Prediksjon og validering av Gene Regulatory Elements aktiveres under retinsyre Induced Embryonic Stem Cell Differensiering

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Embryoutvikling er en flertrinnsprosess som involverer aktivering og undertrykkelse av mange gener. Forsterkerelementer i genomet er kjent for å bidra til vev og celletype-spesifikk regulering av genekspresjon i løpet av cellulær differensiering. Dermed er deres identifikasjon og videre undersøkelser viktig for å forstå hvordan celle skjebne blir bestemt. Integrering av genuttrykk data (f.eks microarray eller RNA-seq) og resultatene av kromatin immunpresipitering (chip) -basert genomstudier (Chip-seq) tillater storstilt identifikasjon av disse regulatoriske regioner. Imidlertid funksjonell validering av celletypespesifikke enhancers krever videre in vitro og in vivo forsøksprosedyrer. Her beskriver vi hvordan aktive forsterkere kan identifiseres og validert eksperimentelt. Denne protokollen gir en trinn-for-trinn-arbeidsflyt som omfatter: 1) identifikasjon av regulatoriske områder av Chip-seq dataanalyse, 2) kloning og experimental validering av antatte regulatoriske potensialet av de identifiserte genomiske sekvenser i en reporter analysen, og 3) bestemmelse av enhancer-aktivitet in vivo ved å måle enhancer RNA-transkript nivå. Den presenterte protokollen er detaljert nok til å hjelpe noen til å sette opp denne arbeidsflyten i laboratoriet. Viktigere, kan protokollen enkelt tilpasses til og anvendes i en hvilken som helst cellemodellsystem.

Protocol

1. Enhancer Utvalg Basert på Chip-seq analyse

  1. Last ned RXR chip seq rådata fastq fil (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) fra http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. Last ned og pakk den nødvendige BWA indeksfilen for justeringen (i vårt tilfelle: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    MERK: Besøk til https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts for mer informasjon om trinnene bioinformatikk analyse og for å laste ned skript som brukes under.
  3. Juster eksempel fastq filen til MM10 genomet (bruke skriptet: perform_alignment.sh). Dette vil opprette en mappe med en .bam fil og statistikk over justeringen. Justert RXR Chip-seq data (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), og den tilsvarende indeks fil (.bai) er tilgjengelig her:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    MERK: BWA er en programvarepakke som er justert relasvis korte sekvenser (f.eks Chip-seq resultater) til en sekvens database, for eksempel mus referansen genomet (f.eks MM10) 13.
  4. Kjør skriptet (callpeaks.sh) for topp kall og de ​​novo motiv analyse. Bruk .bam fil som input. Manuset er basert på Homer findPeaks 14.
    MERK: Utdatafilene gi oss informasjon om det totale antall topper, berikelse av motivene, prosentandel av bakgrunnen, og målet sekvenser med motiver, osv. (Figur 1). Vanligvis flere motiver er oppført etter deres betydning.
  5. Tilordne # 1 rangert motiv (NR halv `AGGTCA`) (bruke skriptet: remap_motif.sh)
    MERK: Som et resultat, genererer skriptet en .bed fil som viser hvilke chip-topper dekker genomiske regioner som inneholder den kanoniske bindingssetet av transkripsjonsfaktoren av interesse.
  6. Last ned og visualisere resultatene av justert RXR chip seq leser (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (også laste ned .bai)) og AGGTCA motiv forekomster (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) av Genomics Viewer (IGV) 15 for å identifisere antatte RAR / RXR-bindingsseter (figur 2 og figur 3).
    MERK: Integrering av ulike Chip-seq data vil bidra til mer presist forutsi gode kandidatforsterkere 16,17. Nyere studier viser at aktive enhancere er vanligvis anriket for P300 og korrelerer med H3K4me1 og H3K27ac, og er plassert i åpne kromatin områder, for derved å vise DNase-I hypersensitivitet er også anbefalt 18-21.
  7. Bruk "Definer et område av interesse" i IGV 15 for å få 200-400 bp sekvens av det valgte genomisk region og bruke disse sekvensene for etterfølgende primer design.

2. Reporter analyse

MERK: luciferin / luciferase systemet brukessom en svært følsom reporter analyse for transkripsjonen regulering. Avhengig av forsterkeren aktiviteten luciferase-enzym som er produsert som vil katalysere oksydasjonen av luciferin til oxyluciferin resulterer i biolumine-scerende, som kan bli detektert. Som et første steg bør identifiserte antatte forsterkersekvenser bli subklonet inn i en vektor reporter (f.eks TK-Luciferase 22, pGL3 eller NanoLuc).

  1. primer design
    1. Design PCR primere for forsterkning av 200-400 bp av antatte forsterker regioner av Primer3 (tilgjengelig her: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. Copy-paste den genomisk sekvens fra IGV som inkluderer den antatte bindingssetet til Primer3 (se trinn 1.7). Set produktstørrelsesområdet til 250-300 bp i Primer3.
    3. Validere PCR primere som bruker UCSC Genome Browser er In silico PCR verktøy (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      MERK: Denne protokollen i et senere trinn bruker HindIII og BamHI restriksjonsenzymer for kloning. Sjekk om PCR forsterket sekvens som spådd av UCSC In-silico PCR verktøyet vil inneholde AAGCTT eller GGATCC restriksjonsseter (f.eks http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. Oppnå de nødvendige primere fra en kommersiell leverandør.
  2. PCR-amplifisering av enhancersekvens fra Genomisk DNA
    1. Rens mal genomisk DNA fra primære celler (f.eks primær embryonale fibroblaster). Bruk kommersielt sett for gDNA isolasjon og følg produsentens anvisninger.
      MERK: Høy kvalitet på gDNA er avgjørende for vellykket PCR forsterkning. Egnede BAC-kloner kan brukes hvis PCR er ikke lett fra gDNA.
    2. Fremstille 50 pl PCR-reaksjon inneholdende 100 ng gDNA, 5 ul 10 x buffer, 3 ul MgSO4 (25 mM), 5 ul dNTP (2 mM hver), 1,5 ul VS-primer (10 uM), 1,5 ul Rev-primer (10 uM) , 1 pl DNA polymerase
    3. Innstill PCR-syklus (2 min 95 ° C (20 sek 95 ° C, 10 sek 58-65 ° C, 18 sek 70 ° C) x25 gjenta, 2 min 70 ° C, for alltid 4 ° C). Sett annealing temperaturen med behandlingen av primeren er spådd Tm verdier.
    4. Rense PCR produkt med et kommersielt PCR rensing kit og følg produsentens anvisninger.
    5. Introdusere restriksjonsseter for kloning ved å gjenta den PCR med primere som anvendt ovenfor, men å legge overheng på deres 5'-ender (f.eks, Vs, 5'-AAGCTT Atat xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3 '(HindIII), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
    6. Drevet 5 ul av PCR-produktet på agarosegel for å undersøke for uspesifikke PCR-produkter.
      MERK: Hvis det oppdages flere band, kjøre hele PCR produkt og rense den aktuelle bandet av en kommersiell gel utvinning kit.
    7. Begrensning
      MERK: For å klone innsats oppstrøms TK promotor 22 renset PCR produkt og vektoren (f.eks TK-Luc) bør bli fordøyd med Hindlll og BamHI.
      1. Fremstille en 50 pl reaksjonsblanding inneholdende 1 ug renset PCR-produkt, 1 pl Hindlll (20 U / ul), 1 pl BamHI (20 U / pl) og 5 pl 10 x buffer.
      2. Forbered en 250 mL reaksjonsblanding som inneholder 5 ug vektor (TK Luc, eller alternativ reporter vektor), 5 mL Hindlll (20 U / mL), 5 mL BamHI (20 U / mL), 5 mL thermo alkalisk fosfatase (1 U / mL) og 25 ul 10x buffer.
        MERK: AP behandling av vektoren sterkt reduserer den selv-ligering av enkelt-spaltet vektor og således bakgrunnen.
      3. Inkuber reaksjonsblandingen i 4 timer ved 37 ° C, og deretter rense den fordøyde PCR-produktene i vektoren og med et kommersielt PCR-rensesett.
    8. Ligation
      1. Sett opp reaksjonsblandingen for ligering i PCR-rør med 2 ul 10 x T4 DNA-ligase-buffer, 10 ng TK-Luc vektor, 50 ng innsats (spaltet PCR-produkt), 1 pl T4 DNA-ligase (400 U / ul) og nuklease-fri vann opp til 20 mL.
        MERK: Forbered en negativ kontroll der reaksjonen ikke inneholder innsats.
      2. bland forsiktig reaksjonen ved å pipettere opp og ned, spinne ned kortfattet PCR-rørene ved hjelp av mini-sentrifuge og deretter inkuberes ved RT i 10 min.
      3. Varmeinaktivering ved 65 ° C i 10 min og deretter koble på is og bruke 5 pl av produktet for transformasjon inn i 50 ul kompetente celler (f.eks DH5a).
      4. Bruk standard varmesjokk prosedyre for å transformere bakterier, plukke opp kolonier og isolere plasmid DNA med et kommersielt kit. Validere alle konstruksjoner ved å sekvensere før de neste trinnene.
    9. Transfeksjon av ES-celler
      1. Bruke 48-brønners plater. Tilsett 200 mL 0,1% gelatin solution / brønn 30 min før cellekledning.
      2. Plate embryonale stamceller (ES) celler per dag før transfeksjon. Bruk mater-fri ES-celler og plate ved en tetthet på 3 x 10 4 celler per brønn i 250 ul media ES / brønn.
      3. Forbered plasmid mikser (hver blanding er beregnet for 8 brønner, 4 ubehandlet og 4 retinsyre-behandlet) Bland 1:. 1250 ng TK-Luc Empty (negativ kontroll), 950 ng β-galaktosidase koding vektor (βGal), Mix 2 : 1250 ng TK-Luc Hoxa1 forsterker (positiv kontroll), 950 ng βGal, Mix 3: 1250 ng TK-Luc PRMT8 forsterker (region av interesse), 950 ng βGal.
        MERK: ES-celler uttrykker de ønskede transkripsjonsfaktorer (RAR / RXR). La brønner utransfekterte for å bestemme basisverdier senere i løpet av luciferase og β-galaktosidase-målingene.
      4. Legg transfeksjon kvalitet reduserte serum media til hvert plasmid blande opp til 106 fil totalvolum (nok til 8 brønner).
      5. Legg 4,5 mL ES kvalitet transfeksjonion reagens og bland forsiktig ved å pipettere 15 ganger opp og ned. Inkuber transfeksjon blandingen i 10 minutter ved RT.
      6. Legg 13 mL av transfeksjon mix til celler per brønn, bland godt ved pipettering. Plassere cellene tilbake i inkubatoren (37 ° C) O / N før ligand behandling.
      7. Fjern media nøye ved aspirasjon fra cellene og legge 250 mL frisk media / brønn som inneholder 0,01 - 1 mikrometer all-trans retinsyre (RA) som endelig konsentrasjon eller DMSO som kjøretøy. Inkuber cellene til 24 - 48 timer.
        MERK: Retinsyre er lysfølsom.
    10. Utarbeidelse av cellelysater
      1. Fortynn 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M ditiotreitol (DTT) (i H2O), 10 ml 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml glyserol, 5 ml Triton X-100, steril vann opp til 100 ml) til 1 x ved bruk av sterilt vann, tilsett 20 ul 1 M DTT / 10 ml og likevekt ved romtemperatur før bruk. Forbered 10 ml i en 48-brønners plate på analysedagen. Fjern media nøye ved aspirasjon fra celler. Skyll celler gang med 1x PBS. Tilsett 200 ul 1x Lysis Buffer / brønn direkte til cellene.
      2. Rist i 2 timer ved romtemperatur (kjemisk lysis). Fryse cellelysatene på plate ved -80 ° C (mekanisk lysis). Lysater kan lagres ved -80 ° C i flere dager.
      3. Tine lysatene. Etter fullstendig tining, overføre cellelysater på en 96-brønners plate ved anvendelse av en elektronisk multikanal pipette. Overføre 80 ul av cellelysatet til 96-brønners plate klar for β-galaktosidase-assay og 40 ul av cellelysatet til en hvit plate for luciferase måling. Unngå at det dannes bobler.
    11. β-galaktosidase-analyse
      MERK: Beta galaktosidase eller alternative andre journalister bør brukes som en intern kontroll på kontoen for uspesifikke eksperimentelle varianter.
      1. Fremstille β-galaktosidase substrat buffer: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO4 • 7H 2 O, fyll opp til 1000 ml med sterilt vann. Juster pH til 7,4. Filter Steriliser (0,2 mikron) og oppbevar ved 4 ° C
      2. Bland 1 ml β-galaktosidase substrat buffer med 4 mg ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galaktosidase). Legg 3,5 mL av 2-mercaptoethanol (βME) per 1 ml buffer rett før bruk. Tilsett 100 ul β-galaktosidase substrat buffer 80 ul cellelysat.
      3. Inkuber reaksjonene ved 37 ° C inntil en svak gul farge har utviklet seg. Les absorbans ved OD 420 nm på en plate leser og eksportere data.
        MERK: Tiden varierer avhengig av transfeksjon effektivitet, vanligvis ikke lenger enn 30 min.
    12. luciferase Assay
      1. Forbered 50 ml luciferin substrat reagens: 15,1 mg D-luciferin salt, 82,7 mg ATP salt, 185 mg MgSO4 • 7H 2 O, legge til 50 ml polypropylen rør,deretter legge 1,5 ml 1 M HEPES buffer, 48,5 ml ATP gratis vann, vortex, sørg for at alle forbindelser oppløses fullstendig. Holde 5 - 10 ml alikvoter ved -80 ° C.
      2. Varm 5 ml luciferin substrat reagens til romtemperatur før du starter. Pipetter 100 pl substrat-reagens til hver brønn av den hvite plate inneholdende 40 ul av cellelysatet og måle signalet umiddelbart ved hjelp av en selvlysende teller maskin.
      3. Skaff aktiviteter fra minst tre uavhengige eksperimenter i tre eksemplarer trans.
      4. Beregn første basisnormaliserte luciferaseaktiviteten og basis normalisert β-galaktosidase-verdier for hver brønn ved å subtrahere gjennomsnittsverdiene målt for ikke-transfekterte celler fra hver verdi målt. Deretter beregne forholdet luciferase / β-galaktosidase-aktivitet.

    3. Karakterisering av Enhancer RNA

    MERK: En mer direkte indikator på Enhancer aktivitet har dukket opp fra siste genom-wIDE studier som identifiserte mange korte ikke-kodende RNA, som varierer i størrelse fra 50 til 2000 nt, som er transkribert fra enhancers, og betegnes enhancer RNA (Ernas) 16,25,26 (figur 4). Erna induksjon sterkt korrelert med induksjonen av tilstøtende ekson-kodende gener. Dermed kan signalavhengig forsterker aktivitet kvantifiseres in vivo ved å sammenligne Erna produksjon mellom ulike forhold ved RT-qPCR.

    1. Retningslinjer for Primer Design for Erna deteksjon av RT-qPCR
      1. Velg genomiske regioner for Erna målinger som er minst 1,5 til 2 kb unna kommenterte transkripsjonsstartsider.
        MERK: Viktigere, høye nivåer av mRNA transkripsjon over intragenic forsterkere hindre nøyaktig kvantifisering av Erna i den forstand orientering, antisense Ernas på intragenic enhancers kan påvises og er like i nivå for å Ernas på extragenic forsterkere.
      2. Som en generell regel bør du bruke regioner 200 - 1000 bp from midten av transkripsjonsfaktor-bindingssetet av interesse for primer utforming enten på den forstand eller anti-sense strand (figur 4 og figur 6).
        MERK: Hvis GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 eller H3K27ac ChIP-Seq data er tilgjengelige fra de ønskede celletyper og forhold det kan brukes til mer nøyaktig primer design. Ernas er transkribert fra antatte forsterker regioner preget av høye nivåer av H3K4me1 og ME3. Uttrykk av Ernas positivt korrelerer med anriking av aktivert Enhancer histone mark H3K27ac.
      3. Design PCR primere for fluorescerende fargestoffbasert RT-qPCR måling av Ernas av Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Generer anti-sense-sekvensen (revers komplement av den forstand tråd) for grunning design som per: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Sett 200-300 bp fornuftig eller anti-sense sekvensen for primer design.
    2. Måling av Erna transkripsjon
    3. Isoler total RNA fra behandlede celler med kommersielle sure fenol / kloroform basert utvinning reagens i henhold til produsentens anbefalinger.
    4. Bruk DNaseI å behandle isolert RNA før du bruker dem i revers transkripsjon reaksjon. Inaktivere DNase i henhold til produsentens anbefalinger før revers transkripsjon.
    5. Mål RNA konsentrasjonen etter DNase behandling og bruk 1000 ng per RT reaksjon. Bruk høy kvalitet revers transkriptase.
      MERK: Som stort antall Ernas ikke kan polyadenylert krever revers transkripsjon bruk av tilfeldige primere.
    6. Oppdage revers transkribert Erna ved RT-qPCR ved hjelp av standard prosedyre. Mål en ikke-behandling avhengig mRNA for normalisering (f.eks 36B4, Ppia, GAPDH, ACTB).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brukte en pan-spesifikt RXR-antistoff for å identifisere genom hvor Ra-regulerte gener har reseptor-anrikning i deres nærhet. Bio-analyse av RXR-chip-seq data oppnådd fra ES-celler behandlet med retinsyre avslørte anrikning av den nukleære reseptor halvdel området (AGGTCA) under RXR okkuperte steder (figur 1). Ved hjelp av en bioinformatikk algoritme vi kartlagt tilbake motivet søkeresultat for halv nettstedet til RXR ChIP-Seq data (figur 2). Denne analysen har hjulpet oss til å nøyaktig identifisere disse chip topper som var overlappende med kanoniske atom reseptor bindingssteder. Visualisering av disse områdene i IGV indikert berikelse av disse transkripsjonsfaktorene i nærheten av Hoxa1, en ​​tidligere preget RAR / RXR mål (figur 2 og 3). Vi identifiserte også en roman RA target gen, nemlig PRMT8 27. dette latter regionen inneholder en direkte gjenta uten avstands nukleotider mellom de to halvsider (AGGTCAAGGTCA) (figur 3). Å funksjonelt validere at elementet identifisert for Hoxa1 kan faktisk binde RAR / RXR og regulert av RA vi konstruert TK-luciferaserapportørplasmid vektorer som inneholdt ~ 300bp genomiske regionen, inkludert de identifiserte elementene. Vi har også konstruert vektorer uten responselementet (figur 5). ES-celler ble transfektert og luciferaseaktivitet ble målt i fravær og nærvær av retinsyre (figur 5). Konstrukter som inneholder retinsyre responselement (sjelden) gjorde viser økt luciferase signalintensitet på RA behandling, mens konstruksjonen uten RARE var ikke induserbar.

Vi studerte også den retinsyre-avhengig aktivitet av Hoxa1 enhancer. For å finne ut om den forstand og anti-sense Erna uttrykk for Hoxa1 RAR / RXR-bundet Enhancer correlate med mRNA-ekspresjon av genet, vi også målt nivået av Hoxa1 mRNA (figur 6). Disse resultatene bekrefter at den forsterker aktiviteten induseres ved korttidsbehandling RA (3 timer), noe som bekrefter at at forsterkeren er sannsynligvis involvert i RA-avhengige enhancer regulering.

Figur 1
Figur 1. Homer D e Novo Motif resultater. En utgangs HTML (homerResults.html) generert av Homer for eksempel RXR chip seq vises. Sekvens logoer tilsvarer toppen beriket transkripsjonsfaktorer motivene identifisert av de novo motiv funn på RXR-bundet loci. 7463 RXR okkupert genomiske regioner ble brukt til motivet ditt. 77,66% av disse regionene inneholder AGGTCA-lignende motiv (rangert som nummer 1). For nærmere beskrivelse se: (http://homer.salk.edu/ho mer / motiv /) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Finne Genomisk regioner som inneholder Motif av interesse. Visualisering av justert RXR chip seq leser (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam og AGGTCA motiv forekomster (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) av Genomics Viewer (IGV). Justeringer er farget av lese strand (leser på + strand: rød, - strand. blå) Genome brukes til justering: MM10. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

jpg "/>
Figur 3. Genomisk Loci av Hoxa1 og PRMT8 Enhancers. IGV øyeblikksbilde av RXR ChIP-Seq signaler innhentet fra ubehandlede og RA-behandlede (24 timer, 1 mikrometer) embryonale stamceller 27 vises. Identifiserte bindende sekvenser er farget rød. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
. Figur 4. Experimental Design for Testing Erna sekvensene Enhancers valgt for Enhancer RNA (Erna) måling bør plasseres minst 1,5 til 2 kb bort i forhold til transkripsjon start hotellet (TSS) av de nærmeste genet. Chip-seq data av transkripsjonsfaktor (TF) av interesse og motivet analysen kan brukes til å identifisere direkte bindingsseter genom-bred. Som binding av transcripelle coactivator (f.eks P300) ofte markerer distal forsterkere, regioner beriket for både TF og P300 er gode enhancer kandidater. Uttrykk av Ernas er positivt korrelert med anriking av aktivert Enhancer histone mark H3K27ac. Regioner 200 -. 1000 bp bort i forstand eller anti-sense retning fra sentrum av transkripsjonsfaktoren binding av anbefales for Erna grunning design Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Luciferase Aktivitet av indikerte Reporter Konstruerer i ES-celler. Indikerte genomiske regioner av Hoxa1 enhanceren ble klonet inn i TK-Luc vektor og transfisert inn i embryonale stamceller. Konstruer en og to inneholdt retinsyre responselement (RARE, underlined sekvens). Celler ble behandlet med RA (24 hr, 1 pM). βGal ble anvendt som en intern kontroll for normalisering. Barer representerer gjennomsnittsnormverdier fra fire biologiske replikater. ± sd *** p <0,005 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. retinsyre Induced Enhancer RNA transkripsjon. Hoxa1 mRNA og Erna nivåer målt ved RT-qPCR. Total RNA ble isolert fra ES-celler ble behandlet i 3 timer med retinsyre (RA) eller DMSO som bærer (Veh). Termin primere for fornuft og anti-sense Erna deteksjon og PCR amplikonene vises. Avstand fra regioner som oppdages av Erna RT-qPCR fra midten av RXR-bindingssetet er indikert. Verdier ble normalisert til gjennomsnittet av 36B4 mRNA. Data representerer gjennomsnitt ± SEM *** p <0,005 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12, (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics