Eine ganze Berg
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
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Biology

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Summary

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Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

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Abstract

Whole mount in situ Hybridisierung (WMISH) ist eine Technik , die für die räumliche Auflösung von Nukleinsäuremolekülen (oft mRNAs) innerhalb eines "whole mount" Gewebepräparation oder Entwicklungsstadium (wie ein Embryo oder Larve) von Interesse ermöglicht. WMISH ist extrem leistungsfähig, da sie wesentlich zur funktionellen Charakterisierung komplexer Metazoen Genome beitragen kann, eine Herausforderung, die mehr von einem Engpass bei der Flut der nächsten Generation Sequenzdaten immer. Trotz der konzeptionellen Einfachheit der Technik viel Zeit wird häufig benötigt, um die verschiedenen Parameter inhärent WMISH Experimente für neuartige Modellsysteme zu optimieren; subtile Unterschiede in den zellulären und biochemischen Eigenschaften zwischen Gewebetypen und Entwicklungsstadien bedeuten, dass eine einzige WMISH Methode nicht für alle Situationen geeignet sein können. Wir haben eine Reihe von WMISH Methoden für die wieder auftauchende gastropod Modell entwickelt , das Spitzschlammschnecke erzeugen konsistent undklar WMISH Signale für eine Reihe von Genen, und in allen Entwicklungsstadien. Diese Verfahren umfassen die Zuordnung von Larven unbekannter chronologischen Alter zu einem ontogenetischer Fenster die effiziente Entfernung von Embryonen und Larven von ihren Eier Kapseln, die Anwendung eines geeigneten Proteinase-K - Behandlung für jeden ontogenetischer Fenster und Hybridisierung, post-Hybridisierung und Immunnachweis Schritte. Diese Methoden stellen eine Grundlage, das resultierende Signal für eine bestimmte RNA-Transkript verfeinert werden kann weiter mit Sonde spezifische Anpassungen (in erster Linie Sondenkonzentration und Hybridisierungstemperatur).

Introduction

Mollusken sind eine Gruppe von Tieren, die das Interesse einer breiten Vielfalt wissenschaftlicher Disziplinen halten. Trotz ihrer morphologischen Vielfalt 1, Artenreichtum ( an zweiter Stelle nach den Arthropoden in Bezug auf die Artenzahl 2) und der Relevanz für eine breite Palette von kommerziellen 3, medizinischen 4 und wissenschaftlichen Fragen 5-8, gibt es relativ wenige Mollusken - Arten , die zu behaupten kann , sein beide gut ausgestattete wissenschaftliche Modelle und einfach in einer Laborumgebung zu halten. Ein Mollusken , die viel von Disziplinen wie Neurobiologie 9 verwendet wird, Ökotoxikologie 10 und in jüngerer Zeit die Evolutionsbiologie 11,12, ist Spitzschlammschnecke, in erster Linie wegen seiner weiten Verbreitung und extrem einfache Wartung. Trotz seiner Popularität als "Modell" Organismus und seine lange Geschichte der Verwendung von Entwicklungsbiologen 13-19, die Reichweite und Leistung von molekularen Werkzeugen zur Verfügung, die L. StAGNalis wissenschaftliche Gemeinschaft liegt weit hinter der traditionellen Tiermodellen (Drosophila, Maus, Seeigel, Nematoden).

Unser Wunsch zu entwickeln Lymnaea als ein molekulares Modell von einem Interesse an den molekularen Mechanismen ergibt sich die Schalenbildung führen. Dies motiviert uns eine Reihe von Techniken zu verfeinern , die für die effiziente, konsistente und sensible Darstellung der Genexpression während der Lymnaea 's Entwicklung ermöglichen würde. Whole mount in situ Hybridisierung (WMISH) ist weit verbreitet für eine Vielzahl von Modellorganismen eingesetzt und ist seit mehr als 40 Jahren im Einsatz 20. In seinen verschiedenen Ausprägungen können, ISH räumlich eingesetzt werden, um spezifische Loci auf den Chromosomen, rRNA, mRNA und Mikro-RNAs zu lokalisieren.

Eine der Herausforderungen , mussten wir vor der Raffination eine WMISH Verfahren zur L. zu adressieren stagnalis war die Frage der sanft und effizient Embryonen und Larven von verschiedenen Stadien von t Extrahierener Ei-Kapseln, in denen sie abgelegt werden. Diese Extraktion oder "decapsulation 'muss effizient angemessene Material zu sammeln eine bestimmte in situ - Experiment, während zur gleichen Zeit die Aufrechterhaltung morphologischen und Zellintegrität um erreicht werden. Während andere Modellorganismen auch gekapselter Entwicklung durchlaufen, konnte erfolgreich in L. eingesetzt werden in unseren Händen keine der Methoden für diese Spezies berichtet stagnalis.

Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens sind daher: L. zu extrahieren stagnalis Embryonen und Larven aus ihren Kapseln in einem Hochdurchsatzverfahren , Pre-Hybridisierung Behandlungen anwenden, das den WMISH Signal zu optimieren, Embryonen und Larven mit zufriedenstellender WMISHsignals für die Bildgebung vorzubereiten.

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Protocol

Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben , unser Verfahren für eine in - situ - Experiment an embryonalen und Larvenstadien von L. Durchführung stagnalis. Wenn ein Schritt , um die Verwendung eines gefährlichen chemischen beinhaltet dies durch das Wort "ACHTUNG" gekennzeichnet ist und alle entsprechenden Sicherheitsverfahren erlassen werden. Links zu repräsentativen Sicherheitsdatenblätter für gefährliche Chemikalien werden in Ergänzungs Datei 1 zur Verfügung gestellt. Rezepte für alle Reagenzien werden in Ergänzungs Datei 2 zur Verfügung gestellt.

1. Montage von Decapsulation Vorrichtung

  1. Um dies zu tun, schließen eine 20 ml Einwegspritze auf Silikonschlauch (mit einem Innendurchmesser von 1 mm und einem Außendurchmesser von 3 mm) , um eine P1,000 Spitze geschnitten auf eine geeignete Länge , wie in 2A gezeigt.
  2. Band mit einem Standard-Mikroskop-Objektträger mit einem invertierten großen Petrischale. Band der Silikonschlauch unmittelbar neben der Mikroskop - Objektträger , wie in Abbildung gezeigt60; 2C und 2D.
  3. Rest ist eine zog Glasnadel auf dem Objektträger und vorsichtig in den Silikonschlauch einführen , bis die Spitze der Nadel etwa 20% des Weges ragt über den Innendurchmesser des Rohres (siehe Abbildung 2C und 2D). Sobald die Nadel darin Position Band auf der Petrischale nach unten.
  4. Lassen Sie das freie Ende des Silikonschlauch in einer anderen Petrischale ruhen, die die entkapselten Material sammeln.

2. Probenentnahme, Fixierung und Decapsulation

HINWEIS: Alle Schritte werden bei RT durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.

  1. Ei Saiten von den Wänden eines Aquariums sorgfältig sammeln. Um dies zu tun, ein flaches Stück aus flexiblem Kunststoff wie einem Spatel verwenden, um die Ei-String aus dem Substrat zu kratzen, und mit einem Kunststoff-Teesieb das schwebende Ei Schnur aus dem Wasser zu fischen. Bühne und sortieren das Material unter einem Mikroskop mit der Führung in Abbildung versehen1.
  2. Legen Sie das Ei Zeichenfolge auf einem Papiertuch und machen einen Längsschnitt entlang der Eimasse mit Hilfe der Federzange. Rollen Sie die Ei-Kapseln aus dem Ei-String und entfernen Sie so viel von der Jelly-Material wie möglich aus jeder Kapsel durch sie um das Papiertuch drückt die Feder Pinzette.
  3. Mit Hilfe der Federzange, übertragen Sie die Ei-Kapseln in eine Petrischale mit 5 ml Leitungswasser. Weiter de-Sülze Ei-Kapseln der gewünschten Entwicklungsstadien in diesem Gericht zu sammeln. Sammeln Sie genug Kapseln aus allen Entwicklungsstadien für die geplante WMISH Experiment dann mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  4. Wenn sie mit weiter entwickelten Larven arbeiten (5 Tage nach der ersten Spaltung (DPFC) und älter) betäuben sie vor der Fixierung.
    HINWEIS: Dadurch werden die Muskeln von Vertrags verhindern , die die Interpretation der in situ Färbemustern sehr schwierig macht.
    1. Relax-Larven (während sie noch in ihrer capsu sindles) in einer 2% igen w / v Lösung von MgCl 2 • 6H 2 O für 30 min vor der Fixierung.
    2. Beurteilen Sie den Grad der Entspannung nach 30 Minuten durch mehrere Larven während Untertauchen noch in ihrer Ei-Kapseln in Fixierungslösung und die Überwachung ihrer Antwort unter dem Mikroskop. Unvollständig entspannt Larven werden in ihren Schalen zurückziehen, während völlig entspannt Larven nicht reagieren. Sobald diese Larven gelockert worden, um mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  5. Übertragen Sie die Ei - Kapseln eine große Bohrung Plastikpipette in ein verschließbares Röhrchen verwenden , das 10 - fache des Volumens von Ei - Kapseln bietet (z. B. 1 ml der abgewickelten Kapseln würden typischerweise mehr als 10 - ml - Röhrchen erfordern).
  6. Absaugen so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Rohr und ersetzen mit einem Volumen von Fixierungslösung, die 10-fache Volumen der abgesetzten Ei-Kapseln ist. Vorsichtig drehen für jede Entwicklungsstufe für die entsprechende Zeit bei RT (siehe Abbildung 1) , um die Ei - Kapseln in Fixiermittel.
  7. Discontinue Rotation und lassen Sie die Kapseln die Fixierungslösung in einen geeigneten Abfallbehälter zu sinken und absaugen.
  8. Waschen Sie die Ei-Kapseln durch die Fixierungslösung mit Phosphat-gepufferte Saline mit 0,1% Tween-20 (PBTw) ersetzt und Drehen bei RT für 5 min. Saugen Sie das PBTw und zweimal wiederholen.
  9. Entfernen Embryonen und Larven aus ihren Kapseln unter Verwendung der Vorrichtung in 2 gezeigt ist . Zeichnen Sie die Kapseln bis in die 20 - ml - Spritze (Abschnitt 1 für Details), den Schlauch befestigen und zerstreuen dann die Kapseln durch den Schlauch und vorbei an der Glasnadel aus in die Auffangschale.
    HINWEIS: Normalerweise ist die Mehrheit (> 90%) aller Kapseln sollten nur einen Durchlauf durch das Gerät benötigen. In vielen Fällen wird die Kapselmembran beschädigt, aber Embryonen und Larven bleiben innerhalb der aufgebrochenen Kapsel. Reprocess dieses Material, indem es einfach nach oben in die Spritze aufgezogen und wieder auszuräumen.
  10. Sammeln Sie die decapsulated Embryonen und Larven in ein 1,5-ml-Röhrchen ein Mikrofon mitropipette (a P20 für 0 bis 3 Tage alten Larven und eine P200 für ältere Larven mit dem Ende der Spitze abgeschnitten).
    Hinweis: eine Pause (bis zu mehreren Monaten) in dem Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Wenn dies erforderlich ist, sollte die decapsuled Material in ein 1,5 ml Röhrchen für die Lagerung gesammelt werden (mit dem nächsten Schritt fortgesetzt). Andernfalls sofort weiter zu Protokoll 3.
  11. Erlauben Embryonen und Larven auf den Boden des Röhrchens zu sinken und den Überstand absaugen. Ersetzen Sie mit 33% Ethanol (EtOH) in PBTw und lassen Sie sich für 5 sitzen - 10 min. Wiederholen Sie mit 66% EtOH in PBTw und 100% EtOH. Waschen Larven zweimal in 100% EtOH bei RT. Lagern Sie das Material bei -20 ° C in 100% EtOH.
  12. Wenn Sie bereit sind, um fortzufahren, rehydrieren die Proben durch die 100% EtOH zu entfernen und mit 66% EtOH in PBTw ersetzt, lassen Sie sich für 5 sitzen - 10 min. Wiederholen Sie mit 33% EtOH in PBTw, sitzen lassen 5 - 10 min. Schließlich waschen mit 3x 5 min Wäschen von PBTw, um sicherzustellen, alle EtOH entfernt wird.

3. Proteinase-K, TEA und Post-fixation

HINWEIS: Wir finden die folgenden Schritte in kleinen Körben mit einem Gitterboden, die effizienteste und schonende Methode für die schnelle zeitkritische Lösungen auszutauschen. Während diese können zu Hause gemacht werden, verwenden wir Körbe (mittlere Größe) , die mit der Flüssigkeit InSituPro -Vsi Intavis kompatibel sind Handhabungsroboter (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Solche Körbe können schnell und einfach zwischen den Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekulturschale (TCD), um Lösungen für den Austausch oder die Lösung abgesaugt werden kann, aus dem Bohrloch mit einer Pipette bewegt werden. Alternativ können alle Lösungsaustausch ohne diese Körbe durchgeführt werden, indem man einfach den Überstand aus den Larven Ansaugen. In diesem Fall wird eine sanfte Wirbelbewegung werden alle Embryonen und Larven in die Mitte des Tellers konzentrieren so dass der Überstand aus dem Rand des Brunnens entfernt werden. Im Folgenden wird angenommen der Benutzer Körbe für Lösungsaustausch verwendet wird.

  1. Mit einer Pipette, Transfer Embryonen und Larven in einen Korb in einer 12-Well-TCD mit 2 ml PBTw sitzen.
    . HINWEIS: Die Anzahl der Embryonen und / oder Larven , die hinzugefügt werden können , hängt von der Entwicklungsphase untersucht, aber eine Faustregel ist , mindestens 25% der Bodenfläche frei von Embryonen / Larven (dh zu halten, nicht überladen Warenkorb).
  2. Bereiten Sie eine angrenzende gut mit 2 ml der entsprechenden Proteinase-K - Lösung (siehe Abbildung 1), und weitere 2 Brunnen mit 2 ml 0,2% Glycin je. Bewegen Sie jeden Korb in den Brunnen der entsprechenden Konzentration von Proteinase-K enthält, und sofort Timing starten.
  3. Nach 10 Minuten jeden Korb in ein gut mit 0,2% Glycin bewegen und für 5 min inkubiert. Dann bewegen Sie jeden Korb in die zweite gut mit 0,2% Glycin und Inkubation für 5 min. Waschen Sie die Glycine mit 3x 5 min Austausch von 3 ml PBTw.
  4. Entfernen Sie die PBTw Lösung und behandeln die Proben einmal mit frisch zubereiteten Triethanolamin (TEA) solution für 5 min ACHTUNG! schütteln Sie nicht. Ersetzen mit 3 ml frisch zubereitete TEA-Lösung für 5 min. Nicht aufregen. Aspirieren die Mehrheit der TEA-Lösung aus den Proben. Fügen Sie den frisch zubereiteten Triethanolamine mit Essigsäureanhydrid (TEAAA) Lösung und Inkubation für 5 min. ACHTUNG! Sie agitieren nicht.
  5. Optional - Während der obige Schritt brütet, bereiten eine weitere neue Charge von TEAAA Lösung und wiederholen Sie den Schritt.
    HINWEIS: Diese zweite Behandlung mit TEAAA optional ist, aber helfen kann vollständig alle Hintergrund mit Sonden zu erzeugen, Hintergrund anfällig zu beseitigen.
  6. Entfernen Sie die TEAAA Lösung, indem sie es aus dem Brunnen Ansaugen und ersetzen mit 3 ml PBTw. Nicht aufregen. Entfernen Sie die PBTw und gelten 3 ml 3,7% Formaldehyd in PBTw. verwirbeln sanft gelegentlich während einer 30-minütigen Inkubation.
  7. Entfernen Sie die Fixiermittel durch sie aus dem Bohrloch abgesaugt und ersetzen mit 3 ml PBTw. Übertragen Sie das Material in ein 1,5-ml-Röhrchen. REDie PBTw mit Hybridisierungspuffer und Inkubation bei RT für 5 min - VORSICHT.
  8. Die Röhrchen in einen heißen Block bei RT, und stellen Sie die Temperatur auf die gewünschte Hybridisierungstemperatur.
    HINWEIS: Die Hybridisierungstemperatur Sonde, die spezifisch und müssen empirisch optimiert werden, jedoch finden wir, 55 ° C, um anfänglich Versuch eine gute Temperatur. Lassen Sie den Block auf die Hybridisierungstemperatur zu kommen, und damit die Proben vorzunehmen hybridisieren ca. 15 min (dh, es ist die Zeit , die Ribosonden vorzubereiten stattfindet, ist nicht länger erforderlich). Bereiten Sie ausreichende Mengen (in der Regel 100 & mgr; l) der verdünnten Riboproben. Wir in der Regel Studie Sondenkonzentrationen von 100 und 500 ng / ml als Anfangsbereich. Wir bereiten Riboproben nach 12.
  9. Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer aus den Proben und fügen Sie die Sonde in Hybridisierungspuffer zu den Proben. Overlay mit 100 & mgr; l (oder einer ausreichenden Volumen einer Phase über die Hybridisierung buffe zu bildenr) von Mineralöl.
    HINWEIS: Das Mineralöl umfangreiche Kondensation verhindert, dass während der langen Hybridisierungsschritt bilden. Extensive Kondensations deutlich sowohl die Chemie der Hybridisierungslösung und die Konzentration der Sonde zu verändern.
  10. Denaturieren der Sonde und der Ziel-RNA durch Erhitzen der Proben auf 75 ° C für 10 min, dann reduzieren die Wärme an die Hybridisierungstemperatur erwünscht. Zulassen der Hybridisierung für mindestens 12 h (O / N) oder länger ablaufen (von 24 bis 48 h).
  11. Während der Hybridisierung ein einzelnes Rohr aus dem Wärmeblock entfernen, drehen Sie es schnell zwischen Daumen und Zeigefinger die Larven zu suspendieren, ohne die Ölphase zu stören, und ersetzen Sie es in den Wärmeblock. Wiederholen Sie einmal dies jedes von 6 bis 12 Stunden oder so.

4. Hot Wäscht und Immunnachweis

HINWEIS: Während wir eine Flüssigkeitshandhabungsroboter für die folgenden Schritte verwenden, können diese auch leicht manuell erfolgen. In diesem Fall, Embryonen und Larven shoULD in den 1,5-ml-Röhrchen gehalten werden, die sie in hybridisiert wurden. Alle nachfolgenden Lösung tauscht werden abgesaugt und mit einer P1,000 Pipette zugegeben. Wenn manuell durchgeführt für jede der folgenden Schritte sollten 1 ml jeder Lösung einzusetzen.

  1. Wärme ausreichende Volumina (je 3 ml für jede Probe) des 4x, 2x und 1x Waschlösungen auf die Hybridisierungstemperatur.
  2. Waschen alle Proben dreimal in Waschpuffer 4x für 15 min jeweils bei der Hybridisierungstemperatur. Waschen alle Proben dreimal in 2x Waschpuffer für 15 min jeweils bei der Hybridisierungstemperatur. Waschen Sie alle Proben dreimal in 1x Waschpuffer für jeweils 15 Minuten bei der Hybridisierungstemperatur.
  3. Waschen Sie alle Proben einmal mit 1x Natriumchlorid Natriumcitrat Puffer + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) bei der Hybridisierungstemperatur. Erlauben Proben auf RT abkühlen.
  4. Waschen Sie alle Proben zweimal in 1x SSC + 0,1% Tween 15 min Ersetzen Sie diese 1x SSC-Lösung mit Maleinsäure-Puffer (MAB) und lassen Sie sich für 10 Minuten sitzen Wiederholen Sie die MAB wAsche. Ersetzen MAB mit Blocklösung und Inkubation für 1,5 Stunden.
  5. Tauschen Sie die Blocklösung für Antikörperlösung (1: 10.000 Verdünnung des Antikörpers in Blocklösung) und Inkubation für 12 Stunden (O / N) bei RT unter leichtem Schütteln.

5. Farbentwicklung und Montage

  1. Absaugen der Antikörperlösung und waschen 15-mal mit PBTw für jeweils 10 min. Ersetzen PBTw mit 1x alkalische Phosphatase-Puffer (AP) und für 10 min inkubiert.
  2. Während die oben genannten Inkubationsschritt fortschreitet, die Färbelösung AP vorbereiten (siehe Zusatz Datei 2) - VORSICHT. Übertragen Sie das Material in einen TCD gut und ersetzen Sie die 1x AP-Lösung mit AP-Färbelösung. Beachten Sie jetzt die Zeit, so dass die Länge der Zeit, die Farbreaktion stattfindet, für aufgezeichnet werden. Überwachen Sie die Entwicklung des Verfärbungsmuster, bis das Signal-Hintergrund-Verhältnis optimal ist.
  3. Um die Farbentwicklung zu stoppen, entfernen Sie die 1x AP Färbelösung (entsorgen in der entsprechenden waste-Container) und 2 ml PBTw einsetzen und die Zeit jetzt beachten. Spülen Sie zweimal mit PBTw für jeweils 5 Minuten. Verwenden Sie eine dieser Spülungen das Material in einem 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen.
  4. Entfernen Sie die PBTw und anwenden 1 ml 3,7% Formaldehyd in PBTw und agitieren oder drehen für mindestens 30 min bei RT (dies auch O getan werden kann / N).
  5. Waschen Sie die Fixiermittel mit 3 Waschungen von PBT (entsorgen den Abfall Fixiermittel in einem geeigneten Abfallbehälter). Waschen Sie die Proben 3 mal bei 50 ° C in entionisiertem Wasser.
    Hinweis: Diese Waschungen eliminieren die Ausfällung von Salzen, die während der Clearing- und Visualisierungsschritte sichtbar werden können.
  6. Entscheiden Sie, ob die Proben sollten in Benzylbenzoat montiert werden: Benzylalkohol (BB: BA, die auch als Murray klar bekannt) oder Glycerin.
    HINWEIS: Wir bevorzugen die leistungsfähigeren Clearingstelle BB: BA als L. stagnalis Embryonen sind etwas undurchsichtig. Proben in BB montiert werden: BA wird zunächst durch eine Ethanolreihe dehydratisiert werden müssen. Proben in 60% zu montierendenGlycerin kann sofort montiert werden.
  7. Übertragen Sie die Proben in die Montagelösung (BB: BA oder 60% Glycerin) mit einer Pipette.
    HINWEIS: Wenn in BB Montage: BA muss dies auch in einem Glas erfolgen (BB: BA wird Polycarbonat-Kunststoff schmelzen).
  8. Lassen Sie die Proben für 5 zu löschen - 10 min, und dann montieren sie auf einen Objektträger eine entsprechende Anzahl von gestapelten Deckgläser als Abstandshalter unter Verwendung von (1 Deck für Proben <1 DPFC, 2 Deckgläser für Proben> 1 DPFC).
    HINWEIS: Vollständige Halterungen können nun eine Verbindung Mikroskop mit DIC-Optik abgebildet werden.

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Representative Results

Die repräsentativen WMISH Färbungsmuster in 3 gezeigt wurden die oben beschriebenen Technik erzeugt wurde, und eine Vielzahl von räumlichen Expressionsmuster für Gene , die in einem Bereich von molekularen Prozessen beteiligt reflektieren Bereich von Schalenbildung (Novel Gen 1, 2, 3 und 4), an Zell-Zell - Signalisierung (DPP) zur Transkriptionsregulation (Brachyurie) in einer Reihe von Entwicklungsstadien. Während wir die Expressionsniveaus dieser Gene quantifiziert erwarten wir, dass sie es unterscheiden sich auch signifikant, was darauf hinweist, dass unser Verfahren gegen eine Vielzahl von Genprodukten in allen Stadien der Entwicklung auf verschiedenen Ebenen ausgedrückt angewendet werden kann. Nur einer der hier vorgestellten Gene (Dpp) wurde in L. zuvor beschrieben stagnalis 21,22. Die Ergebnisse, die wir hier vorstellen, sind weitgehend mit diesen früheren Berichten im Einklang, aber mit deutlich höheren räumlichen Reso lution. Die räumliche Expressionsmuster von Brachyury wurde in Abalone 23 und limpet 24 und in beiden Fällen beschrieben wurde , auch in Mantel - Zellen nachgewiesen , wie wir für L. finden stagnalis (Abbildung 3F). Wir isolierten Novel Gene 1 - 4 (von einem Proteom - Bildschirm entworfen Genprodukte direkt in die Schalenbildung beteiligt zu identifizieren und so ihre räumliche Expressionsmuster im Zusammenhang mit der Schalendrüse (3A und B) oder Shell - Feld (3C und D) vollständig deckungsgleich mit schalenbildenden Funktionen. Diese Ergebnisse zeigen , dass der hohe Durchsatz Technik , die wir zum Entfernen von Embryonen und Larven aus dem Ei Kapsel und die nachfolgende Stufe spezifische Permeabilisierung Behandlungen erzeugen ganze Berg Proben entwickelt, die eine hohe Qualität in situ - Färbung ergeben wird Muster für eine Vielzahl von Genen für alle Stadien der embryonalen und Larvenentwicklung.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Abbildung 1
Abbildung 1. Ein zusammenfassender Ontogenese von Spitzschlammschnecke und entsprechende Fixierung und Proteinase-K - Behandlungen. Repräsentative Bilder von Embryonen und Larven aus den ersten 7 Tagen nach der Entwicklung zeigen eine deutliche Steigerung in der Größe (Zeile 1) und morphologische Komplexität (Zeilen 2 und 3) . Diese Entwicklungsveränderungen übersetzen in große Unterschiede in den entsprechenden Fixierungszeit und Proteinase-K-Konzentrationen, die eine optimale WMISH Signale erzeugen. Für WMISH alle Stufen sollten in 3,7% Formaldehyd in PBS bei RT unter leichtem Schütteln in ihren Eierkapseln fixiert werden. Alle Stufen sollte dann mit dem geeigneten Proteinase-K-Konzentration für 10 min behandelt. Beachten Sie, dass wir zwischen Batch Variation in der Aktivität von Proteinase-K von unserem Lieferanten signifikante beobachten. Diese Veränderung muss von performi berücksichtigt werdenng eine Runde "Kalibrieren" WMISH Experimenten, bei denen die Aktivität des neuen Proteinase-K wird empirisch bestimmt. Die Proteinase-K - Konzentrationen in der Figur angegeben sollten daher als erste Orientierungshilfe, aber die relativen Konzentrationen zwischen Entwicklungsstadien (zB 2 Tage alten Embryonen erfordern eine Proteinase-K - Konzentration 3 - mal höher als Tag 1 Embryonen) gesetzt behandelt werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Vorrichtung verwendet , um Decapsule L. stagnalis Embry. (A) Eine Übersicht über die Vorrichtung , die L. effizient entfernen stagnalis Embryonen und Larven von ihren Kapseln. (B) eine vergrößerte Ansichtdie gelbe eingerahmten Bereich in (A). Eine scharfe Glasnadel wird auf dem Objektträger platziert und in die Silikonschlauch (Innendurchmesser 1 mm, Außendurchmesser 3 mm), so dass die Spitze etwa 20% des Weges ragt in den Hohlraum des Schlauchs. Die Glas Nadel wird dann mit Klebeband auch auf dem Objektträger und die Petrischale. (C) eine schematische "Plan" des gelben Box - Abschnitt in A. Eierkapseln fixierte Embryonen und Larven enthalten , werden zunächst die 20 - ml - Spritze gesammelt werden. Die Spritze wird dann mit dem Silikonschlauch angebracht ist und die Kapseln durch den Schlauch und vorbei an der Nadel ausgestoßen wird. Eikapsel Membranen werden durch die Nadel zerrissen und das freigesetzte Embryonal- und Larvenmaterial kann aus der Auffangschale gesammelt werden , um eine Mikropipette verwenden. (D) Eine schematische "Querschnitt" des gelben geschachtelte Abschnitt in A. Der Objektträger ist sichergestellt , dass die Nadel tritt in den Silikonschlauch auf der richtigen Höhe. (F) Eine repräsentative Ansicht von Larven , die einen einzigen Durchlauf durch die Vorrichtung gemacht haben. Mehr als 90% des Materials effektiv und schonend aus ihren Kapseln entfernt wurde. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Repräsentative Bilder von WMISH Expressionsmuster gegen eine Vielzahl von Genen aus einer Reihe von L. . stagnalis Entwicklungsstadien von der Methode generiert hier beschriebenen Alle Entwicklungsstadien wurden wie in dem oben beschriebenen Verfahren verarbeitet und wurden in BB montiert und abgebildet: BA (Murray klar). Ungefähre Alters sind in der angegebenenp rechts von jeder Platte und der Orientierung wird in der unteren rechten Ecke angezeigt. Gene Orthologie (wenn bekannt) wird in der unteren linken jeder Tafel angezeigt. Abkürzungen: Schalendrüse (sg); Shell-Feld (sf); Mantel (mt); Fuß (ft); Decapentaplegic (Dpp); DPFC (Tage erste Spaltung Post). Alle Maßstabsbalken sind 20 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die effiziente Visualisierung von RNA - Transkripte mit vermutlich unterschiedlichen Expressionsniveaus in allen Entwicklungsstadien der Spitzschlammschnecke. Die Embryonen und Larven aus ihren Kapseln entfernen wir eine Vielzahl von chemischen, osmotischen Schock und physikalische Behandlungen trialed für andere encapsulated- berichtet Entwicklung von Modellorganismen. in unseren Händen Allerdings ist die Methode, die wir hier beschreiben, die nur mit hohem Durchsatz Technik, die ohne Beschädigung der Embryonen und Larven die harte Kapselmembran entfernt. Folgende decapsulation kann entweder das Material gespeichert werden, oder mit einem stufenspezifische Therapie mit Proteinase-K behandelt und dann zu einer Ribosonde hybridisiert. Weitere empirische Optimierung Bemühungen (in der Regel konzentriert sich auf Sondenkonzentration und Hybridisierungstemperatur) kann für jede Sonde / Ziel erforderlich. Diese Parameter (zusätzlich zu dem Fixierungsschema und Proteinase-K-Behandlungen) sind typischerweise die einflussreichsten Parametersitu - Experiment von jeder in (unter der Annahme , dass die Qualität des festen Materials und die RNA - Sonde mit hohem Standard sind).

Die Bedeutung eines geeigneten Proteinase-K - Behandlung auf die endgültige Ergebnis einer in situ - Experiment ist von größter Bedeutung für L. stagnalis. Dies wird in der breiten Palette von Proteinase-K-Konzentrationen erforderlich durch verschiedene Entwicklungsstadien (im Bereich von 0 & mgr; g / ml bis 500 ug / ml) reflektiert. Es ist daher wichtig, um einen bestimmten Ei String in einen ontogenetischer Fenster zuzuweisen. Zu diesem Zweck wird die Leitlinie , die wir in Abbildung bieten 1 für die Durchführung von Entwicklungsmaterial unbekannten Alters erlaubt (eine Druckversion dieser Figur ist in den Ergänzungs Datei 3 , dass die Benutzer nützlich finden am Mikroskop zu haben , wenn die Materialbereitstellung) . Wir stellen fest, dass für andere Arten von Gastropoden Proteinase-K-Behandlungen für WMISH kann entweder für eine breite Palette von develo konstant gehalten werdenpmental Stufen 8,25,26, oder ganz 27 weggelassen werden. Dies steht in krassem Gegensatz zu der Situation in L. stagnalis. Hinzu kommt , dass andere Forschergruppen haben bisher WMISH Expressionsmuster für mehrere Gene in L. berichtet stagnalis Larven (siehe 22,28,29) die Methode , die wir hier beschreiben , ergibt Muster deutlich höhere räumliche Auflösung. Schließlich haben wir erhebliche inter Batch Veränderung der Aktivität des Proteinase-K von unserem Lieferanten beobachtet. Diese Variante müssen berücksichtigt werden, indem man eine Runde "Kalibrieren" WMISH Durchführung von Experimenten, in denen die Aktivität des neuen Proteinase-K empirisch bestimmt wird. Alle nachfolgenden Versuche mit Teilmengen von Proteinase-K aus dieser Charge kann dann frei durchgeführt werden.

Wir haben bereits zuvor eine alternative WMISH Verfahren für L. stagnalis Embryonen und Larven an anderer Stelle 12. Das Verfahren detailliert die Verwendung des mucolytic Mittel N-Acetyl-L-cystein (NAC), ein Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT) und eine Vorhybridisierung der Behandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS). Wir fanden diese Behandlungen die Färbungsmuster einiger Gene für einige Entwicklungsstufen erweitert. Die Fixierung Strategie , die wir vor kurzem hier entwickelt und beschreiben (Befestigungs Larven in ihren Kapseln) vereinfacht und beschleunigt die erforderlichen Schritte , Material für eine in - situ - Experiment vorzubereiten, und negiert offenbar die Notwendigkeit empirisch zusätzliche optimale Vorhybridisierung Behandlungen mit NAC, DTT Bestimmung oder SDS. Zukünftige Verbesserungen der Technik , die hier berichtet konnte die Visualisierung von microRNAs (folgenden Änderungen an Standard WMISH Protokolle bisher 30 berichtet) umfassen, doppelte oder dreifache Kennzeichnung von mRNA zielt auf 31 und fluoreszierende Visualisierung von WMISH Signale 32. Wohl die größte Einschränkung der Technik ist die Gesamtlänge der Zeit es braucht, von collectin zu geheng das Material, in ein digitales Bild, das ein gegebenes Genexpressionsmuster darstellt. Aufgrund der Natur der biochemischen und biophysikalischen Ereignisse, die während eines solchen Prozesses erfolgen muss dies ein inhärentes Merkmal der meisten in situ Hybridisierungsprotokolle.

Lymnaea nimmt eine Position innerhalb der Metazoa , die in Bezug auf die Modellorganismen extrem unterrepräsentiert ist. Als Vertreter Spiralian, Einblick in die Entwicklung von verschiedenen morphologischen Merkmale wie Shell Händigkeit 12 und Körperbildung bringen 33-35 und ist auch eine wertvolle Neuroethologie 36 und Neurophysiologie Modell 9,37 Lymnaea können. Leistungsfähigen Techniken wie die Fähigkeit , Genexpressionsmuster in situ , um effizient zu visualisieren erhöht die Funktionalität von Lymnaea als Modellorganismus, und erweitert die Vielzahl von Fragen , die es verwendet werden kann , zu adressieren. Zu einem Zeitpunkt, wenn die Erzeugung von großen Sequenz datasets (komplette Transkriptom und sogar Genome) ist relativ Routine, solche Methoden relevanter Forscher werden tern, die Flut von Sequenzdaten von solchen Modellen zu interpretieren. Während Lymnaea ein relativ abgeleitet Schneckenart ist 38, und besitzt , was ein großes Genom im Vergleich zu anderen Modellorganismen angesehen würden (1,22 Gb 39), hat es viele praktische und interessante Features , die es ein attraktives Modellsystem zu machen. Die Methoden , die wir hier beschreiben , erweitern die Toolbox zur Verfügung Lymnaea und kann auf andere Arten von Nutzen sein , die Entwicklung gekapselt unterziehen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung zu DJJ durch DFG-Projekt # JA2108 / 2-1 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

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References

  1. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  2. Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. Sinauer. Sunderland. (2002).
  3. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
  4. World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
  5. Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218, (3), 211-229 (2010).
  6. Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53, (2), 237-244 (2015).
  7. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
  8. Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
  9. Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343, (1-2), 124-137 (2010).
  10. Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50, (4), 369-373 (2005).
  11. Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58, (6-8), 501-511 (2014).
  12. Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15, (1), 19 (2015).
  13. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 91-121 (1946).
  14. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 353-434 (1946).
  15. Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121, (1), 1-77 (1952).
  16. Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
  17. Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183, (1), (1973).
  18. Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26, (3), 367-391 (1971).
  19. Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35, (1), 29 (1973).
  20. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63, (2), 378-383 (1969).
  21. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  22. Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221, (2), 59-68 (2011).
  23. Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311, (1), 200-212 (2007).
  24. Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129, (6), 1411-1421 (2002).
  25. Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7, (1), 160 (2007).
  26. Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
  27. Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. (2015).
  28. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  29. Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4, (1), 15 (2013).
  30. Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
  31. Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49, (8), 635-645 (2007).
  32. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11, (1), 43 (2011).
  33. Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5, (1), 20-22 (2009).
  34. Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462, (7274), 790-794 (2009).
  35. Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14, (16), 1462-1467 (2004).
  36. Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6, (4), e18745 (2011).
  37. Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9, (4), e92941 (2014).
  38. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  39. Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35, (Database issue), D332-D338 (2007).

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