تستخدم علفا بروتوكول مسار طول ل

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anreiter, I., Vasquez, O. E., Allen, A. M., Sokolowski, M. B. Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (110), e53980, doi:10.3791/53980 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

والدروسوفيلاميلانوجاستر اليرقات مسار بطول النمط الظاهري هو مقياس واستخدامها لدراسة المساهمات الوراثية والبيئية للتغيير السلوكي. وقد وضعت اليرقات فحص مسار طول لقياس الفروق الفردية في السلوك تستخدم علفا التي ارتبطت في وقت لاحق هذا الجين تستخدم علفا. اليرقات مسار طول هو سمة سجل بسهولة أن يسهل جمع عينات كبيرة الحجم، بأقل تكلفة ممكنة، لشاشات الوراثية. هنا نقدم وصفا مفصلا للبروتوكول الحالي لاليرقات فحص مسار بطول استخدم لأول مرة من قبل Sokolowski. تفاصيل البروتوكول كيفية التعامل مع بتكاثر حيوانات الاختبار، إجراء فحص السلوكية وتحليل البيانات. مثال عن كيفية الفحص يمكن استخدامها لقياس المرونة السلوكية في الاستجابة للتغيرات البيئية، من خلال بيئة تغذية التلاعب قبل إجراء الفحص، وتقدم أيضا. وأخيرا، تصميم الاختبار المناسب فضلا عن العوامل البيئية التي يمكن تعديلوتناقش اليرقات مسار بطول مثل نوعية الغذاء والعمر التنموي والآثار اليوم.

Introduction

منذ اكتشاف الجين بيضاء في مختبر توماس مورغان في عام 1910، وقد استخدمت ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة البطن)، كنموذج لدراسة الأسس الجزيئية والفيزيولوجية للعمليات البيولوجية المختلفة. شعبية د. البطن ينبع إلى حد كبير من كمية كبيرة ومتنوعة من الأدوات الجينية. حجم ذبابة الفاكهة الصغير، وسهولة النسبية للمعالجة وتوليد وقت قصير يجعله نموذجا مثاليا للدراسات علم الوراثة. على قدم المساواة المهم هو قدرة ذبابة الفاكهة لاظهار العديد من الظواهر التي عبر عنها أكثر الكائنات الحية المعقدة بما فيها الثدييات. وهذا يشمل الظواهر المعقدة مثل السلوك التي تقف في واجهة بين الكائن الحي وبيئته. كما ساهمت هذه والدراسات السلوكية على ذبابة الفاكهة بشكل كبير في فهمنا لكيفية الجينات والبيئة تتوسط السلوك1.

واحدة من الدراسات الأولى من د. التحقيق في سلوك اليرقات البطن الفروق الفردية في استراتيجيات تستخدم علفا اليرقات عن طريق قياس أطوال مسار اليرقات 2 في حين تغذية. تم تعريف مسار طول والمسافة الإجمالية التي يقطعها يرقة واحدة على الخميرة، خلال مدة خمس دقائق. كل من السلالات المخبرية والذباب من الطبيعي للسكان في تورونتو تفاوتت في السلوكيات البحث عن الطعام، وكان هناك عنصر وراثي إلى الفروق الفردية في مسار طول. وقد وصفت اثنين نقرأ تستخدم علفا اليرقات من التوزيعات مسار بطول الكمية وكانت تسمى روفر وحاضنة. روفرز تبدي أطول مسار أطوال حين تعبر مساحة أكبر في حين على ركيزة الغذاء من المعتصمون. باستخدام هذا المسار طول فحص، دي حسناء وآخرون. 3 تعيين تستخدم علفا (ل) الجينات الكامنة وراء هذه الاختلافات السلوكية الفردية إلى موقع منفصل على chromosome- 2 (24A3-24C5). ود. مelanogaster لالجيني تم استنساخ في وقت لاحق 4 وكشفت أن يكون المركب تعتمد بروتين كيناز المغير من علم وظائف الأعضاء والسلوك في ذبابة الفاكهة وغيرها من الكائنات 6.

نحن هنا الخطوط العريضة للبروتوكول الحالي لاليرقات فحص مسار طول وضعت أصلا في Sokolowski 2. على الرغم من أن بعض جوانب الفحص تغيرت على مر السنين، والمفهوم الكامن وراء تصميم لديه لا. كما نقوم بتوفير البيانات لتوضيح إمكانية فحص لتقييم المساهمات الوراثية والبيئية إلى الفروق الفردية في السلوك تستخدم علفا لليرقات ذبابة الفاكهة. اليرقات مسار بطول فحص بسيط وفعال، ولكن قوية. ويمكن لشخص واحد اختبار ما يصل الى 500 اليرقات بكل سهولة في أربع ساعات والنتائج التي يمكن الحصول عليها مع مستوى عال من التكاثر. وضعت أصلا لتوطين ل، يمكن استخدامه في شاشات الوراثية، الكمي رسم الخرائط موضع الصفة، والدراساتمن الجينات التي كتبها للبيئة (GXE) التفاعلات. وعلاوة على ذلك، بساطته واستنساخ جعلها موردا كبيرا للتدريس في المرحلة الجامعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد لوحات العنب وزجاجات القابضة للجمع يرقات

  1. لصنع زجاجات عقد، وقطع ثقوب في جانب واحد من زجاجات 6 أوقية ثقافة الطاير، كبيرة بما يكفي لتناسب المكونات قنينة الطيران لتوفير الهواء (الشكل 1D).
  2. لجعل لوحات العنب، وإعداد 250 مل من المتوسط ​​عصير العنب (1.8٪ أجار، 45٪ عصير العنب، حامض الخليك 2.5٪، 2.5٪ من الإيثانول) من خلال غلي أجار، عصير العنب وأكثر من الماء، ويبرد إلى 70 درجة مئوية ( إثارة في حين التبريد)، ثم إضافة حمض الخليك والإيثانول وحتى تصل الى حجم بالماء.
  3. استخدام حقنة (بدون إبرة) لملء 35 × 10 ملم بيتري الأغطية طبق حتى سطح المتوسط ​​عصير العنب يجعل قبة فوق الشفة من الغطاء (الشكل 1A).
  4. لوحات تخزين العنب في وعاء محكم الرطبة وعند 4 درجات مئوية حتى استخدام (تصل إلى حد أقصى قدره 2 أسابيع).

2. إعداد لوحات للأغذية

  1. إعداد القياسية وصفة الطعام ذبابة.
    ملاحظة: لرطبقا لتقديرات نوعية الآثار تربية الطعام على مسار بطول استخدمنا منخفض المغذيات ذبابة المواد الغذائية: 10٪ سكروز، 1.3٪ أجار، 0.8٪ طرطرات الصوديوم والبوتاسيوم، 0.1٪ monopotassium الفوسفات، 0.05٪ كلوريد الصوديوم، 0.05٪ كلوريد الكالسيوم، 0.05٪ كلوريد المغنيسيوم، 0.05٪ كبريتات الحديد، 5٪ الخميرة وحمض البروبيونيك 0.5٪ في الماء؛ وارتفاع المواد الغذائية المواد الغذائية الطيران: 1.5٪ سكروز، 1.4٪ أجار، 3٪ جلوكوز، و 1.5٪ من دقيق الذرة، 1٪ جنين القمح، 1٪ دقيق الصويا، و 3٪ مولاس، 3.5٪ الخميرة، وحمض البروبيونيك 0.5٪، 0.2٪ Tegosept و1 ٪ من الإيثانول في الماء. لكل من الأطعمة الأوتوكلاف الحل وبارد إلى 50 درجة مئوية قبل إضافة حمض البروبيونيك، Tegosept والايثانول.
  2. صب 40 مل من المواد الغذائية يطير إلى 100 س 15mm أطباق بتري.
  3. لوحات تخزين المواد الغذائية في وعاء محكم الرطبة وعند 4 درجات مئوية حتى استخدام (تصل إلى حد أقصى قدره 2 أسابيع).

3. إعداد لوحات الاختبار

  1. إعداد 58 × 25 سم، 6 مم لوحات زجاجي أسود مع 10، 1 ملم آبار دائرية عميقة، 10 سم وقطرها مرتبة في 2 × 5 دESIGN (الشكل 1C) لاختبار اليرقات على.
    ملاحظة: ما يصل إلى 30 يرقات يمكن اختبارها في الوقت إذا تتوفر 3 أو أكثر من لوحات زجاجي أعلاه. بدلا من ذلك، اليرقات يمكن اختبارها في أطباق بتري، 10 سم في القطر. هذا الخيار هو أكثر شاقة بكثير، ويسمح لانخفاض أعداد اليرقات لفحصها.
  2. الحصول على الأسود 39 × 8 سم، 6 مم زجاجي سميك رش لنشر عجينة الخميرة على لوحات اختبار زجاجي.
  3. إعداد 100 × 15 مم الأغطية طبق بتري لتسجيل اليرقات مسار أطوال عن طريق فصل الأغطية من قيعان مقدما.

4. إعداد السكان الوالدين

  1. حافظ على ظروف الاستزراع ثابتة طوال فحص كامل (على سبيل المثال، 25 درجة مئوية، الرطوبة 60٪، و12:12 الخفيفة: دورة الظلام على الغذاء ذبابة قياسي).
  2. رفع سكان الوالدين في ظروف تربية نفسها.
  3. جمع 100-150 الإناث و50-75 ذكور والسن منهم لمدة 5 ± 1 أيام للخصوبة المثلى.
  4. سماح وemales والذكور للتزاوج بين عشية وضحاها في زجاجة الثقافة ذبابة 6 أوقية مع الطعام ذبابة القياسية.
  5. نقل الذباب في زجاجة عقد وتأمين لوحة العنب (كمية صغيرة من معجون الخميرة الطازجة على لوحة العنب وتعزيز وضع البيض؛ الشكل 1B) فوق الجزء العلوي مع اخفاء الشريط (الشكل 1E).
  6. ترك زجاجات الوقوف رأسا على عقب (الشكل 1F)، مع لوحة العنب في الجزء السفلي للسماح الكبار لتضع بيضها على لوحة العنب.
  7. تجاهل أول لوحة العنب بعد 24 ساعة ووضع لوحة العنب جديدة في زجاجة القابضة. وستكون هذه هي لوحة العنب الذي يتم جمع اليرقات في اليوم التالي.
    ملاحظة: لوحات العنب يتعين تطهيرها من يرقات 22 ساعة بعد انشائها، وإنشاء لوحات بحيث يمكن إزالتها في وقت مبكر اليوم التالي (. على سبيل المثال، وإنشاء لوحة في 12:00 واضحة في 10 من صباح اليوم التالي). فإنه من المستحسن أن يتخلص من أول لوحة العنب لتجنب أي البيض أن الإناث قد تكون حجب وثار قد تكون متقدمة في التنمية.

5. جمع L1 (الطور الأول) يرقات من لوحات العنب

  1. إزالة لوحات العنب من زجاجات 22 ساعة بعد أن تم إعداد وقعت في 60 × 15 مم طبق بيتري.
  2. وضع لوحة العنب جديدة مع عجينة الخميرة الطازجة على الزجاجة القابضة.
  3. واضح وتجاهل جميع اليرقات من لوحة العنب المصنفة باستخدام مسبار تشريح.
  4. مسح احتضان لوحات العنب لمدة 4 ساعة في الظروف القياسية.
  5. بعد 4 ساعات، واختيار 100 اليرقات L1 في سلالة من لوحات العنب ووضع على لوحات الغذاء.
    1. وضع اليرقات على الغذاء بلطف (بدون تثقيب الطعام ودفن اليرقات) وتجنب الازدحام من خلال توزيع اليرقات عبر لوحة الغذاء.
  6. احتضان لوحات الطعام حتى الحيوانات اختبار ما يقرب من 10 ساعة قبل بدء الطواف.
    ملاحظة: في 25 درجة مئوية، 10 ساعة قبل تجول عموما يتوافق مع 72-96 ساعة بعد الفقس. وexacوينبغي أن تحدد كمية طن من فترة حضانة قبل بدء التجربة من خلال جمع مجموعة أولية من يرقات لكل سلالة وتسجيل عدد من الساعات حتى بداية من التيه (وتجول اليرقات الخروج من الطعام على الجانبين وغطاء من المواد الغذائية لوحات).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، ونفس الآباء يمكن استخدامها لجمع اليرقات لمدة 3 - 4 أيام من الاختبار بتكرار الخطوات 4،7-5،5. تغيير الترتيب الذي يتم تعيين سلالات صعودا واختبارها عبر أيام لتجنب تأثير اختبار النظام على مسار طول. اختبار نفسه "السيطرة" سلالة / يجهد كل يوم من أيام الاختبارات للسيطرة على الآثار اليوم.
  7. إذا تم اختبار العديد من السلالات، ارباك إعداد وجمع الأوقات من اليرقات لإتاحة الفرصة لاختبار كل سلالة في نقطة زمنية مناسبة في وقت لاحق.

6. اليرقات مسار طول الاختبار

  1. حل الخميرة الجافة النشطة في الماء بنسبة 1: 2 نسبة (الوزن الحجم). يجب أن تكون عجينة الخميرة الانتهاء من أرق من السلطة الفلسطينيةncake الخليط، في الطريقة التي عندما رفع ملعقة من معجون، فإنه يقطر ويترك وراءه شرائط على سطح العجينة التي تذوب بسرعة بعيدا.
    ملاحظة: اتساق عجينة الخميرة مهم ويجب أن تكون ثابتة في كافة مراحل التجربة. قد يتعين تعديلها تبعا لنوع ودفعة من الخميرة نسبة الماء: الخميرة بالضبط.
  2. اختيار بلطف اليرقات من سلالة الأول لفحصها من لوحة الغذاء باستخدام فرشاة الطلاء.
  3. جمع اليرقات في طبق بتري وغسل بلطف بالماء لإزالة جميع المواد الغذائية.
    1. يغسل بسرعة اليرقات مع 1-2 مل من الماء والداب بلطف اليرقات الجافة مع مختبر مسح لتجنب نقل أي مياه عند وضع اليرقات على لوحة الاختبار. لتجنب الإجهاد، والحفاظ على يرقات الرطبة ولكن ليس مغمور في الماء.
  4. ترتيب ثلاث لوحات اختبار جنبا الى جنب وتحديد توقيت 5 دقائق لكل لوحة الاختبار.
  5. تطبيق عجينة الخميرة في الجزء العلوي من لوحات اختبار واستخدام رش، نشر تكمن رقيقةإيه من معجون الخميرة على كل لوحة الاختبار حتى يتسنى لجميع الآبار لها حتى طبقة من الخميرة.
  6. وضع بلطف يرقة واحدة في وسط كل بئر، بدءا الموقت 5 دقائق بعد وضع اليرقات الأولى على كل لوحة. ملاحظة: يمكن القيام به ثلاث لوحات في وقت واحد، مما أسفر عن حجم عينة من يوم 30 / سلالة / اختبار، وتصل إلى ما مجموعه 500 اليرقات.
  7. وضع طبق بتري غطاء على رأس كل بئر.
  8. عندما توقيت تنفد، دون إزالة اليرقات من لوحة، وبدء تتبع أطوال مسار تركت وراءها في الخميرة باستخدام علامة دائمة. وضعت تتبع مسار أطوال في نفس الترتيب كما اليرقات على لوحات الاختبار.
    1. أداء تتبع بنفس السرعة كما وضعت اليرقات على لوحات. من أجل التناسق في مجال تحليل البيانات في وقت لاحق، استخدم نفس علامة لجميع أطوال المسار. ينصح علامة دائمة.
  9. كرر الخطوات من 6.2 إلى 6.8.1 لكل سلالة لفحصها. اختيار كل سلالة من الطعام مباشرة قبل الاختبار لتجنب آثار المجاعة على السلطة الفلسطينيةطول عشر.

7. الغذاء الحرمان

  1. إذا اليرقات أن يكون الغذاء يحرم قبل الاختبار، وجمع يرقات كما هو موضح في الخطوات 6،2-6،3، ولكن المبلغ المطلوب من الوقت الحرمان من الطعام في وقت سابق (على سبيل المثال، إذا اليرقات إلى أن الغذاء حرمان لمدة 4 ساعة، وجمع اليرقات 4 ساعات قبل وقت الاختبار).
  2. تقسيم اليرقات غسلها إلى مجموعتين ووضع مجموعة المواد الغذائية حرمانا في طبق بتري 60 × 15 ملم مع 5 مل 1٪ أجار والمجموعة الضابطة في طبق بيتري مع 5 مل الغذاء القياسية.
  3. وضع الوزن على الجزء العلوي من غطاء المقلوب من أطباق بتري (وإلا اليرقات قادرة على الزحف للخروج عند البحث عن الطعام).
  4. احتضان للفترة الحرمان من الطعام المحددة سابقا والمضي قدما في الاختبار كما هو موضح في الخطوات 6،2-6،9.
  5. إذا العديد من السلالات هي لفحصها، ارباك الحرمان من الطعام يبدأ مرات للسماح للاختبار من كل سلالة في نقطة زمنية مناسبة.

تحليل 8. البيانات

ملاحظة: يصف هذا القسم طريقة لتحليل البيانات باستخدام يماغيج 7 أو 8 فيجي لتجهيز مسار أطوال، على الرغم من أن برامج أخرى يمكن استخدامها.

  1. استخدام منضدة خفيفة لنقل جميع تتبعت مسار أطوال من الأغطية طبق بتري إلى ورقة بيضاء (يمكن غسلها الأغطية مع الإيثانول واستخدامها لمزيد من تسجيل مسار الطول).
  2. تتبع خط إشارة على التوالي 50 ملم على واحد من ورقة من الورق.
  3. مسح أطوال مسار بدرجة وضوح 300 نقطة في البوصة، وباستثناء ما نقطية أو شجار ملفات الصور.
  4. فتح ملف صورة، حدد "عملية" علامة التبويب> "ثنائي"> "جعل ثنائي". ثم تحت علامة التبويب "عملية"، حدد "ثنائي"> "أصبح هيكل". وهذا ينتج خط عرض بكسل واحدة، بغض النظر عن سمك أثر.
  5. تأكد من ظهور كل طول الطريق كخط واحد مستمر مع عدم وجود سيارات الكروس أوفر.
  6. فصل أي التقاطعات باستخدام "لي مستقيمأداة شمال شرق "وتلوين البيض خط (استمرارية مسار يمكن التحقق مع" "(تتبع أداة العصا)، ينبغي تسليط الضوء على المسار بالكامل الأصفر (الشكل 2).
  7. حدد "تحليل" علامة التبويب> تعيين القياسات وحدد "محيط" و "تسمية العرض".
  8. حدد "تحليل" علامة التبويب> "على نطاق تعيين" وحدد "إزالة النطاق".
  9. في الصورة، حدد خط إشارة فقط، حدد "تحليل" علامة التبويب> "الجسيمات تحليل" وحدد "عرض: الخطوط العريضة"، "عرض النتائج" و "جدول النتائج واضحة". ملاحظة: سيتم إخراج عرض عدد من بكسل المقابلة لخط مقياس 50 ملم.
  10. حدد "تحليل" علامة التبويب> "على نطاق تعيين" وشغل في عدد البكسل في "المسافة بالبكسل" وبعد المقابلة (50 ملم) في "المسافة المعروفة".
  11. وأخيرا، حدد كافة الرسومات مسار طول راثى واحدتا الوقت، حدد "تحليل" علامة التبويب> "الجسيمات تحليل" وحدد "عرض: الخطوط العريضة"، "عرض النتائج" و "جدول النتائج واضحة".
    1. إزالة أي علامات مكتوبة أو علامات غريبة واضحة (سوف يتم التعرف على مسار أطوال) ضمن المنطقة المحددة عن طريق تحديد المنطقة وملئه الأبيض.
  12. بصريا تفقد "الخطوط العريضة" ملف الإخراج لضمان محيط التأكد بشكل صحيح. سوف إخراج تظهر طول المسار في ملم لكل رسم مسار طول في التحديد. هذا يمكن بسهولة تصديرها إلى جدول بيانات وتحليلها مع أي برنامج الإحصائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويوضح الاختلافات في مسار طول روفر وحاضنة للسلالات وتأثير الحرمان من الطعام على مسار طول في الشكل. 3 جمع البيانات على مدى ثلاثة أيام متتالية من التجارب أظهرت تأثير كبير سلالة (F (1421) = 351.89، ف <2.20 × 10 -16؛ الشكل 3A)، مع روفرز السفر أبعد من المعتصمون. بالإضافة إلى تأثير الإجهاد، وكان هناك أيضا تأثير كبير معالجة الغذاء (F (1، 421) = 461.62، ف <2.20 × 10 -16؛ الشكل 3A)، مع اليرقات التي تم الغذاء حرمان لقبل أربع ساعات لاختبار بعد أقل من ذلك بكثير مسار أطوال من اليرقات تتغذى. وعلاوة على ذلك، أظهرت أنوفا بضغط كبير من التفاعل العلاج (F (1423) = 9.78، ص = 2 × 10 -3)، وردت بمعنى روفرز والمعتصمون إلى الحرمان من الطعام بدرجات مختلفة.

"FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> على الرغم من أن البيانات الواردة أعلاه أيضا أظهرت تأثير كبير في يوم الاختبار (F (2420) = 7.22، ع = 8 × 10 -4؛ الشكل 3B - 3C). هناك لم يكن ضغطا كبيرا من التفاعل اليوم (F (2846) = 2.32، ع = 0.10)، وهذا يعني أن تتأثر اليوم روفرز والمعتصمون بالمثل. ومع ذلك كان هناك اليوم الكبير الذي تفاعل العلاج (F (2420) = 8.07، ع = 4.00 س 10 -4)، وتبين أن تأثير العلاج تنوعت عبر الأيام. وكان جودة تربية الطعام أيضا تأثير كبير على مسار أطوال (الشكل 4). وكانت عموما مسار أطوال أطول عندما كانت تربى اليرقات كل الضغوط على غذائنا المواد الغذائية مرتفعة مقارنة الغذاء بالمغذيات منخفضة (F (1، 352) = 126.38، ف <2.20 × 10 -16) الاختلافات. روفر حاضنة ومع ذلك ما زالت الحفاظ على الرغم من جودة الأغذية خلال تربية اليرقات (F (1، 352) = 94.89، ف <2.20 × 10 -16 ). وقد أدرجت الآثار اليوم الذي كانت كبيرة (F (2، 351) = 3.77، ع = 0.024) في النموذج الإحصائي. وعلاوة على ذلك، كان هناك ضغطا كبيرا من التفاعل اليوم (F (1704) = 7.15، ع = 9.00 × 10 -4)، فضلا عن المواد الغذائية الكبير الذي تفاعل اليوم (F (1704) = 5.06، ع = 7.60 × 10 - 3).

وأخيرا، من المهم أن نلاحظ أن الخلافات روفر حاضنة النسبية كانت كبيرة في اليوم، وجودة الأغذية والحرمان من الطعام والآثار، إلا أن القياسات مسار بطول المطلقة اختلف بين أيام والعلاجات. هذه النتائج لا تؤكد فقط على قوة من اليرقات مسار بطول الفحص، ولكن أيضا على أهمية السيطرة على الأوضاع تربية، تشغيل كل سلالة / معاملة الفائدة في كل يوم من الاختبار، والعوملة في الآثار اليوم في التحليلات.

1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53980 / 53980fig1.jpg "/>
ينبغي أن تملأ الشكل 1. إعداد زجاجات القابضة ولوحات الاختبار. (أ) لوحات من العنب لوضع البيض فوق حافة على شكل قبة سلسة من وسائل الإعلام. إضافة كمية صغيرة من معجون الخميرة الطازجة (ب) تشجع على وضع البيض. اختبار لوحة (C) زجاجي مع فوز في الآبار ورش. (D) سافر زجاجة الثقافة مع ثقب في قطع إمدادات الهواء. بعد نقل السكان الوالدين إلى زجاجة الثقافة، لوحات العنب ينبغي تركيب خلال افتتاح مع اخفاء الشريط (E) وينبغي وضع زجاجات مع لوحة العنب في القاع (F). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .

ز "/>
الرقم تحليل 2. صورة من الملتوية آثار مسار طول. مسار أطوال حيث عبروا اليرقات خلال طريقها يجب فصل يدويا عند تقاطع لتوليد خط واحد مستمر. (A) يدل على سبيل المثال من ثلاثة مسار أطوال الممسوحة ضوئيا، مع سهم يشير الحمراء عند نقطة تقاطع من كبار مسار طول. (ب) يظهر نفس مسار بطول تحريرها في ImageJ للفصل بين التقاطع. (C) ويبين يماغيج محيط الناتج من تقاطع الطريق طول، مع تقييم خاطئ من محيط مسار 1 بسبب التقاطع. (D) ويبين يماغيج محيط إخراج الملف المحرر مع تقاطع المشقوق والتقييم الصحيح للمحيط مسار بطول 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ithin الصفحات = "1"> الشكل (3)
الشكل 3. بنك الاحتياطي الفيدرالي والغذاء المحرومين روفر وحاضنة اليرقات مسار أطوال يعني اليرقات مسار بطول (ملم ± SEM) لروفرز والمعتصمون، مما يدل على: (أ) المجمعة مسار أطوال لتغذية و 4 ساعة الغذاء اليرقات حرمان أكثر من ثلاث مرات متتالية أيام من الاختبار، 105 <ن <120؛ (ب) بنك الاحتياطي الفيدرالي اليرقات مسار أطوال بعد يوم 38 <ن <40 يوميا. و (ج) 4 ساعة الغذاء حرمان اليرقات مسار أطوال بعد يوم، 38 <ن <40 في اليوم. وقد تربى جميع اليرقات وأولياء الأمور على الطعام المغذي منخفضة عند 25 درجة مئوية، الرطوبة 60٪، و00:12 L: دورة التطوير. تم تقييم الاختلافات بين الجماعات الاختبار و / أو العلاج عن طريق تحليل التباين (ANOVA) واختبار توكي للمقارنات متعددة بعد خاصة زوجيا. ل(A) تم إضافة عامل عرقلة من اليوم لهذا النموذج. تمثل رسائل المجموعات الإحصائية؛ يعني مع نفس الرسالة ليست الاشتراكيةمختلف gnificantly (ع <0.05). بنك الاحتياطي الفيدرالي وFD الوقوف لظروف حرمان للتغذية و 4 ساعة الغذاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. جودة الأغذية واليرقات مسار أطوال، وكان متوسط ​​اليرقات مسار بطول (ملم ± SEM) لروفرز والمعتصمون، مما يدل على مسار أطوال يرقات نمت على ارتفاع وانخفاض الطعام المغذي. تجميع البيانات على مدى ثلاثة أيام متتالية من التجارب مع عامل عرقلة من اليوم تضاف إلى نموذج إحصائي، 75 <ن <90. جميع اليرقات والآباء والأمهات وتربى على انخفاض أو ارتفاع المواد الغذائية المغذيات في 25 درجة مئوية، الرطوبة 60٪، و12:12 L: دورة التطوير. تم تقييم الاختلافات بين الجماعات الاختبار و / أو العلاج عن طريق تحليل التباين (ANOVA) واختبار توكي لمرحلة ما بعد خاصة زوجيا multiplمقارنة ه. تمثل رسائل المجموعات الإحصائية؛ يعني مع نفس الرسالة ليست مختلفة معنويا (P <0.05). موقف العالية والمنخفضة لغذائية عالية وانخفاض نوعية الغذاء بالمغذيات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فحص مسار بطول المذكورة هنا يوفر مقياسا قوية وبسيطة من السلوك تستخدم علفا لليرقات ذبابة الفاكهة. بروتوكول يتبع المنهجية العامة وصفها في Sokolowski ولكن منذ ذلك الحين تحسنت في ما يخص الكفاءة والضوابط التجريبية. إلى علمنا هذه الطريقة هي الطريقة الوحيدة المتاحة لقياس اليرقات مسار طول. النسخة الأصلية من بروتوكول 2، 3، 15، 16 اختبار اليرقات على أطباق بتري بطبقة رقيقة من معجون الخميرة تطبيقها مع فرشاة، وبعد ذلك الزجاج نشر قضيب مسار طول. أحدث الإصدارات من البروتوكول 10، 17 انتقلت إلى استخدام لوحات زجاجي هو موضح هنا. قدم استخدام أطباق بتري والزجاج رش الاستفادة من طبقة رقيقة جدا من الخميرة، والتي أسفرت عن مسار طويلة جدا أطوال وتفاقمت الخلافات بين المسبار وحاضنة الظواهر. أدى استخدام لوحات زجاجي في الكلية أطوال مسار أقصر، ولكن ريال عمانيالنسخة حاضنة واستمرت الخلافات واستنساخه على حد سواء. على الرغم من أن استخدام لوحات زجاجي أقل شاقة من ذلك بكثير، وأطول أطوال الطريق التي تم الحصول عليها مع أسلوب طبق بيتري سمحت للانفصال أفضل من لاند روفر وحاضنة الظواهر، وتسهيل رسم الخرائط الوراثية للفرق روفر حاضنة لللالجيني 3. استخدام لوحات اختبار زجاجي بدلا من أطباق بتري، والتحليلات الحسابية من آثار مسار بطول هي التغييرات الرئيسية التي أدخلت على بروتوكول منذ الأسلوب وضعت لأول مرة، وزادت بشكل كبير من أعداد اليرقات التي يمكن اختبارها من قبل شخص واحد ، فضلا عن سرعة تحليل البيانات. كما قمنا بتحسين معرفتنا على عدة عوامل التجريبية والبيئية التي يمكن أن تؤثر على نتائج الفحص، وبعضها المذكورة أدناه.

أولا، هذا الاختبار يقيس الفروق الفردية في السلوك مسار طول على ركيزة تستخدم علفا (عجينة المياه الخميرة). د كبيرifferences في هذا الاختبار يمكن أن تنجم عن عيوب في الحركة اليرقات العام. وهذا يمكن أن يسيطر عليها يعاير في وقت واحد للسلوك تنقل اليرقات على لوحات أجار غير الغذائية. إذا استمرت الخلافات الضغط على لوحات أجار، فمن الأسلم أن نفترض أن الاختلافات الموجودة على ركيزة المياه الخميرة لا يبحث الفأر محددة السلوك. ولقد ثبت سابقا أنه في حين أن لاند روفر لأليل يمنح بشكل ملحوظ أطول مسار أطوال على الخميرة، المركبتين والمعتصمون لا تختلف في حالة عدم وجود الغذاء، كما أنها تظهر طويلة وبالمثل مسار أطوال على أجار 9. وعلاوة على ذلك، لأن يرقات عموما زيادة الحركة في حالة عدم وجود الغذاء، وإيجاد حركة قليلة أو معدومة على لوحات أجار تعد مؤشرات المحتمل لعيوب في الحركة. منذ العيوب حركة مستقلة الغذاء يمكن أن يكون بمثابة متغير التباس عند التحقيق في البحث عن الطعام السلوك، ويمكن السيطرة أجار لحد من ايجابيات كاذبة في شاشات الجينية 10. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنه إذا لارتضررت الدرهم قبل الاختبار، لأنها قد لا تتحرك على الإطلاق. غير متحركة، اليرقات الميتة أو التالفة يمكن تمييزها عن اليرقات السليمة من خلال مراقبة حركة هوك الفم. يرقات متحركة دون أي تحركات ربط الفم يجب التخلص.

ثانيا، كما هو الحال مع غيرها من السلوكيات، اليرقات مسار بطول يمكن أن تتأثر العوامل البيئية التي تحتاج إلى النظر فيها والخاضعة للرقابة لعند إجراء هذا الاختبار. وتشمل العوامل البيئية المعروفة بتأثيرها على مسار بطول درجة حرارة الماء والرطوبة ونوعية الغذاء، تربية كثافة، الخميرة عجينة السمك، والاختلافات العشوائية بين أيام، والتعامل مع اليرقات. نمو اليرقات والعمر في وقت الاختبار تؤثر أيضا على مسار بطول 11. كما هو مبين في الشكل. 4، ورفع اليرقات في انخفاض نوعية الغذاء يقلل مسار طول. من المستحسن استخدام واحدة من صفات الطعام ذبابة الموصوفة في هذا البروتوكول أو الميتة صفة أخرى الخميرة التي تعادل في محتواها الغذائي. بل هو أيضا suggeSTED لتجنب البيئات عالية أو منخفضة الكثافة تربية من قبل البذر دائما لوحات الغذاء مع 100 اليرقات وإبعادها عن بعضها بشكل متساو على الطعام. تربية اليرقات بكثافات عالية يحد من توافر الغذاء ويؤخر نمو اليرقات، التي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات التنموية بين اليرقات في وقت الاختبار 12. منخفضة الكثافة الظروف تربية ويمكن أيضا أن تؤثر التنمية منذ يرقات ذبابة الفاكهة يمكن أن تشكل الجماعات تستخدم علفا الاجتماعية لكسر المواد الغذائية وزيادة تستخدم علفا للنجاح 13. عندما يعاير اليرقات مع الطفرات التي تؤثر على حجم اليرقات، قد يكون من الضروري لحساب هذه الآثار عن طريق حساب مسار بطول بوصفها وظيفة من طول الجسم اليرقات أو محيط. في جميع الحالات من المهم للتأكد من أن اليرقات لم تتحول إلى المرحلة تجول المرحلة التي يجري اختبارها. إذا اليرقات تتحرك صعودا على طبق بتري غطاء أثناء الاختبار، فمن المرجح أنها تتخبط ويجب التخلص من هذه التجربة والمتكررة مع لوس انجليس الأصغرrvae.

وثمة عامل آخر يستحق الذكر هو اتساق عجينة الخميرة المستخدمة في اختبار مسار طول لأنه يؤثر على سرعة الزحف اليرقات. اختبار اليرقات على عجينة الخميرة سميكة سيكون أقصر مسار أطوال من اليرقات اختبارها على عجينة الخميرة أكثر مائي. وعلاوة على ذلك، تؤثر الاختلافات العشوائية بين أيام الاختبار أيضا مطلقة عشرات مسار طول. لا بد من عشوائية الترتيب الذي يتم اختبار سلالات / المورثات خلال أيام ومنعها بين أيام. وأخيرا، ينبغي الحرص على عدم التأكيد على اليرقات قبل اختبار مسار طول. اثنين من الضغوطات التي يتم تقديمها عادة عن طريق التعامل والجوع والغرق. كما هو مبين في الشكل. 3، تجويع اليرقات قبل الاختبار يقلل مسار طول، وعلى الرغم من أن المجاعة كما يمكن ادخال تلاعب البيئي، وينبغي تجنب حدوثه غير مقصود. وينبغي تجنب مشددا على اليرقات من خلال العمل بلطف ولكن بسرعة، مما يحد من مقدار الوقت ليرة سوريةوالأنف والحنجرة جمع، والتنظيف، ونقل اليرقات. منذ اليرقات معرض انجذاب ضوئي سلبي 14، يمكن للضوء الشديد أيضا بمثابة الضغوطات وينبغي أن يتم فحص تحت حتى، والإضاءة المنتشرة. وعلى الرغم من العوامل البيئية المتعددة التي يمكن أن تغير مسار طول، من المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من مطلقة عشرات مسار بطول عرضة للظروف البيئية، واستمرت الخلافات النسبية بين سلالات عندما يتم التعامل مع جميع الأفراد على حد سواء.

دقة وكفاءة ومتانة في الكمي هي في صلب الدراسات الرامية إلى فهم العوامل الوراثية والبيئية التي تتوسط السلوك. ذبابة الفاكهة اليرقات مسار بطول فحص يقدم كل هذه المزايا بالإضافة إلى كونها منخفضة التكلفة، وإنتاجية عالية، وسهلة لأداء. على هذا النحو، وهذا الفحص يمكن أن تستخدم على نطاق واسع لشاشات جينية لتحديد المسارات الجزيئية والجينية المرتبطة الاستجابات السلوكية. وعلاوة على ذلك، يمكن للفحص أن يكونpplied لاختبار السمية أو شاشات الدوائية، أو تكييفها لتدريس في الفصول الدراسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 oz fly culture bottles  Fisher Scientific  AS355 
Fly vial plugs Droso-Plugs 59-201
35 x 10 mm Petri dishes  Falcon 351008
100 x 15 mm Petri dishes  Fisher 875712
60 x 15 mm Petri dishes VWR 25384-168 
Dissecting probes Almedic 2325-58-5300 
Yeast Lab Scientific FLY-8040-20F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster). Dubnau, J. Cambridge University Press. New York. 173 (2014).
  2. Sokolowski, M. B. Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis. Behav Genet. 10, 291-302 (1980).
  3. de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 123, 157-164 (1989).
  4. Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila. Science. 277, 834-836 (1997).
  5. Kalderon, D., Rubin, G. cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila. J Biol Chem. 264, (18), 10739-10748 (1989).
  6. Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior. Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  9. Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 140, 263-270 (1995).
  10. Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster. J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).
  11. Graf, S. A., Sokolowski, M. B. The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation. J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).
  12. Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time. Genetics. 82, 33-44 (1990).
  13. Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. Dynamics of social behavior in fruit fly larvae. PLoS One. 9, (4), e95495 (2014).
  14. Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae). J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).
  15. de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster. Heredity. 59, 73-83 (1987).
  16. de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster. Genome. 36, 94-101 (1993).
  17. Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection. PNAS. 94, 7373-7377 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics