Fouragering Sti-længde Protokol for

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anreiter, I., Vasquez, O. E., Allen, A. M., Sokolowski, M. B. Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (110), e53980, doi:10.3791/53980 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Drosophila melanogaster larvestadiet vejlængde fænotype er en etableret foranstaltning anvendt til at undersøge de genetiske og miljømæssige bidrag til adfærdsmæssig variation. Larvestadiet vejlængde assay blev udviklet til at måle individuelle forskelle i fourageringsadfærd der senere blev bundet til fouragering genet. Larve sti-længde er en let scoret træk, der letter samling af store stikprøvestørrelser, med minimale omkostninger, for genetiske skærme. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den nuværende protokol for larvestadiet vejlængde assay først brugt af Sokolowski. Protokollen beskriver, hvordan man reproducerbart håndterer forsøgsdyr, udføre den adfærdsmæssige assay og analysere data. Et eksempel på hvordan assayet kan anvendes til at måle adfærdsmæssige plasticitet som reaktion på miljøændringer, ved at manipulere fodring miljø før udførelse af assayet, er også tilvejebragt. Endelig passende test design samt miljømæssige faktorer, der kan ændrelarvestadiet vejlængde såsom mad kvalitet, udviklingsmæssige alder og påvirkes diskuteres.

Introduction

Siden opdagelsen af den hvide gen i Thomas Hunt Morgan laboratorium i 1910, har bananfluen, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), blevet anvendt som model for studiet af de molekylære og fysiologiske fundament for forskellige biologiske processer. Populariteten af D. melanogaster stort set stammer fra den betydelige mængde og række genetiske værktøjer. Drosophila lille størrelse i forhold nem håndtering og korte generationstid gør det en ideel model for genetik studier. Lige så vigtigt er Drosophila evne til at demonstrere mange af de fænotyper udtrykt af mere komplekse organismer, herunder pattedyr. Dette omfatter komplekse fænotyper såsom adfærd, der står på grænsefladen mellem organismen og dens omgivelser. Som sådan, adfærdsmæssige undersøgelser bananfluen har bidraget væsentligt til vores forståelse af, hvordan gener og miljø mægle adfærd1.

En af de første undersøgelser af D. melanogaster larver adfærd undersøgt individuelle forskelle i larver Fourageringsstrategier ved at måle sti-længder af larver 2, mens fodring. Sti-længde blev defineret som den samlede distance, som en enkelt larve på gær, inden for en fem minutters periode. Både laboratoriestammer og fluer fra en naturlig population i Toronto varieret i deres fouragering adfærd, og der var en genetisk komponent til individuelle forskelle i sti-længde. To larver fouragering morfer blev beskrevet af de kvantitative sti-længde distributioner og de blev kaldt rover og sitter. Rovers udviser længere sti-længder, mens gennemkører et større område, mens på en fødevare substrat end posering. Ved hjælp af denne sti-længde assay, de Belle et al. 3 kortlagt fouragere (for) gen bag disse individuelle adfærdsmæssige forskelle i forhold til en diskret placering på chromosome- 2 (24A3-24C5). D. melanogaster for genet blev senere klonet 4 og afslørede at være en cGMP afhængig protein kinase 5, en modulator af fysiologi og adfærd i Drosophila og andre organismer 6.

Her skitserer vi den nuværende protokol for larvestadiet vejlængde assay oprindeligt udviklet i Sokolowski 2. Selv om nogle aspekter af analysen har ændret sig gennem årene, konceptet bag designet har ikke. Vi leverer også data til illustrering assayet potentiale til at vurdere genetiske og miljømæssige bidrag til individuelle forskelle i fourageringsadfærd af Drosophila-larver. Larvestadiet vejlængde assay er enkel, effektiv og alligevel robust. En enkelt person kan teste op til 500 larver med lethed i fire timer, og resultater kan opnås med en høj grad af reproducerbarhed. Oprindeligt udviklet til at lokalisere til, det kan anvendes i genetiske skærme, kvantitativ egenskab locus mapping, og i undersøgelseraf gen-for-miljø (GxE) interaktioner. Desuden sin enkelhed og reproducerbarhed gør det en stor ressource for prægraduat undervisning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered Grape Plader og Holding Flasker til Indsamling af Larver

  1. For at gøre holder flasker, skære huller i den ene side af 6 oz flue kultur flasker, store nok til at passe en flue hætteglas stik til lufttilførsel (Fig. 1d).
  2. For at gøre drue plader, forberede 250 ml druesaft medium (1,8% agar, 45% druesaft, 2,5% eddikesyre, 2,5% ethanol) ved kogning af agar, druesaft og det meste af vandet, køle ned til 70 ° C ( røre under afkøling), tilsæt derefter eddikesyre og ethanol og fyld op til stregen med vand.
  3. Brug en sprøjte (uden nål) til at fylde 35 x 10 mm petriskål låg, indtil overfladen af druesaft medium gør en kuppel over læben af låget (fig. 1A).
  4. Store drue plader i et fugtigt og lufttæt beholder ved 4 ºC indtil brug (op til maksimalt 2 uger).

2. Forberedelse af fødevarer plader

  1. Forbered standard flue mad opskrift.
    Bemærk: For at test opdræt fødevarekvalitet virkninger på vejlængde vi bruges lav næringsstof flyve fødevarer: 10% saccharose, 1,3% agar, 0,8% kaliumnatriumtartrat, 0,1% monokaliumphosphat, 0,05% natriumchlorid, 0,05% calciumchlorid, 0,05% magnesiumchlorid, 0,05% ferrisulfat, 5% gær og 0,5% propionsyre i vand; og høj næringsstof flue fødevarer: 1,5% saccharose, 1,4% agar, 3% glucose, 1,5% majsmel og 1% hvedekim, 1% sojamel, 3% melasse, 3,5% gær, 0,5% propionsyre, 0,2% Tegosept og 1 % ethanol i vand. For begge fødevarer autoklaveres løsningen og afkøles til 50 ° C, før du tilføjer den propionsyre, Tegosept og ethanol.
  2. Hæld 40 ml flyve mad i 100 x 15 mm petriskåle.
  3. Store fødevarer plader i et fugtigt og lufttæt beholder ved 4 ºC indtil brug (op til maksimalt 2 uger).

3. Forbered testplader

  1. Forbered 58 x 25 cm, 6 mm tykke sorte plexiglas plader med 10, 1 mm dybe cirkulære brønde, 10 cm i diameter og anbragt i en 2 x 5 dEsign (fig. 1C) for at teste larver på.
    Bemærk: Der kan testes op til 30 larver ad gangen, hvis 3 eller flere af ovennævnte plexiglas plader fås. Alternativt kan larver testes i petriskåle, 10 cm i diameter. Denne indstilling er meget mere besværlig og giver mulighed for lavere antal larver, der skal testes.
  2. Anskaf en sort 39 x 8 cm, 6 mm tykke plexiglas spreder til at sprede gær pasta på plexiglas test plader.
  3. Forbered 100 x 15 mm petriskål låg til optagelse larver sti-længder ved at adskille låg fra bunde på forhånd.

4. Opsætning af Forældrekontrol populationer

  1. Hold opdrætsforhold konstant gennem hele analysen (f.eks 25 ºC, 60% fugtighed og en 12:12 lys: mørke cyklus på standard flue fødevarer).
  2. Hæv forældrenes befolkning i samme opdrætningsvilkårene.
  3. Saml 100 - 150 kvinder og 50 - 75 hanner og alder dem i 5 ± 1 dage for optimal frugtbarhed.
  4. Tillad females og hanner at parre natten over i en 6 ounce flue kultur flaske med standard flue fødevarer.
  5. Transfer flyver ind en bedrift flaske og sikre en drue plade (en lille mængde af frisk gær pasta på den drue pladen vil fremme æglægning,. Figur 1B) over toppen med malertape (. Figur 1E).
  6. Lad flasker stående på hovedet (fig. 1 F), med den drue plade i bunden for at gøre det muligt for voksne at lægge æg på drue plade.
  7. Kassér den første drue plade efter 24 timer og placere en ny drue plade på bedriften flasken. Dette vil være den drue plade, hvorfra larver indsamles den næste dag.
    Bemærk: Drue-plader bliver nødt til at blive ryddet af larver 22 timer efter at blive oprettet, oprettet plader, så de kan blive ryddet tidligt næste dag (. Fx oprettet plade ved 12:00 og klar ved 10 am den næste dag). Det er tilrådeligt at kassere den første drue plade for at undgå æg, hunner kunne have været tilbageholdt og that kunne blive fremført i udvikling.

5. Saml L1 (Første INSTAR) larver fra Grape Plates

  1. Fjern drue plader fra flasker 22 timer efter de blev sat op og sted i en 60 x 15 mm petriskål.
  2. Placer en ny drue plade med frisk gær pasta på bedriften flasken.
  3. Klar og kassér alle larver fra seedede drue plade ved hjælp af en dissekere sonde.
  4. Inkubér ryddet drue plader i 4 timer i standardbetingelser.
  5. Efter 4 timer, pick 100 L1 larver pr stamme fra drue plader og placere på fødevarer plader.
    1. Placer larver på maden forsigtigt (uden at perforere mad og begrave larverne) og undgå fortrængning ved at fordele larverne tværs maden plade.
  6. Inkubér fødevarer plader indtil forsøgsdyr er cirka 10 timer før starten af ​​vandre.
    Bemærk: Ved 25 ºC, 10 timer før vandrer normalt svarer til 72-96 timer efter klækning. Den exact mængde inkubationstiden skal bestemmes, før du starter eksperimentet ved at indsamle et første sæt af larver for hver stamme og registrering af antallet af timer, indtil starten af ​​vandre (vandre larver vil bevæge sig ud af maden på siderne og låget af maden plader).
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan de samme forældre bruges til at indsamle larver i 3 - 4 dages testning ved at gentage trin 4,7-5,5. Skift den rækkefølge, som stammer sat op og testet på tværs af dage for at undgå en test ordre effekt på vej-længde. Test samme "kontrol" stammen / stammer hver dag af test for at kontrollere for dag effekter.
  7. Hvis mange stammer testes, forskyde oprettet og indsamling tidspunkter af larverne at give mulighed for afprøvning af hver stamme på det rette tidspunkt senere.

6. Larver Sti længde Test

  1. Opløs tør-aktive bagegær i vand ved en 1: 2-forhold (vægt til volumen). Den færdige gær Pastaen skal være tyndere end pancake dej, på en måde, ved løft en ske ud af pastaen, det drypper og efterlader bånd på overfladen af ​​pastaen, som hurtigt smelte væk.
    Bemærk: Konsistensen af ​​gæren pasta er vigtig og bør være konstant under hele forsøget. Den nøjagtige gær: vand-forhold kan være nødvendigt at blive justeret afhængig af mærke og batch af gær.
  2. bryde forsigtigt larver af den første stamme, der skal testes fra tallerken ved anvendelse af en pensel.
  3. Indsamle larver i en petriskål og forsigtigt vaske med vand for at fjerne alle fødevarer.
    1. Hurtigt vaske larver med 1 - 2 ml vand og forsigtigt ising larver tør med et laboratorium tørre for at undgå at overføre noget vand, når du placerer larverne på testpladen. For at undgå stress, holde larver fugtigt, men ikke nedsænket i vand.
  4. Arranger tre test plader ved siden af ​​hinanden og sætte en 5 minutters timer for hver test plade.
  5. Påfør gær pasta til toppen af ​​testpladerne og brug sprederen, sprede et tyndt layis af gær pasta på hver testplade, således at alle brøndene har et jævnt lag af gær.
  6. Anbring forsigtigt en larve i midten af ​​hver brønd, starter 5 minutters timer efter placering af første larver på hver plade. Bemærk: Tre plader kan ske ad gangen, hvilket gav en prøvestørrelse på 30 / stamme / testdagen op til i alt 500 larver.
  7. Placer en petriskål låget oven på hver brønd.
  8. Når timeren løber ud, uden at fjerne larverne fra pladen, begynde at spore stien-længder efterladt i gæren ved hjælp af en permanent markør. Trace sti-længder i samme rækkefølge som larver blev placeret på test-plader.
    1. Udfør sporing med samme hastighed som larver blev anbragt på pladerne. For konsistens i senere dataanalyse, bruge den samme markør for alle sti-længder. Permanent markør anbefales.
  9. Gentag trin 6.2 til 6.8.1 for hver stamme, der skal testes. Pluk hver stamme fra maden umiddelbart før testning for at undgå sult virkninger på path-længde.

7. Mad Berøvelse

  1. Hvis larver skal være mad berøvet inden testning, indsamle larver som beskrevet i trin 6.2 til 6.3, men den ønskede mængde af fødevarer afsavn tid tidligere (f.eks. Hvis larver skal mad berøvet i 4 timer, indsamle larver 4 timer før testtid).
  2. Opdel vasket larver i to grupper og placere fødevarer belastet gruppe i en 60 x 15 mm petriskål med 5 ml 1% agar og kontrolgruppen i en petriskål med 5 ml standard fødevarer.
  3. Placer en vægt oven på den inverterede låget af petriskålene (ellers larver er i stand til at kravle ud når de søger efter fødevarer).
  4. Inkuber i den tidligere fastsatte mad afsavn periode og fortsætte med test som beskrevet i trin 6.2 til 6.9.
  5. Hvis mange stammer er der skal testes, forskyde underernæring starttider for at muliggøre afprøvning af hver stamme på det rette tidspunkt.

8. Data Analysis

Bemærk: Dette afsnit beskriver en metode til dataanalyse ved hjælp ImageJ 7 eller Fiji 8 til forarbejdning af sti-længder, selv om der kan bruges anden software.

  1. Brug en lysbord at overføre alle spores sti-længder fra petriskålen låg til hvidt papir (låg kan vaskes med ethanol og genanvendes til yderligere optagelse sti-længde).
  2. Spore en 50 mm lige referencelinje på en af ​​de ark papir.
  3. Scan sti-længder med en opløsning på 300 dpi og gemme som bitmap eller tiff billedfiler.
  4. Åbn billedfilen, vælg "Process" fanen> "Binary"> "Gør binær". Så under fanebladet "Process", vælg "Binary"> "Skeletonize". Dette frembringer en én pixel bredde linje, uanset tykkelse af spor.
  5. Kontroller, at hver sti-længde vises som en kontinuerlig enkelt linje uden delefiltre.
  6. Adskil eventuelle kryds ved hjælp af "Straight line værktøj "og farve linjen hvid (kontinuiteten i stien kan kontrolleres med" Wand "(sporing) værktøj, bør hele stien blive fremhævet gul (fig. 2).
  7. Vælg "Analyse" fanen> Set målinger og vælg "Perimeter" og "Display label".
  8. Vælg "Analyse" fanen> "Indstil skalaen" og vælg "Fjern skala".
  9. På billedet, skal du vælge referencelinjen kun vælge "Analyse" fanen> "Analyse partikler" og vælg "Vis: konturer", "Vis resultaterne" og "Klare resultater bord". Bemærk: Udgangen viser antallet af pixel, der svarer til omfanget linie 50 mm.
  10. Vælg "Analyse" fanen> "Indstil skalaen" og udfyld pixel nummer i "Distance i pixels", og den tilsvarende afstand (50 mm) i "kendte distance".
  11. Endelig skal du vælge alle de sti-længde tegninger af en genotype enta tid, skal du vælge "Analyse" fanen> "Analyse partikler" og vælg "Vis: skitserer", "Vis resultaterne" og "Klare resultater bord".
    1. Fjern eventuelle skriftlige etiketter eller åbenlyse uvedkommende markeringer (de vil blive anerkendt som sti-længder) inden for det valgte område ved at markere området og fylde det hvide.
  12. Visuelt inspicere "Outlines" output-fil for at sikre det påbudt var korrekt konstateret. Outputtet vil vise en sti-længde i mm for hver tegning vejlængde i udvælgelsen. Dette kan nemt eksporteres til et regneark og analyseret med nogen statistisk software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forskelle i sti-længde af rover og sitter for stammer og effekten af underernæring på sti-længde er illustreret i fig. . 3 Data indsamlet over tre på hinanden følgende dage med test viste en signifikant belastning effekt (F (1421) = 351,89, p <2,20 x 10 -16;. Figur 3A), med rovere rejser længere end posering. Ud over den stamme virkning, var der også en signifikant mad behandlingseffekt (F (1, 421) = 461,62, p <2,20 x 10 -16;. Figur 3A), med larver, der blev fødevarer berøvet i fire timer før afprøvning der betydeligt lavere sti-længder end fodret larver. Desuden viste ANOVA en betydelig belastning ved behandling interaktion (F (1423) = 9,78, p = 2 x 10 -3), hvilket betyder rovere og posering reagerede på mad afsavn i forskelligt omfang.

"Fo: holde-together.within-side =" 1 "> Selv om ovenstående data viste også en signifikant effekt af test dag (F (2420) = 7,22, p = 8 x 10 -4, Fig 3B - 3C.) Der var ingen signifikant stamme ved dag interaktion (F (2,846) = 2,32, p = 0,10), hvilket betyder at day påvirket rovere og posering tilsvarende. Alligevel var der en signifikant dag ved behandling interaktion (F (2,420) = 8,07, p = 4,00 x 10 -4), som viser, at effekten af behandlingen varierede tværs dage. opdræt kvaliteten af maden havde også en betydelig effekt på sti-længder (fig. 4). alt i alt sti-længder var længere, når larver af begge stammer blev opdrættet på vores høje næringsstof mad i forhold til lav næringsstof mad (F (1, 352) = 126,38, p <2,20 x 10 -16). Rover-sitter forskelle dog stadig opretholdt trods fødevarekvalitet under larveopdræt (F (1, 352) = 94,89, p <2,20 x 10 -16 ). Day virkninger, som var signifikant (F (2, 351) = 3,77, p = 0,024) blev inkluderet i den statistiske model. Endvidere var der en signifikant stamme ved dag interaktion (F (1,704) = 7,15, p = 9,00 x 10 -4), samt en betydelig fødevarer ved dag interaktion (F (1,704) = 5,06, p = 7,60 x 10 - 3).

Endelig er det vigtigt at bemærke, at de relative rover-sitter forskelle var signifikante på tværs i døgnet, fødevarekvalitet og mad afsavn effekter, men at absolutte sti-længde målinger afveg mellem dag og behandlinger. Disse resultater ikke kun understreger robustheden af ​​larvestadiet vejlængde assay, men også vigtigheden af ​​at kontrollere for opdræt betingelser, kører hver stamme / behandling af renter på hver dag i test, og factoring i dag effekter i analyserne.

1 "src =" / files / ftp_upload / 53.980 / 53980fig1.jpg "/>
Figur 1. Forberedelse af Holding Flasker og Testing Plates. (A) Grape plader til æglægning skal fyldes over kanten til en glat kuppel af medier. Tilsætning af en lille mængde frisk gær pasta (B) fremmer æglægning. (C) Plexiglas test plade med kantet i brønde og sprederen. (D) Fly kultur flaske med hul skåret i for lufttilførslen. Efter overførsel forældrenes befolkning til kulturen flasken, bør drue plader monteres over åbningen med malertape (E) og flasker skal placeres med drue plade i bunden (F). Klik her for at se en større version af dette tal .

g "/>
Figur 2. Billede Analyse af snoede sti-længde Traces. Path-længder hvor larverne har krydset over deres egen vej skal manuelt adskilt ved skæringspunktet for at generere en enkelt kontinuerlig linje. (A) viser et eksempel på tre scannede sti-længder, med en rød pil, der peger på skæringspunktet af den øverste vejlængde. (B) viser den samme vejlængde redigeret i ImageJ at adskille krydset. (C) viser den ImageJ perimeter output af krydsende sti-længde, med fejlagtig vurdering af omkredsen af stien 1 på grund af krydset. (D) Viser ImageJ perimeter produktionen af den redigerede fil med den spaltede kryds og korrekt vurdering af omkredsen af vejlængde 1. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 3. Fed og Fødevarer Berøvet Rover og Sitter larvestadiet Path-længder Mean larver sti-længde (millimeter ± SEM) for rovere og posering, demonstrere:. (A) Poolede sti-længder til fodres og 4 hr mad berøvet larver over tre på hinanden følgende dages testning, 105 <n <120; (B) Fed larver sti-længder ved dag 38 <n <40 per dag; og (C) 4 t mad berøvet larver sti-længder om dagen, 38 <n <40, per dag. Alle larver og forældre blev opdrættet på lav næringsstof mad ved 25 ºC, 60% fugtighed og en 12:12 L: D cyklus. Forskelle mellem testgrupper og / eller behandlinger blev vurderet ved variansanalyse (ANOVA) og Tukey test for post-hoc parvis multiple sammenligninger. For (A) en blokerende faktor på dagen blev tilsat til modellen. Breve repræsenterer statistiske grupperinger; betyder med det samme bogstav er ikke significantly forskellige (p <0,05). Fed og FD står for fed og 4 timers mad berøvet betingelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Fødevarekvalitet og larver Path-længder. Mean larver sti-længde (millimeter ± SEM) for rovere og posering, demonstrerer sti-længder af larver dyrket på høj og lav næringsstof mad. Data, samlet over tre på hinanden følgende dage med test med en blokerende faktor dag føjet til den statistiske model, 75 <n <90. Alle larver og forældre blev opdrættet på lav eller høj næringsstof mad ved 25 ºC, 60% fugtighed og en 00:12 L: D cyklus. Forskelle mellem testgrupper og / eller behandlinger blev vurderet ved variansanalyse (ANOVA) og Tukeys test for post-hoc parvise multiple sammenligning. Breve repræsenterer statistiske grupperinger; betyder med det samme bogstav er ikke signifikant forskellige (p <0,05). Høj og lav bevoksning af høj næringsstof og lav næringsstof fødevarekvalitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stien længde assay skitseret her tilbyder en robust og simpelt mål for fouragering adfærd Drosophila larver. Protokollen følger den generelle metode, der er beskrevet i Sokolowski 2, men er siden blevet forbedret i forhold til effektivitet og eksperimentelle kontrol. Så vidt vi ved denne metode er den eneste tilgængelige metode til måling af larvestadiet vejlængde. Den originale version af stien længde protokol 2, 3, 15, 16 testede larver på petriskåle med et tyndt lag af gær pasta påføres med en pensel, og senere et glas spreder stang. Nyere versioner af protokollen 10, 17 skiftet til at bruge de plexiglas plader, der er beskrevet her. Anvendelsen af ​​petriskåle, og glasspreder præsenterede fordelen af ​​en meget tyndt lag af gær, som gav meget lange sti-længder og forværret forskellene mellem rover og sitter fænotyper. Anvendelsen af ​​plexiglas plader resulterede i samlede kortere vejlængder, men rover-sitter forskelle blev opretholdt og lige så reproducerbar. Selv om anvendelsen af plexiglas plader er langt mindre besværlig, de længere sti-længder opnået med petriskålen metode tilladt for bedre separation af rover og sitter fænotyper, lette den genetiske kortlægning af rover-sitter forskel for for gen 3. Brugen af ​​plexiglas testplader stedet for petriskåle, og beregningsmæssige analyser af sti-længde spor er de store ændringer i protokollen, da metoden blev først udviklet, og i høj grad har øget antallet af larver, der kan testes af en enkelt person samt hastigheden af ​​dataanalyser. Vi har også forbedret vores viden om adskillige forsøg og miljømæssige faktorer, der kan påvirke resultatet af assayet, hvoraf nogle er beskrevet nedenfor.

For det første dette assay måler individuelle forskelle i vejlængde adfærd på en fouragering substrat (en gær-vand paste). Betydelig differences i denne analyse kan medføre fejl i almindelighed larve bevægelse. Dette kan kontrolleres for ved sideløbende analysere for larvernes locomotion adfærd på ikke-nærende agarplader. Hvis opretholdes stamme forskelle på agarplader, er det sikkert at antage, at forskelle findes på en gær-vand substrat ikke fourageringsadfærd specifik. Det er tidligere blevet vist, at mens rover for allelen giver betydeligt længere sti-længder på gær, behøver rovere og posering ikke afvige i mangel af mad, da de udviser tilsvarende lange sti-længder på agar 9. Desuden, på grund larver generelt øge deres bevægelsesevne i fravær af fødevarer, finde lidt eller ingen bevægelse på agarplader sandsynligvis indikerer defekter i bevægelse. Da fødevarebårne uafhængig bevægelse defekter kan fungere som en confounding variabel, når undersøger fourageringsadfærd, kan agar kontrol reducere falske positiver i genetiske skærme 10. Det er også vigtigt at bemærke, at hvis larVAE blev beskadiget før testning, kan de ikke bevæge sig overhovedet. Immobile, døde eller beskadigede larver kan skelnes fra sunde larver ved at observere munden krog bevægelse. Immobile larver uden munden krog bevægelser skal kasseres.

For det andet, som med andre adfærd, larver vejlængde kan påvirkes af miljømæssige faktorer, der skal overvejes og kontrolleret for, når du udfører denne analyse. Miljømæssige faktorer, der vides at påvirke sti-længde omfatter opdræt temperatur, fugtighed, fødevarekvalitet, opdræt tæthed, gær pasta tykkelse, tilfældige forskelle mellem dag og håndtering af larver. Larve udvikling og alder på testtidspunktet påvirker også sti-længde 11. Som vist i fig. 4, hæve larver i lavere fødevarekvalitet nedsætter sti-længde. Det anbefales at bruge en af ​​de flyve mad opskrifter, der er beskrevet i denne protokol eller et andet døde gær opskrift, der er tilsvarende i sin ernæringsmæssige indhold. Det er også suggeplace at undgå høje eller lave tæthed opdræt miljøer ved altid seeding fødevarer plader med 100 larver og afstand dem jævnt ud på maden. Opdræt larver ved høje densiteter begrænser tilgængeligheden af fødevarer og forsinker larveudvikling, hvilket kan resultere i udviklingsmæssige forskelle mellem larver på testtidspunktet 12. Lav tæthed opdrætsforhold kan også påvirke udviklingen siden Drosophila larver kan danne sociale fouragering grupper til at nedbryde fødevarer og øge fouragering succes 13. Når larverne med mutationer, der påvirker larvernes størrelse analyseres, kan det være nødvendigt at tage højde for disse virkninger ved beregning vejlængde som funktion af larvernes kropslængde eller omkreds. I alle tilfælde er det vigtigt at sikre, at larverne har ikke skiftet ind vandrer fase, når de bliver testet. Hvis larver flytte op på petriskålen låg under testen, er det sandsynligt, at de vandrer og forsøget skal kasseres, og gentages med yngre larvae.

En anden faktor værd at nævne er konsistensen af ​​gær pasta bruges i test vejlængde, da det påvirker kravlende hastighed af larver. Larver testet på en tyk gær pasta vil have kortere sti-længder end testet på en mere vandig gær pasta larver. Desuden stokastiske forskelle mellem testdage også påvirke absolutte sti-længde scoringer. Det er bydende nødvendigt at randomisere rækkefølgen, hvor stammer / genotyper testes inden for få dage og til at blokere dem mellem dage. Endelig bør være forsigtig med ikke at understrege larver inden prøvningen sti-længde. To stressfaktorer, der er almindeligt indført gennem håndtering er sult og drukning. Som vist i fig. 3, sultende larver inden testning formindsker sti-længde, og selv om sult kan indføres som en miljømæssig manipulation, bør dets utilsigtet forekomst undgås. Understreger larver bør undgås ved at arbejde forsigtigt, men hurtigt, hvilket begrænser mængden af ​​tid spent indsamling, rengøring, og overførsel larver. Da larver udviser negativ phototaxis 14, kan intens lys også fungere som en stressfaktor, og analysen bør ske under endnu, diffus belysning. Trods de mange miljømæssige faktorer, der kan ændre stien længde, er det vigtigt at bemærke, at selv om absolutte sti-længde score er modtagelige for miljøforhold, er relative forskelle mellem stammer opretholdes, når alle personer behandles ens.

Præcision, effektivitet og robusthed i kvantificering er kernen af ​​undersøgelser med henblik på at forstå de genetiske og miljømæssige faktorer, der medierer adfærd. Drosophila larvestadiet vejlængde assay tilbyder alle disse fordele ud over at være lave omkostninger, høj gennemløb, og let at udføre. Som sådan kan dette assay anvendes bredt til genetiske screeninger til at identificere de molekylære og genetiske pathways associeret med adfærdsmæssige reaktioner. Endvidere kan assayet være etpplied til toksicitet afprøvning eller farmakologiske skærme, eller tilpasset til at undervise i klasseværelset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 oz fly culture bottles  Fisher Scientific  AS355 
Fly vial plugs Droso-Plugs 59-201
35 x 10 mm Petri dishes  Falcon 351008
100 x 15 mm Petri dishes  Fisher 875712
60 x 15 mm Petri dishes VWR 25384-168 
Dissecting probes Almedic 2325-58-5300 
Yeast Lab Scientific FLY-8040-20F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster). Dubnau, J. Cambridge University Press. New York. 173 (2014).
  2. Sokolowski, M. B. Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis. Behav Genet. 10, 291-302 (1980).
  3. de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 123, 157-164 (1989).
  4. Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila. Science. 277, 834-836 (1997).
  5. Kalderon, D., Rubin, G. cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila. J Biol Chem. 264, (18), 10739-10748 (1989).
  6. Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior. Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  9. Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 140, 263-270 (1995).
  10. Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster. J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).
  11. Graf, S. A., Sokolowski, M. B. The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation. J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).
  12. Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time. Genetics. 82, 33-44 (1990).
  13. Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. Dynamics of social behavior in fruit fly larvae. PLoS One. 9, (4), e95495 (2014).
  14. Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae). J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).
  15. de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster. Heredity. 59, 73-83 (1987).
  16. de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster. Genome. 36, 94-101 (1993).
  17. Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection. PNAS. 94, 7373-7377 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics