Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

1Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Research Center for Molecular Medicine, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, 3MTA-DE “Lendulet” Immunogenomics Research Group, University of Debrecen
* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Embriyonik gelişim, birçok genlerin aktivasyonunu ve baskıyı içeren çok aşamalı bir süreçtir. genomu içinde güçlendirici elemanlar hücre farklılaşması esnasında gen sentezlenmesinin doku ve hücre tipi özel düzenlemeye katkıda bulunduğu bilinmektedir. Böylece, kendi kimlik ve daha fazla araştırma hücre kaderi nasıl belirlendiğini anlamak için önemlidir. Gen ifadesi verileri (örneğin, mikrodizi veya RNA-seq) ve kromatin immunoprecipitation (ChIP) tabanlı genom çalışmaları (ChIP-seq) sonuçlarının entegrasyonu bu düzenleyici bölgelerin büyük ölçekli belirlenmesini sağlar. Ancak, hücre türüne özgü arttırıcılar işlevsel doğrulama in vitro ve in vivo deney prosedürü de gerektirir. Burada aktif artırıcılar tespit ve deneysel olarak doğrulanmış nasıl açıklar. ChIP-seq veri analizi, 2) klonlama ve exper tarafından düzenleyici bölgelerin 1) tanımlanması: Bu protokol içeren bir adım-adım iş akışı sağlarimental bir raportör analizinde tanımlanmış olan genom dizilerinin varsayımsal düzenleme potansiyeli doğrulama ve güçlendirici RNA transkript seviyesinin ölçülmesiyle in vivo güçlendirici aktivitesinin 3) belirlenmesi. sunulan protokol laboratuarında bu iş akışını kurmak için kimseye yardımcı olmak için yeterli ayrıntılı. Önemli olarak, iletişim kuralı, kolayca adapte ve herhangi bir hücresel model sistemde kullanılabilir.

Protocol

Chip-seq Analiz dayanarak 1. Artırıcı Seçimi

  1. http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ gelen RXR ChIP seq ham veri fastq dosyası (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) now
  2. Indirin ve bizim durumumuzda (uyum için gerekli BWA dizin dosyası ayıklamak: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    NOT: biyoinformatik analiz aşamaları hakkında daha fazla bilgi için https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts ziyaret ve aşağıda kullanılan komut indirmek için.
  3. (: Perform_alignment.sh komut dosyası kullanabilirsiniz) MM10 genomuna örnek fastq dosyasını aynı hizaya getirin. Bu .bam dosyası ve uyum istatistikleri ile bir klasör oluşturur. Bağlantısızlar RXR ChIP-seq veri (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) ve karşılık gelen dizin dosyası (.bai) burada mevcuttur:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    NOT: İKD ilgili Ethicon hizalar bir yazılım paketiFare referans genom olarak bir dizi veritabanına nispeten kısa diziler (örneğin, ChIP-seq sonuçları), (örneğin, MM10) 13.
  4. Zirve arama ve de novo motifi analizi için komut (callpeaks.sh) çalıştırın. girdi olarak .bam dosyasını kullanın. Komut Homer findPeaks 14 dayanır.
    NOT: Çıktı dosyaları bize vb toplam piklerin sayısı, zenginleştirilmesi motifleri, arka yüzdesi ve motiflerle hedef dizilerin, hakkında bilgi verir. (Şekil 1). Genellikle birkaç motifler önemleri sırasına göre listelenir.
  5. 1. sırada motifi (NR yarısı `AGGTCA`) eşleştirmek (: remap_motif.sh komut dosyası kullanabilirsiniz)
    NOT: Sonuç olarak, komut ChIP-zirveleri ilgi transkripsiyon faktörü kanonik bağlanma bölgesini ihtiva genomik bölgeleri kapsayan hangi gösteren bir .Yatakta dosyası oluşturur.
  6. (Mm_ES_RX indirin ve okur hizalanmış RXR ChIP-seq sonuçları görselleştirmekR_24h_ATRA.bam (ayrıca .bai indirin)) ve Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) 15 tarafından AGGTCA motifi oluşumları (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) / varsayılan RAR tespit RXR bağlanma bölgeleri (Şekil 2 ve Şekil 3).
    NOT: Çeşitli ChIP-seq veri entegrasyonu tam iyi bir aday arttırıcılar 16,17 tahmin daha yardımcı olacaktır. Son çalışmalar, aktif artırıcılar, genellikle P300 için zenginleştirilmiş ve H3K4me1 ve H3K27ac ile ilişkili ve aynı zamanda 18-21 tavsiye edilir böylece DNaz-I aşırı duyarlılık göstererek, açık kromatin bölgelerde bulunan olduğunu ortaya koydu.
  7. Seçilen genomik bölgenin 400 bp dizisi ve sonraki astar tasarımları için bu dizileri kullanmak - 200 elde etmek IGV 15 "ilgi bir bölge tanımlama" kullanın.

2. Raportör Deneyi

NOT: luciferin / lusiferaz sistemi kullanılmaktadırtranskripsiyonel düzenleme için çok hassas bir muhabir tahlil olarak. güçlendirici aktivitesi, lusiferaz enzim bağlı olarak tespit edilebilir, bioluminescense sonuçlanan oksilusiferin lusiferinin oksidasyonunu katalize olacaktır üretilmektedir. İlk adım olarak, tespit farazi güçlendirici sekansları, bir raportör vektörüne (örneğin, TK-Lusiferaz 22 pGL3 ya NanoLuc) alt-klonlanmıştır olmalıdır.

  1. primer Tasarım
    1. 23: (http://bioinfo.ut.ee/primer3/ mevcuttur Burada) Primer3 ile farazi güçlendirici bölgelerinin 400 bp - 200 amplifikasyonu için PCR primerleri, tasarım
    2. Primer3 içine varsayılan bağlanma bölgesini içeren IGV genomik sekansı Kopya yapıştırın (adım 1.7 bakınız). Set ürün boyutu aralığı 250 - Primer3 300 bp.
    3. UCSC Genom Browser kullanarak PCR primerleri doğrulamak silico PCR aracında (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24 var
      NOT: bir sonraki adımda Bu protokol Hind II kullanırI ve BamHI kısıtlama enzimleri klonlama için. Olup olmadığını kontrol edin AAGCTT ya GGATCC sınır mevkisini ihtiva edecektir ucsc In-silico PCR aracı tarafından tahmin edildiği gibi PCR ile amplifiye dizisi (ör http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. ticari bir satıcıdan gerekli primerler edinin.
  2. Genomik DNA'dan çoğaltıcı dizi PCR amplifikasyonu
    1. Birincil hücreler (örneğin, primer embriyonik fibroblastlar) şablon genomik DNA arındırın. gDNA izolasyonu için ticari kiti kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun.
      Not: gDNA Yüksek kaliteli başarılı bir PCR amplifikasyonu için gereklidir. PCR gDNA kolay değilse Uygun BAC klonları da kullanılabilir.
    2. GDNA 100 ng, 5 ul 10x tampon maddesi, 3 ul MgSO 4 (25 mM), 5 ul dNTP (2 mM her biri), 1.5 ul İleri primer (10 uM), 1.5 ul Rev astar ihtiva eden 50 | il PCR reaksiyonu hazırlama (10 uM) , 1 ul DNA polimerazı
    3. PCR döngüsü ayarlama (2 dak 95 ° C, (20 saniye 95 ° C, 10 sn 58-65 ° C, 18 sn 70 ° C) X25 tekrar, 2 dakika 70 ° C, sonsuza kadar 4 ° C). Astar en dikkate alınarak ayarlama tavlama sıcaklığı Tm değerleri öngördü.
    4. ticari PCR saflaştırma kiti ile PCR ürünü arındırmak ve üreticinin talimatlarına uyun.
    5. Yukarıda kullanıldığı haliyle primerleri ile PCR tekrar, ancak, 5 çıkıntılar ekleyerek klonlama için kısıtlama yerleri sokacak 'uçlarına (ör İletme: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (Hind III), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 3 '(BamHI)).
    6. Spesifik olmayan PCR ürünlerinin kontrol etmek için agaroz jeli üzerinde PCR ürünün 5 ul çalıştırın.
      NOT: Daha fazla bant tespit edilirse, tüm PCR ürünü çalıştırmak ve ticari jel ekstraksiyon kiti ile uygun bant arındırmak.
    7. kısıtlama
      Not: HindIII ve BamHI ile dijeste gereken TK promoteri 22 saflaştınlmış PCR ürünü, vektör (örneğin, TK-LUC) akış yukarı uç klonlamak için.
      1. 1 ug saflaştırılmış PCR ürünü, 1 ul HindIII (20 U / ul), 1 ul BamHI (20 U / ml) ve 5 ul 10x tampon ihtiva eden bir 50 ul reaksiyon karışımı hazırlandı.
      2. 250 ul reaksiyon karışımı ihtiva eden 5 ug vektörü (TK Luc veya alternatif raportör vektör), 5 ul Hindlll (20 U / ul), 5 ul BamHI (20 U / ul), 5 ul ısıya Alkalin Fosfataz (1 U / ul) hazırlayın 25 ul 10x tampon eklendi.
        NOT: Vektörün AP tedavisi büyük ölçüde tek sindirilmiş vektör kendini ligasyonu ve böylece arka plan azalır.
      3. Daha sonra sindirilmiş PCR ürünleri ve ticari bir PCR saflaştırma kiti ile vektör saflaştırılması, 37 ° C de 4 saat reaksiyon karışımlarını inkübe edin.
    8. Ligation
      1. 2 ul 10 x T4 DNA ligaz tampon maddesi, 10 ng TK-LUC vektörü 50 ng uç (sindirilmiş PCR ürünü), 1 | il T4 DNA ligaz (400 U / ml) ve nükleaz içermeyen su içeren PCR tüplerine ligasyon reaksiyonu ayarlama 20 ul kadar.
        Not: Reaksiyon ekleme içermeyen bir negatif kontrol hazırlayın.
      2. Hafifçe yukarı pipetleme reaksiyonu karıştırın ve aşağı, mini santrifüj kullanılarak kısaca PCR tüpleri aşağı spin ve daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
      3. Isı daha sonra buz üzerine soğuk ve 50 ul yetkin hücreleri (ör DH5α) dönüşüm için ürünün 5 ul kullanımı, 10 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta etkisiz hale getirirler.
      4. ticari bir kit ile, bakteri dönüşümü koloniler pick up ve plazmid DNA izole etmek için standart ısı şoku yordamı kullanın. sonraki adımlar öncesinde sıralanmasıyla bütün yapıları doğrulayın.
    9. ES hücrelerin transfeksiyonu
      1. 48 oyuklu plakalar kullanılmıştır. 200 ul% 0.1 jelatin solut eklemeHücre kaplama öncesinde iyon / kuyu 30 dakika.
      2. Plaka embriyonik kök (ES) hücreleri transfeksiyondan bir gün önce. / Oyuk 250 ul ES ortamda oyuk başına 3 x 10 4 hücre yoğunluğunda besleyici içermeyen ES hücreleri ve plaka kullanınız.
      3. . Plazmid karışımları hazırlayın karıştırın (her karışımı işlenmemiş 4 ve 4 retinoik asit ile tedavi edilen 8 kuyuları için hesaplanır) 1: 1250 ng TK-Luc Boş (negatif kontrol), 950 ng β-galaktosidaz kodlama vektörü (βGal), Mix 2 : 1,250 ng TK-Luc Hoxa1 arttırıcı (pozitif kontrol), βGal, Mix 3 ng 950: 1250 ng TK-Luc PRMT8 arttırıcı (region of interest), βGal ng 950.
        NOT: ES hücreleri istenilen transkripsiyon faktörlerini ifade (RAR / RXR). lusiferaz ve β-galaktosidaz ölçümleri sırasında daha sonra baz değerlerini belirlemek için untransfected kuyu bırakın.
      4. 106 ul (8 kuyular için yeterli) toplam hacmi karıştırmak her plazmid transfeksiyon kalitesi düşer serum ortam ekleyin.
      5. 4.5 ul ES kaliteli Transfect ekleiyon reaktif sonra yukarı ve aşağı 15 kez pipetleme iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile transfeksiyon karışımı inkübe edin.
      6. , Kuyu başına hücrelere transfeksiyon karışımı 13 ul ekleyin Pipetleme ile iyice karıştırın. geri inkübatör ligandı tedavi öncesi (37 ° C) O / N içine hücreleri yerleştirin.
      7. hücrelerden aspirasyonu ile dikkatlice ortamı çıkarın ve 250 ul taze medya / kuyu 0.01 içeren - araç olarak nihai konsantrasyona veya DMSO gibi 1 mcM all-trans retinoik asit (RA). 48 saat - 24 inkübe hücreleri.
        NOT: Retinoik asit duyarlı ışıktır.
    10. Hücre lizatlarının Hazırlanması
      1. 5x Lizis Tamponu (1.25 mi, 0.5 M Tris pH = 7.8, seyreltilir 1 mi, 1 M ditiyotreitol (DTT) (H2O), 10 ml 0.1 M EDTA pH = 8.0, 50 ml gliserol, 5 ml Triton X-100, steril 100 ml kadar su), steril su ile 1 x 20 ul 1 M DTT / 10 ml ilave edilir ve kullanımdan önce oda sıcaklığına dengelenmeye. Deney gününde, 48-delikli plaka için 10 ml hazırlayın. hücrelerden aspirasyonu ile dikkatlice ortamı çıkarın. 1x PBS ile bir kez hücreler durulayın. Hücrelere 200 ul 1x Lizis Tampon / kuyu doğrudan ekleyin.
      2. RT (kimyasal liziz) 2 saat boyunca çalkalanır. -80 ° C (mekanik parçalama) plakanın hücre lizatları dondurun. Lizatlar birkaç gün -80 ° C de muhafaza edilebilir.
      3. lizatları çözülme. Tam Çözündükten sonra bir elektronik çok kanallı pipet kullanılarak 96 çukurlu bir levhaya hücre lizatları aktarın. Aktarım β-galaktosidaz deneyi için 96 oyuklu plaka berrak hücre lizatının 80 ul lusiferaz ölçümü için, beyaz bir plakaya hücre lizatının 40 ul. herhangi bir kabarcıkları oluşturan kaçının.
    11. β-galaktosidaz deneyi
      NOT: Beta galaktosidaz veya alternatif ikinci muhabirleri non-spesifik deneysel varyasyonları hesaba bir iç kontrol olarak kullanılmalıdır.
      1. Β-galaktosidaz alt-tabaka tamponu hazırlayın: 80.0 gr Na 2 HPO 4 • 7H 2, O,H2O • 3.8 g NaH 2 PO 4, 30.0 gr KCl, • 7H 2 O 4, steril su ile 1000 ml'ye 1.0 gr MgSO. PH 7.4 ayarlayın. 4 ° C'de sterilize (0.2 mikron) ve mağaza Filtre
      2. 4 mg ONPG 1 mi β-galaktosidaz alt-tabaka tamponu ilave (o-nitrofenil-β-D-galaktosidaz). Kullanımdan hemen önce, 1 ml tampon başına 2-merkaptoetanol (βME) 3.5 ul ekle. 80 ul hücre lisatı, 100 ul β-galaktosidaz alt-tabaka tamponu ekleyin.
      3. açık sarı bir renk geliştirdi kadar 37 ° C 'de reaksiyonlar inkübe edin. Bir plaka okuyucu ve ihracat verileri OD 420 nm'de absorbansı okunur.
        NOT: Saat genellikle artık 30 dakika daha, transfeksiyon verimliliğine bağlı olarak değişir.
    12. Lusiferaz Deneyi
      1. 50 ml polipropilen tüp eklemek 15.1 mg D-luciferin tuz, 82.7 mg ATP tuz, 185 mg MgSO 4 • 7H 2 O: 50 ml luciferase substrat reaktif hazırlayınDaha sonra, 1.5 ml 1 M HEPES tamponu, 48.5 ml ATP ücretsiz su, girdap ekleyin bütün bileşikler tamamen çözülür emin olun. -80 ° C'de 10 ml lik kısımlar halinde 5 - tutun.
      2. başlamadan önce oda sıcaklığına ısınmaya 5 mi lusiferin substratının reajanı. Pipet 100 ul substrat hücre lizatı 40 ul ihtiva eden beyaz bir plakanın her bir oyuğuna reaktifi hemen bir lüminesan sayacı makinesi kullanılarak sinyali ölçer.
      3. , üçlü Transfeksiyonlar, en az üç bağımsız deneyden elde etkinlikleri.
      4. Ölçülen her değer olmayan transfekte edilen hücreler için ölçülen ortalama değerler çıkarılarak ilk her bir taban normalize lusiferaz aktivitesi ve baz normalize β-galaktosidaz değerleri hesaplanır. Sonra lusiferaz / β-galaktosidaz aktivitesinin oranı hesaplanır.

    Arttırıcı RNA 3. karakterizasyonu

    NOT: arttırıcı aktivitenin bir daha doğrudan gösterge son genom-w ortaya çıkmıştırarttırıcılar transkripsiyonu edilir nt 50 2,000, arasında değişen büyüklüklerde birçok kısa kodlayıcı olmayan RNA'lar tespit ve (Ernas) artırıcı RNA'ların denir ide çalışmaları 16,25,26 (Şekil 4). ERNA indüksiyonu yüksek bitişik ekson-kodlayan genlerin indüklenmesi ile ilişkilidir. Bu durumda, sinyal bağımlı arttırıcı aktivitesi RT-qPCR çeşitli koşullar altındaki ERNA üretimi karşılaştırılarak in vivo olarak ölçülebilir.

    1. RT-qPCR Erna tespiti için Primer Tasarım Kuralları
      1. 2 kb uzakta açıklamalı transkripsiyon başlangıç ​​sitelerinden - en az 1.5 olduğu Erna ölçümleri için genomik bölge seçin.
        Not: Önemli bir şekilde, intrajenik arttırıcılar arasında mRNA transkripsiyonu yüksek seviyelere sens yönlenmede ERNA doğru kantifikasyon önlemek intrajenik arttırıcılar da antisens Ernas saptanabilir ve ekstragenik arttırıcılar da Ernas seviyesine benzerdir.
      2. Genel bir kural olarak, bölgeler 200 kullanmak - 1000 bp froanlamda ya da anti-duyu şeridi (Şekil 4 ve Şekil 6) üzerine ya da Primer tasarım için ilgi bağlanma sitesini transkripsiyon faktörünün merkezi m.
        Not: GRO seq, DNaz seq, H3K4me1, H3K4me3 ya H3K27ac ChIP seq veriler daha doğru bir primer tasarımı için kullanılabilecek istenen hücre tipleri ve koşullarından varsa. Ernas H3K4me1 ve Me3 yüksek seviyeleri ile karakterize farazi arttırıcı bölgeleri transkribe edilmektedir. Ernas İfadesi olumlu aktive arttırıcı histon işareti H3K27ac zenginleşmesine ile ilişkilidir.
      3. Primer3 tarafından Ernas floresan boya temelli RT-qPCR ölçümü için Tasarım PCR primerleri (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 uyarınca astar tasarımı için anti-sens dizisi (sense sarmalının tamamlayıcı ters) oluşturun: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Primer tasarım için sens veya anti-sens dizisi 300 bp - 200 yerleştirin.
    2. ERNA Transkripsiyon ölçümü
    3. üreticinin tavsiyelerine göre, ticari asidik fenol / kloroform bazlı ekstre edici reaktif ile muamele edilen hücrelerden alınan toplam RNA izole edin.
    4. önce ters transkripsiyon reaksiyonunda bunları kullanarak izole RNA tedavisi için DNaseI kullanın. ters transkripsiyon öncesinde, üreticinin tavsiyesine göre DNaz inaktive.
    5. DNaz I tedavisinden sonra RNA konsantrasyonu ölçmek ve RT reaksiyon başına 1,000 ng kullanın. Yüksek kaliteli ters transkriptaz kullanın.
      Not: Ernas sayıda poliadenile olamaz gibi, ters transkripsiyon rastgele primerler gerektirir.
    6. Algılama ters standart prosedür kullanılarak RT-qPCR Erna transkripsiyonu. Normalleşmesi için olmayan bir tedavi bağımlı mRNA ölçün (örneğin, 36B4, PPIA, GAPDH, Actb).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz genom hangi RA-düzenlenen genler kendi yakın reseptör zenginleştirme var tanımlamak amacıyla bir pan-spesifik RXR antikor kullanıldı. Retinoik asit ile tedavi ES hücrelerinden elde RXR ChIP seq veri Biyoinformatik analiz RXR sitesi işgal altında nükleer reseptör yarım ekibi (AGGTCA) (Şekil 1) zenginleştirme saptandı. Bir biyoinformatik algoritması kullanarak biz RXR ChIP-seq verilere yarım sitesinden (Şekil 2) için motif arama sonucunu geri eşleştirilmiş. Bu analiz doğru kanonik nükleer reseptör bağlanma yerleriyle örtüşen edildi olanlar ChIP zirveleri tanımlamak için bize yardımcı oldu. IGV bu siteye Görselleştirme Hoxa1, daha önce karakterize edilen RAR / RXR hedef (Şekil 2 ve Şekil 3) yakın olarak, bu transkripsiyon faktörlerinin zenginleştirme göstermektedir. Ayrıca, yeni bir RA hedef geni, yani PRMT8 27 tespit edilmiştir. bu latter bölgesi, iki yarım alanlar (AGGTCAAGGTCA) (Şekil 3) arasında hiçbir boşluk nükleotitleri doğrudan bir tekrar içerir. işlevsel RA tarafından gerçekten RAR / RXR bağlayabilir Hoxa1 için belirlenen ve düzenlenen eleman biz ~ tespit elemanları da dahil olmak üzere 300bp genomik bölge, içerdiği TK-lusiferaz bildirici vektörleri inşa olduğunu doğrulamak için. Ayrıca, tepki elemanı (Şekil 5) olmadan vektörleri inşa edilmiştir. ES hücreleri transfekte edilmiş ve lusiferaz etkinliği ve yokluğunda retinoik asidin mevcudiyetinde (Şekil 5) ölçülmüştür. (NADİR) retinoik asit tepki elementi içeren Yapıları RA tedavisi üzerine gösteri artan lusiferaz sinyal yoğunluğu, yaptığı NADİR olmadan yapı uyarılabilir değil iken.

Ayrıca Hoxa1 artırıcının retinoik asit bağımlı aktivitesi incelenmiştir. kesinleştirmek için eğer Hoxa1 RAR / RXR bağlı arttırıcı c duygusu ve anti-sense Erna ifadesigeninin mRNA ekspresyonu ile orrelate, daha da Hoxa1 mRNA düzeyini (Şekil 6) ölçüldü. Bu sonuçlar, güçlendirici etkisi, dolayısıyla, güçlendirici olasılıkla RA bağımlı güçlendirici düzenlenmesi ile ilgili olduğunu teyit kısa süreli RA tedavisi (3 saat) neden olduğunu doğruladı.

Şekil 1
Şekil 1. Homer D e Novo Motif örneğin RXR ChIP-seq için Homer tarafından oluşturulan bir çıkış HTML (homerResults.html) gösterilir. Sonuçlar. Sıra logolar RXR bağlı lokusların de novo motifi keşif tarafından tanımlanan zenginleştirilmiş transkripsiyon faktörü motifleri üst tekabül etmektedir. 7463 RXR genomik bölgelerin motif arama için kullanıldı işgal etti. Bu bölgelerin 77,66% (# 1 olarak sıralanır) AGGTCA benzeri motifi bulunur. ayrıntılı açıklaması ziyaret için: (http://homer.salk.edu/ho mer / motif /) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil hizalanmış RXR ChIP-seq Faiz. Görselleştirme Motif İçeren 2. Bulma Genomik Bölgeleri (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam ve Bütünleştirici Genomik Viewer tarafından AGGTCA motifi oluşumları (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) (IGV). Hizalamalar (okuma iplikçik ile okur renkli okur kırmızı, - iplikli: + iplikçikteki. mavi) Genom hizalama için kullanılır: MM10. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

jpg "/>
Şekil 3. Hoxa1 ve PRMT8 Enhancers. Tedavi edilmemiş ve RA-tedavi (24 saat, 1 mM) embriyonik kök hücreleri 27 elde edilen RXR ChIP-Seq sinyallerin IGV anlık Genomik Loci gösterilmiştir. Bağlayıcı diziler kırmızı renklidir belirledi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
. Yakın genin kopyalama başlangıç ​​sitesine (TSS) uzağa göreli 2 kb - Test ERNA Kodlama dizileri için Şekil 4. Deney Tasarımı güçlendirici RNA (ERNA) ölçümü için seçilen arttırıcılar en az 1.5 bulunmalıdır. İlgi ve motif analizi transkripsiyon faktörü (TF) talaştan DİZİ veriler genom doğrudan bağlanma siteleri belirlemek için kullanılabilir. transkripsiyonu bağlanması olaraktional koaktivatör (örneğin, P300) sıklıkla uzak artırıcılar işaretler, TF ve P300 hem de zenginleştirilmiş bölgeler iyi arttırıcı adaylarıdır. Ernas İfadesi olumlu aktive arttırıcı histon işareti H3K27ac zenginleşme ile ilişkili olduğunu. 200 Bölgeler -. Uzakta anlamda ya da anti-duyu yönünde bağlayıcı transkripsiyon faktörü merkezine 1.000 bp Erna astar tasarımı için tavsiye edilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Belirtilen Reporter Şekil 5. Lusiferaz Aktivite ES Hücrelerde oluşturur. Hoxa1 arttırıcı belirtilen genomik bölge TK-LUC vektörüne klonlanmış ve embriyonik kök hücreleri içine transfekte edildi. retinoik asit tepki elemanı 1 Construct ve 2 içeriyordu (NADİR underlined sekansı). Hücreler, RA (24 saat, 1 uM) ile muamele edildi. βGal normalleştirilmesi için bir iç kontrol olarak kullanıldı. Barlar dört biyolojik çoğaltır ortalama normalize değerleri temsil etmektedir. ± SD *** P <0.005 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
RT-qPCR tarafından ölçülen Şekil 6. Retinoik Asit Kaynaklı Artırıcı RNA Transkripsiyon. Hoxa1 mRNA ve Erna seviyeleri. Toplam RNA aracı (Veh) halinde retinoik asit (RA) veya DMSO ile 3 saat muamele edilmiş ES hücreleri izole edilmiştir. sens ve anti-sens ERNA algılama ve PCR amplikonlarının için ileri primerler gösterilmiştir. RXR bağlanma yeri merkezine ERNA RT-qPCR tespit bölgelerinin uzaklığı gösterilir. Değerler 36B4 mR ortalamasına göre normalize edildiNA. Veri ± sem *** P <0.005 demek temsil bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12, (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics