各种参数的概念简单;在组织类型和发育阶段之间的细胞和生化特性的细微差异意味着一个单WMISH方法可能并不适用于所有的情况。我们已经制定了一套产生一致的和重新出现的腹模型静水椎实螺 WMISH方法明确WMISH信号一系列的基因,并在所有发展阶段。这些方法包括未知实足年龄的幼虫到一个个体发育窗口分配,有效地除去胚胎和幼虫从它们的卵胶囊剂合适的蛋白酶K处理的每个个体发育窗口的应用,和杂交,杂交后和免疫检测脚步。这些方法提供从其中对于给定的RNA转录所得到的信号可以是与探测器专用的调整(主要探针浓度和杂交温度)进一步精制的基础。

Introduction

软体动物是一组持有学科的广泛多样化的利益动物。尽管他们的形态多样性1,物种丰富度(仅次于节肢动物的种类数2项)和相关性,以广泛的商业3,4医学和科学问题5-8,也有可以称得上相对较少的种软体动物既装备精良的科学模型,容易在实验室环境维护。即多使用学科,如神经生物学9,生态毒理学10和最近的进化生物学11,12一种软体动物,是静水椎实螺,主要是它的广泛分布和极端易于维护的,因为。尽管它作为一种“模式”有机体的知名度和其悠久的历史使用通过提供给L.发育生物学家13-19,分子工具的范围和功率stagnALIS科学界位于远远落后于更为传统的动物模型( 果蝇 ,小鼠,海胆,线虫)。

我们的愿望,开发椎实螺的分子模型在指导蛋壳形成的分子机制的兴趣茎。这促使我们缩小一组技术,将允许对椎实螺的发育过程中的基因表达的有效的,一致的和敏感的可视化。 整体原位杂交(WMISH)被广泛用于各种模式生物的和已经使用了超过40年20。在它的不同的形式,ISH可以采用在空间上定位于染色体,rRNA基因,mRNA和微RNA的特异位点。

面临的挑战之一,我们需要解决炼制WMISH方法L.之前stagnalis是温和而有效地提取胚胎和从T不同阶段的幼虫的问题他在它们所沉积的蛋胶囊。该提取或“解封”,需要被有效地实现,以收集足够的物质用于现场试验给出,而在同一时间保持形态和细胞完整性。虽然其他模式生物,也经历了发展封装,在我们手中没有任何报道这些物种的方法可以成功地使用L. stagnalis。

因此该方法的总体目标是:以提取L. stagnalis从它们在高通量胶囊,胚胎和幼虫以施加优化WMISH信号,以提供满意的WMISHsignals用于成像准备胚胎和幼虫预杂交处理。

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Protocol

注:以下步骤概括我们的方法对L.的胚胎和幼体阶段进行的现场试验stagnalis。当一个步骤涉及使用危险化学品这是由词'小心'和所有适当的安全程序的表示应采用。在补充文件1提供链接代表MSDS表的危险化学品。所有试剂配方在补充文件2提供。

1.解封设备的组装

  1. 要做到这一点,连接20ml的一次性注射器,以硅管(1毫米的内径为3毫米的外径),使用P1,000尖切至适当的长度, 如图2A所示。
  2. 磁带标准显微镜幻灯片倒大培养皿。胶带紧邻显微镜载玻片的硅管, 如图60;图2C和2D。
  3. 搁置在显微镜载玻片一个拉玻璃针,轻轻将其插入硅导管,直到针尖突出的横跨管件的内径的方式约20%(参见图2C和2D)。一旦针在定位磁带下来的培养皿。
  4. 允许在硅管的自由端,以另一培养皿,将收集的解封装材料休息。

2.样品收集,固定和解封

注:所有步骤都在室温下进行,除非另有说明。

  1. 仔细收集来自水族馆的墙壁鸡蛋串。要做到这一点,使用一块平坦的柔性塑料作为铲刮鸡蛋串从基材,并用塑料滤茶鱼浮蛋串出水面。阶段并在提供了使用导在显微镜下材料排序1。
  2. 鸡蛋串放置到纸巾,并沿着使用轻量级镊子的卵块的纵向切口。滚动蛋胶囊出来的蛋串的,并通过使用轻量级镊子推动他们周围的纸巾从每个胶囊除去尽可能多的果冻材料尽可能的。
  3. 使用轻量级镊子,转移蛋胶囊成含有5毫升自来水的皮氏培养皿。继续收集所需的发育阶段的脱果冻卵胶囊进入这个菜。收集所有发育阶段足够胶囊计划WMISH实验然后进行下一个步骤。
  4. 当与较发达的幼虫工作(后5天第一次卵裂(DPFC)及以上)前麻醉他们固定。
    注意:这将防止肌肉染上这使得解释原位染色模式非常困难。
    1. 放松幼虫(而他们仍然在他们的capsu莱)中的MgCl 2•6H 2 O:用于固定前30分钟2%w / v的溶液。
    2. 通过在固定剂溶液中的蛋胶囊仍然浸没几幼虫而和监测在显微镜下它们的响应评估30分钟后放松程度。不完全放松的幼虫会缩回到他们的炮弹,而完全放松幼虫会不会响应。一旦这些幼虫已放宽继续进行下一步。
  5. 转移使用宽孔塑料吸管蛋胶囊成可密封管提供蛋胶囊10倍的体积( ,将1ml定居胶囊将需要10+毫升管)。
  6. 抽吸尽可能多的液体尽可能从管中并用固定剂溶液的体积是10倍的定居蛋胶囊的体积替换。在RT轻轻转动在固定剂蛋胶囊的适当的时间为每个发育阶段(参见图1)。
  7. DiscontinUE旋转并允许胶囊下沉,吸固定液到合适的废物容器中。
  8. 通过用0.1%吐温-20(PBTw)替换用磷酸盐缓冲盐水固定液和旋转在RT 5分钟洗蛋胶囊。吸出PBTw,重复两次。
  9. 除去胚胎和使用该装置的胶囊幼虫(详见第1部分)在图2中所示的向上绘制胶囊进20毫升注射器,通过管道并经过玻璃针伸到连接管,然后消除胶囊集合菜。
    注意:通常情况下,所有的胶囊的大部分(> 90%)应该只需要一个通过该装置通。在许多情况下,胶囊型膜被破坏,但胚胎和幼虫仍破裂胶囊内部。通过简单地画起来到注射器中,再消除它重新处理该材料。
  10. 收集胚胎解封和幼虫到1.5毫升管使用麦克风ropipette(为0 P20 - 3天老幼虫,并为与尖端的端部较旧的幼虫P200的切断)。
    注:暂停(长达数月)中的协议可以在这个阶段进行。如果需要的话,该decapsuled材料应被收集到1.5ml试管进行存储(继续到下一个步骤)。否则立即继续协议3。
  11. 允许胚胎和幼虫下沉到管的底部,并吸出上清液。用33%乙醇(乙醇)在PBTw更换,让坐5 - 10分钟。 66%乙醇中PBTw和100%的乙醇重复。在RT在100%EtOH中洗幼体两次。在100%的乙醇-20℃保存材料。
  12. 当准备继续,重新水合物通过去除100%的乙醇和PBTw 66%乙醇代替样本,让我们坐5 - 10分钟。用33%乙醇重复PBTw,让坐在5 - 10分钟。最后用PBTw的3倍5分钟洗洗澡以保证所有的乙醇被删除。

3.蛋白酶K,TEA和Post-Fi无线xation

注:我们发现在执行篮子小下面的步骤与网格地板最有效和最温和的方法快速交换时间关键型解决方案。虽然这些可以自制,我们使用的是与Intavis InSituPro -Vsi液体处理机器人(www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc)兼容篮(中等大小)。这样筐可以快速并容易地以一个12孔组织培养皿(TCD)的孔之间移动交换的解决方案,或该溶液可从井使用移液管被吸出。另外,可以在没有这些篮子只需吸从幼虫上清执行的所有解决方案的交流。在这种情况下,轻轻旋转运动将集中所有​​的胚胎和幼虫的菜允许从井的边缘除去上清液的中心。下面假设用户采用的解决方案交流篮子。

  1. 用移液管,移植胚胎和幼虫成一篮子坐在12以及TCD用2毫升PBTw的。
    注:可以添加依赖于发育阶段的胚胎和/或幼虫的数量正在调查,但一般的经验法则是保持无胚胎/幼虫( 建筑面积的25%以上,不过度拥挤的篮子)。
  2. 用2ml合适的蛋白酶K溶液(参见图1)的,和另外2孔与每个2毫升0.2%甘氨酸制备的相邻井。移动每个篮子到蛋白酶-K的孔含有适当浓度,并立即开始计时。
  3. 10分钟后移至各筐成孔含有0.2%甘氨酸和孵育5分钟。然后每筐移动到第二井用0.2%甘氨酸和孵育5分钟。洗出甘氨酸用3ml PBTw的3倍5分钟的交流。
  4. 取出PBTw溶液,并用新鲜配制的三乙醇胺(TEA)溶胶曾经治疗样本ution 5分钟小心!不要搅动。用3毫升5分钟新鲜制备的TEA溶液替换。不要搅动。吸多数来自样品TEA溶液。加入与乙酸酐(TEAAA)解决方案新鲜配制三乙醇胺和孵育5分钟。 注意!不要搅动。
  5. 可选 - 虽然上述步骤孵化,准备新一轮的新一批TEAAA解决方案,并重复上述步骤。
    注意:这与TEAAA第二次处理是可选的,但可能有助于完全消除所有的背景,探头容易产生背景。
  6. 通过从井中吸取它取出TEAAA溶液并用3ml PBTw的替换。不要搅动。取出PBTw和应用3毫升3.7%甲醛PBTw。 30分钟温育过程中轻轻偶尔摇动。
  7. 由井吸它取出固定液,并用3ml PBTw的更换。材料转移到1.5ml试管。 - [RE放置PBTw与杂交缓冲液,并在室温下孵育5分钟 - 注意。
  8. 管放入在RT热块,并设置温度到所需的杂交温度。
    注:杂交温度探测器专用,将需要凭经验优化,但是我们发现55°C是一个很好的温度开始审判。允许块来杂交温度,并允许样品预杂交约15分钟( 即,它需要制备的核糖核酸探针,更长的时间是没有必要的)。准备足够的体积(通常在100微升)稀释核糖核酸探针的。我们的100和500 ng / ml的典型试验探针浓度为初始范围。我们按照12准备的核糖核酸探针。
  9. 从样品中除去杂交缓冲液,并在杂交缓冲液中添加所述探针的样品。覆盖用100μl(或足够的量,以形成杂交buffe上方的相矿物油中的R)。
    注:矿物油防止广泛凝聚,将在漫长的杂交步骤形成。广泛缩合将显著改变杂交溶液两者的化学和探针的浓度。
  10. 变性探针和样品加热至75℃10分钟,靶RNA,然后加热减少到所需的杂交温度。允许杂交进行了至少12小时(O / N)或更长的时间(24 - 48小时)。
  11. 在杂交从热块删除单个管,拇指和食指之间迅速将其旋转到暂停幼虫,而不会干扰油相,并在加热块代替它。重复此每隔6次 - 12小时左右。

4.热清洗和免疫检测

注意:尽管我们使用液体处理机器人为执行以下步骤,这些也可以很容易地手动完成。在这种情况下,胚胎和幼虫抄ULD被保持在它们在杂交1.5毫升管。随后的所有溶液交换吸出,并用P1,000吸管加入。当手动进行的各步骤如下应该使用各1ml溶液。

  1. 热充足体积(每一个用于每个样品3ml)中的4倍,2倍和1倍洗涤溶液的杂交温度。
  2. 洗所有的样品在4×洗涤缓冲液三次,每次15分钟,在杂交温度。洗所有的样品在2×洗涤缓冲液三次,每次15分钟,在杂交温度。洗所有样品在1×洗涤缓冲液三次,每次15分钟,在杂交温度。
  3. 与在杂交温度1×氯化钠柠檬酸钠缓冲液+ 0.1%吐温(SSC + 0.1%吐温)洗涤一次所有样本。允许样品冷却到室温。
  4. 清洗所有样本在两次1X SSC + 0.1%吐温15分钟替换用马来酸缓冲器(MAB)本1X SSC的解决方案,并让坐在10分钟重复MABW¯¯灰。用块替换解决方案MAB孵育1.5小时。
  5. 换来的抗体溶液块溶液(1:10,000稀释在封闭液抗体),并在室温下孵育12小时(O / N),轻轻摇动。

5.颜色开发与安装

  1. 吸出抗体溶液并用PBTw洗15次,每次10分钟。替换PBTw用1×碱性磷酸酶缓冲液(AP)和孵育10分钟。
  2. 虽然上述培养步骤的进行,准备AP染色溶液(见补充文件2) -注意。材料转移到TCD井和更换AP染色溶液1倍AP解决方案。注意现在时间,使得时间长度显色反应发生为可以被记录。监测染色模式的发展,直到信号背景比是最佳的。
  3. 要停止显色,去掉1个AP染色溶液(配置在适当的赤身Ë容器),并申请2毫升PBTw,现在记下时间。冲洗PBTw两次,每次5分钟。使用这些漂洗之一将材料转移到1.5ml试管。
  4. 取出PBTw和PBTw适用1毫升3.7%的甲醛和搅动或在室温为旋转至少30分钟(这也可以做O / N)。
  5. 洗出固定剂与PBT的洗涤3次(配置适当的废物容器中的废定影液)。洗样品3次,在50℃下在去离子水中。
    注意:这些洗涤消除盐的沉淀清除和可视化步骤过程中可能变得可见。
  6. 决定样本是否应当被安装在苯甲酸苄酯:苯甲醇(BB:BA,也被称为Murray的清除)或甘油。
    注意:我们喜欢更强大的清除剂BB:BA为L. stagnalis胚胎有些不透明。将被安装在BB样品:BA首先需要通过乙醇系列来脱水。将被安装在60%的样品甘油可以立即安装。
  7. 转移样品到安装溶液:使用移液管(BB BA或60%甘油)中。
    注:在安装BB:BA这个一定要在一个玻璃做得好(BB:BA会融化聚碳酸酯塑料)。
  8. 允许样品以清除5 - 10分钟,然后用叠盖玻片适当数量作为隔离物(1盖玻片样品<1 DPFC,2盖玻片样品> 1 DPFC)它们安装到一幻灯片。
    注:所有坐骑现在可以使用与DIC的光学化合物显微镜成像。

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Representative Results

图3所示的代表WMISH染色图案用上面描述的技术产生的,并反映了所涉及的范围内的分子过程,从外壳形成的基因的各种空间表达模式的( 新基因1,2,34),细胞-细胞信号(DPP)在一系列发育阶段的转录调控( 短尾 )。虽然我们还没有量化的这些基因,我们期望他们也表达水平变化显著,这表明我们的方法可以对各种各样的处于不同发展阶段的各个阶段表达的基因产物被应用。只有在这里提出的基因(DPP)中的一个已经被L.先前描述stagnalis 21,22。我们在座的结果基本符合这些以前的报告一致,但显著更高的空间RESO (分辨率)。 短尾的空间表达模式已鲍鱼23进行了描述和帽贝24和 ​​在两种情况下地幔细胞也被检测为我们找到L. stagnalis( 图3F)。我们分离新基因1 - 4(从蛋白质组屏幕旨在确定基因产物直 ​​接参与壳的形成,等等)与壳腺( 图3A和B)或壳场( 图3C和D相关联的空间表达模式是完全全等与壳形成的功能。这些结果表明,我们已对从鸡蛋胶囊除去胚胎和幼虫开发了高通量的技术,以及随后的阶段特异性透处理,生成整装样品,将在原位染色得到高品质模式为各种各样的基因胚胎和幼体发育的各个阶段。

ove_content“FO:保together.within页=”1“> 图1
静水椎实螺 的图1.汇总个体发育 和相应固定和蛋白酶-K治疗,从第7天的发展胚胎和幼虫的代表图像说明大小(行1)显著上升和形态的复杂性(行2和3) 。这些发展变化转化为相应的固定时间大的差异,并产生最佳WMISH信号蛋白酶K含量。对于WMISH所有阶段应固定在PBS中的3.7%甲醛于室温与其蛋胶囊内温和搅拌。所有阶段然后应用适当的蛋白酶K的浓度处理10分钟。请注意,我们在蛋白酶-K从我们的供应商的活动观察显著批间差异。这种变化必须考虑由performi纳克圆的“校准”WMISH实验,其中新的蛋白酶-K的活性是凭经验确定。因此在图中所述的蛋白酶-K浓度应视为初始导向,但是发育阶段之间的相对浓度(例如2-天龄胚胎需要蛋白酶K的浓度比天高3倍1胚胎)置1。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.仪器用于Decapsule L. stagnalis 胚胎。 (A)装置的概述,可以有效地除去L. stagnalis胚胎和幼虫从他们的胶囊。(B)的放大图黄色方框区域在(A)。尖锐玻璃针放置在显微镜载玻片上,并插入到硅管(内径1毫米,外径3毫米),使得所述前端突出的方式约20%到管道的空腔。玻璃针,然后还贴在显微镜载玻片和培养皿。(C)在含固定胚胎和幼虫A.蛋胶囊黄色盒装部的简要'计划'视图中首先使用20毫升注射器收集。然后将注射器连接到硅管和通过管道与过去的针排出的胶囊。卵囊膜通过针撕破和释放的胚胎和幼虫材料可以从使用微量的收集盘来收集。(D)的 A中的黄色盒装部的示意图'截面“图的显微镜载玻片确保了针进入在正确的高度的硅管。 。(F),都使得通过设备的单个传递幼虫代表性的观点。材料的90%以上已经从他们的胶囊被有效轻轻吹走。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. WMISH表达模式的代表图像针对基因的品种从L的范围 。BA(Murray的清除): 由这里描述的方法生成 stagnalis 发育阶段如上面所描述的方法,并已安装并在成像BB进行了处理所有发展阶段。近似​​年龄是在指示各面板与取向的对权利的右下指示。基因直向(已知时)在每一个面板的左下方被指示。缩写:蛋壳腺(SG); shell字段(SF);地幔(MT);足(英尺); Decapentaplegic(DPP); DPFC(天后第一次卵裂)。所有的比例尺是20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这里所描述的方法允许RNA转录物与静水椎实螺的所有发育阶段内想必改变的表达水平的高效率的可视化为了从它们的胶囊除去胚胎和幼虫我们造模报道其他encapsulated-各种化学,渗透压休克和物理处理的开发模式生物。然而,在我们的手中,我们在这里描述的方法是唯一的高通量技术,消除了艰难的囊膜不破坏胚胎和幼虫。以下解封装,该材料可以被存储,或与蛋白酶K的阶段具体方案治疗,然后杂交到核糖探针。附加经验优化努力(通常集中在探针浓度和杂交温度),可能需要对每个探针/靶。这些参数(除固定方案和蛋白酶-K处理)通常是最有影响力的参数的任何现场试验(假设固定材料的质量和RNA探针是一个高标准的)。

合适的蛋白酶-K处理的原位试验的最终结果是头等重要的为L. stagnalis。这反映在宽范围内不同的发育阶段(从0微克/毫升到500微克/毫升)所需蛋白酶-K浓度。因此,能够为一个给定的蛋字符串指定给一个个体发育窗口重要。为此,我们在图1提供指引允许未知年龄的发育材料的升级(该图的打印版是在补充文件3可用的用户可能会发现有用的分期材料时,必须在显微镜) 。我们注意到,对于其他种类的腹足类蛋白酶-K处理为WMISH可以为广泛开发板的的保持恒定pmental级8,25,26,或可以完全27被省略。与此形成鲜明对比的是L.情况stagnalis。此外,尽管其他研究小组曾报道WMISH表达模式为L.几个基因我们在这里描述stagnalis幼虫(见22,28,29)的方法产生显著更高的空间分辨率的模式。最后,我们已在蛋白酶-K的从供应商所的活性观察到显著批间变异。该变化必须通过进行一轮“校准”WMISH实验,其中新的蛋白酶-K的活性经验确定被考虑。与来自该批次蛋白酶-K的等分所有随后的实验就可以自由地进行。

我们先前描述的一个替代WMISH方法L. stagnalis胚胎和幼虫在别处12。该方法的详细使用mucolyt的集成电路剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC),如二硫苏糖醇(DTT)中,用十二烷基硫酸钠预杂交处理(SDS)的还原剂。我们发现一些增强基因的染色模式对一些发育阶段的治疗。我们最近开发和在这里描述的固定策略(定影其胶囊内的幼虫)简化并加速到原位实验为准备材料所需的步骤,显然否定对于经验性地确定有NAC,DTT附加最佳杂交预处理的必要性或SDS。未来的改进在这里报告的技术可以包括小分子RNA的可视化(以下修改先前报告的30个标准WMISH协议),mRNA的双重或三重标记目标31和WMISH信号32的荧光可视化。可以说该技术的最大限制是时间的总长度需要从聚集去克材料,以表示一个给定的基因表达模式的数字图像。由于在这样一个过程,必须发生的生物化学和生物物理事件的性质,这是大多数原位杂交协议的固有特征。

椎实螺占据了极为模式生物方面的代表性不足的后生动物中的位置。作为代表Spiralian, 椎实螺能带来洞察不同的形态特征的演变,如蛋壳形成12和身体霸道33-35,也是一个宝贵的神经行为学36和神经生理学模型9,37。强大的技术,如在原位有效地显现的基因表达模式的能力增加了椎实螺的功能作为模式生物,并拓宽了多种,它可以用来解决问题。而此时大序列的DAT的产生asets(完整转录甚至基因组)比较有规律,这样的方法将成为更切合希望解释的序列数据,从这些模型洪水的研究人员。虽然椎实螺是一种比较衍生腹38,并且拥有怎样才算相较于其他模式生物(1.22千兆39)大基因组,它有许多实用而有趣的功能,使它成为一个有吸引力的模型系统。我们在这里所描述的方法,扩展可供椎实螺工具箱,可利用该离岗封装发展的其他物种。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgements

这项工作是通过DFG项目#JA2108 / 2-1资金支持DJJ。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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