全体のマウント
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
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Biology

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Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

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Abstract

in situハイブリダイゼーション(WMISH) 全体のマウント興味のある(例えば、胚または幼虫など)「ホールマウント」組織標本、または発達段階内の核酸分子(多くの場合のmRNA)の空間分解能を可能にする技術です。それはかなり複雑な後生動物ゲノムの機能解析、次世代シーケンスデータの大洪水でボトルネックをより多くなってきている課題に貢献することができるので、WMISHは非常に強力です。技術に多くの時間の概​​念シンプルさにもかかわらず、多くの場合、新たなモデル系のためのWMISH実験に固有の様々なパラメータを最適化するために必要とされます。組織型と発達段階の間の細胞および生化学的特性の微妙な違いは、単一WMISH方法がすべての状況に適切ではないかもしれないことを意味します。我々は一貫生成し、再新興腹足類モデルモノアラガイのstagnalisためWMISHメソッドのセットを開発しています遺伝子の、およびすべての発達段階全体の範囲について明確なWMISH信号。これらの方法は、個体発生のウィンドウに未知の暦年齢の幼虫の割り当て、それらの卵のカプセルからの胚および幼生の効率的な除去各個体発生のウィンドウのための適切なプロテイナーゼK処理の適用、およびハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション後および免疫検出、ステップ。これらのメソッドは、指定されたRNA転写物について得られた信号は、プローブ固有の調整(主にプローブ濃度及びハイブリダイゼーション温度)でさらに洗練することができ、そこから基盤を提供します。

Introduction

軟体​​動物は、科学分野の幅広い多様性の持分を保有動物の群です。その形態的多様性1、(種数2の点で第のみ節足動物への)種の豊かさや商業3、医学4及び科学的問題5-8の広い範囲との関連性にもかかわらず、に主張することができ、比較的少数の軟体動物の種があります設備の整った科学的なモデルと実験室環境で維持しやすいの両方です。多くのそのような神経生物学9、生態毒性10、より最近では進化生物学11,12などの分野で使用されている一つの軟体動物は、主に、その広範な分布およびメンテナンスの極度の容易さのため、モノアラガイのstagnalisです。 「モデル」生物としての人気とLに利用できる発達生物学者13-19、分子ツールの範囲とパワーによる使用の長い歴史にもかかわらず、 stagnALIS科学コミュニティは、はるかに多くの伝統的な動物モデル( ショウジョウバエ 、マウス、ウニ、線虫)の背後にあります。

分子モデルとしてモノアラガイを開発すること私たちの願いは、シェル形成を誘導する分子機構への関心から生じます。これはモノアラガイの発達中の遺伝子発現の、効率的で一貫性のある敏感な可視化を可能にする技術のセットを絞り込むために私たちの動機。 in situハイブリダイゼーションホールマウント(WMISH)が広くモデル生物のさまざまな使用され、40年以上20のために使用されてきました。その異なる装いで、ISHは空間的に染色体、リボソームRNA、mRNAおよびマイクロRNAは上の特定の遺伝子座をローカライズするために使用することができます。

私たちは前L.ためWMISH方法を精緻化に対処するために必要な課題の一つstagnalisは静かにかつ効率的に抽出する胚およびトンから様々な段階の幼虫の問題でした彼それらが積層された卵のカプセル。この抽出、または「脱カプセル化」は、同時に形態学的および細胞の完全性を維持しながら、 その場での実験与えられるために十分な材料を収集するために効率的に達成する必要があります。他のモデル生物はまた、カプセル化された開発を受けている間、我々の手でこれらの種について報告された方法のいずれもが正常L.において使用することができませんでしたstagnalis。

この方法の全体的な目標は、したがって、次のとおりです。L.を抽出するためにイメージングのための十分なWMISHsignalsで胚および幼虫を準備するために、WMISH信号を最適化するプレハイブリダイゼーション処理を適用するために、ハイスループット様式でそのカプセルから胚および幼生をstagnalis。

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Protocol

注:以下の手順は、Lの胚および幼生期にその場での実験行うための我々の方法を概説しますステップはこれが単語'注意'で示され、すべての適切な安全手順が採用されるべき有害化学物質の使用を伴うstagnalis。有害化学物質のための代表的なMSDSシートへのリンクは、 補足ファイル1で提供されている。全ての試薬 ​​のためのレシピは、 補足ファイル2で提供されています。

脱カプセル化装置の1組立

  1. これを行うために、 図2Aに示すように、適切な長さにP1,000先端カットを使用して(1mmの内径3mmの外径を有する)シリコンチューブ20 mlの使い捨て注射器を接続します
  2. 反転大きなペトリ皿に、標準的な顕微鏡スライドをテープで固定します。 に示すように、顕微鏡スライドに直接隣接したシリコンチューブをテープ60;図2Cおよび2D。
  3. 顕微鏡スライド上に引っ張らガラス針を休ま、ゆっくりと針の先端がチューブの内径を横断道の約20%を突出するまで、シリコンチューブに挿入します( 図2Cおよび2Dを参照)。針は、ペトリ皿に位置テープそれを下にしたら。
  4. シリコンチューブの自由端は、カプセル化を解除した材料を収集する別のペトリ皿に休息できるようにします。

2.検体採取、固定化と脱カプセル化

注:特に断りのない限り、すべてのステップは室温で実施されます。

  1. 慎重に水槽の壁から卵の文字列を集めます。これを行うには、基板から卵の文字列をこすり、水の外に浮遊卵の文字列を魚にプラスチック製の茶こしを使用するようにへらのように柔軟なプラスチックの平らな部分を使用します。 に設けられたガイドを使用して、顕微鏡下で材料を舞台と並べ替え1。
  2. ペーパータオルの上に卵の文字列を配置し、フェザー級の鉗子を使用して卵塊に沿って縦切開を行います。卵の文字列のうち、卵カプセルをロールとフェザー級の鉗子を使用して、紙タオルの周りにそれらを押すことによって、各カプセルから可能なゼリーの材料の多くを削除します。
  3. フェザー級の鉗子を使用して、水道水5mlを含むペトリ皿に卵のカプセルを転送します。この皿に希望の発達段階の脱ゼリー状の卵カプセルを収集し続けます。そして、次のステップに進み、計画WMISH実験のためのすべての発達段階から十分なカプセルを収集します。
  4. より発展した幼虫を操作する場合は、固定する前に、それらをanaesthetize(5日は最初の切断(DPFC)と古いポスト)。
    注:これは、 その場での染色パターンの解釈が非常に困難にする契約から筋肉を防ぐことができます。
    1. 彼らはcapsuにまだある間(幼虫をリラックス固定前に30分間•6H 2 OのMgCl 2の2%w / vの溶液中でのレ)。
    2. まだ固定液中で彼らの卵カプセル内ながら、いくつかの幼虫を沈め、顕微鏡下での応答を監視することにより、30分後に緩和の程度を評価します。完全にリラックスした幼虫が応答しませんしながら、不完全にリラックスした幼虫は、自分の殻の中に収納されます。これらの幼虫が緩和されたら次のステップに進んでください。
  5. 卵カプセルの10倍の体積を提供する密封可能なチューブに広い口径のプラスチックピペットを用いて卵カプセルを転送する( 例えば 、沈降カプセル1mlを10+ mlのチューブを必要とします)。
  6. チューブからできるだけ多くの液体として吸引し、定住卵カプセルの10倍の量である固定液の量と交換します。静かに各発達段階( 図1を参照)のための適切な時間RTで固定剤で卵のカプセルを回転させます。
  7. DiscontinUE回転およびカプセルは、適切な廃棄容器に固定溶液をシンクし、吸引することができます。
  8. 室温で5分間、0.1%のTween-20(PBTw)とリン酸緩衝生理食塩水で固定液を交換し、回転させることにより、卵カプセルを洗ってください。 PBTwを吸引し、二回繰り返します。
  9. 図2に示されている(詳細はセクション1を参照)装置を用いて、それらのカプセルから胚および幼生を削除します。最大20 mlシリンジにカプセルを描き、チューブを取り付け、その後に出て、チューブを通って、ガラス針を過ぎてカプセルを払拭コレクションの一品。
    注:通常、すべてのカプセルの大部分(> 90%)がデバイスを介して1つのパスのみを必要とする必要があります。多くの場合、カプセル膜が損傷しているが、胚および幼虫が破裂したカプセルの内部に残っています。単にシリンジにそれを描画し、再びそれを払拭することにより、この材料を再処理。
  10. マイクを使用して、1.5mlチューブにデカプセル化胚および幼生を収集ropipette(0 P20 - 3日齢幼虫、およびカットオフチップの先端を持つ古い幼虫のためのP200)。
    注:この段階で行うことができるプロトコルで(数ヶ月までのための)ポーズ。これが必要な場合は、decapsuled材料は、(次のステップに進みます)保存のために1.5mlチューブに収集する必要があります。それ以外の場合は議定書3に、すぐに続けています。
  11. 胚および幼虫がチューブの底に沈み、上清を吸引することを可能にします。 PBTwで33%エタノール(エタノール)と交換し、5放置 - 10分。 PBTw 66%エタノールおよび100%EtOHで繰り返します。室温で100%エタノールで二回幼虫を洗ってください。 100%EtOH中、-20℃で材料を保管してください。
  12. 10分 - 準備が継続する場合には、再水和物100%エタノールを除去し、PBTwで66%EtOHで置き換えることによって、サンプルは、5放置します。 10分 - 5放置、PBTwに33%EtOHで繰り返します。最後に、すべてのエタノールが除去されていることを確認するためにPBTwの3倍、5分間の洗浄で洗浄します。

3.プロテイナーゼK、TEAとポストFiのxation

注:我々はすぐにタイムクリティカルなソリューションを交換するための最も効率的かつ穏やかな方法は、メッシュの床と小さなバスケットに次の手順を実行して見つけます。これらは自宅行うことができますが、我々はIntavis InSituPro -Vsi液体ハンドリングロボット(www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc)と互換性のあるバスケット(ミディアムサイズ)を使用します。このようなバスケットは、迅速かつ容易に交換溶液に順に12ウェル組織培養皿(TCD)のウェルの間で移動させることができ、または溶液を十分にピペットを使用してから吸引することができます。代わりに、すべてのソリューション交換は、単に幼虫からの上清を吸引することにより、これらのバスケットなく行うことができます。この場合、穏やかな旋回運動は、上清をウエルの縁部から除去されることを可能にする皿の中央にすべての胚および幼虫を集中します。以下は、ユーザーがソリューション交換のバスケットを採用されている前提としています。

  1. ピペットを使用して、PBTwの2ミリリットルで12ウェルTCDに座ってバスケットに胚および幼虫を移します。
    注:追加された発達段階に依存することができ胚および/ ​​または幼虫の数は、しかし、一般的な経験則は、胚/幼虫( すなわちの空き床面積の少なくとも25%を維持することで、研究されている、しないでください)バスケットを混雑。
  2. 適切なプロテイナーゼK溶液2ml( 図1を参照)、および0.2%グリシンの2ミリリットルそれぞれに別の2つのウェルとよく隣接を準備します。よくプロテイナーゼKの適切な濃度を含む、すぐに開始タイミングに各バスケットを移動します。
  3. 10分後も含む0.2%グリシンに各バスケットを移動し、5分間インキュベートします。その後、0.2%グリシンを有する第2のウェルに各バスケットを移動し、5分間インキュベートします。 3ミリリットルPBTwの3×5分間の交流とグリシンを洗浄します。
  4. PBTw溶液を除去し、新たに調製したトリエタノールアミン(TEA)で1回のサンプルを扱うゾル5分間の注意のためのution!撹拌しないでください。 5分間の新たに調製したTEA溶液3mlと交換してください。攪拌しないでください。サンプルからのTEA溶液の大部分を吸引します。新たに調製された無水酢酸とトリエタノールアミン(TEAAA)ソリューションを追加し、5分間インキュベートする。 注意!撹拌しないでください。
  5. OPTIONAL - 上記の手順をインキュベートしている間、TEAAA液の別の新鮮なバッチを準備し、上記の手順を繰り返します。
    注:TEAAAでのこの第二の処理はオプションですが、完全にバックグラウンドを生成する傾向がプローブとすべてのバックグラウンドを除去するために役立つことがあります。
  6. 井戸からそれを吸引することによってTEAAA溶液を除去し、PBTwの3ミリリットルと交換してください。攪拌しないでください。 PBTwを削除し、PBTw 3.7%ホルムアルデヒドの3ミリリットルを適用します。ゆっくり30分のインキュベーションの間、時折渦巻きます。
  7. 井戸からそれを吸引することにより固定液を取り出して、PBTwの3ミリリットルと交換してください。 1.5mlチューブに材料を移します。 Rハイブリダイゼーション緩衝液でPBTwをeplaceし、室温で5分間インキュベートする - 注意。
  8. RTでホットブロックにチューブを配置し、所望のハイブリダイゼーション温度に温度を設定。
    注:ハイブリダイゼーション温度は、特定のプローブ、経験的に最適化する必要がある、しかし、我々は55°Cが最初に裁判に良好な温度であることがわかりました。ブロックは、ハイブリダイゼーション温度に来て、サンプルを約15分間プレハイブリダイズすることを可能にすることを可能にする( すなわち、それがより長い、リボプローブを作製するのにかかる時間は必要ありません)。希釈されたリボプローブの十分な容量(通常100μl)を準備します。我々は最初の範囲として100および500 ng / mlでの、典型的には裁判プローブ濃度。私たちは12に従ってリボプローブを準備します。
  9. サンプルからのハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、サンプルにハイブリダイゼーションバッファーにプローブを追加します。 100μlの(またはハイブリダイゼーションブフェ上記相を形成するのに十分な容量を持つオーバーレイR)鉱油。
    注:鉱油は長いハイブリダイゼーション工程の間に形成する大規模な凝縮を防ぎます。豊富な結露を大幅にハイブリダイゼーション溶液の化学的性質およびプローブの濃度の両方が変更されます。
  10. 所望のハイブリダイゼーション温度に熱を減らすその後、10分間75℃にサンプルを加熱することにより、プローブと標的RNAを変性させます。 ( - 48〜24時間)ハイブリダイゼーションは12時間(O / N)以上の最小のために進行させます。
  11. ハイブリダイゼーションの間に、ヒートブロックから単一の管を除去する油相を乱すことなく幼虫を中断し、親指と人差し指の間で急速にそれを回転させて、ヒートブロックでそれを交換してください。 12時間かそこら - この回6を繰り返します。

4.ホットウォッシュと免疫

注:私たちは、次の手順のために液体処理ロボットを使用していますが、これらも簡単に手動で行うことができます。この場合には、胚および幼生の笙それらがでハイブリダイズした1.5​​ミリリットルチューブ内に保持することULD。後続のすべてのソリューションの交換がP1,000ピペットで吸引し、追加されます。手動で行う場合は、次のステップの各々は、各溶液1mlを採用すべきです。

  1. 4倍、2倍とハイブリダイゼーション温度に1×洗浄溶液の熱十分なボリューム(3ミリリットル各サンプルについて、それぞれ)。
  2. ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを4倍洗浄バッファーで3回洗浄します。ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを2回洗浄緩衝液で3回洗浄します。ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを1×洗浄バッファーで3回洗浄します。
  3. ハイブリダイゼーション温度で1×塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム緩衝液+ 0.1%のTween(SSC + 0.1%のTween)で1回、すべてのサンプルを洗います。サンプルは室温まで冷却します。
  4. wはMABを繰り返しマレイン酸バッファー(MAB)この1×SSC溶液を交換して15分間、1×SSC + 0.1%Tween中で二度全てのサンプルを洗浄し、10分間放置灰。ブロック溶液でMABを交換し、1.5時間インキュベートします。
  5. 抗体溶液(1:ブロック溶液中の抗体の10,000希釈)のブロックソリューションを交換し、穏やかに攪拌しながら室温で12時間(O / N)インキュベートします。

5.色の開発と取り付け

  1. 抗体溶液を吸引し、10分ごとにPBTwで15回洗浄します。 1xのアルカリホスファターゼバッファー(AP)とPBTwを交換し、10分間インキュベートします。
  2. 注意-上記のインキュベーション工程が進行は、AP染色溶液を調製しながら( 補助ファイル2を参照)。よくTCDに材料を移し、AP染色液で1×APソリューションを交換してください。時間の長さは、呈色反応を記録することができるために起こるようになりました時間に注意してください。シグナル対バックグラウンド比が最適になるまで染色パターンの開発を監視します。
  3. 発色を停止するには、適切なワストに処分(1×AP染色溶液を除去電子コンテナ)、およびPBTwの2ミリリットルを適用し、現在の時間に注意してください。 5分間ずつ二回以上PBTwですすいでください。 1.5mlチューブに材料を転送するために、これらのリンスのいずれかを使用します。
  4. (これはまた、O / Nを行うことができます)PBTwを外し、PBTwで3.7%ホルムアルデヒドの1ミリリットルを適用し、攪拌または室温で少なくとも30分間回転させます。
  5. (適切な廃棄容器に廃棄物の固定剤を廃棄)PBTの3回の洗浄で固定液を洗浄します。脱イオン水に50℃でサンプルを3回洗浄します。
    注:これらの洗浄は、清算および可視化工程の間に見えるようになるかもしれ塩の沈殿をなくします。
  6. ベンジルアルコール(BB:またマレーの明確なとして知られているBA)またはグリセロールサンプルは安息香酸ベンジルでマウントする必要があるかどうかを決定します。
    注:私たちは、より強力な浄化剤BBを好む:L.としてBA stagnalis胚はやや不透明です。 BBに搭載されるサンプルは:BAは最初のエタノール系列で脱水する必要があります。試料は、60%に搭載されますグリセロールは、直ちに実装することができます。
  7. ピペットを用いて:マウントソリューション(BAまたは60%グリセロールBB)にサンプルを移します。
    注:BBにマウントする場合:BAこれはよくガラスに(BBを:BAはポリカーボネートプラスチックを溶融する)行わなければなりません。
  8. 10分、その後、スペーサーとして積み重ねられたカバースリップの適切な数(サンプル<1 DPFC、サンプル用の2カバースリップ> 1 DPFC 1カバーガラス)を使用して、スライド上にそれらをマウントする - サンプルは5のためにクリアすることができます。
    注記:全マウントは現在DIC光学系を有する化合物の顕微鏡を使用して画像化することができます。

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Representative Results

図3に示される代表的なWMISH染色パターンは、上述の技術を用いて生成され、分子のシェルの形成に至るまでの処理( 新規遺伝子1、2、3、4)の範囲に関与する遺伝子のための空間的な発現パターンの多様性を反映し、細胞間シグナル伝達(DPP)への発達段階の範囲にわたって転写調節( ブラキュリ )へ。一方で我々は、我々の方法は、様々なレベルでの開発のすべての段階で発現した遺伝子産物の幅広いに対して適用できることを示し、我々は、彼らがまた大きく変わるだろうと期待して、これらの遺伝子の発現レベルを定量化していません。のみここに提示する遺伝子(DPP)の一方が先にLに記載されていますstagnalis 21,22。ここで提示する結果は、主にこれらの以前の報告と一致しているが、有意に高い空間RESOとリューション。 短尾の空間的な発現パターンはアワビ23とカサガイ24に記載されていると我々はL.を見つけるように両方のケースでも、マントル細胞で検出されましたstagnalis( 図3F)。直接シェル形成に関与する遺伝子産物を同定するために設計されたプロテオミクス画面から(4、およびので、その空間卵殻腺( 図3AおよびBに関連した発現パターン)またはシェルフィールド( 図3C及びD)がある-私たちは、1新規遺伝子を単離しましたシェル形成機能と完全に一致する。これらの結果は、我々が卵カプセルから胚および幼生を除去するために開発した高スループット技術、および後段固有の透過性の治療は、 その場での染色高品質が得られる全体のマウント・サンプルを生成することを示しています胚および幼虫の発育のすべての段階のための遺伝子の多種多様なパターン。

ove_content「FO:キープtogether.withinページ= "1"> 図1
図1. A集計 モノアラガイstagnalis の個体発生 および対応する固定し、プロテイナーゼKトリートメント。開発の最初の7日から胚および幼生の代表的な画像は、サイズが大幅に増加(行1)および形態学的複雑さ(行2および3)を示します。これらの発達的変化は、大規模な適切な固定時間の違いや最適なWMISH信号を生成するプロテイナーゼK濃度に変換されます。 WMISHのためにすべての段階では、それらの卵カプセル内で穏やかに攪拌しながら室温でPBS中の3.7%ホルムアルデヒドで固定しなければなりません。すべての段階は、10分間の適切なプロテイナーゼK濃度で処理されるべきです。私たちはサプライヤーからのプロテイナーゼKの活性の有意なバッチ間変動を観測することに注意してください。この変化はperformiによって考慮されなければなりませんngの新しいプロテイナーゼKの活性は、経験的に決定された「キャリブレーション」WMISH実験のラウンドです。図に記載されたプロテイナーゼK濃度は、したがって、しかし、発達段階(例えば2日齢の胚日より3倍高い1胚をプロテイナーゼKの濃度を必要とする)との間の相対的な濃度が設定され、初期ガイドとして扱われるべきである。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
Decapsule L. に使用される図2の装置 stagnalis 胚。 (A) 効率よくL.を削除することができ、装置の概要そのカプセルから胚および幼生をstagnalis。(B)の拡大図(A)中の黄色の四角で囲んだエリア。鋭いガラス針を顕微鏡スライド上に配置され、先端部がチューブのキャビティ内に道の約20%に突出するようにシリコンチューブ(内径1mmと外径3 mm)の中に挿入されます。ガラス針は、その後も、顕微鏡スライドとペトリ皿にテープで固定されている。(C)固定胚および幼生を含むA.卵カプセル内の黄色の箱入りセクションの概略'計画'ビューは、最初の20 mlシリンジを使用して収集されます。注射器は、その後、シリコンチューブに取り付けられ、カプセルは、管を通って針を越えて排出されました。卵カプセル膜は針によって引き裂かれ、解放された胚および幼虫の材料は、マイクロピペットを用いて収集皿から採取することができる。(D)A.黄色箱入りセクションの概略'断面」ビューを顕微鏡スライドがいることを保証します針が正しい高さでシリコンチューブに入ります。 。(F)装置を介して、単一パスをした幼虫の代表的な見解。材料の90%以上が効果的に、静かにそのカプセルから削除されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
L の範囲からの遺伝子の多様性に対するWMISH発現パターンの図3.代表的な画像 。ここで説明した方法によって生成された発達段階を stagnalisすべての発達段階は、上記の方法で説明したように処理したとBBに搭載され、撮影されています:BA(マレーのクリア)。おおよその年齢層は、にに示されていますp個の各パネルの右側と向きが右下に表示されます。 (既知)遺伝子オルソロジーは、各パネルの左下に表示されます。略語:シェル腺(SG);シェルフィールド(SF);マントル(MT);足(フィート);デカペンタプレジック(DPP)。 DPFC(最初の切断後の日)。すべてのスケールバーは20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明する方法はモノアラガイstagnalisのすべての発達段階内で、おそらく様々な発現レベルを有するRNA転写物の効率的な可視化を可能にするそのカプセルから胚および幼生を削除するには、我々は他のencapsulated-に対して報告化学物質、浸透圧ショックおよび物理的処理の様々な試用しましたモデル生物を開発。しかし、私たちの手の中に私たちがここで説明する方法は、胚および幼虫に損傷を与えることなく、タフな莢膜を除去するだけで高スループット技術です。デカプセル化後、材料は、いずれかの保存することができ、またはプロテイナーゼKのステージ特異的レジメンで処理した後、リボプローブとハイブリダイズさせました。 (典型的には、プローブ濃度及びハイブリダイゼーション温度に焦点を当てた)追加の経験的な最適化の努力は、各プローブ/標的のために必要となる場合があります。 (固定レジメンおよびプロテイナーゼK処理に加えて)これらのパラメータは、一般的に最も影響力のパラメータでありますその場での実験 、任意の(固定された材料の品質およびRNAプローブは、高い水準であることを仮定して)。

その場での実験の最終的な結果に適切なプロテイナーゼK処理の重要性は、Lのために最も重要ですstagnalis。これは、(0 / mlの500 / mlの範囲の)異なる発達段階で必要とされるプロテイナーゼK濃度の広い範囲に反映されます。個体発生のウィンドウに与えられた卵の文字列を割り当てることができることが重要です。この目的のために、我々は図1に提供するガイドラインは、未知の年齢の発達材料のステージングを可能にします(この図の印刷に適したバージョンでは、ユーザーが材料をステージングするとき、顕微鏡であると便利かもしれないことを補足ファイル3で利用可能です) 。我々はWMISHため腹足類プロテイナーゼK処理の他の種のいずれかのためdeveloの広い範囲のために一定に保つことができることに注意してくださいpmentalステージ8,25,26、または完全に27を省略することができます。これはL.の状況と全く対照的ですstagnalis。さらに、他の研究グループは、以前L.におけるいくつかの遺伝子についてWMISH発現パターンを報告したが幼虫(22,28,29を参照てください)私たちはここで説明する方法は、有意に高い空間分解能のパターンを生成するstagnalis。最後に、我々は我々のサプライヤーからのプロテイナーゼKの活性の有意なバッチ間変動を観察しました。この変化は、新しいプロテイナーゼKの活性が、経験的に決定されます。「キャリブレーション」WMISH実験のラウンドを行うことによって、考慮に入れる必要があります。そのバッチからのプロテイナーゼKのアリコートを持つすべてのその後の実験は、その後自由に行うことができます。

我々は以前L.のための代替WMISH方法を説明しましたstagnalisの胚および幼生の他の場所12。その方法はmucolytの使用を詳述しましたIC剤N-アセチル-L-システイン(NAC)、ジチオスレイトール(DTT)などの還元剤とドデシル硫酸ナトリウム(SDS)とのプレハイブリダイゼーション処理。我々は、これらの治療法は、いくつかの発達段階のためにいくつかの遺伝子の染色パターンを増強見出さ。 (そのカプセル内の幼虫を固定)私たちは、最近開発され、ここで説明する固定戦略が簡素化し、 その場での実験の材料を準備するために必要な手順を促進し、明らかに経験的にNAC、DTTで追加の最適なプレハイブリダイゼーション処理を決定するための必要性を否定しますまたはSDS。ここで報告された技術と今後の改良が(以前に30を報告した標準WMISHプロトコルへの変更を次の)マイクロRNAの可視化、mRNAの二重または三重標識は31をターゲットし、WMISH信号32の蛍光可視化を含むことができます。間違いなく技術の最大の制限は、コレクチンから行くのにかかる時間の全体の長さがありますグラム素材、与えられた遺伝子発現パターンを表すデジタル画像へ。このようなプロセスの間に行われなければならないの生化学的および生物物理学的事象の性質のために、このin situハイブリダイゼーションプロトコルの中で最も固有の特徴です。

モノアラガイは非常過小代表モデル生物に関するものである後生動物内の位置を占めています。代表Spiralianとして、 モノアラガイは 、シェル形成12とボディ利き手33-35のような明確な形態学的特徴の進化への洞察をもたらし、また貴重な神経動物行動学36と神経生理学モデル9,37であることができます。そのような効率的な現場での遺伝子発現パターンを視覚化する能力のような強力な技術は、モデル生物としてモノアラガイの機能性を増加させ、それをアドレス指定するために使用することができる質問の多様を広げます。大規模なシーケンスのdatの発生時にはasets(完全なトランスクリプトーム、さらにゲノム)が比較的ルーチンであり、そのような方法は、モデルからの配列データの洪水を解釈することを望む研究者にとってより関連性になるであろう。 モノアラガイが比較的派生腹足類38であり、他のモデル生物(1.22 GBの39)と比較して大きなゲノムであると考えられるものを持っているが、それはそれ魅力的なモデルシステムにする多くの実用的かつ興味深い機能を備えています。我々はここで説明する方法はモノアラガイに利用できるツールボックスを拡張し、開発をカプセル化受ける他の種に有用であり得ます。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgements

この作品は、DFGプロジェクト#1 JA2108 / 2-1を通じてDJJに資金調達によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

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References

  1. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  2. Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. Sinauer. Sunderland. (2002).
  3. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
  4. World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
  5. Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218, (3), 211-229 (2010).
  6. Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53, (2), 237-244 (2015).
  7. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
  8. Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
  9. Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343, (1-2), 124-137 (2010).
  10. Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50, (4), 369-373 (2005).
  11. Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58, (6-8), 501-511 (2014).
  12. Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15, (1), 19 (2015).
  13. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 91-121 (1946).
  14. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 353-434 (1946).
  15. Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121, (1), 1-77 (1952).
  16. Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
  17. Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183, (1), (1973).
  18. Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26, (3), 367-391 (1971).
  19. Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35, (1), 29 (1973).
  20. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63, (2), 378-383 (1969).
  21. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  22. Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221, (2), 59-68 (2011).
  23. Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311, (1), 200-212 (2007).
  24. Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129, (6), 1411-1421 (2002).
  25. Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7, (1), 160 (2007).
  26. Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
  27. Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. (2015).
  28. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  29. Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4, (1), 15 (2013).
  30. Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
  31. Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49, (8), 635-645 (2007).
  32. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11, (1), 43 (2011).
  33. Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5, (1), 20-22 (2009).
  34. Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462, (7274), 790-794 (2009).
  35. Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14, (16), 1462-1467 (2004).
  36. Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6, (4), e18745 (2011).
  37. Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9, (4), e92941 (2014).
  38. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  39. Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35, (Database issue), D332-D338 (2007).

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