A Mont entier
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
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Biology

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Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

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Abstract

Whole mount hybridation in situ (WMISH) est une technique qui permet la résolution spatiale des molécules d'acide nucléique (souvent ARNm) dans une préparation de tissu «tout support», ou le stade de développement (comme un embryon ou larve) d'intérêt. WMISH est extrêmement puissant car il peut contribuer de manière significative à la caractérisation fonctionnelle des génomes de métazoaires complexes, un défi qui devient de plus d'un goulot d'étranglement avec le déluge de données de séquence de la prochaine génération. En dépit de la simplicité conceptuelle de la technique de temps est souvent nécessaire d'optimiser les différents paramètres inhérents aux expériences WMISH pour les nouveaux systèmes de modèles; de subtiles différences dans les propriétés cellulaires et biochimiques entre les types de tissus et des stades de développement signifient qu'une méthode de WMISH unique peut ne pas convenir à toutes les situations. Nous avons mis au point un ensemble de méthodes WMISH pour les ré-émergentes modèle gastéropode Lymnaea stagnalis qui génèrent cohérente etsignaux WMISH clairs pour une gamme de gènes, et dans tous les stades de développement. Ces méthodes comprennent l'affectation des larves de l' âge chronologique inconnue à une fenêtre ontogénétique, l'élimination efficace des embryons et des larves de leurs capsules d'oeufs, l'application d'un traitement à la protéinase-K approprié pour chaque fenêtre ontogénétique, et l' hybridation, post-hybridation et immunodétection des pas. Ces méthodes fournissent une base à partir de laquelle le signal résultant d'une transcription d'ARN donné peut être encore affiné avec des ajustements spécifiques de la sonde (principalement sonder la concentration et la température d'hybridation).

Introduction

Les mollusques sont un groupe d'animaux qui détiennent l'intérêt d'une grande diversité de disciplines scientifiques. En dépit de leur diversité morphologique 1, la richesse en espèces ( en second lieu seulement aux arthropodes en termes de nombre d'espèces 2) et de la pertinence d'une large gamme de 3 commerciaux, médicaux et scientifiques 4 questions 5-8, il y a relativement peu d' espèces de mollusques qui peuvent prétendre à être à la fois des modèles scientifiques bien équipés et faciles à entretenir dans un environnement de laboratoire. Un mollusque qui est beaucoup utilisé par des disciplines telles que la neurobiologie 9, écotoxicologie 10 et plus récemment la biologie évolutionniste 11,12, est Lymnaea stagnalis, principalement en raison de sa large distribution et de l' extrême facilité d'entretien. En dépit de sa popularité en tant que «modèle» organisme et sa longue histoire d'utilisation par les biologistes du développement 13-19, la portée et la puissance des outils moléculaires disponibles pour le L. StAGNalis communauté scientifique est loin derrière celle des modèles plus traditionnels animaux (drosophile, souris, oursin de mer, nématodes).

Notre volonté de développer Lymnaea comme un modèle moléculaire découle d'un intérêt pour les mécanismes moléculaires qui guident la formation de la coquille. Cela nous a motivé pour affiner un ensemble de techniques qui permettraient de la visualisation efficace, cohérente et sensible de l' expression des gènes au cours du développement de l 'Lymnaea. Whole mount hybridation in situ (WMISH) est largement utilisé pour une variété d'organismes modèles et a été utilisé pendant plus de 40 ans 20. Dans ses différentes formes, ISH peut être utilisée pour localiser spatialement locus spécifiques sur des chromosomes, un ARNr, un ARNm et des micro-ARN.

L' un des défis que nous avons besoin pour faire face avant d' affiner une méthode de WMISH pour L. stagnalis était la question des embryons doucement et efficacement l' extraction et les larves de différents stades de til capsules d'oeufs dans lesquels ils sont déposés. Cette extraction ou «désencapsulation», doit être réalisée de manière efficace afin de collecter un matériel adéquat pour une donnée expérience in situ, tout en conservant l' intégrité morphologique et cellulaire. Alors que d' autres organismes modèles subissent également le développement encapsulées dans nos mains , aucune des méthodes rapportées pour ces espèces peut être employée avec succès dans L. stagnalis.

Les objectifs généraux de cette méthode sont donc: pour extraire L. stagnalis embryons et des larves de leurs capsules dans un mode à haut débit, d'appliquer des traitements de pré-hybridation qui optimisent le signal de WMISH, pour préparer des embryons et des larves avec WMISHsignals satisfaisantes pour l' imagerie.

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Protocol

REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent notre méthode pour mener une expérience in situ sur les stades embryonnaires et larvaires de L. stagnalis. Lorsqu'une étape implique l'utilisation d'un produit chimique dangereux ceci est indiqué par le mot «ATTENTION» et toutes les procédures de sécurité appropriées devraient être adoptées. Liens vers les fiches signalétiques représentatifs des produits chimiques dangereux sont fournis dans le dossier supplémentaire 1. Recettes pour tous les réactifs sont fournis dans le dossier complémentaire 2.

Assemblée 1. de Decapsulation Appareil

  1. Pour ce faire, connectez un 20 ml seringue jetable à un tube de silicium (avec un diamètre interne de 1 mm et un diamètre extérieur de 3 mm) à l' aide d' une pointe de P1,000 coupé à une longueur appropriée comme indiqué sur la Figure 2A.
  2. Collez une lame de microscope standard pour un plat inversé Petri grande. Tape le tube de silicium immédiatement adjacente à la lame de microscope , comme illustré sur la figure60; 2C et 2D.
  3. Reposez une aiguille de verre tiré sur la lame de microscope et doucement l' insérer dans le tube de silicium jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille dépasse environ 20% de la largeur du diamètre intérieur du tube (voir la figure 2C et 2D). Une fois que l'aiguille est en position du ruban adhésif vers le bas pour la boîte de Pétri.
  4. Laisser l'extrémité libre du tube de silicium pour se reposer dans une autre boîte de Pétri qui permettra de recueillir le matériau décapsulé.

2. Echantillon Collection, Fixation et Decapsulation

Remarque: Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire.

  1. Recueillir soigneusement les chaînes d'œufs provenant des parois d'un aquarium. Pour ce faire, utilisez un morceau plat de plastique souple comme une spatule pour gratter la chaîne d'œufs hors du substrat, et d'utiliser une passoire à thé en plastique pour pêcher la chaîne d'oeuf flottant sur l'eau. Scène et trier le matériau au microscope en utilisant le guide fourni dans la Figure1.
  2. Placez la chaîne d'oeuf sur une serviette en papier et de faire une incision longitudinale le long de la masse d'oeufs à l'aide des pinces de poids plume. Rouler les capsules d'oeufs sur la chaîne d'oeuf et enlever le plus de la matière gelée que possible de chaque capsule en les poussant autour de la serviette en papier à l'aide des pinces de poids plume.
  3. Utilisation de la pince de plume, transférer les capsules d'oeufs dans une boîte de Pétri contenant 5 ml d'eau du robinet. Continuer à recueillir des capsules de-gélifiée œufs des stades de développement souhaités dans ce plat. Recueillir suffisamment de capsules de tous les stades de développement pour l'expérience de WMISH planifiée puis passez à l'étape suivante.
  4. Lorsque l'on travaille avec des larves plus développées (5 jours après la première division (DPFC) et plus) anesthésier les avant la fixation.
    NOTE: Cela permettra d' éviter de contracter les muscles qui rend l'interprétation des motifs de coloration in situ très difficiles.
    1. Relax larves (alors qu'ils sont encore dans leur capsules) dans une solution à 2% p / v de MgCl 2 • 6H 2 O pendant 30 min avant la fixation.
    2. Évaluer le degré de détente après 30 min en submergeant plusieurs larves tout en restant dans leurs capsules d'œufs en solution fixateur et le suivi de leur réponse sous un microscope. Incomplètement larves détendue se rétracte dans leurs coquilles, tandis que les larves complètement détendu ne répondra pas. Une fois que ces larves ont été assouplies passer à l'étape suivante.
  5. Transférer les capsules d'oeufs à l' aide d' une pipette large alésage en matière plastique pouvant être scellé dans un tube qui fournit 10 fois le volume des capsules d'oeufs (par ex., 1 ml de capsules réglées nécessiterait un tube ml 10+).
  6. Aspirer autant de liquide que possible du tube et de le remplacer par un volume de solution de fixation qui est 10 fois le volume des capsules d'oeufs réglées. Tournez doucement les capsules d'oeufs en fixateur à température ambiante pendant le temps approprié pour chaque stade de développement (voir la figure 1).
  7. Discontinrotation ue et laisser les capsules de couler et aspirer la solution de fixateur dans un conteneur à déchets approprié.
  8. Laver les capsules d'oeufs en remplaçant la solution fixative avec une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1% de Tween-20 (PBTw) et tournant à température ambiante pendant 5 min. Aspirer le PBTw et répéter deux fois.
  9. Retirer les embryons et les larves de leurs capsules en utilisant l'appareil (voir la section 1 pour plus de détails) montre la figure 2. Dessinez les capsules dans la seringue de 20 ml, fixez le tube puis dissiper les capsules à travers le tube et le passé de l'aiguille de verre dehors dans le plat de collection.
    REMARQUE: Normalement, la majorité (> 90%) de toutes les capsules devrait avoir besoin un seul passage à travers le dispositif. Dans de nombreux cas, la membrane de la capsule est endommagée, mais les embryons et les larves restent à l'intérieur de la capsule rompue. Retraiter ce matériau par simple tirant dans la seringue et de dissiper à nouveau.
  10. Recueillir les embryons décapsulé et les larves dans un tube de 1,5 ml en utilisant un microropipette (un P20 0 - 3 jours larves, et P200 pour les larves plus âgées avec l'extrémité de la pointe coupée).
    NOTE: Une pause (jusqu'à plusieurs mois) dans le protocole peut être faite à ce stade. Si cela est nécessaire, le matériau decapsuled doit être recueilli dans un tube de 1,5 ml pour le stockage (passez à l'étape suivante). Sinon continuer immédiatement protocole n ° 3.
  11. Autoriser les embryons et les larves tombent au fond du tube et aspirer le surnageant. Remplacer avec 33% d'éthanol (EtOH) en PBTw et laisser reposer pendant 5 - 10 min. Répéter l'opération avec 66% EtOH dans PBTw et 100% EtOH. Laver les larves deux fois dans 100% EtOH à température ambiante. Conserver le matériau à -20 ° C dans 100% EtOH.
  12. Lorsque vous êtes prêt à continuer, réhydrater les échantillons en supprimant l'EtOH à 100% et le remplacement de 66% EtOH dans PBTw, laissez reposer pendant 5 à 10 min. Répéter l'opération avec 33% EtOH dans PBTw, laisser reposer pendant 5 - 10 min. Enfin laver avec 3x 5 min lavages de PBTw pour assurer que tout EtOH est éliminé.

3. protéinase-K, TEA et Post-fixation

NOTE: Nous trouver d'effectuer les étapes suivantes dans des petits paniers avec un plancher de maille la méthode la plus efficace et doux pour échanger rapidement des solutions critiques de temps. Bien que ceux - ci peuvent être faits maison, nous utilisons des paniers (de taille moyenne) qui sont compatibles avec la manipulation du liquide robot de Intavis InSituPro -Vsi (de www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Ces paniers peuvent être rapidement et facilement déplacés entre les puits d'une boîte de 12 culture tissulaire (TCD) pour des solutions d'échange, ou de la solution peuvent être aspirés à partir du puits à l'aide d'une pipette. Sinon, tous les échanges de solutions peuvent être réalisées sans ces paniers en aspirant simplement le surnageant des larves. Dans ce cas, un mouvement tourbillonnant douce se concentrera tous les embryons et les larves au centre du plat permettant le surnageant à retirer à partir du bord du puits. Ce qui suit suppose que l'utilisateur emploie des paniers pour les échanges de solutions.

  1. En utilisant une pipette, Les embryons de transfert et les larves dans un panier assis dans un TCD 12 puits avec 2 ml de PBTw.
    NOTE:. Le nombre d'embryons et / ou des larves qui peuvent être ajoutés dépend du stade de développement à l'étude, mais une règle générale est de maintenir au moins 25% de l'espace libre au sol d'embryons / de larves (ie, ne pas surchargez le panier).
  2. Préparer un puits adjacent avec 2 ml de la solution protéinase-K approprié (voir Figure 1), et un autre 2 puits avec 2 ml de 0,2% Glycine chacun. Déplacez chaque panier dans le puits contenant la concentration appropriée de protéinase-K et commencer immédiatement la synchronisation.
  3. Après 10 min déplacer chaque panier dans un puits contenant 0,2% de glycine et on incube pendant 5 min. Puis déplacez chaque panier dans le second puits avec 0,2% Glycine et incuber pendant 5 min. Laver le Glycine avec 3x 5 échanges min de 3 ml PBTw.
  4. Retirer la solution PBTw et traiter les échantillons une fois avec fraîchement préparé Triéthanolamine (TEA) solution pendant 5 min ATTENTION! Ne pas agiter. Remplacer avec 3 ml de solution de TEA fraîchement préparé pendant 5 min. Ne pas agiter. Aspirer la majeure partie de la solution de thé à partir des échantillons. Ajoutez le Triéthanolamine fraîchement préparé avec de l'anhydride acétique (TEAAA) solution et incuber pendant 5 min. ATTENTION! Ne pas agiter.
  5. EN OPTION - Alors que l'étape ci-dessus est en phase d'incubation, préparer un autre nouveau lot de solution de TEAAA et répétez l'étape ci-dessus.
    NOTE: Ce second traitement avec TEAAA est facultative, mais peut aider à éliminer complètement tous les arrière-plan avec des sondes sujettes à générer fond.
  6. Retirer la solution de TEAAA par aspiration à partir du puits et le remplacer par 3 ml de PBTw. Ne pas agiter. Retirez le PBTw et appliquer 3 ml de 3,7% de formaldéhyde dans PBTw. Remuer doucement de temps en temps au cours d'une incubation de 30 min.
  7. Retirer le fixateur en aspirant à partir du puits et le remplacer par 3 ml de PBTw. Transférer le matériau dans un tube de 1,5 ml. REPlacez l'PBTw avec un tampon d'hybridation et incuber pendant 5 min à température ambiante - ATTENTION.
  8. Placer les tubes dans un bloc chaud à la température ambiante, et régler la température à la température d'hybridation souhaitée.
    NOTE: La température d'hybridation est sonde spécifique et devra être empiriquement optimisé, cependant, nous trouvons 55 ° C pour être une bonne température initialement procès. Laisser le bloc à venir à la température d'hybridation, et laisser les échantillons de pré-hybrident pendant environ 15 min (soit le temps qu'il faut pour préparer les ribosondes, plus est pas nécessaire). Préparer des volumes adéquats (normalement 100 pi) des ribosondes dilué. Nous concentrations de sonde généralement essai de 100 et 500 ng / ml comme une gamme initiale. Nous préparons ribosondes selon 12.
  9. Retirer le tampon d'hybridation à partir des échantillons et ajouter la sonde dans un tampon d'hybridation pour les échantillons. Superposition avec 100 ul (ou un volume suffisant pour former une phase au-dessus de la Buffe d'hybridationr) de l'huile minérale.
    REMARQUE: L'huile minérale empêche une vaste condensation qui formera au cours de l'étape d'hybridation longue. la condensation étendue modifie de manière significative à la fois la chimie de la solution d'hybridation et la concentration de la sonde.
  10. Dénature la sonde et l'ARN cible en chauffant les échantillons à 75 ° C pendant 10 min, puis réduire la chaleur à la température d'hybridation souhaitée. Laisser l'hybridation se dérouler pendant un minimum de 12 heures (O / N) ou plus (24-48 h).
  11. Pendant l'hybridation supprimer un seul tube à partir du bloc thermique, faire pivoter rapidement entre le pouce et l'index de suspendre les larves sans perturber la phase huileuse, et de le remplacer dans le bloc thermique. Répétez cette fois tous les 6-12 heures ou plus.

4. Washes Hot et immunodétection

NOTE: Bien que nous utilisons un robot de manipulation de liquide pour les étapes suivantes, ceux-ci peuvent facilement être effectuées manuellement. Dans ce cas, les embryons et les larves shoULD être conservés dans les tubes de 1,5 ml ont été hybridées. Tous les échanges de solutions ultérieures sont aspirés et a ajouté avec une pipette P1,000. Quand elle est réalisée manuellement chacune des étapes suivantes devrait employer 1 ml de chaque solution.

  1. La chaleur des volumes adéquats (3 ml chacune, pour chaque échantillon) de la 4x, 2x et 1x solutions de lavage à la température d'hybridation.
  2. Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage 4x pendant 15 minutes chacun à la température d'hybridation. Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage 2x pendant 15 min chacun à la température d'hybridation. Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage pendant 15 min 1x chacun à la température d'hybridation.
  3. Laver tous les échantillons une fois avec 1 x tampon de chlorure de sodium Citrate de sodium + 0,1% de Tween (SSC + 0,1% Tween) à la température d'hybridation. Laisser les échantillons refroidir à la température ambiante.
  4. Laver tous les échantillons deux fois dans 1x SSC + 0,1% de Tween pendant 15 min Remplacer cette solution SSC 1x avec le tampon acide maléique (MAB) et laisser reposer pendant 10 min Répétez le MAB wcendre. Remplacer MAB avec une solution de bloc et incuber pendant 1,5 heure.
  5. Échanger la solution de bloc pour une solution d'anticorps (1: 10000 dilution de l'anticorps dans une solution de blocage) et on incube pendant 12 heures (O / N) à température ambiante sous agitation douce.

5. Développement de couleur et de montage

  1. Aspirer la solution d'anticorps et laver 15 fois avec PBTw pendant 10 minutes chacun. Remplacez PBTw avec 1x tampon phosphatase alcaline (AP) et incuber pendant 10 min.
  2. Bien que le produit de l' étape d'incubation ci - dessus, préparer la solution de coloration AP (voir fichier complémentaire 2) - ATTENTION. Transférer le matériel dans un TCD bien et remplacer la solution 1x AP avec une solution AP de coloration. Notez le temps de sorte que la durée de la réaction colorée a lieu pour peut être enregistré. Surveiller le développement du modèle de marquage jusqu'à ce que le rapport signal d'arrière-plan est optimale.
  3. Pour arrêter le développement de la couleur, enlever la solution de coloration 1x AP (en disposer dans le wast appropriée conteneur), et appliquer 2 ml de PBTw et notez le temps maintenant. Rincer deux fois avec PBTw pendant 5 minutes chacun. Utilisez l'une de ces rinçages pour transférer le matériau dans un tube de 1,5 ml.
  4. Retirez le PBTw et appliquer 1 ml de formaldehyde à 3,7% en PBTw et agiter ou faire pivoter pour moins de 30 min à température ambiante (cela peut aussi être fait O / N).
  5. Laver le fixateur avec 3 lavages de PBT (éliminer le fixateur des déchets dans un conteneur à déchets approprié). Laver les échantillons 3 fois à 50 ° C dans de l'eau déminéralisée.
    NOTE: Ces lavages éliminent la précipitation des sels qui peuvent devenir visibles lors de la compensation et les étapes de visualisation.
  6. Décider si les échantillons doivent être montés dans benzyl benzoate: Alcool benzylique (BB: BA, également connu sous le nom de Murray clair) ou de glycérol.
    NOTE: Nous préférons l'agent de compensation plus puissant BB: BA en L. embryons stagnalis sont quelque peu opaque. Les échantillons destinés à être montés en BB: BA devra d'abord être déshydraté par une série d'éthanol. Les échantillons destinés à être montés dans 60%le glycérol peut être monté immédiatement.
  7. Transférer les échantillons dans la solution de montage (BB: BA ou 60% de glycérol) à l'aide d'une pipette.
    NOTE: Lors du montage en BB: BA cela doit être fait dans un verre bien (BB: BA va fondre le plastique polycarbonate).
  8. Laisser les échantillons pour effacer pendant 5 - 10 min, puis les monter sur une lame en utilisant un nombre approprié de lamelles empilées comme espaceurs (1 lamelle pour les échantillons <1 DPFC, 2 Lamelles pour les échantillons> 1 DPFC).
    NOTE: montures entières peuvent maintenant être visualisés à l'aide d'un microscope composé avec optique DIC.

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Representative Results

Les motifs de coloration de WMISH représentatifs représentés sur la figure 3 ont été produites en utilisant la technique décrite ci - dessus, correspondent à une variété de schémas d'expression spatiale pour les gènes impliqués dans une variété de processus moléculaires allant de la formation de la coquille (gène Novel 1, 2, 3 et 4), à la signalisation cellule-cellule (Dpp) à la régulation de la transcription (Brachyury) à travers une série de stades de développement. Bien que nous n'avons pas quantifié les niveaux de ces gènes nous attendre à ce qu'ils aussi d'expression varient considérablement, ce qui indique que notre méthode peut être appliquée contre une large variété de produits de gènes exprimés dans toutes les étapes de développement à différents niveaux. Seul l' un des gènes présentés ici (DPP) a été précédemment décrit dans L. stagnalis 21,22. Les résultats que nous présentons ici sont largement en accord avec ces rapports précédents, mais avec reso spatiale significativement plus élevée résolu-. Le profil d'expression spatiale de Brachyury a été décrit dans les ormeaux 23 et patelle 24 et dans les deux cas a également été détectée dans les cellules du manteau que nous trouvons pour L. stagnalis (figure 3F). Nous avons isolé les gènes nouveaux 1 - 4 ( à partir d' un écran protéomique conçu pour identifier les produits de gènes directement impliqués dans la formation de la coquille, et ainsi de leurs profils d'expression spatiales associées à la glande de la coquille (figure 3A et B) ou sur le terrain de la coquille (figure 3C et D) sont complètement en harmonie avec les fonctions shell de formation. Ces résultats indiquent que la technique à haut débit , nous avons développé pour éliminer les embryons et les larves de la capsule d'oeuf, et les traitements de perméabilisation spécifiques au stade ultérieures, génèrent des échantillons entiers de montage qui donneront de haute qualité coloration in situ des modèles pour une grande variété de gènes pour tous les stades du développement embryonnaire et larvaire.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 1
Figure 1. Sommaire des Ontogeny de Lymnaea stagnalis et fixation correspondant et protéinase-K traitements. Des images représentatives des embryons et des larves des 7 premiers jours de développement illustrent une augmentation significative de la taille (ligne 1) et de la complexité morphologique (lignes 2 et 3) . Ces changements de développement se traduisent par de grandes différences dans le temps de fixation appropriée et les concentrations protéinase-K qui génèrent des signaux de WMISH optimaux. Pour WMISH toutes les étapes doivent être fixés à 3,7% de formaldéhyde dans du PBS à température ambiante avec agitation douce dans leurs capsules d'œufs. Toutes les étapes doivent ensuite être traités avec la concentration protéinase-K approprié pour 10 min. Notez que nous observons une importante variation inter-lots dans l'activité de la protéinase-K de notre fournisseur. Cette variation doit être prise en compte par performing une ronde de «calibrage» des expériences WMISH où l'activité de la nouvelle protéinase-K est déterminée empiriquement. Les concentrations protéinase-K indiqués dans la figure doivent donc être traités comme un guide initial, mais les concentrations relatives entre les stades de développement (par exemple 2 jours embryons âgés nécessitent une concentration protéinase-K 3 fois plus élevé que le jour 1 embryons) sont fixés. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Appareil utilisé pour décapsulé L. stagnalis Embryons. (A) Une vue d' ensemble de l'appareil qui peut éliminer efficacement L. embryons de stagnalis et les larves de leurs capsules. (B) Une vue agrandiela zone jaune en boîte en (A). Une aiguille de verre tranchant est placé sur la lame de microscope et on l'insère dans le tube de silicium (diamètre intérieur 1 mm, le diamètre extérieur 3 mm) de telle sorte que la pointe fait saillie à peu près 20% du chemin dans la cavité du tube. L'aiguille de verre est alors également collé sur la lame de microscope et la boîte de Pétri. (C) Vue A «plan» schématique de la section en boîte jaune dans des capsules d'oeufs de A. contenant des embryons fixes et les larves sont d' abord recueillies en utilisant la seringue de 20 ml. La seringue est ensuite fixé sur le tube de silicone et les capsules expulsé à travers le tube et au-delà de l'aiguille. Membranes de capsules d'oeufs sont déchirés par l'aiguille et le matériel embryonnaire et larvaire libéré peuvent être collectées à partir de la boîte de collection à l' aide d' une micropipette. (D) A 'section' vue schématique de la section en boîte jaune A. La lame de microscope assure que la aiguille pénètre dans le tube de silicium à la bonne hauteur. (F) Une vue représentative des larves qui ont fait une seule passe à travers l'appareil. Plus de 90% de la matière a été effectivement et doucement retiré de leurs capsules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Images représentatives de formes d'expression WMISH contre une variété de gènes d'une gamme de L. . Les étapes du développement stagnalis générés par la méthode décrite ici Tous les stades de développement ont été traités comme décrit dans la méthode ci - dessus et ont été montés et imagée en BB: BA (Murray clair). Âges approximatifs sont indiqués dans le àp droite de chaque panneau et l'orientation est indiquée en bas à droite. Gene orthologie (lorsque connu) est indiqué dans le coin inférieur gauche de chaque panneau. Abréviations: glande shell (sg); champ shell (sf); manteau (mt); pieds (ft); Decapentaplegic (Dpp); DPFC (jours après la première division). Toutes les barres d'échelle sont de 20 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La méthode décrite ici permet la visualisation efficace des transcrits d'ARN avec vraisemblablement des niveaux variables d'expression au sein de tous les stades de développement de Lymnaea stagnalis. Pour supprimer des embryons et des larves de leurs capsules , nous trialed une variété de traitements chimiques et physiques, un choc osmotique et rapporté pour d' autres encapsulated- le développement des organismes modèles. Cependant, dans nos mains la méthode que nous décrivons ici est la seule technique à haut débit qui élimine la membrane capsulaire dure sans endommager les embryons et les larves. Après décapsulation, le matériau peut être soit stocké ou traité avec un régime spécifique de stade de protéinase-K puis hybridé à une ribosonde. efforts d'optimisation empiriques supplémentaires (généralement axées sur la concentration de la sonde et la température d'hybridation) peuvent être nécessaires pour chaque sonde / cible. Ces paramètres (en plus du régime de fixation et de traitement à la protéinase-K) sont typiquement des paramètres les plus influentsde toute expérience in situ ( en supposant que la qualité du matériel fixe et la sonde d'ARN sont d'un niveau élevé).

L'importance d'un traitement protéinase-K approprié pour le résultat final d'une expérience in situ est primordiale pour L. stagnalis. Ceci se reflète dans la large gamme de concentrations protéinase K requises par les stades de développement distincts (allant de 0 pg / ml à 500 pg / ml). Il est donc important d'être en mesure d'attribuer une chaîne d'oeuf donné à une fenêtre ontogénétique. À cette fin, la ligne directrice que nous fournissons à la figure 1 permet la mise en scène de la matière de développement de l' âge inconnu (une version amicale d'impression de cette figure est disponible en fichier supplémentaire 3 que les utilisateurs peuvent trouver utile d'avoir au microscope lorsque le matériau de stockage intermédiaire) . Nous notons que pour d'autres espèces de gastéropodes protéinase-K traitements pour WMISH peut soit être maintenue constante pour une large gamme de dévepmental étapes 8,25,26, ou peut être omis entièrement 27. Ceci est en contraste frappant avec la situation en L. stagnalis. En outre, alors que les autres groupes de recherche ont signalé précédemment les profils d'expression WMISH pour plusieurs gènes de L. stagnalis larves (voir 22,28,29) la méthode que nous décrivons ici donne des modèles de résolution spatiale nettement plus élevé. Enfin, nous avons observé une importante variation inter-lots dans l'activité de la protéinase-K de notre fournisseur. Cette variation doit être prise en compte en effectuant une série de «calibrage» des expériences WMISH où l'activité de la nouvelle protéinase-K est déterminée empiriquement. Toutes les expériences ultérieures avec des aliquotes de protéinase-K de ce lot peuvent alors être effectuées librement.

Nous avons décrit précédemment une méthode alternative pour WMISH L. embryons stagnalis et les larves ailleurs 12. Cette méthode détaillée l'utilisation du mucolytAgent ic N-acétyl-L-cystéine (NAC), un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT) et un traitement de pré-hybridation avec du dodécylsulfate de sodium (SDS). Nous avons trouvé ces traitements améliorés les schémas de coloration de certains gènes pour certains stades de développement. La stratégie de fixation que nous avons récemment développé et décrit ici (larves dans leurs capsules de fixation) simplifie et accélère les étapes nécessaires pour préparer le matériel pour une expérience in situ, et nie apparemment la nécessité de déterminer de façon empirique des traitements supplémentaires pré-hybridation optimales avec le NAC, la TNT ou SDS. Améliorations futures à la technique rapportée ici pourraient inclure la visualisation de microARN (suite à des modifications aux protocoles de WMISH standards précédemment rapportés 30), l' étiquetage double ou triple de l' ARNm cible 31, et la visualisation fluorescente de signaux WMISH 32. Sans doute la plus grande limitation de la technique est la longueur totale du temps qu'il faut pour aller de collectineg du matériau, à une image numérique qui représente un motif d'expression de gène donné. En raison de la nature des événements biochimiques et biophysiques qui doivent avoir lieu au cours d' un tel processus est ce une caractéristique inhérente de la plupart des protocoles d'hybridation in situ.

Lymnaea occupe une position dans le métazoaires qui est extrêmement sous-représentées en termes d'organismes modèles. En tant que représentant Spiralian, Lymnaea peut apporter un aperçu de l'évolution des caractéristiques morphologiques distinctes telles que la formation de la coquille 12 et le corps latéralité 33-35 et est également un précieux neuroéthologie 36 et neurophysiologie modèle 9,37. Techniques puissantes telles que la capacité de visualiser efficacement les profils d'expression des gènes in situ augmente la fonctionnalité de Lymnaea comme un organisme modèle, et élargit la diversité des questions qu'il peut être utilisé pour répondre. À une époque où la génération de grande dat de séquenceEASEF (transcriptomes complets et même des génomes) est, de telles méthodes relativement courantes deviendront plus pertinentes pour les chercheurs qui souhaitent interpréter le flot de données de séquence à partir de ces modèles. Alors que Lymnaea est un gastéropode relativement dérivé 38, et possède ce qui serait considéré comme un grand génome par rapport à d' autres organismes modèles (1,22 Gb 39), il possède de nombreuses fonctionnalités pratiques et intéressantes qui en font un système modèle attractif. Les méthodes que nous décrivons ici d' élargir la boîte à outils à la disposition de Lymnaea et peuvent être utiles à d' autres espèces qui subissent encapsulées développement.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par un financement à DJJ à travers le projet DFG # JA2108 / 2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

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References

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