A Whole Mount
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hele mount in situ hybridisering (WMISH) er en teknikk som gjør det mulig for den romlige oppløsningen på nukleinsyremolekyler (ofte mRNA) innenfor en hel mount 'vev forberedelse, eller utviklingsstadiet (slik som et embryo eller larve) av interesse. WMISH er ekstremt kraftig, fordi det kan bidra vesentlig til den funksjonelle karakterisering av komplekse metazo genomer, en utfordring som blir stadig mer av en flaskehals med oversvømmelse av neste generasjons sekvensdata. Til tross for den konseptuelle enkelheten av teknikken mye tid er ofte nødvendig for å optimalisere de ulike parameterne som ligger til WMISH eksperimenter for nye modellsystemer; små forskjeller i de cellulære og biokjemiske egenskaper mellom vevstyper og utviklingsstadier bety at en enkelt WMISH metoden ikke kan være hensiktsmessig for alle situasjoner. Vi har utviklet et sett av WMISH metoder for re-fremvoksende gastropod modell stor damsnegl som genererer konsekvent ogklare WMISH signaler for en rekke gener, og på tvers av alle utviklingsstadier. Disse metodene inkluderer tildeling av larver av ukjent kronologiske alder til en ontogenetisk vindu, effektiv fjerning av embryoer og larver fra sine egg kapsler, anvendelse av en passende proteinase-K behandling for hver ontogenetisk vinduet, og hybridisering, post-hybridisering og immundeteksjon trinn. Disse metodene gir et grunnlag for det resulterende signal for en gitt RNA-transkript kan være ytterligere raffinert med probe spesifikk justering (primært probe konsentrasjon og hybridisering temperatur).

Introduction

Bløtdyr er en gruppe dyr som holder interessen for et bredt mangfold av vitenskapelige disipliner. Til tross for deres morfologisk mangfold 1, artsrikdom (andre bare til Leddyr i form av arter nummer to) og relevans for et bredt spekter av kommersielle 3, medisinsk 4 og vitenskapelige spørsmål 5-8, er det relativt få bløtdyr arter som kan hevde å være både velutstyrte vitenskapelige modeller og lett å vedlikeholde i et laboratoriemiljø. En bløtdyr som er mye brukt av disipliner som nevrobiologi 9, økotoksikologi 10 og mer nylig evolusjonsbiologi 11,12, er stor damsnegl, først og fremst på grunn av sin omfattende distribusjon og ekstrem enkelt vedlikehold. Til tross for sin popularitet som en "modell" organisme og dens lange historie med bruk av utviklings biologer 13-19, omfanget og kraften av molekylære verktøy tilgjengelig for L. stagnAlis vitenskapelige samfunnet ligger langt bak at mer tradisjonelle dyremodeller (Drosophila, mus, kråkeboller, nematoder).

Vårt ønske om å utvikle Lymnaea som en molekylær modell stammer fra en interesse i de molekylære mekanismene som styrer skalldannelsen. Dette motiverte oss til å avgrense et sett av teknikker som ville tillate for effektiv, konsekvent og sensitiv visualisering av genuttrykk under Lymnaea utvikling. Hele mount in situ hybridisering (WMISH) er mye brukt for en rekke modellorganismer og har vært i bruk i mer enn 40 år 20. I sine forskjellige forkledninger, kan ISH brukes til romlig lokalisere bestemte loci på kromosomene, rRNA, mRNA og mikro-RNA.

En av utfordringene vi trengte å ta før raffinering en WMISH metode for L. stagn var spørsmålet om forsiktig og effektivt trekke ut embryoer og larver av varierende stadier fra than egg kapsler hvor de er avsatt. Denne ekstraksjon, eller 'decapsulation', som må oppnås effektivt for å samle tilstrekkelig materiale for en gitt in situ forsøk, mens det på samme tid opprettholde morfologiske og cellulær integritet. Mens andre modellorganismer også gjennomgå innkapslet utvikling i våre hender ingen av metodene som er rapportert for disse artene kan være vellykket ansatt i L. stagn.

De overordnede målene for denne metoden er derfor: å trekke L. stagn embryoer og larver fra sine kapsler i en high-throughput mote, for å bruke pre-hybridisering behandlinger som optimaliserer WMISH signal, for å forberede embryoer og larver med tilfredsstillende WMISHsignals for bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Følgende fremgangsmåte beskriver vår metode for å gjennomføre en in situ forsøk på embryonale og larvestadier av L. stagn. Dersom et trinn innebærer bruk av farlige kjemikalier dette er angitt med ordet "FORSIKTIG" og alle nødvendige sikkerhetsprosedyrer bør vedtas. Lenker til representative MSDS ark for farlige kjemikalier er gitt i Tilleggs File 1. Oppskrifter for alle reagenser er gitt i tilleggs File to.

1. Montering av Decapsulation Apparatus

  1. For å gjøre dette, å koble en 20 ml engangssprøyte og silisium slange (med en indre diameter på 1 mm og en ytre diameter på 3 mm) under anvendelse av en P1,000 spiss kuttet til en passende lengde, som vist i figur 2A.
  2. Tape en standard objektglass til en invertert stor petriskål. Tape silikonrøret umiddelbart tilstøtende til objektglass som vist i figur60, 2C og 2D.
  3. Hvil en trakk glass nål på objektglass og sett det forsiktig inn i silikonslangen til tuppen av nålen stikker ca 20% av veien over den indre diameter av røret (se figur 2C og 2D). Når nålen er i posisjon tape det ned til petriskål.
  4. Tillat den frie ende av silikonrøret til hvile i en annen petriskål som skal samle inn Decapsulated materiale.

2. Prøvetaking, Fiksering og Decapsulation

MERK: Alle trinnene blir utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt.

  1. Nøye samle eggstrenger fra veggene i et akvarium. For å gjøre dette, bruk en flat stykke fleksibel plast som en slikkepott til å skrape egg strengen av underlaget, og bruk en plast te sil å fiske den flytende egg strengen ut av vannet. Stage og sortere materialet under et mikroskop med guide gitt i Figur1.
  2. Plasser egg strengen på et papirhåndkle og lag et langsgående snitt langs egg masse ved hjelp av fjærlette tang. Rull egget kapsler ut av egget streng og fjerne så mye av gelé materiale som mulig fra hver kapsel ved å skyve dem rundt papirhåndkle ved hjelp av fjærlette tang.
  3. Bruke featherweight tang, overføre egg kapslene i en petriskål som inneholder 5 ml vann fra springen. Fortsett å samle de-jellied egg kapsler av de ønskede utviklingsstadier i denne retten. Samle nok kapsler fra alle utviklingsstadier for den planlagte WMISH forsøket går videre til neste trinn.
  4. Når du arbeider med mer utviklede larver (5 dager etter første cleavage (dpfc) og eldre) bedøver dem før fiksering.
    MERK: Dette vil hindre musklene trekker seg sammen som gjør tolkningen av in situ fargemønstre svært vanskelige.
    1. Slapp av larver (mens de fortsatt er i sin capsules) i en 2% vekt / volum oppløsning av MgCl2 • 6 H 2 O i 30 minutter før fiksering.
    2. Vurdere graden av velvære etter 30 min ved å senke flere larver mens de fortsatt i sine egg kapsler i fiksativ løsning og overvåke deres reaksjon under et mikroskop. Ufullstendig avslappet larver vil trekke inn sine skjell, mens helt avslappet larver ikke vil svare. Når disse larvene har vært avslappet gå videre til neste trinn.
  5. Overfør egget kapsler ved bruk av et bredt boring plastpipette inn i et forseglbart rør som gir 10 ganger volumet av egg kapsler (f.eks., Vil en ml av oppgjorte kapsler krever en 10 + ml rør).
  6. Sug så mye væske som mulig fra røret og erstatte med et volum på fiksativ løsning som er 10x volumet av de bosatte egg kapsler. Forsiktig rotere egget kapsler i fiksativ ved RT i riktig tid for hvert utviklingsstadiet (se figur 1).
  7. Discontinue rotasjon og tillate kapslene å synke og aspirer fiksativ løsning i en passende avfallsbeholder.
  8. Vask egget kapslene ved å erstatte den fikserløsning med fosfatbufret saltvann med 0,1% Tween-20 (PBTw) og roterer ved RT i 5 min. Aspirer PBTw og gjenta to ganger.
  9. Fjern embryoer og larver fra sine kapsler ved hjelp av anordningen (se avsnitt 1 for detaljer) er vist i figur 2. Tegn kapslene opp i 20 ml sprøyte, festes produksjonsrøret og deretter fjerne kapslene gjennom røret og forbi glasset nålen ut i samlingen fatet.
    MERK: Normalt skal et flertall (> 90%) av alle kapsler trenger bare ett pass gjennom enheten. I mange tilfeller kapselen membranen skades, men embryoer og larver forbli inne i den knuste kapselen. Behandle dette materiale ganske enkelt ved å trekke den opp i sprøyten og avskaffe den igjen.
  10. Samle Decapsulated embryoer og larver i en 1,5 ml tube med en micropipette (a P20 0 - 3 dag gamle larver, og et P200 for voksne larver med enden av spissen avskåret).
    MERK: En pause (i opp til flere måneder) i protokollen kan være laget på dette stadiet. Hvis dette er nødvendig, skal det decapsuled materialet samles i en 1,5 ml tube for lagring (fortsett til neste trinn). Ellers fortsetter umiddelbart til protokoll 3.
  11. Tillat embryoer og larver til å synke til bunnen av røret og aspirer supernatanten. Bytt ut med 33% etanol (EtOH) i PBTw og la sitte i 5 - 10 min. Gjenta med 66% EtOH i PBTw og 100% EtOH. Vask larver to ganger i 100% EtOH ved romtemperatur. Oppbevar materialet ved -20 ° C i 100% EtOH.
  12. Når du er klar til å fortsette, re-hydrat prøvene ved å fjerne 100% EtOH og erstatte med 66% EtOH i PBTw, la sitte i 5 - 10 min. Gjenta med 33% EtOH i PBTw, la sitte i 5 - 10 min. Endelig vask med 3 x 5 min vasker av PBTw for å sikre at alt EtOH fjernes.

3. proteinase-K, TEA og Post-fixation

MERK: Vi finner utføre følgende trinn i små kurver med en maske gulvet den mest effektive og skånsomme metode for raskt å bytte tidskritiske løsninger. Selv om disse kan være hjemmelaget, bruker vi kurver (medium størrelse) som er kompatible med Intavis InSituPro -Vsi væske håndtering robot (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Slike kurver kan raskt og enkelt beveges mellom brønnene i en 12 brønners kulturskål (TCD) for å utveksle løsninger, eller oppløsningen kan aspireres fra brønnen ved hjelp av en pipette Alternativt kan alle løsnings utveksling utføres uten disse kurvene ved ganske enkelt å aspirere supernatanten fra larver. I dette tilfellet en forsiktig svingende bevegelse vil konsentrere alle embryoer og larver til midten av tallerken tillate supernatanten å bli fjernet fra kanten av brønnen. Følgende forutsetter at brukeren ansette kurver for løsnings børser.

  1. Ved hjelp av en pipette, Overføring embryoer og larver i en kurv sitter i en 12 godt TCD med 2 ml PBTw.
    MERK:. Antall embryoer og / eller larver som kan legges avhenger av utviklingsstadiet blir etterforsket, men en generell tommelfingerregel er å ha minst 25% av arealet fritt for embryoer / larver (dvs. ikke for mange av kurven).
  2. Fremstille en nærliggende brønn med 2 ml av den passende proteinase K-løsning (se figur 1), og ytterligere 2 brønner med 2 ml 0,2% Glycine hver. Flytte hver kurv i brønnen som inneholder den passende konsentrasjon av proteinase-K og umiddelbart begynne timing.
  3. Etter 10 min bevege hver kurv i en brønn inneholdende 0,2% glycin og inkuberes i 5 min. Deretter flytter hver kurv til den andre brønnen med 0,2% glysin og inkuberes i 5 min. Vask ut Glysin med 3x 5 min utveksling av 3 ml PBTw.
  4. Fjern PBTw løsning og behandle prøvene gang med nylagde Trietanolamin (TEA) solution for 5 min OBS Ikke agitere. Erstatt med 3 ml nylaget TEA løsning i 5 min. Ikke agitere. Aspirere flertallet av TEA-oppløsningen fra prøvene. Legg nylaget trietanolamin med eddiksyreanhydrid (TEAAA) løsning og inkuberes i 5 min. OBS Ikke agitere.
  5. EKSTRA - Mens trinnet ovenfor er ruger, forberede en annen ny ladning med TEAAA løsning og gjenta trinn.
    MERK: Denne andre behandling med TEAAA er valgfritt, men kan bidra til å fullstendig eliminere all bakgrunns med prober utsatt for generering bakgrunn.
  6. Fjern det TEAAA oppløsningen ved å suge den fra brønnen og erstatte med 3 ml PBTw. Ikke agitere. Fjern PBTw og bruke 3 ml 3,7% formaldehyd i PBTw. Virvle ganger under en 30 min inkubasjon.
  7. Fjern fiksativ ved å aspirere det fra brønnen og erstatte med 3 ml PBTw. Overfør materialet inn i et 1,5 ml rør. Replace den PBTw med hybridisering buffer og inkuberes i 5 min ved RT - FORSIKTIG.
  8. Plasser rørene inn i en varm blokk ved RT, og sett temperaturen til ønsket hybridisering temperatur.
    MERK: hybridiseringstemperaturen er sonden spesifikk og vil måtte bli optimalisert empirisk, men vi finner 55 ° C for å være en god temperatur til å begynne med prøve. Tillat blokken for å komme til hybridisering temperatur, og tillate prøvene å pre-hybridisere i omtrent 15 min (det vil si, er den tid det tar å fremstille de riboprober, lenger er ikke nødvendig). Forbered tilstrekkelige volumer (normalt 100 mL) av de fortynnede riboprober. Vi vanligvis prøve probe konsentrasjoner av 100 og 500 ng / ml som en utgangsleiet. Vi forbereder riboprober ifølge 12.
  9. Fjern det hybridiseringsbuffer fra prøvene og legge til sonden i hybridiseringsbuffer til prøvene. Overlegg med 100 ul (eller et tilstrekkelig volum til å danne en fase over hybridisering buffer) av mineralolje.
    MERK: mineralolje forhindrer omfattende kondens som vil danne under den lange hybridisering trinn. Omfattende kondensering vil vesentlig endre både kjemien av hybridiseringsoppløsningen og konsentrasjonen av proben.
  10. Denaturere probe og mål-RNA ved å oppvarme prøvene til 75 ° C i 10 minutter, og deretter redusere varmen til den ønskede hybridisering temperatur. Tillate hybridisering for å forløpe i minst 12 timer (O / N) eller lengre (i 24 - 48 timer).
  11. Under hybridisering fjerne et enkelt rør fra varmeblokk, rotere det raskt mellom tommel og pekefinger for å suspendere larvene uten å forstyrre oljefasen, og erstatte den i varmen blokken. Gjenta dette en gang hver 6-12 timer eller så.

4. Varm Vasker og immundeteksjon

MERK: Selv om vi bruker en væske håndtering robot for de neste trinnene, disse kan også enkelt gjøres manuelt. I dette tilfellet, embryoer og larver should holdes i 1,5 ml rør de ble hybridisert i. Alle etterfølgende løsning børser er aspirert og lagt med en P1,000 pipette. Når utføres manuelt hver av de følgende trinnene bør ansette 1 ml av hver løsning.

  1. Varme tilstrekkelige volumer (3 ml hver gang for hver prøve) av den 4x, 2x og 1x vaskeløsninger til hybridiseringstemperaturen.
  2. Vask alle prøvene tre ganger i 4 x vaskebuffer i 15 minutter hver ved hybridiseringstemperaturen. Vask alle prøvene tre ganger i 2 x vaskebuffer i 15 minutter hver ved hybridiseringstemperaturen. Vask alle prøvene tre ganger i 1 x vaskebuffer i 15 minutter hver ved hybridiseringstemperaturen.
  3. Vask alle prøvene en gang med 1x Natriumklorid natriumcitratbuffer + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) ved hybridiseringstemperaturen. Tillate prøvene å avkjøles til RT.
  4. Vask alle prøvene to ganger i 1x SSC + 0,1% Tween 15 min Erstatt denne 1x SSC løsning med maleinsyre Buffer (MTB) og la sitte i 10 min Gjenta MAB waske. Erstatte MAB med blokk-løsning og inkuberes i 1,5 timer.
  5. Utveksler blokken løsning for antistoffoppløsning (1: 10.000 fortynning av antistoff i blokk oppløsning) og inkuberes i 12 timer (O / N) ved romtemperatur med forsiktig omrøring.

5. Color Utvikling og Montering

  1. Aspirer antistoffløsning og vaskes 15 ganger med PBTw i 10 minutter hver. Erstatt PBTw med 1x alkalisk fosfatase Buffer (AP) og inkuberes i 10 min.
  2. Mens de ovennevnte inkubasjon steg inntektene, forberede AP fargeløsning (se Tilleggs File 2) - FORSIKTIG. Overfør materialet i en TCD brønnen og erstatte den 1x AP AP løsning med fargeløsning. Legg merke til den tid nå slik at lengden av tidsfargereaksjonen finner sted for kan registreres. Overvåke utviklingen av den fargemønster til signalet til bakgrunnsforhold er optimal.
  3. For å stoppe fargeutvikling, fjerne 1x AP fargeløsning (kast i riktig waste container), og bruke 2 ml PBTw og merk tiden nå. Skyll to ganger mer med PBTw i 5 min hver. Bruke en av disse skyllinger til å overføre materialet til et 1,5 ml rør.
  4. Fjern det PBTw og anvende 1 ml 3,7% formaldehyd i PBTw og agitere eller rotere i minst 30 minutter ved romtemperatur (dette kan også gjøres O / N).
  5. Skyll fiksativ med 3 vasker av PBT (kast avfallet fiksativ i en passende avfallsbeholder). Vask prøvene 3 ganger ved 50 ° C i avionisert vann.
    MERK: Disse vasker eliminere utfelling av salter som kan bli synlig under rydding og visualiserings trinn.
  6. Avgjør om prøvene skal monteres i Benzyl Benzoate: Benzyl Alcohol (BB: BA, også kjent som Murray klar) eller glyserol.
    MERK: Vi foretrekker de mer kraftige clearing agenten BB: BA som L. stagn embryoer er noe ugjennomsiktig. Prøver som skal monteres i BB: BA må først dehydratiseres gjennom en etanol-serien. Prøver som skal monteres på 60%glyserol kan umiddelbart montert.
  7. Overfør prøvene inn i monteringsløsning (BB: BA eller 60% glycerol) ved hjelp av en pipette.
    MERK: Ved montering i BB: BA dette må gjøres i et glass godt (BB: BA vil smelte polykarbonatplast).
  8. La prøvene å rydde i 5 - 10 min, og deretter montere dem på et lysbilde ved hjelp av et passende antall stablede dekkglass som avstandsstykker (en dekk for prøver <1 dpfc, 2 dekk for prøver> 1 dpfc).
    MERK: Hele mounts kan nå avbildes med et sammensatt mikroskop med DIC optikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representative WMISH fargemønstre som er vist på figur 3 ble samlet ved hjelp av teknikken som er beskrevet ovenfor, og gjenspeiler en rekke romlig uttrykk mønstre for gener som er involvert i en rekke molekylære prosesser som strekker seg fra skalldannelse (Novel gen 1, 2, 3 og 4), til celle-celle signalisering (DPP) til transkripsjonsregulering (Brachyury) på tvers av en rekke utviklingsstadier. Selv om vi ikke har kvantifisert uttrykket nivåer av disse genene vi forventer at de vil også variere i betydelig grad, noe som indikerer at vår metode kan anvendes mot et bredt spekter av genprodukter uttrykt i alle faser av utviklingen på ulike nivåer. Bare ett av genene som er presentert her (DPP) er tidligere beskrevet i L. stagn 21,22. Resultatene vi presenterer her er i stor grad i tråd med disse tidligere rapporter, men med betydelig høyere romlig reso oppløsning. Den romlige uttrykk mønster av Brachyury har blitt beskrevet i abalone 23 og limpet 24 og i begge tilfeller ble også påvist i mantelen celler som vi finner for L. stagn (figur 3F). Vi isolert Nye gener 1-4 (fra en proteomikk skjerm designet for å identifisere genprodukter som er direkte involvert i skallet formasjon, og så deres romlige uttrykk mønstre forbundet med skallet kjertelen (figur 3A og B) eller skall felt (Figur 3C og D) er fullstendig sammenfallende med skalldannende funksjoner. Disse resultater indikerer at den høye gjennomstrømningen teknikk har vi utviklet for fjerning av embryoer og larver fra egg kapselen, og det etterfølgende trinn spesifikke permeabiliseringen behandlinger, generere hele monterings prøver som vil gi høy kvalitet in situ farving mønstre for et bredt utvalg av gener for alle stadier av embryonale og larveutvikling.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 1
Figur 1. en oppsummering ontogeny av stor damsnegl og tilsvarende Fixation og proteinase-K behandlinger. Representative bilder av embryoer og larver fra de første 7 dagene med utvikling illustrerer en betydelig økning i størrelse (rad 1) og morfologisk kompleksitet (radene 2 og 3) . Disse utviklings endringer sette til store forskjeller i riktig fiksering tid og proteinase-K konsentrasjoner som genererer optimale WMISH signaler. For WMISH alle ledd skal være løst i 3,7% formaldehyd i PBS ved RT med forsiktig omrøring innenfor sine egg kapsler. Alle trinn bør deretter behandles med det passende proteinase-K-konsentrasjon i 10 min. Merk at vi observere betydelige inter-sats variasjon i aktiviteten av proteinase-K fra leverandør. Denne variasjonen må regnskapsføres etter performing en runde av "kalibrering" WMISH forsøk hvor aktiviteten av den nye proteinase-K er empirisk bestemt. De proteinase-K konsentrasjoner er angitt i figuren bør derfor behandles som en innledende guide, men de relative konsentrasjoner mellom utviklingsstadier (for eksempel to dager gamle embryoer krever en proteinase-K konsentrasjon 3 ganger høyere enn dagen 1 embryo) er satt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. apparatet som brukes til Decapsule L. stagn embryoer. (A) En oversikt over anordningen som effektivt kan fjerne L. stagn embryoer og larver fra sine kapsler. (B) En forstørret bilde avdet gule eske i området (A). En skarp nål glass er plassert på objektglass og satt inn i silikonrøret (indre diameter 1 mm, ytre diameter 3 mm), slik at tuppen stikker ut omtrent 20% av veien inn i hulrommet av slangen. Glasset Nålen er da også tapet til objektglass og petriskål. (C) En skjematisk 'plan' syn på den gule eske delen i A. Egg kapsler som inneholder faste embryoer og larver er først samlet inn ved hjelp av 20 ml sprøyte. Sprøyten blir deretter festet til silisium slangen og kapslene drives ut gjennom røret og forbi nålen. Egg kapsel membraner er revet av nålen og den frigjorte embryonale og larve materialet kan hentes fra samlingen fatet ved hjelp av en mikropipette. (D) En skjematisk tverrsnitt 'syn på den gule eske delen i A. objektglass sikrer at nål inn i silisium slangen i riktig høyde. (F) En representant visning av larver som har gjort en enkelt passering gjennom apparatet. Mer enn 90% av materialet er effektivt og skånsomt fjernet fra sine kapsler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representative Bilder av WMISH uttrykk mønstre mot en rekke gener fra en rekke L. . stagnutviklingsstadier som genereres av metoden beskrevet her Alle utviklingsstadier ble behandlet som beskrevet i ovennevnte metode og har blitt montert og avbildes i BB: BA (Murray klar). Omtrentlige alderen er angitt i åp høyre for hvert panel og orientering vises i nedre høyre. Gene orthology (når kjent) er angitt i nederst til venstre i hvert panel. Forkortelser: shell kjertel (sg); shell-feltet (sf); mantelen (mt); fot (ft); Dekapentaplegisk (DPP); dpfc (dager etter første cleavage). Alle skala barer er 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremgangsmåten som er beskrevet her gjør det mulig for effektiv visualisering av RNA-transkripter med antagelig varierende ekspresjonsnivåer i alle utviklingsstadier av stor damsnegl. For å fjerne embryoer og larver fra sine kapsler vi trialed en rekke kjemiske, osmotisk sjokk og fysiske behandlinger er rapportert for andre encapsulated- utvikle modellorganismer. Men i våre hender metoden vi beskriver her er det bare høy gjennomstrømming teknikk som fjerner den tøffe kapsel membranen uten å skade befruktede egg og larver. Etter decapsulation kan materialet enten lagres, eller behandles med en scene spesiell diett av proteinase-K og deretter hybridisert til en riboprobe. Andre empiriske optimalisering innsats (typisk fokusert på sonden konsentrasjon og hybridisering temperatur) kan være nødvendig for hver probe / target. Disse parametrene (i tillegg til fiksering diett og proteinase-K behandlinger) er vanligvis den mest innflytelsesrike parametreneav en hvilken som helst in situ forsøk (forutsatt at kvaliteten av det faste materiale og den RNA sonde er av høy standard).

Betydningen av en passende proteinase-K behandling for det endelige resultatet av en in situ forsøk er viktig for L. stagn. Dette gjenspeiles i det store utvalget av proteinase-K-konsentrasjoner som kreves av forskjellige utviklingsstadier (varierende fra 0 ug / ml til 500 ug / ml). Det er derfor viktig å være i stand til å tildele en gitt egg streng til en ontogenetisk vindu. For dette formål, den retningslinje at vi gir i figur 1 åpner for iscenesettelsen av utviklings materiale av ukjente aldre (en utskriftsvennlig versjon av denne figuren er tilgjengelig i Tilleggs Fil 3 at brukere kan finne nyttig å ha på mikroskop når iscenesettelsen materiale) . Vi merker oss at for andre arter av snegler Proteinase K-behandling for WMISH kan enten holdes konstant for et bredt spekter av utvikledepmental stadier 8,25,26, eller kan utelates helt 27. Dette står i sterk kontrast til situasjonen i L. stagn. Videre, mens andre forskningsgrupper som tidligere har rapportert WMISH uttrykk mønstre for flere gener i L. stagn larver (se 22,28,29) metoden som vi beskriver her gir mønstre av betydelig høyere romlig oppløsning. Til slutt er det også observert signifikant inter-batch variasjon i aktiviteten av proteinase-K fra leverandør. Denne variasjon må tas hensyn til ved å utføre en runde av "kalibrering" WMISH forsøk hvor aktiviteten av den nye proteinase-K er empirisk bestemt. Alle etterfølgende eksperimenter med aliquoter av proteinase-K fra det parti deretter kan fritt utføres.

Vi har tidligere beskrevet en alternativ WMISH metode for L. stagn embryoer og larver andre steder 12. At metoden beskrevet bruken av mucolytic middel N-acetyl-L-cystein (NAC), et reduksjonsmiddel så som ditiotreitol (DTT) og et pre-hybridisering behandling med natriumdodecylsulfat (SDS). Vi fant de behandlinger forbedret fargemønstre av noen gener for enkelte utviklingsstadier. Fikser strategi som vi nylig utviklet og beskriver her (fikse larver innenfor sine kapsler) forenkler og påskynder trinnene som er nødvendig for å forberede materiale for en in situ eksperiment, og tilsynelatende opphever behovet for empirisk å bestemme ytterligere optimale pre-hybridisering behandlinger med NAC, DTT eller SDS. Fremtidige forbedringer til teknikken rapportert her kan inkludere visualisering av microRNAs (etter endringer i standard WMISH protokoller tidligere rapportert 30), dobbel eller trippel merking av mRNA er rettet mot 31, og fluorescerende visualisering av WMISH signaler 32. Uten tvil den største begrensning av teknikken er den totale lengde av tid det tar å gå fra collecting av materialet, på et digitalt bilde som representerer en gitt genekspresjon mønster. På grunn av beskaffenheten av de biokjemiske og biofysiske hendelser som skal finne sted under en slik prosess dette er en iboende egenskap ved de fleste in situ hybridisering protokoller.

Lymnaea inntar en posisjon innen metazoer som er svært underrepresentert når det gjelder modellorganismer. Som representant Spiralian kan Lymnaea bringe innsikt i utviklingen av distinkte morfologiske funksjoner som shell formasjon 12 og kropp handedness 33-35, og er også en verdifull neuroethology 36 og nevrofysiologi modell 9,37. Kraftige teknikker slik som evnen til effektivt å visualisere genutrykksmønster in situ øker funksjonaliteten til Lymnaea som modellorganisme, og utvider rekke spørsmål som den kan brukes til å ta opp. I en tid da den generasjonen av stor sekvens datasets (komplett transcriptomes og selv genomer) er relativt rutinemessige, slike metoder vil bli mer relevant for forskere som ønsker å tolke flommen av sekvensdata fra slike modeller. Mens Lymnaea er en relativt avledet gastropod 38, og besitter hva som ville bli betraktet som en stor genom i forhold til andre modellorganismer (1,22 Gb 39), den har mange praktiske og interessante funksjoner som gjør det til et attraktivt modellsystem. Metodene som vi beskriver her utvide verktøykassen tilgjengelig for Lymnaea og kan være til nytte for andre arter som gjennomgår innkapslet utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av midler til DJJ gjennom DFG prosjekt # JA2108 / 2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  2. Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. Sinauer. Sunderland. (2002).
  3. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
  4. World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
  5. Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218, (3), 211-229 (2010).
  6. Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53, (2), 237-244 (2015).
  7. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
  8. Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
  9. Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343, (1-2), 124-137 (2010).
  10. Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50, (4), 369-373 (2005).
  11. Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58, (6-8), 501-511 (2014).
  12. Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15, (1), 19 (2015).
  13. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 91-121 (1946).
  14. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 353-434 (1946).
  15. Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121, (1), 1-77 (1952).
  16. Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
  17. Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183, (1), (1973).
  18. Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26, (3), 367-391 (1971).
  19. Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35, (1), 29 (1973).
  20. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63, (2), 378-383 (1969).
  21. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  22. Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221, (2), 59-68 (2011).
  23. Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311, (1), 200-212 (2007).
  24. Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129, (6), 1411-1421 (2002).
  25. Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7, (1), 160 (2007).
  26. Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
  27. Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. (2015).
  28. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  29. Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4, (1), 15 (2013).
  30. Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
  31. Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49, (8), 635-645 (2007).
  32. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11, (1), 43 (2011).
  33. Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5, (1), 20-22 (2009).
  34. Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462, (7274), 790-794 (2009).
  35. Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14, (16), 1462-1467 (2004).
  36. Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6, (4), e18745 (2011).
  37. Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9, (4), e92941 (2014).
  38. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  39. Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35, (Database issue), D332-D338 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats