Foraging Protocole Chemin de longueur pour

Neuroscience

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Anreiter, I., Vasquez, O. E., Allen, A. M., Sokolowski, M. B. Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (110), e53980, doi:10.3791/53980 (2016).

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Abstract

La Drosophila melanogaster larvaire longueur de chemin phénotype est une mesure établie utilisée pour étudier les contributions génétiques et environnementales à la variation du comportement. Le test de longueur de chemin larvaire a été développé pour mesurer les différences individuelles dans le comportement alimentaire qui ont ensuite été lié au gène de recherche de nourriture. Larvaire longueur de chemin est un trait facilement marqué qui facilite la collecte des échantillons de grande taille, à un coût minime, pour les écrans génétiques. Ici, nous fournissons une description détaillée du protocole actuel pour le test de longueur de chemin larvaire d'abord utilisé par Sokolowski. Le protocole décrit comment gérer de façon reproductible des animaux d'essai, effectuer le test de comportement et d'analyser les données. Un exemple de la façon dont le dosage peut être utilisé pour mesurer la plasticité comportementale en réponse aux changements environnementaux, en manipulant l'alimentation environnement avant d'effectuer le test, est également fourni. Enfin, la conception d'essai approprié, ainsi que les facteurs environnementaux qui peuvent modifierchemin de longueur larvaire tels que la qualité des aliments, l'âge de développement et les effets de jour sont discutés.

Introduction

Depuis la découverte du gène blanc dans le laboratoire de Thomas Hunt Morgan en 1910, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), a été utilisé comme modèle pour l'étude des fondements moléculaires et physiologiques de divers processus biologiques. La popularité de D. melanogaster provient en grande partie de la quantité considérable et la variété des outils génétiques. La petite taille de la drosophile, une relative facilité de manipulation et de courte durée de génération rendent un modèle idéal pour les études génétiques. Tout aussi important est la capacité de Drosophila de démontrer un grand nombre des phénotypes exprimés par des organismes plus complexes , y compris les mammifères. Cela inclut des phénotypes complexes tels que le comportement qui se dressent à l'interface entre l'organisme et son environnement. À ce titre, des études comportementales sur la mouche des fruits ont largement contribué à notre compréhension de la façon dont les gènes et l'environnement médiatisent comportement1.

L' une des premières études de D. le comportement des larves melanogaster étudié les différences individuelles dans les stratégies de recherche de nourriture des larves en mesurant le chemin d' accès longueurs des larves 2 tout en se nourrissant. Chemin de longueur a été définie comme la distance totale parcourue par une seule larve sur la levure, dans un délai de cinq minutes. Les deux souches et les mouches de laboratoire à partir d'une population naturelle de Toronto varient dans leurs comportements de recherche de nourriture et il y avait une composante génétique à des différences individuelles dans le chemin de longueur. Deux morphes de recherche de nourriture des larves ont été décrites dans les distributions quantitatives chemin de longueur et ils ont été appelés rover et sitter. Rovers présentent plus de chemin longueurs tout en traversant une zone plus large tandis que sur un substrat alimentaire que sitters. L' utilisation de ce test de longueur de chemin, de Belle et al. 3 cartographié la recherche de nourriture (pour) gène qui sous - tend ces différences de comportement individuelles à un emplacement discret sur ​​chromosome- 2 (24A3-24C5). D. melanogaster pour le gène a ensuite été clone 4 et révélée être une protéine kinase dépendante du GMPc 5, un modulateur de la physiologie et le comportement dans Drosophila et d' autres organismes 6.

Nous présentons ici le protocole actuel pour le test de longueur de chemin larvaire développé à l' origine dans Sokolowski 2. Bien que certains aspects de l'essai ont changé au fil des ans, le concept derrière le design n'a pas. Nous fournissons également des données pour illustrer le potentiel du test pour évaluer les contributions génétiques et environnementales à des différences individuelles dans le comportement alimentaire des larves de drosophile. Le test de longueur de chemin larvaire est simple, efficace, et pourtant robuste. Une seule personne peut tester jusqu'à 500 larves avec facilité en quatre heures et les résultats peuvent être obtenus avec un niveau élevé de reproductibilité. Développé à l' origine pour localiser, il peut être utilisé dans des criblages génétiques, la cartographie du locus de trait quantitatif, et dans les étudesdu gène-environnement (GxE) interactions. De plus, sa simplicité et sa reproductibilité en font une grande ressource pour l'enseignement de premier cycle.

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Protocol

1. Préparer raisin assiettes et bouteilles Holding pour Collection de Larves

  1. Pour fabriquer des bouteilles de maintien, les trous coupés dans un côté de bouteilles 6 oz de culture de mouche, assez grand pour accueillir un bouchon de flacon de mouche pour l' alimentation en air (Fig. 1D).
  2. Pour fabriquer des plaques de raisin, préparer 250 ml de milieu de jus de raisin (1,8% de gélose, 45% de jus de raisin, l'acide acétique à 2,5%, 2,5% d'éthanol) en faisant bouillir l'agar-agar, le jus de raisin et la plupart de l'eau, refroidir à 70 ºC ( remuer pendant le refroidissement), puis ajouter de l'acide acétique et de l'éthanol et amener au volume avec de l'eau.
  3. Utiliser une seringue (sans aiguille) pour remplir 35 x 10 mm boîte de Petri couvercles jusqu'à ce que la surface du milieu jus de raisin fait un dôme au- dessus de la lèvre du couvercle (Fig. 1A).
  4. plaques de raisin de magasin dans un récipient étanche à l'air humide et à 4 ° C jusqu'à utilisation (jusqu'à un maximum de 2 semaines).

2. Préparation des plaques alimentaires

  1. Préparez la recette de la nourriture à la mouche standard.
    Remarque: Pour taliments d'élevage est Couleur des effets de qualité sur le trajet de longueur, nous avons utilisé des aliments à faible braguette nutritif: 10% de saccharose, 1,3% d'agar, 0,8% de tartrate de sodium et de potassium, 0,1% de phosphate monopotassique, chlorure de sodium à 0,05%, 0,05% de chlorure de calcium, chlorure de magnésium à 0,05%, 0,05% de sulfate de fer, 5% de levure et l'acide propionique 0,5% dans l'eau; et à haute teneur en nutriments volantes: 1,5% de saccharose, 1,4% de gélose, 3% de glucose, 1,5% de farine de maïs, 1% de germe de blé, 1% de farine de soja, 3% de mélasse, 3,5% de levure, de l'acide propionique, 0,5%, 0,2% Tegosept et 1 % d'éthanol dans l'eau. Pour les deux aliments autoclave la solution et laisser refroidir à 50 ° C avant d' ajouter l'acide propionique, Tegosept et de l' éthanol.
  2. Verser 40 ml de nourriture à la mouche en 100 x 15mm boîtes de Pétri.
  3. plaques alimentaires de magasin dans un récipient étanche à l'air humide et à 4 ° C jusqu'à utilisation (jusqu'à un maximum de 2 semaines).

3. Préparer les plaques d'essai

  1. Préparer 58 x 25 cm, épaisseur de 6 mm plaques de plexiglas noir avec 10, 1 mm de profondeur des puits circulaires de 10 cm de diamètre et disposé dans une 2 x 5 jesign (Fig. 1C) pour tester les larves sur.
    Note: Jusqu'à 30 larves peuvent être testés à la fois si 3 ou plus des plaques de plexiglas ci-dessus sont disponibles. Alternativement, les larves peuvent être testés dans des boîtes de Pétri, 10 cm de diamètre. Cette option est beaucoup plus laborieuse et permet une diminution du nombre des larves à tester.
  2. Obtenir un noir 39 x 8 cm, 6 mm d'épaisseur en plexiglas écarteur pour étaler la pâte de levure sur les plaques d'essai en plexiglas.
  3. Préparer 100 x 15 mm boîte de Pétri couvercles pour l'enregistrement chemin longueurs larvaires en séparant les paupières de fonds à l'avance.

4. Mise en place des populations parentales

  1. Gardez les conditions d' élevage constant tout au long du test (par exemple, 25 ° C, 60% d' humidité et une lumière 12h12: cycle d' obscurité sur la nourriture à la mouche standard).
  2. Soulever la population parentale mêmes conditions d'élevage.
  3. Collecter 100 - 150 femelles et 50 - 75 hommes et de les vieillir pendant 5 ± 1 jours pour la fécondité optimale.
  4. Autoriser females et les hommes pour s'accoupler la nuit dans une mouche bouteille de culture de 6 oz avec de la nourriture à la mouche standard.
  5. Transfert mouches dans une bouteille de maintien et fixer une plaque de raisin (une petite quantité de pâte de levure fraîche sur la plaque de raisin favorisera la ponte;. La figure 1B) sur le dessus avec du ruban adhésif (Fig . 1E).
  6. Laisser les bouteilles debout à l' envers (Fig. 1F), avec la plaque de raisin au fond pour permettre aux adultes de pondre des œufs sur la plaque de raisin.
  7. Jeter la première plaque de raisin après 24 h et de placer une nouvelle plaque de raisin dans la bouteille de maintien. Ce sera la plaque de raisin à partir de laquelle les larves sont recueillies le lendemain.
    Remarque: plaques de raisin devront être débarrassé des larves 22 heures après avoir été mis en place, mettre en place des plaques de sorte qu'ils peuvent être effacés tôt le lendemain (. Par exemple, mettre en place la plaque à 12 h et clair à 10 heures le lendemain). Il est conseillé de jeter la première plaque de raisin pour éviter les oeufs que les femelles pourraient avoir été retenues et that peut être avancé dans le développement.

5. Collecter L1 (première Instar) Larves de raisin Assiettes

  1. Retirer les plaques de raisin de bouteilles 22 heures après avoir été mis en place et les placer dans une boîte de Pétri 60 x 15 mm.
  2. Placez une nouvelle plaque de raisin avec de la pâte de levure fraîche sur la bouteille de maintien.
  3. Effacer et jeter toutes les larves de la plaque de raisin ensemencées en utilisant une sonde de dissection.
  4. Incuber effacé plaques de raisin pendant 4 heures dans des conditions standard.
  5. Après 4 heures, chercher 100 larves L1 par souche à partir des plaques de raisin et de placer sur des plaques alimentaires.
    1. Placez les larves sur la nourriture doucement (sans perforer la nourriture et à enterrer les larves) et éviter l'encombrement en distribuant les larves à travers la plaque alimentaire.
  6. Incuber les plaques alimentaires jusqu'à ce que les animaux d'essai sont d'environ 10 heures avant le début de l'errance.
    Note: À 25 ºC, 10 h avant de flâner en général correspond à 72-96 heures après l'éclosion. L'ExACt quantité de temps d'incubation doit être déterminé avant de commencer l'expérience en recueillant un ensemble initial de larves pour chaque souche et enregistrer le nombre d'heures avant le début de l'errance (larves errant se déplacer hors de la nourriture sur les côtés et le couvercle de la nourriture plaques).
    Remarque: Si nécessaire, les mêmes parents peuvent être utilisés pour recueillir les larves pour 3 - 4 jours d'essais en répétant les étapes 04.07 à 05.05. Changer l'ordre dans lequel les souches sont mis en place et testés à travers jours afin d'éviter un effet de commande de test sur le chemin de longueur. Testez la même souche "de commande" / souches chaque jour de tests pour contrôler les effets de jour.
  7. Si de nombreuses souches sont testées, décaler les temps de mise en place et la collecte des larves pour permettre l'essai de chaque souche au point de temps approprié plus tard.

6. larvaire Chemin longueur d'essai

  1. Dissoudre la levure de boulangerie sèche-actif dans l'eau à un rapport 1: 2 (poids à volume). La pâte de levure fini devrait être plus mince que pancake pâte, d'une manière qui en soulevant une cuillère sur la pâte, il coule et laisse derrière des rubans sur la surface de la pâte qui fondent rapidement loin.
    Remarque: La consistance de la pâte de levure est important et devrait être constante tout au long de l'expérience. L'exacte levure: rapport d'eau peut être ajustée en fonction de la marque et le lot de levure.
  2. choisir doucement les larves de la première souche à tester de la plaque d'aliments à l'aide d'un pinceau.
  3. Recueillir les larves dans une boîte de Pétri et laver délicatement avec de l'eau pour éliminer tous les aliments.
    1. Laver rapidement les larves avec 1 - 2 ml d'eau et doucement dab larves sec avec un laboratoire essuyer pour éviter le transfert de l'eau en plaçant les larves sur la plaque d'essai. Pour éviter le stress, garder les larves humide mais pas immergé dans l'eau.
  4. Disposer trois côté des plaques d'essai à côte et régler une minuterie de 5 minutes pour chaque plaque d'essai.
  5. Appliquer la pâte de levure au-dessus des plaques d'essai et avec l'écarteur, la propagation d'une mise minceer de la pâte de levure sur chaque plaque d'essai de telle sorte que tous les puits ont une couche uniforme de levure.
  6. Placez délicatement une larve dans le centre de chaque puits, à partir de la minuterie de 5 min après avoir placé les premières larves sur chaque plaque. Remarque: Trois plaques peuvent être faites à un moment, ce qui donne une taille de 30 jours / souche / échantillon d'essai, jusqu'à un total de 500 larves.
  7. Placez un plat couvercle Petri sur le dessus de chaque puits.
  8. Lorsque le temps imparti, sans enlever les larves de la plaque, commencer à tracer les chemins de longueurs laissées dans la levure en utilisant un marqueur permanent. Trace Chemin des longueurs dans le même ordre que les larves ont été placées sur les plaques d'essai.
    1. Effectuer le traçage à la même vitesse que les larves ont été placées sur les plaques. Par souci de cohérence dans l'analyse ultérieure des données, utiliser le même marqueur pour tous les chemins de longueurs. Marqueur permanent est recommandé.
  9. Répétez les étapes 6.2 à 6.8.1 pour chaque souche à tester. Choisissez chaque souche de la nourriture immédiatement avant l'essai pour éviter les effets de la famine sur pae-longueur.

7. pénuries alimentaires

  1. Si les larves sont d'être privés de nourriture avant le test, de recueillir les larves comme décrit dans les étapes 6.2 à 6.3, mais la quantité désirée de temps de privation de nourriture plus tôt (par exemple. Si les larves sont à la nourriture privé pendant 4 heures, de recueillir les larves 4 heures avant temps de test).
  2. Divisez les larves lavé en deux groupes et placer le groupe alimentaire privé dans une boîte de Pétri 60 x 15 mm avec 5 ml 1% d'agar et le groupe de contrôle dans une boîte de Pétri avec 5 ml de nourriture standard.
  3. Placer un poids sur le dessus du couvercle inversé des boîtes de Pétri (sinon les larves sont en mesure d'explorer lors de la recherche de la nourriture).
  4. Incuber pendant la période de privation de nourriture préalablement établie et procéder à des essais comme décrit dans les étapes 6.2 à 6.9.
  5. Si de nombreuses souches sont à tester, échelonner la privation de nourriture heures de début pour permettre de tester de chaque souche au point de temps approprié.

Analyse 8. Données

Remarque: Cette section décrit une méthode pour l' analyse des données en utilisant ImageJ 7 ou 8 Fidji pour le traitement des chemins de longueurs, bien que d' autres logiciels peuvent être utilisés.

  1. Utilisez une table lumineuse pour transférer tous les chemins tracés longueurs de la boîte de Petri couvercles de papier blanc (couvercles peuvent être lavés avec de l'éthanol et réutilisées pour d'autres enregistrements de longueur de chemin).
  2. Tracer une droite de référence de 50 mm sur l'une des feuilles de papier.
  3. Scannez le chemin d'accès longueurs à une résolution de 300 dpi et enregistrer en tant que bitmap ou tiff fichiers image.
  4. Ouvrez le fichier d'image, sélectionnez l'onglet "Processus"> "binaire"> "Make binaire". Puis, sous l'onglet "Processus", sélectionnez "binaire"> "squelettisent". Cela produit une ligne de largeur d'un pixel, indépendamment de l'épaisseur de la trace.
  5. Assurez-vous que chaque chemin de longueur apparaît comme une seule ligne continue, sans croisements.
  6. Séparer toutes les intersections en utilisant le "li Hétérooutil ne "et la coloration de la ligne blanche (la continuité de la trajectoire peuvent être vérifiés avec le" (traçage) outil Baguette ", le chemin complet doit être mis en évidence jaune (Fig. 2).
  7. Sélectionnez l'option "Analyser"> onglet mesures Définir et sélectionnez «Périmètre» et «étiquette d'affichage".
  8. Sélectionnez l'onglet "Analyse"> "échelle Set" et sélectionnez "Supprimer l'échelle".
  9. Sur l'image, sélectionnez la ligne de référence, sélectionnez l'onglet "Analyse"> "particules Analyser" et sélectionnez "Afficher: Outlines", "Afficher les résultats" et "tableau des résultats clairs". Remarque: La sortie affiche le nombre de pixels correspondant à la ligne de l'échelle 50 mm.
  10. Sélectionnez "Analyse" onglet> "Scale" et remplissez le nombre de pixels dans "Distance en pixels" et la distance correspondante (50 mm) dans «distance connu».
  11. Enfin, sélectionnez tous les dessins de longueur de chemin d'un génotype d'untemps ta, sélectionnez l'onglet "Analyse"> "particules Analyser" et sélectionnez "Afficher: contours", "Afficher les résultats" et "tableau des résultats clairs".
    1. Retirez toutes les étiquettes écrites ou des marques étrangères évidentes (ils seront reconnus comme chemin-longueurs) dans la zone sélectionnée en sélectionnant la zone et de le remplir blanc.
  12. Inspecter visuellement le fichier de sortie "Outlines" pour assurer les périmètres ont été correctement vérifiées. La sortie est un chemin de longueur en mm pour chaque dessin de longueur de chemin dans la sélection. Cela peut facilement être exportées vers un tableur et analysé avec un logiciel statistique.

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Representative Results

Les différences de longueur de trajet du rover et sitter pour les souches et l'effet de la privation de nourriture sur le chemin de longueur sont illustrés sur la Fig. . 3 Les données recueillies pendant trois jours consécutifs de tests ont montré un effet significatif de déformation (F (1,421) = 351,89, p <2,20 x 10 -16;. La figure 3A), avec rovers voyager plus loin que sitters. En plus de l'effet de déformation, il y avait également un effet significatif du traitement des aliments (F (1, 421) = 461,62, p <2,20 x 10 -16;. La figure 3A), avec des larves qui ont été privés de nourriture pendant quatre heures avant l'essai , ayant chemin longueurs significativement plus faibles que les larves nourries. En outre, l'ANOVA a montré une forte pression par l' interaction de traitement (F (1,423) = 9,78, p = 2 x 10 -3), rovers sens et sitters ont répondu à la privation de nourriture à des degrés divers.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Bien que les données ci - dessus ont également montré un effet significatif de la journée de test (F (2,420) = 7,22, p = 8 x 10 -4; Fig 3B - 3C.) Il était pas de contrainte significative par interaction quotidienne (F (2,846) = 2,32, p = 0,10), ce qui signifie que jour touchés rovers et sitters similaire. Néanmoins , il a été une journée importante par l' interaction de traitement (F (2,420) = 8,07, p = 4,00 x 10 -4), montrant que l'effet du traitement variait jours. la qualité d' élevage de la nourriture a également eu un effet significatif sur la trajectoire des longueurs (fig. 4). chemin longueurs globales étaient plus lorsque les larves des deux souches ont été élevées sur notre nourriture riche en éléments nutritifs par rapport à la nourriture faible en éléments nutritifs (F (1, 352) = 126,38, p <2,20 x 10 -16) différences. Rover-sitter mais étaient encore maintenus en dépit de la qualité de la nourriture au cours de l' élevage larvaire (F (1, 352) = 94,89, p <2,20 x 10 -16 ). Effets Day qui étaient significatifs (F (2, 351) = 3,77, p = 0,024) ont été inclus dans le modèle statistique. En outre, il y avait une forte pression par l' interaction de jour (F (1,704) = 7,15, p = 9,00 x 10 -4), ainsi qu'une nourriture interaction significative entre le jour (F (1,704) = 5,06, p = 7,60 x 10 - 3).

Enfin, il est important de noter que les différences relatives rover-sitter étaient significatives dans les effets jour, la qualité des aliments et la privation de nourriture, mais que les mesures absolues chemin de longueur différente entre les jours et les traitements. Ces résultats non seulement soulignent la robustesse de l'essai de longueur de chemin larvaire, mais aussi l'importance du contrôle des conditions d'élevage, courant chaque souche / traitement des intérêts sur tous les jours de tests, et de l'affacturage dans les effets d'une journée dans les analyses.

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Figure 1. Préparation des bouteilles holding et plaques d' essai. (A) des plaques de raisin pour la ponte des œufs doit être rempli au- dessus du rebord pour former un dôme lisse des médias. L' addition d'une petite quantité de pâte de levure fraîche (B) favorise la ponte des œufs. (C) Plexiglas plaque d'essai avec tranchant dans les puits et épandeur. (D) Fly flacon de culture avec trou découpé dans pour l' alimentation en air. Après le transfert de la population parentale à la bouteille de culture, des plaques de raisin doivent être installés sur l'ouverture avec du ruban adhésif de masquage (E) et les bouteilles doivent être positionnés avec la plaque de raisin au fond (F). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

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Figure 2. Analyse de l' image de alambiqué Traces Chemin de longueur. Chemin des longueurs où les larves ont croisés sur leur propre chemin d' accès doit être séparé manuellement à l'intersection pour générer une seule ligne continue. (A) montre un exemple de trois chemins de longueurs numérisées, avec une flèche rouge au point de la partie supérieure de longueur de chemin intersection. (B) montre le même chemin de longueur édité en ImageJ pour séparer l'intersection. (C) Indique le ImageJ périmètre sortie du trajet de longueur d' intersection, avec une évaluation erronée du périmètre de la trajectoire 1 en raison de l'intersection. (D) Indique le ImageJ périmètre sortie du fichier édité avec l'intersection clivée et l' évaluation correcte du périmètre de longueur de chemin 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3. Fed et privés de nourriture Rover et Sitter larvaires Chemin longueurs larvaire chemin de longueur moyenne (millimètres ± SEM) pour rovers et sitters, ce qui démontre:. (A) Chemin de longueurs Pooled pour l' alimentation des larves privé nourris et 4 heures plus de trois consécutifs jours d'essais, 105 <n <120; (B) de la Fed larvaires chemin longueurs par jour 38 <n <40 par jour; et (C) 4 h alimentaire privé chemin longueurs larvaires par jour, 38 <n <40, par jour. Toutes les larves et les parents ont été élevés sur des aliments faibles en éléments nutritifs à 25 ° C, 60% d'humidité et un 12:12 L: cycle D. Les différences entre les groupes d'essai et / ou de traitements ont été évalués par une analyse de variance (ANOVA) et le test de Tukey pour des comparaisons multiples post-hoc par paires. Pour (A) un facteur de blocage du jour a été ajoutée au modèle. Les lettres représentent des regroupements statistiques; signifie par la même lettre ne sont pas Sígnificativement différents (p <0,05). Fed et FD représentent des conditions privées nourris et 4 h alimentaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Qualité alimentaire et Chemin-longueurs larvaires. Moyennes larvaire chemin de longueur (millimètres ± SEM) pour rovers et sitters, démontrant chemin longueurs de larves cultivées à l' alimentation haute et basse nutriments. Les données regroupées sur trois jours consécutifs de tests avec un facteur de blocage du jour ajouté au modèle statistique, 75 <n <90. Toutes les larves et les parents ont été élevés sur faible ou élevé alimentaire nutritif à 25 ° C, 60% d'humidité et un 12:12 L: cycle D. Les différences entre les groupes et / ou des traitements tests ont été évalués par analyse de variance (ANOVA) et le test de Tukey pour post-hoc pairwise multiplComparaison de e. Les lettres représentent des regroupements statistiques; signifie par la même lettre ne sont pas significativement différentes (p <0,05). Position haute et basse pour une grande nutriment et la faible qualité des aliments en éléments nutritifs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le test de longueur de chemin décrite ici propose une mesure simple et robuste du comportement alimentaire des larves de drosophile. Le protocole suit la méthodologie générale décrite dans Sokolowski 2, mais a depuis été amélioré en ce qui concerne l' efficacité et les contrôles expérimentaux. Au meilleur de notre connaissance, cette méthode est la seule méthode disponible pour la mesure des larves de longueur de chemin. La version originale du protocole 2, 3, 15, 16 larves testé sur des boîtes de Pétri avec une fine couche de pâte de levure appliquée avec un pinceau, puis un verre d' étalement tige de longueur de chemin. Des versions plus récentes du protocole 10, 17 la transition à l' aide de plaques en plexiglas décrites ici. L'utilisation de boîtes de Pétri et le verre épandeur présenté l'avantage d'une très fine couche de levure, ce qui a donné chemin longueurs très longues et exacerbé les différences entre le mobile et sitter phénotypes. L'utilisation de plaques de plexiglas conduit à des longueurs d'ensemble des chemins plus courts, mais rover-sitter différences ont été maintenues et aussi reproductible. Bien que l'utilisation de plaques en plexiglas est beaucoup moins laborieux, les plus longs chemins longueurs obtenus avec la méthode de boîte de Pétri autorisés pour une meilleure séparation des rover et sitter phénotypes, ce qui facilite la cartographie génétique de la différence rover-sitter à la pour le gène 3. L'utilisation de plexiglas plaques d'essai au lieu de boîtes de Pétri, et des analyses informatiques de traces chemin de longueur sont les principales modifications apportées au protocole puisque la méthode a d'abord été mis au point, et ont considérablement augmenté le nombre de larves qui peuvent être testés par une seule personne ainsi que la vitesse des analyses de données. Nous avons également amélioré notre connaissance de plusieurs facteurs expérimentaux et environnementaux qui peuvent influer sur l'issue de l'essai, dont certains sont décrits ci-dessous.

Tout d'abord, ce test mesure des différences individuelles dans le comportement de longueur de chemin sur un substrat de recherche de nourriture (une pâte de levure dans l'eau). d importantsifferences dans cet essai pourraient résulter de défauts dans la locomotion larvaire générale. Ceci peut être contrôlé par concurremment dosage pour le comportement de locomotion larvaire sur des plaques de gélose non nutritives. Si les différences de contrainte sont maintenues sur des plaques d'agar-agar, il est prudent de supposer que les différences trouvées sur un substrat eau de levure ne butinent pas un comportement spécifique. Il a été précédemment montré que tandis que le rover pour l' allèle confère beaucoup plus longs chemin longueurs sur la levure, rovers et sitters ne diffèrent pas en l'absence de nourriture, car ils présentent chemin longueurs similaire longues sur gélose 9. De plus, parce que les larves augmente généralement leur locomotion en l'absence de nourriture, en trouvant que peu ou pas de mouvement sur des plaques d'agar-agar est une indication probable de défauts dans la locomotion. Depuis les défauts de mouvement alimentaires indépendants peuvent agir comme un facteur de confusion lors d' enquêtes sur le comportement alimentaire, le contrôle agar peut réduire les faux positifs dans les écrans génétiques 10. Il est également important de noter que si larvae ont été endommagés avant l'essai, ils pourraient ne pas bouger du tout. , Les larves mortes ou endommagées Immobile peut être distingué des larves saines en observant le mouvement bouche du crochet. Immobile larves sans mouvements de crochet de la bouche doit être jeté.

Deuxièmement, comme avec d'autres comportements, des larves de longueur de chemin peut être affectée par des facteurs environnementaux qui doivent être pris en considération et contrôlée pour en effectuant ce test. Les facteurs environnementaux connus pour affecter de longueur de chemin comprennent la température d'élevage, l'humidité, la qualité des aliments, la densité d'élevage, l'épaisseur de la pâte de levure, des différences aléatoires entre les jours, et le traitement des larves. Le développement larvaire et l' âge au moment du test affectent également de longueur de chemin 11. Comme on le voit sur ​​la Fig. 4, élever des larves dans le bas des aliments de qualité diminue de longueur de chemin. L'utilisation de l'une des recettes de cuisine de mouches décrites dans ce protocole ou d'une autre recette de levure morte qui est équivalent dans son contenu nutritionnel est recommandé. Il est également Suggested afin d'éviter les environnements à fort ou faible densité d'élevage par l'ensemencement des plaques toujours alimentaires avec 100 larves et les espaçant uniformément sur la nourriture. L' élevage des larves à des densités élevées limite la disponibilité des aliments et retarde le développement des larves, ce qui peut entraîner des différences de développement entre les larves au moment du test 12. Conditions de faible densité d' élevage peuvent également influer sur le développement depuis la drosophile larves peuvent former des groupes de recherche de nourriture sociaux pour décomposer les aliments et accroître la recherche de nourriture succès 13. Lorsque les larves avec des mutations qui affectent la taille des larves sont dosés, il peut être nécessaire de tenir compte de ces effets par le calcul de longueur de trajet en fonction de la longueur du corps des larves ou périmètre. Dans tous les cas, il est important de veiller à ce que les larves ne sont pas la transition dans l'étape errant quand ils sont testés. Si les larves se déplacer vers le haut sur le plat couvercle Petri pendant le test, il est probable qu'ils errent et l'expérience doivent être jetés et répétés avec la plus jeunervae.

Un autre facteur important de mentionner est la consistance de la pâte de levure utilisée dans les tests de longueur de chemin, car il affecte la vitesse d'exploration des larves. Larves testé sur une pâte épaisse de levure aura chemin longueurs plus courtes que les larves testées sur une pâte de levure plus aqueuse. En outre, les différences stochastiques entre les jours de test ont également une incidence absolue des scores chemin de longueur. Il est impératif de randomiser l'ordre au cours de laquelle les souches / génotypes sont testés dans les jours et les bloquer entre les jours. Enfin, il faut prendre soin de ne pas insister sur les larves avant le test de longueur de chemin. Deux facteurs de stress qui sont couramment introduits par la manipulation sont la faim et la noyade. Comme on le voit sur ​​la Fig. 3, les larves affamées avant le test diminue de longueur de chemin, et bien que la famine peut être présenté comme une manipulation de l' environnement, son apparition accidentelle doit être évitée. Soulignant les larves doit être évitée en travaillant doucement mais rapidement, limitant ainsi la quantité de temps spent la collecte, le nettoyage et le transfert de larves. Depuis les larves présentent phototaxie négative 14, la lumière intense peut aussi agir comme un facteur de stress et le test doit être fait sous même, l' éclairage diffus. Malgré les multiples facteurs environnementaux qui peuvent modifier la longueur de chemin, il est important de noter que, bien absolues scores chemin de longueur sont sensibles aux conditions environnementales, les différences relatives entre les souches sont maintenues lorsque tous les individus sont traités de manière égale.

Précision, l'efficacité et la robustesse de la quantification sont au cœur des études visant à comprendre les facteurs génétiques et environnementaux qui interviennent dans le comportement. Le larvaire test de longueur de chemin Drosophila offre tous ces avantages en plus d'être à faible coût, à haut débit, et facile à réaliser. En tant que tel, cet essai peut être largement utilisé pour les écrans génétiques pour identifier les voies moléculaires et génétiques associées à des réponses comportementales. En outre, le dosage peut êtrepplied aux essais de toxicité ou écrans pharmacologiques, ou adaptés pour l'enseignement en classe.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 oz fly culture bottles  Fisher Scientific  AS355 
Fly vial plugs Droso-Plugs 59-201
35 x 10 mm Petri dishes  Falcon 351008
100 x 15 mm Petri dishes  Fisher 875712
60 x 15 mm Petri dishes VWR 25384-168 
Dissecting probes Almedic 2325-58-5300 
Yeast Lab Scientific FLY-8040-20F

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References

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