Automatic Translation

This translation into Danish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

En guide til Structured Illumination TIRF Mikroskopi på High Speed ​​med flere farver

1, 1, 1

1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Cite this Article

    Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J. Vis. Exp. (111), e53988, doi:10.3791/53988 (2016).

    Abstract

    Optisk super-opløsning billeddannelse med struktureret belysning mikroskopi (SIM) er en vigtig teknologi til visualisering af processer på molekylært niveau i den kemiske og biomedicinske videnskaber. Selv om de kommercielle SIM systemer er tilgængelige, systemer, der special designet i laboratoriet kan udkonkurrere kommercielle systemer, sidstnævnte typisk designet til brugervenlighed og applikationer generelle formål, både med hensyn til billedbehandling troskab og hastighed. Denne artikel præsenterer en grundig guide til opbygning af et SIM-system, der bruger total intern refleksion (TIR) ​​belysning og er i stand til billedbehandling på op til 10 Hz i tre farver med en opløsning på 100 nm. På grund af kombinationen af ​​SIM og TIRF, giver systemet bedre image kontrast end konkurrerende teknologier. For at opnå disse specifikationer, er forskellige optiske dele anvendes til at muliggøre automatiseret kontrol over polarisationstilstand og rumlig struktur af belysning lys for alle tilgængelige excitation wavelengths. Fuldstændige oplysninger om hardware gennemførelse og kontrol er givet for at opnå synkronisering mellem excitationslyset mønster generation, bølgelængde, polarisering tilstand, og kamerastyring med vægt på at opnå maksimal erhvervelse billedhastighed. En trin-for-trin-protokollen for systemets tilpasning og kalibrering præsenteres og den opnåelige opløsning forbedring valideres på ideelle prøver. Evnen til video-rate super-opløsning billeddannelse demonstreres med levende celler.

    Introduction

    I løbet af de sidste et halvt årti, har super-opløsning mikroskopi modnet og flyttede fra specialiserede optik laboratorier i hænderne på biologen. Findes Kommercielle mikroskop løsninger til de tre vigtigste varianter for at opnå optisk super-opløsning: enkelt molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM), stimuleret emission udtømning mikroskopi (STED), og struktureret belysning mikroskopi (SIM) 1,2. SMLM såsom fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM) har været de mest populære teknikker, hovedsageligt på grund af enkelheden i den optiske opsætning og løftet om høj rumlig opløsning, let ned til 20 nm. Men super opløsning mikroskopi via enkelt molekyle lokalisering kommer med en indre afvejning: den rumlige opløsning opnåelige afhænger akkumulere et tilstrækkeligt antal individuelle fluoroforen lokaliseringer, således begrænser den tidsmæssige opløsning. Imaging dynamisk proceses i levende celler bliver derfor problematisk, da en tilstrækkeligt må prøve bevægelsen af ​​strukturen af ​​interesse at forhindre bevægelsesartefakter samtidig erhverve nok localization begivenheder i denne tid at rekonstruere et billede. For at opfylde disse krav, har levende celle SMLM demonstrationer opnået den ønskede stigning i fluorophor photoswitching satser ved at forøge excitation magt, og dette fører igen til fototoksicitet og oxidativ stress, og derved prøve overlevelsestid og biologisk relevans tre begrænsende.

    En klar fordel ved STED over både SIM og SMLM er, at det kan billede med super-opløsning i tykke prøver, f.eks lateral opløsning på omkring 60 nm blev opnået i organotypiske hjernen skiver på dybder op til 120 um 4. Imaging på sådanne dybder med enkelt objektive implementeringer af SMLM eller SIM er urealistisk, men bliver muligt med enten enkelt-molekyle lys ark eller gitter lys ark microscopy fem. Video-rate STED er også blevet påvist, og bruges til at kortlægge synaptisk vesikel mobilitet, selv om dette har hidtil været begrænset til billeddannelse små synsfelter 6.

    Til anvendelser i cellebiologi og molekylær selvsamlende reaktioner 7 - 12, der kræver billeddannelse med høj tidsmæssig opløsning over mange tidspunkter, struktureret belysning mikroskopi (SIM) kan være velegnet, da det ikke er afhængig af de fotofysiske egenskaber af en bestemt fluorescerende probe. På trods af denne iboende fordel af SIM, indtil nu sin anvendelse er begrænset sig til at billeddannelse faste celler eller langsomme processer. Dette skyldes begrænsningerne ved kommercielt tilgængelige SIM-systemer: erhvervelse billedhastighed på disse instrumenter var begrænset af rotationshastigheden af ​​ristene anvendes til at generere de nødvendige sinusformede belysningsmønstre samt polarisationsbevarende optik. Den nyeste generation af kommercielle SIMinstrumenter er i stand til hurtige billedbehandling, men de er uoverkommeligt dyre for alle, men centrale billeddiagnostiske faciliteter.

    Denne protokol viser en guide til konstruktionen af ​​et fleksibelt SIM-system til billeddannelse af hurtige processer i tynde prøver og nær den basale overflade af levende celler. Den beskæftiger indre refleksion totale fluorescens (TIRF) til at generere et belysningsmønster som trænger ikke dybere end ca. 150 nm i prøven 13, som kraftigt reducerer ude af fokus baggrundssignal. Ideen med at kombinere SIM med TIRF er næsten lige så gammel som SIM selv 14, men blev ikke realiseret eksperimentelt før 2006 15. Den første in vivo billeder opnås med TIRF-SIM blev rapporteret i 2009 16 opnår frame rates på 11 Hz til visualisere tubulin og kinesin dynamik, og to farve TIRF-SIM-systemer er blevet præsenteret 17,18. Senest en vejledning til konstruktion og brug af en enkelt farve to-beam SIM system blev præsenteret med frame-hastigheder på op til 18 Hz 19,20.

    Opsætningen præsenteres her er i stand til SIM super-opløsning billeddannelse ved 20 Hz i tre farver, hvoraf to kan betjenes i TIRF-SIM. Hele systemet er bygget op omkring et omvendt mikroskop ramme og bruger en motoriseret XY oversættelse scenen med en piezo-aktiverede z fase. For at generere de sinusformede excitations- mønstre kræves for TIRF-SIM, systemet præsenteret bruger en ferroelektrisk rumlig lysmodulator (SLM). Binære rivning mønstre vises på SLM og de resulterende ± 1 diffraktion ordrer filtreres, videreformidles og fokuseret ind TIR ring af objektivlinsen. De nødvendige faseskift og rotationer af ristene anvendes ved at ændre det viste SLM billedet. Denne protokol beskriver, hvordan man opbygger og tilpasse sådan en excitation sti, detaljer tilpasningen af ​​emissionen stien, og præsenterer prøveemner for at sikre optimal tilpasning. Det er også de skriftkloge de spørgsmål og udfordringer særegne for høj hastighed TIRF-SIM vedrørende polarisering kontrol og synkronisering af komponenter.

    Design Overvejelser og begrænsninger

    Før montering af TIRF-SIM-system præsenteres i denne protokol, er der flere design begrænsninger at overveje, der bestemmer valget af optiske komponenter. Alle forkortelser af optiske komponenter refererer til figur 1.

    Spatial Light Modulator (SLM)

    En binær ferroelektrisk SLM anvendes i denne opsætning, som det er i stand til sub-millisekund mønster switching. Gråtone nematiske SLM'er kan anvendes, men disse tilbud stærkt reduceret skiftetider. Hver til eller fra pixel i et binært fase SLM vil bibringe enten en π eller 0 faseforskydning til hændelsen plan bølgefront, derfor hvis en periodisk gittermønster vises på SLM den vil fungere som en fase diffraktionsgitter.

    ent "> total intern refleksion (TIR)

    For at opnå TIR og frembringe et kortvarigt felt, skal indfaldsvinklen Ekscitations- bjælker på glas-prøve-grænsefladen være større end den kritiske vinkel ligning . Dette sætter minimum indfaldsvinklen krævet, og dermed også den maksimale afstand, eller periode, af den kortvarige belysningsmønster. Den maksimale indfaldsvinkel ligning (Accept vinkel) er begrænset af den numeriske apertur (NA) i objektivlinsen som kan beregnes fra definitionen ligning . Dette bestemmer den mindste mønster afstand opnåelige i henhold til Abbe formel ligning der forbinder NA og bølgelængde ligning til et minimum mønster afstand (dvs.. TIR ring), og hvor de to excitation foci skal placeres nøjagtigt og præcist roteres til at generere hver belysningsmønster.

    Genopbygning af TIRF-SIM-billeder kræver erhvervelse af mindst tre faseskift pr mønster rotation derfor mønstret periode SLM skal være deleligt med 3 (se figur 1). For eksempel, en periode på 9 pixels for 488 nm belysning og 12 pixels for 640 nm belysning. For en omfattende diskussion af SLM mønster design, herunder sub-pixel optimering af mønster afstand ved hjælp af klippede risteSe tidligere arbejde af Kner et al. 16 og Lu-Walther et al. 20 Positionen af to excitation foci skal være inde i TIR ring for alle bølgelængder, men diffraktion vinkel ± 1 ordrer fra SLM er bølgelængden afhængig. For standard SIM, kan flerfarvet imaging opnås ved at optimere rist periode for den længste bølgelængde, og tolerere et tab i ydeevne til de kortere kanaler. For TIRF-SIM dog optimere for én bølgelængde betyder, at den anden bølgelængde foci ikke længere inden for TIR ring. For eksempel ved anvendelse af en rist periode på 9 pixels er tilstrækkelig til at tilvejebringe TIRF for 488 nm som de foci er ved 95% af diameteren af ​​ryggen blænde og inden TIR ring, men for 640 nm denne periode ville placere foci udenfor åbningen. Derfor forskellige pixel mønster afstande skal anvendes for hver excitationsbølgelængde.

    Tilpasningen af ​​TIRF-SIM excitation stier yderst følsomt over for små ændringer i positionen af den dikroiske spejl (DM4 i figur 1) i mikroskopstativet, langt højere grad end i konventionelle SIM. Anvendelse af et roterende filter terning tårn anbefales ikke, i stedet bruge en enkelt, multi-band dichroic spejl, som holdes i en fast position og designet specielt til de excitationsbølgelængder brugt. Det er vigtigt, at kun den højeste kvalitet dikroiske spejle anvendes. Disse kræver tykke underlag på mindst 3 mm, og er ofte betegnes som "imaging flad" af fabrikanterne. Alle andre substrater føre til utålelige aberration og image nedbrydning i TIRF-SIM.

    Polarisering Kontrol

    For at opnå TIRF-SIM er det vigtigt at rotere polarisationstilstand af excitationslyset synkront med belysningen mønster, således at det forbliver azimutalt polariseret i den objektive elev plan i forhold til den optiske akse (dvs.. s-polariseret). Opretning af polarisering kontrol optik vil afhænge af den specifikke optiske element anvendes, for eksempel en Pockets celle 21, eller en halv bølge plade i en motoriseret rotation stadium 22. I denne protokol bruges en brugerdefineret flydende krystal variabel retarder (LCVR), designet til at give fuld bølge (2π) retardance over bølgelængdeområdet 488-640 nm, da det giver mulighed for hurtig (~ ms) skift. Hvis der anvendes et flydende krystal retarder er det essentielt at anvende en høj komponent kvalitet: standard komponenter er typisk ikke er stabile nok til at give en konstant retardance over længden af ​​kameraets eksponeringstid, som fører til en udviskning af belysningen mønster og lav kontrast modulation . Flydende krystal retardere er også stærkt temperaturafhængige og kræver indbygget temperaturstyring.

    Synkronisering

    Laserne skal synkroniseres med SLM. Binære ferroelektriske SLM'er internt afbalanceret switching mellem en på stat og slukket tilstand. De pixels kun fungere som en halv bølge plader i enten deres tændt eller slukket tilstand, men ikke under interframe skifte tid. Derfor bør kun tændt lasere på under on / off stater via LED Aktiver signalet fra SLM at forhindre en reduktion i mønster kontrast på grund af den mellemliggende tilstand af pixels. En akustisk-optisk modulator (AOM) kunne alternativt anvendes som en hurtig lukker, hvis laserne ikke kan digitalt moduleret.

    Valg af objektiver

    Baseret på disse begrænsninger, at den krævede demagnification af SLM plan på prøveplanet de ønskede belysningsmønstre kan bestemmes. Dette tillader beregning af brændvidder for de to linser L3 og L4 i billedet relay teleskopet og excitation kondensatorlinse L5. I dette system en 100X / 1.49NA immersionsolie objektiv bruges med 488 nm og 640 nm excitation, dermed bruger brændvidder på 300 og 140 mmfor L4 og L3, og 300 mm for L5, hvilket giver en samlet demagnification af 357X, svarende til en SLM pixel størrelse på 38 nm ved prøven flyet. Brug af denne kombination af linser, SLM rivning perioder af 9 for 488 nm belysning og 12 pixels for 640 nm giver mønster afstande på 172 og 229 nm mod prøven, svarende til indfaldsvinkler på 70 ° og 67 ° henholdsvis. For et glas-vand-grænsefladen, den kritiske vinkel er 61 °, og er uafhængig af bølgelængden, hvorfor disse to mønster afstande tillader TIRF excitation for begge bølgelængder. En objektivlinse udstyret med en korrektion krave er nyttig til korrektion af sfæriske aberrationer indført ved variationer i dækglasset tykkelse, eller hvis den arbejder ved 37 ° C.

    Billede Genopbygning

    Når rå SIM data er blevet erhvervet det er et spørgsmål om beregningsmæssige indsats for at generere super-løst billeder i en to-trins proces. For det første belysningsmønster skal bestemmes forhvert billede og for det andet, skal delene af SIM-spektret adskilles og rekombineret hensigtsmæssigt som at fordoble den effektive OTF støtte (se figur 6, sten indlæg).

    Præcis viden om de forventede belysningsmønstre er altafgørende, da de super-løst frekvens komponenter skal være ublandet så præcist som muligt for at undgå artefakter forårsaget af de resterende dele af overlappende komponenter. Vi bestemme belysning mønster parametre efterfølgende fra den rå billeddata efter proceduren indført ved Gustafsson et al. 23. Kort sagt, et sæt af belysning parametre, der beskriver en normaliseret todimensional sinuskurve har skal findes for hver af de ligning excitation mønstre ligning :

    ligning

    Herved ligning og ligning beskrive frynser kontrast og mønstret indledende fase af hvert enkelt billede m hhv. Komponenterne i den bølge vektor, ligning og ligning Kun ændre sig med forskellige orienteringer ligning på det mønster og dåsen antages at være ellers konstant. Til groft bestemme komponenterne i bølgevektoren en krydskorrelation af rå billede spektre er udført, som raffineres ved anvendelse subpixel skift til et af de tværgående korrelerede billeder som at optimere overlap. Dette gøres via mangedobling af real-space fase gradienter ligning at inducere en subpixel skift i frefrekvens-space. Bemærk at det er nyttigt at have et godt skøn over den bølge-vektorer forud for den faktiske mønster estimation og dette kan findes ved at afbilde en fluorescerende vulst lag.

    Som fase trin mellem flyttet mønstre er ligning , Dvs.. ligning Adskillelsen af ​​frekvens komponenter kan udføres af en Fourier transformation langs "fase akse". Den globale fase ligning og yderkant kontrast ligning kan derefter bestemmes under anvendelse af komplekse lineær regression af forskellige komponenter. De individuelle adskilte komponenter kombineres derefter under anvendelse af en generaliseret Wiener filter. For en detaljeret beskrivelse af både parameter udvinding og gennemførelse af generaliseret Wiener filter henviser vi læseren til Gustafssonet al. 23, hvor der anvendes den samme algoritme.

    Protocol

    1. Formidling og Justering af Excitation Path

    1. Marker placeringen af de komponenter på det optiske tabellen (se figur 1 for en oversigt over den optiske setup). Adskil det mål, linser L3, L4, L5, og SLM hver med summen af ​​deres respektive brændvidder, således at den SLM overflade kan videresendes på brændplanet af målet.
    2. Indsæt flere kant dichroic spejl DM4 i filteret terning tårn af mikroskopet rammen.
    3. Sæt den anden dichroic spejl DM3 i en 1 "firkant kinetisk spejl mount, og placere det et brændvidde væk fra kondensatoren linsen L5.
      Bemærk: Denne excitation sti design indeholder to identiske dichroic spejle DM3 og DM4 som er taget fra samme produktionsbatch at sikre identiske optiske egenskaber. Det dikroiske spejl (DM4) er placeret således, at de S- og P- akser er skiftet i forhold til det dikroiske placeret i mikroskop (DM3) derved annullere ethvertpolarisering ellipticitet indført ved dets dobbeltbrydning (figur 1). Denne kompensation fungerer lige godt for hver belysningsbølgelængde. Dette trin er afgørende for at opretholde høj graduering kontrast.
    4. Inden du tilslutter linser excitation sti, præcist definere den optiske akse for systemet.
      1. Fjern objektivlinsen (OB) fra tårnet og i stedet skrue i et justeringsværktøj. Denne består af en 500 mm lang optisk bur med to alignment diske i begge ender.
      2. Brug det dikroiske spejl DM3 og en midlertidig tilpasning spejl placeret ved den omtrentlige senere placering af SLM at styre en kollimeret referencestråle fra laser 1 gennem centrum af hullerne i de to alignment diske. Direkte strålen fra laser 1 til midlertidig spejl som vist i figur 1 under anvendelse af tre spejle og dikroisk spejl DM2. Den midlertidige spejlet i det SLM position skal være tæt på vinkelret på den optiske akse.
      3. Fjern justeringsværktøjet når den grove optiske akse har været determined.Insert en iris strålegangen ind før den kommer ind i mikroskopi krop og centrere det på bjælken. Vedhæft et stykke hvidt kort med et lille hul centreret om iris.Reinsert objektivlinsen (OB).
        Bemærk: Bjælken forlader mål vil nu være meget forskellige, men der vil være en meget svag refleksion fra den bageste overflade af linsen, der vil være synlig på det hvide kort. Alle linser, selv om de er antireflekterende overtrukket, vil have svage ryg refleksioner, der kan bruges til at sikre koaksialt på linie. Hvis strålen er nøjagtigt vinkelret på linsen derefter tilbage refleksion vil gå tilbage gennem centrum af iris
      4. Foretag iterative kantede justeringer af to spejle (DM3 og tilpasning spejl på SLM position) for at centrere ryggen refleksion overkortet med den indkommende stråle. Midlertidigt fjerne objektivlinsen (OB) og markere laser plet på loftet for at skabe en reference position.
      5. Sæt et par iris på højden af ​​referencestrålen langs de gevindskårne huller i tabellen. Strålen skal være parallel med overfladen af ​​den optiske tabel. Den optiske akse er nu defineret.
    5. Sæt kondensatoren linsen (L5) ca. en brændvidde væk fra målet. Montere denne linse på en lineær forskydningstrin sæt overføres langs retningen af ​​referencestrålen.
    6. Juster samlelinse position og vinkel, at strålen forlader målet er kollimeret og rammer henvisning plet på loftet. Kontroller, at objektivet er vinkelret på strålen ved igen at kontrollere tilbage refleksion med iris og hvidt kort. Fjern objektivlinsen (OB) og sæt den anden linse af billedet relæet teleskop (L4).
      Bemærk: Sikring ordentlig kollimering og ikke-afbøjning af væream er gjort lettere, når der er et lige antal linser i strålevejen.
    7. Juster positionen og vinklen af ​​denne linse under anvendelse af en lineær translation fase at opretholde kollimering og sikre referencestrålen stadig rammer afmærket sted på loftet.
    8. Udskift objektivlinsen (OB) og sæt den første linse af teleskopet (L3). Juster positionen og vinklen af ​​denne linse for at sikre kollimering og ikke-deformation, som beskrevet i tidligere trin.
    9. Monter SLM chip på en kardan mount som tilvejebringer rotation uden oversættelse omkring midten af ​​chip overfladen.
      Bemærk: Den specifikke montering design afhænger af SLM anvendes. Hvis SLM er leveret uden mount, bør det være fikseret til en brugerdefineret bearbejdet aluminiumsplade som derefter fastgjort til en linse slingrebøjle mount.
    10. Med linserne rettet ind, indsætte SLM i stedet for spejlet. Justere placeringen af ​​SLM, således at referencestrålen er placeret i midten af ​​SLM chip, og justere enGLE sådan, at strålen passerer gennem de to relay linser (L3 og L4). Kontroller at referencestrålen stadig er centreret på afmærket sted.
    11. Udvid og kollimering referencestrålen ved hjælp af en Kepler stråle expander.
      1. Monter de to linser (L1 og L2) i et bur for nem justering.
      2. Centre buret systemet på referencestrålen ved at fjerne linserne og erstatte dem med iris.
      3. Indsæt de to linser og justere den aksiale position af L2 at kollimere ekspanderede stråle under anvendelse af en klipning interferometer. L2 bør være en brændvidde væk fra overfladen af ​​SLM.
      4. Kontroller, at den udvidede stråle stadig kollimeret efter de to relæ linser L3 og L4. Brug klipning interferometeret lige efter DM3 at kontrollere for kollimering.
    12. Når excitation stien er blevet tilpasset til en enkelt bølgelængde, par de to andre lasere strålegangen ind. Steer hver bjælke gennem to iris centreret om excitation kurve medde strålesamlende dikroiske spejle (DM1 og DM2).

    2. Tilpasning af polarisation Rotator

    1. Monter LCVR med sin hurtige akse ved 45 ° til den indfaldende polarisation.
    2. Finjustering polarisering vinkel på strålen hændelsen til LCVR anvendelse af en akromatisk halv bølge plade (HWP) ved at indsætte HWP og LCVR mellem krydsede polarisatorer. Drej HWP at minimere den transmitterede effekt.
      Bemærk: For at kunne fungere som en variabel polarisering rotator, skal den hurtige akse flydende krystal retarder (LCVR) præcist rettet ind ved 45 ° til indfaldende lodret stråle polarisering. LCVR er fysisk monteret ved 45 °, men dette er kun en grov opretning. HWP bruges til at sikre opretning perfekt 45 ° af den indfaldende polarisation i forhold til LCVR hurtigt akse. Kvartbølgepladen (QWP) omdanner den vippede elliptisk polarisation induceret af LCVR tilbage til lineær polarisation i en vinkel der kontrolleres af den påtrykte spænding24.
    3. Sæt QWP efter LCVR og drej den til at tilpasse sin langsomme akse til den indkommende polarisering ved at minimere den transmitterede magten mellem krydsede polarisatorer.

    3. Tilpasning af Emission Path

    1. Groft placere kameraet ved hjælp af en scene mikrometer dias og transmitteret lys.
      1. Fokus på reticle ved hjælp af mikroskop okularer og løse objektivet på denne position.
      2. Groft centrere kameraet og bevæge kameraet position for at bringe billedet af sigtemiddel i fokus ved at observere billedet på skærmen.
        Bemærk: Hvis der anvendes en ekstern filterhjul derefter filteret terning vil ikke indeholde en emission filter, derfor okularerne må ikke anvendes, når lasere er tændt.
    2. Finjustere kameraet position ved hjælp af en fluorescerende vulst prøve.
      1. Forbered et monolag af fluorescerende kugler ved at sprede en dråbe 100 nm flerfarvet perler på en # 1.5 dækglas. Lad dry for at adsorbere perlerne til dækglasset og derefter igen nedsænkes i vand.
      2. Placer perlen prøve på målet med fordybelse olie. Finjustere placeringen af ​​kameraet, således at den fluorescerende vulst lag er i fokus. Juster ikke objektiv holdning, når der er fundet i fokus.
        Bemærk: Som SLM skal være i et plan konjugat til prøveplanet, positionen af ​​SLM, relæ linser, og målet må være fast. For at justere fokus, flytte prøven aksialt i stedet for det mål ved hjælp af en piezo z-scenen.
    3. Generer de relevante SIM binære rist mønstre som bitmap-filer.
      1. For 2D / TIRF-SIM, generere en serie af 9 binære rist billeder: 3 mønster orienteringer hver med 3 jævnt fordelte faseskift. Generere disse numerisk (ved hjælp af MATLAB for eksempel) fra en roteret 2D sinusoid med en faseforskydning påført, derefter tærsklingsrutine at frembringe et binært billede. Se Supplerende Kode filer for eksempel kode.
      2. For alignment formål, også generere rivning mønstre der er windowed af en lille cirkulær åbning for hver af de 3 retninger, som vist i figur 2. De vinduesbehandlede alignment riste behøver ikke at være eksternt udløst, men kan skiftes manuelt af brugeren via SLM software.
        Bemærk: Se referencer for en diskussion af de optimale rotation vinkler og et eksempel på rist mønster generation kode 16,20.
    4. Upload bitmapbilleder til SLM efter fabrikantens software (f.eks MetroCon).
      1. Læg SLM kontrol software og klik på "Connect".
      2. I "Repertoire" fanen, klik på "Load" for at åbne repertoire filen og kontrollere antallet af Running Ordrer indeholdt i filen. I eksemplet repertoire fil givet er der fem Running ordrer.
      3. Klik på "Send til board" for at uploade repertoiret fil til SLM.
      4. Vent til bitmapbilleder at uploade etnd for enheden til automatisk at genstarte.
        Bemærk: Et eksempel repertoire fil, der indeholder rivning bitmap billeder og en fil der definerer rækkefølgen, indgår som en supplerende kode fil. Den ".repz" fil kan åbnes ved hjælp af ZIP-fil Archiver software.
    5. Vis en windowed tilpasning gitter på SLM for første orientering (f.eks 0 °).
      1. I SLM kontrol software, skal du vælge fanen "Status", indtast nummeret på den Running Order (i tilfældet med eksemplet fil, det er Running Order "1").
      2. Klik på "Vælg" for at ændre Running Order til tilpasningen rist.
        Bemærk: Dette vil belyse en lille cirkulært område i prøveplanet. Hvis SLM overflade er korrekt konjugeret til prøveplanet derefter kanterne af denne region vil være skarpt i fokus. Gitteret mønster vil producere flere diffraktion ordrer fokus L3: refleksion nul ordre fra den reflekterende backplane afSLM, -1 og +1 ordrer svarende til risten, og også svagere højere ordrer, der opstår fra diffraktion af interne elementer specifikke for SLM enhed (f.eks. Refleksioner af de interne ledningsnet i SLM pixels og uregelmæssigheder ved de pixel kanter) . Alle men -1 og +1 ordrer skal filtreres ud.
    6. Indsæt en rumlig maske (SM) monteret i en x, y fase strålegangen ved den fokale position L3 ind, og oversætte sin position i forhold til den optiske akse, således at kun de ønskede første ordrer passeres. Direkte efter det rumlige filter, vil kun to cirkulære stråler være synlige.
      Bemærk: Den rumlige maske er fremstillet ved udstansning 6 huller i aluminiumsfolie hjælp af en nål. Hullerne skal være store nok til at passere den første ordre bjælker for alle laserbølgelængder. En detaljeret analyse af den rumlige maske findes i reference 20.
    7. Vis næste orientering af tilpasningen rist (60 °, køreklar 2) og igensikre, at kun de første ordrer er Lad gennem den rumlige maske, justere dens position, hvis det kræves.
    8. Gentag for den endelige orientering (120 °, køreklar 3).
    9. Kontroller billedet af det fluorescerende vulst lag på kameraet. Hvis de to cirkulære stråler er ikke overlappende som afbildet i figur 2 derefter repositionere prøveplanet ved en iterativ justering objektivlinsen og kameraposition.
    10. Juster objektive position til at overlappe de to stråler, som vil bringe billedet ude af fokus. Flyt kameraet for at bringe billedet tilbage i fokus og finjustere målet i tilfælde to cirkler er stadig synlige. Gentag denne proces, indtil de to stråler overlapper hinanden, og et enkelt cirkulært område er i fokus.
    11. Når positionen af ​​prøveplanet er indstillet, holde målet bestemt stilling.
    12. At bekræfte TIRF belysning, billede en opløsning af fluorescerende farvestof, for eksempel til et 488 nm excitationsbølgelængde, anvendes en opløsning af 1081; M rhodamin 6G.
      1. Bringe farvestoffet prøven i fokus. Hvis de to stråler er indfaldende på den korrekte TIRF vinkel derpå enkelte molekyler vil være synlig uden høj baggrund, og kanterne af den cirkulære åbning vil være i fokus. Se figur 2B-D for eksempler på justeret og misvisende TIRF bjælker.
      2. Vise hver orientering af vinduesbehandlede riste på skift og sikre, at alle tre retninger giver TIRF belysning og at de to stråler overlapper på prøveplanet. Fin justeringer af positionen af ​​bjælkerne kan gøres ved at justere dichroic spejl DM3.
        Bemærk: Selvom forskellige bølgelængder er fokuseret på lidt forskellige positioner som følge af aksial kromatisk aberration, er dette ikke kritisk og kan korrigeres ved at anvende en konstant z-offset til prøven stilling før excitation med den anden bølgelængde.

    4. System Synkronisering og kalibrering

    1. Placer vulsten monolag srigelig på målsætningen og sætter fokus.
    2. Programmere SLM bruge sin kontrol software til at vise hver af de 3 faseforskydningsenheder billeder i igen, for det første mønster orientering (0 °).
      1. Brug af SLM kontrol software, skifte til Running Order 4 i eksempel repertoire.
      2. Konfiguration af kameraet ved hjælp af sin erhvervelse software (f.eks HCImage) til output to signaler: en positiv og en negativ TTL trigger signal i perioden globale eksponering. I kameraets software, under "Advanced Camera Properties", sæt Output Trigger Kind 1 og 2 til "Exposure", og Output Trigger polaritet 1 og 2 til "positiv" og "negativ" hhv.
      3. Forbind Output 1 og 2 i kameraet til "Trigger" og "Finish" indgange på SLM henholdsvis bruger koaksialkabler. SLM er nu synkroniseret til kameraet.
    3. Erhverve en serie på 3 billeder.
      1. I "Sequence" rude, vælg &# 34; Harddisk Record "som scanningen type, og sæt rammen tæller til tre.
      2. Klik på "Start" for at erhverve 3 rammer. SLM mønster vil ændre sig ved hver eksponering. De fluorescerende perler i billedet vil synes at blinke til og fra mellem hver af de 3 billeder. Mængden af ​​blinkende er en skrivebeskyttet ud af modulationen kontrasten i sinusformet belysningsmønster.
    4. Roter polariseringen af ​​excitation laser med LCVR hjælp brugerdefineret software for at opnå azimut polarisering og dermed den højeste graduering kontrast til den givne mønster orientering.
      1. Læg LCVR kalibrering software.
      2. Indtast 0 og 8 for minimum og maksimum spænding hhv.
      3. Klik på "Sweep LCVR Spænding" at dreje polariseringen.
        Bemærk: LCVR retardance er en funktion af temperatur og kan drive dag-til-dag selv med temperaturkontrol. I dette trin er optimal azimut polarisering fundet empirisk ved Sweeping den påtrykte spænding mellem dens minimum og maksimum spænding, der har den virkning at dreje polarisationen indfaldende på prøven. Gradueringen kontrast beregnes for hver spænding 25 og den spænding, der opnår peak kontrast anvendes i de følgende trin.
      4. Vent kalibreringsprocessen at fuldføre, og notere den målte spænding.
    5. Gentag denne kalibreringen for de resterende to mønster orienteringer (60 ° og 120 °) og hver af de excitationsbølgelængder.
    6. Synkroniser kameraets eksponering med LCVR, lasere, emission filter hjul og piezo z-stadie 26. For at opnå dette, skal du bruge en høj hastighed dataopsamling (DAQ) bord som master clock kilde for systemet, og bruge SLM s LED Aktiver udgangssignal at modulere lasere (se figur 3B).
      Bemærk: Den specifikke implementering er afhængig af de anvendte komponenter, men brugen af ​​en højhastigheds DAQ board for digital trigger synkronisering og kontrol af LCVR anvende en analog spænding, styres via software, anbefales. Styringen software, der anvendes i denne protokol er til rådighed efter anmodning.
    7. På grund af aksial kromatisk aberration, for hver bølgelængde, gælder også en z-offset til prøveholderen.
      1. Bestemme korrekturen eksperimentelt ved at fokusere på et monolag prøve flerfarvet perle ved den første bølgelængde (f.eks. 488 nm) og derefter skifte til den anden (f.eks. 640 nm). Perlerne vil nu være ude af fokus.
      2. Koncentrere perlerne og måle ændringen i z position, der var nødvendigt. Denne forskydning kan derefter påføres på det piezo z-fase hver gang excitationsbølgelængden ændres.
    8. Brug af SLM kontrol software, skifte SLM Running Order til den fulde serie af 9 binære rist billeder, der kræves for TIRF-SIM. Dette er Running Order 0 i eksemplet repertoire.
    9. Brug af kameraet kontrol software, erhverve 9 billeder af perlen prøven. I "Sequence" rude af kameraets software, skal du vælge "Hard Disk Record" som scanningen type, og ændre rammens tæller til 9.
    10. Klik på "Start" for at hente billeder.
    11. Gem de erhvervede billeder som TIFF-filer ved at vælge "TIFF" som billedtype i "Save buffered Images" vinduet, og klikke på OK.
  • Rekonstruere en super-opløsning billede fra de rå TIFF-billeder ved hjælp af kommerciel eller brugerdefinerede software til at validere forbedring i opløsning i forhold til standard TIRF.
    Bemærk: Til vores mikroskop bruger vi brugerdefinerede genopbygning kode udvikles både internt og af Dr. Lin Shao 27.
  • Representative Results

    Flerfarvet 100 nm diameter fluorescerende kugler blev afbildet for at sammenligne standard TIRF til TIRF-SIM og kvantificere opnåelige forbedring i lateral opløsning (figur 4A - B). Rekonstruktion af rå frames i super-opløsning blev udført ved anvendelse af standard algoritmer som skitseret i litteraturen 27,28. Det kan ses, at TIRF-SIM klart har betydeligt højere lateral opløsning sammenlignet med TIRF. Den punktspredningsfunktionen (PSF) i et mikroskop er godt tilnærmet ved billedet af en enkelt sub-diffraktion størrelse fluorescerende perle, derfor PSF og resolutionen kan kvantificeres ved at montere 2D Gauss-funktioner til individuelle perler til hver bølgelængde. Den anslåede opløsning af mikroskopet er baseret på middelværdien af den fulde bredde halv maksimum (FWHM) er 89 nm og 116 nm for 488 og 640 nm TIRF-SIM (figur 4C). Dette svarer til en dobbelt improvement i lateral opløsning for begge bølgelængder i forhold til den teoretiske diffraktion begrænset sag. Fluorescensmærkede amyloide fibriller er også en glimrende test prøve for at demonstrere fordoblet opløsning (figur 4D). Amyloidfibriller blev dannet in vitro ved at inkubere β-amyloid mærket med 10% rhodaminderivat farvestoffer (488 nm excitation) i 1 uge og efterfølgende billeddannelse med TIRF-SIM. Se reference 12 for mere information.

    Subcellulære strukturer med høj kontrast, såsom emGFP mærkede mikrotubuli (figur 5B, G) eller LifeAct-GFP (figur 5D) er ideelle til TIRF-SIM billedbehandling og giver billeder i høj kontrast super-opløsning. TIRF-SIM billeddannelse ved hjælp af opsætningen beskrevet i denne protokol muliggør observation af en delpopulation af mikrotubuli placeret i nærheden af ​​den basale celle cortex, og mikrotubuli polymerisering og depolymerisering kan be set over tid (animeret figur 1). Ikke alle prøver er modtagelig for billeddannelse med TIRF-SIM, især, lav kontrast prøver uden diskrete strukturer. Celler, der udtrykker cytosolisk GFP mangler høj information opløsning bortset fra ved kanterne af plasmamembranen (fig 5F, H og animerede figur 2) og er derfor sub-optimal for TIRF-SIM billeddannelse som de resulterende rekonstruktioner er hovedsagelig TIRF billeder overlejret med artefakter. I sådanne prøver, kan stigningen i modsætning ofte tilskrives dekonvolution trinnet genopbygningen algoritme.

    Høj graduering kontrast er afgørende for en vellykket SIM billeddannelse. Fouriertransformation af det rekonstruerede billede tillader visualisering af SIM optiske overføringsfunktion (OTF) (figur 6A, indsat). Uden at maksimere graduering kontrast for hver retning ved at sikre azimut-polæreization med en polariseringsrotator, er der meget lidt modulation af høj opløsning oplysninger i prøven fører til et lavt forhold signal-til-støj i SIM pasbånd. Genopbygning algoritmer, som anvender standard Wiener filter tilgang vil blot forstærke støj i SIM pasbånd og give et billede, der er hovedsagelig en standard TIRF billede overlejret med sekskantet (eller "honeycomb") ringer artefakter (figur 6A, højre panel). En mulig forbedring kunne være anvendelsen af iterative 29,30 eller blinde rekonstruktionsalgoritmer 31,32 at reducere disse artefakter afhængigt af typen af prøven. Vi anbefaler brug af ImageJ plugin SIMcheck at kontrollere kvaliteten af SIM-data før og efter genopbygning 33.

    figur 1
    Figur 1:. Layout af Multicolor TIRF-SIM Setup TIRF-SIM microscope består af tre hoveddele, strålen generation enhed, mønstret projektion enhed, og påvisning enhed. I bjælken generation enhed, er tre forskellige lasere justeret på samme strålegangen via dichroic spejle (DM1 og DM2) og instrueret gennem fire optiske elementer til polarisering kontrol. Først en polarisator (P) sikrer renheden af ​​den lineære polarisationstilstand af hver af laserstråler. De følgende tre optiske elementer er nødvendige for at dreje polarisering i en hurtig, automatiseret måde som beskrevet i detaljer i teksten. Bagefter to linser (L1 og L2) i et teleskop konfiguration udvide strålen til at matche den aktive overflade af den rumlige lysmodulator (SLM) og afbøjes i tre beamlets af SLM'er forventede binære rist mønstre (eksempler er vist i fliser 1- 9). Polarisationstilstanden af ​​belysningslysstrålen forhold til SLM mønster er vist som en pil. En anden teleskop (L3 og L4) de-forstørrer mønster og giver adgang til the Fourier planet af SLM mønster. I dette plan en rumlig maske (SM) anvendes til at bortfiltrere den centrale komponent og andre uønskede diffraktion bestanddele fra pixeleret struktur SLM og dens interne ledningsføring. Før de to resterende stråler er fokuseret på bagsiden brændplan af målet (OB) via kondensatoren linse (L5), er to dikroiske spejle (DM3 og DM4) inkluderet i opsætningen. DM4 fungerer som en konventionel dikroisk spejl i fluorescens mikroskopi til separat belysning fra emissionslyset. Men dette spejl uundgåeligt inducerer ellipticitet i polarisering tilstand af belysning lys, som kan kompenseres for ved DM3, et dikroisk spejl fra ideelt samme parti som DM4. Oliebestandighedsobjektets TIRF mål har en stor nok NA mod direkte lancere to modsat formerings bølger på dækglasset, der reflekteres fuldstændigt og giver anledning til et struktureret flygtige felt i dækglasset. Prøven er monteret på en xyz oversættelse fase. Detektion er performed gennem samme mål og DM4 i transmission, plus en ekstra filtrering af bandpass emission filtre, monteret i en computerstyret filter hjul (EFW). Endelig er billedet projiceres på en sCMOS kamera af den interne mikroskop rør linse (L6). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2:. Tilpasning af Overlappende Bjælker (A) En SLM rist mønster windowed med en cirkulær blænde er nyttigt for justering. Hvis to ikke-overlappende bjælker er synlige på kameraet (venstre), derefter positionen af ​​prøveplanet skal omplaceres ved iterativt at justere de aksiale positioner af objektivlinsen og kameraet til opnåelse af en enkelt cirkulær belysning plet (højre). Bjælkerne skal overlappe i order for at frembringe den sinusformede excitation mønster kræves til TIRF-SIM. Hvis bjælkerne ikke fuldt overlapper dette reducerer synsfeltet over hvilket er dannet interferensmønstret. (B og C) Den nøjagtige indfaldsvinkel af strålerne er vigtig for TIRF-SIM. Hvis vinklen er forkert, vil en af ​​bjælkerne ikke være på den ønskede vinkel for TIRF og dette er let synlig, når billeddannelse et fluorescerende farvestof løsning. En stråle har en indfaldsvinkel større end den kritiske vinkel, som giver den cirkulære stedet, og den anden ikke gør, hvilket fører til den lyse stribe til venstre for billedet i (B). (D) justering af vinklen af spejlet DM3 sikrer begge stråler er indfaldende i den samme vinkel, og dette kan godkendes af defokusering målet: hvis den er korrekt justeret, bør xz projektion af en z stabel af et fluorescerende farvestof prøve viser to symmetrisk krydsende bjælker med ubetydelig baggrund påfokusere. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3:. Synkronisering afhængigheder for de forskellige systemkomponenter (A) Til hurtig SIM erhvervelse, synkronisering af systemets komponenter ved hjælp af en hardware baseret løsning er afgørende. (B) En datafangst bord (DAQ) bør anvendes som en master trigger. Et TTL signal fra DAQ bestyrelsen sendes til sCMOS External Input og bruges til at udløse eksponering kameraet. Kameraet Global Exposure output derefter udløser SLM at vise et gitter mønster, og SLM LED Aktiver output bruges til digitalt modulere laser excitation sådan, at laseren kun udsender, når SLM pixels er i "on" tilstand. Efter eksponeringen er komplete, er kameraet samlede eksponering output bruges til at fremme SLM mønster videre til næste rist fase eller vinkel. DAQ board udsender også en analog spænding til LCVR controller til at styre den lineære polarisationstilstand af belysningsstrålen. Denne spænding er tændt efter erhvervelsen af ​​de 3 fasede billeder for hver mønster vinkel. Efter købet af 9 billeder til en enkelt bølgelængde, DAQ bord udsender et signal til emission filterhjul controller, og skifter til den næste bølgelængde. Den DAQ bord gælder også en z-offset til prøven ved at udsende en analog spænding til z-scenen piezo-controller. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4: TIRF-SIM Imaging af prøver på 100 nm flerfarvet perler og Fluorescerende Labelled amyloidfibriler. (A og B) Sammenligning af standard TIRF forhold til TIRF-SIM rekonstruktioner til 488 nm og 640 nm excitation. (C) Histogram af fuld bredde halv maksimum (FWHM) af Gauss passer til TIRF-SIM-perler viser forbedringen forventede afklaring. (D) TIRF versus TIRF-SIM af p-amyloid fibriller mærket med 10% rhodaminderivat farvestof (488 nm excitation). Scale barer = 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 5
    Figur 5:. Levende celler TIRF-SIM Imaging Sammenligning af konventionel TIRF og TIRF-SIM billeder af (a, b) mikrotubuli (emGFP-tubulin) i en HEK293 cell, (C, D (E, F) cytosolisk GFP i en HEK293 celle. Billeder i B og F er enkelte tidspunkter fra filmene. Boxed områder er vist forstørret i (G, H). Scale barer = 3 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 6
    Figur 6:. Indflydelse af polariseringsrotator på Reconstructed Bead-billeder (A) Uden brug af en polariseringsrotator såsom en LCVR, forholdet signal-støj i SIM pasbånd er lav, hvilket resulterer i karakteristiske sekskantede artefakter i det rekonstruerede SIM billeder (højre), (B) i 2D-SIM, de strukturerede belysningsmønstre er direkte synlige i Fourieromdanne de rå billeder (venstre, fremhævede excitation rumlige frekvens), som de falder inden for en radius af emissionen OHF støtte, men i TIRF-SIM, de er uden for OHF støtte og derfor ikke synlig (til højre). I dette tilfælde skal mønstret graduering kontrast vurderes ved hjælp af en sparsom perle monolag, som skitseret i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 7
    Figur 7:. Spatial Light Modulator Baseret Pattern Generation Giver Implementering af Andre billeddiagnostiske metoder Såsom Multifocal SIM (A) I MSIM, et gitter af firkantede pointsdisplayed på SLM (indsat) giver et gitter af diffraktion begrænset foci på billedplanet. Et tyndt lag af en lav koncentration rhodamin 6G afbildes til udstyr og forretni Lize foci. Mønsteret er oversat hele prøven (B) og den erhvervede rå billede z-stack er rekonstrueret til at generere et billede med reduceret ude af fokus lys (C). Scale barer = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Movie 1 Ramme
    Animeret Figur 1:. Time Series Movie of EmGFP-tubulin i en HEK293 Cell hurtig polymerisering og depolymerisering af emGFP mærkede mikrotubuli kan observeres ved hjælp af TIRF-SIM. Billeder erhvervet under anvendelse af 50 msek eksponeringstid per rå ramme (450 msek pr SIM ramme) anbringes med intervaller på 0,5 sek. Eksponeringstid anvendte var begrænset af lysstyrken af ​​fluoroforen, ikke af hastigheden af ​​kameraet eller SLM. 3988movie1.mov "target =" _ blank "> Klik her for at se denne video.

    Movie 2 Ramme
    Animeret Figur 2:. Time Series Movie of Cytosoliske GFP i en HEK293 Cell Prøver med lav kontrast som denne er ikke ideelle prøver til TIRF-SIM billeddannelse. Retrograd membran flow kan ses i TIRF billeder, men TIRF-SIM giver ingen yderligere oplysninger bortset fra på cellen kanter. TIRF-SIM billeder blev erhvervet med 50 ms eksponeringstid per rå ramme (450 ms pr SIM ramme) anbringes med intervaller på 5 sek. Klik her for at se denne video.

    Supplerende Kode Fil: Eksempel SLM repertoire fil (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).d / 53.988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_001.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_002.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_003.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil: Eksempel SLM repertoire fil (period9_004.bmp). Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_005.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_006.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_007.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_009.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_mask_1.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_mask_2.bmp) Klik her for at downloade denne fil. >

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (period9_mask_3.bmp) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel SLM repertoire fil (TIRF-SIM_example.rep) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel rist generation kode (1 af 2) (generate_gratings.m) Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil: Eksempel rist generation kode (2 af 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> Klik her for at downloade denne fil.

    Supplerende Kode Fil:. Eksempel kode til at beregne modulation kontrast (calculate_contrast.m) Klik her for at downloade denne fil.

    Discussion

    Specialbyggede TIRF-SIM systemer såsom opsætningen beskrevet i denne protokol er i stand til flerfarvet super-opløsning billeddannelse ved høj hastighed i forhold til kommercielt tilgængelige mikroskoper. Den iboende fordel ved SIM som en super-opløsning teknik er, at den tidsmæssige opløsning ikke er begrænset af de fotofysik af fluoroforen, sammenlignet med andre metoder, såsom enkelt molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM) eller scanning metoder såsom stimuleret emission udtømning mikroskopi ( STED). I modsætning til disse andre teknikker, er SIM ikke kræver photoswitchable eller udtømmelig fluoroforer så flerfarvet imaging er ligetil. Ikke TIRF-SIM-systemer, såsom optisk sektionering SIM og multifokal SIM kan normalt opnå forbedringer af 1,7 gange eller mindre opløsning i praksis i modsætning til den faktor 2 forbedring rapporteret her, og kommercielle systemer er også ofte langsommere og mindre fleksible end det system præsenteres i denne protokol.

    "> De to vigtigste vanskeligheder med at gennemføre denne teknik er for det første nødvendigheden af ​​præcis positionering af de seks SIM bjælker i TIR zone af målet ryg blænde, hvilket kræver en omstændelig og tidskrævende optisk justering procedure. For det andet, til at producere høj mønster kontrast ved prøven, polarisering rotation er afgørende. for lave NA 2D-SIM-systemer, kan polarisering rotation undgås ved omhyggeligt valg af den lineære polarisering orientering, men det bliver umuligt for TIRF-SIM 25. for høj hastighed flerfarvet imaging, elektro- optisk polarisering kontrol er nødvendig, og dette øger kompleksiteten og bekostning af systemet.

    Begrænsninger af teknikken

    TIRF-SIM, ligesom konventionel TIRF, er naturligt begrænset til observation af biologiske strukturer og processer placeret på den basale cellemembran, der kan belyses ved 150-200 nm indtrængningsdybde kortvarigt felt. MensSIM er ofte citeret som værende mindre photodamaging til celler end enten STED eller SMLM, betyder lateral opløsning fordobling stadig stige det nødvendige antal fotoner med mindst 4 gange 5 i forhold til konventionelle TIRF mikroskopi. For billeddannelse ved høje frame rates med korte engagementer gange, denne foton stigning nødvendiggør brug af øgede belysning intensiteter. Mens enhver fluorophor kan anvendes til SIM billeddannelse af faste eller langsomme prøver, høj lysstyrke fluorescerende proteiner eller næste generation syntetiske farvestoffer med forbedret fotostabilitet anbefales til levende celler.

    Selv om denne implementering er i stand til at afbilde en enkelt farve på SIM frame rates på over 20 Hz, er flerfarvet billeddannelse i præsenterede systemet begrænset af skiftetid for motoriserede emission filter hjul. På grund af den store størrelse af sCMOS kamerachippen, ville anvendelsen af ​​en flerbånds emission filtrer og billedfiler splitting optik være muligt og tillade samtidig imaging med flere bølgelængder på ingen hastighed straf. En anden mulighed ville være at skifte de forskellige excitation lasere og bruge en multiband hak filter til at afvise excitationslyset. Anvendelsen af ​​en binær ferroelektrisk SLM i denne implementering er heller ikke optimal. Diffraktionseffektiviteten af ​​en sådan SLM er meget lav, så de fleste af det indfaldende lys er i nulteordens refleksion, som filtreres ud af den rumlige maske. Til applikationer, der kræver meget høje frame rates, bliver billeddannelseshastighed derfor begrænset af udgangseffekten af ​​laserdioder. SLM introducerer også nogle ellipticiteten i polarisering for bølgelængder væk fra 550 nm design bølgelængde, hvor pixels ikke fungerer som ideelle halvdel bølge plader. Selv om dette kunne der kompenseres for ved hjælp af en yderligere LCVR, kan den ideelle løsning være at bruge en digital mikro-spejl indretning (DMD) som et mønster generator.

    mulige modifikationer

    Opsætningen presented her er fleksibelt og lettere modificeret end kommercielle instrumenter så andre billeddiagnostiske modaliteter såsom 3D-SIM, hurtig 2D-SIM, multifokal SIM (MSIM) og ikke-lineære SIM (NL-SIM) kan gennemføres 21,34,35.

    2D-SIM kan være velegnet til afbildning relativt flad, hurtig bevægelse strukturer, såsom den perifere endoplasmatiske reticulum. Den perifere ER ligger dybere inde i cellen end kan belyses ved anvendelse af en TIRF kortvarigt felt, men på grund af sin flade struktur kan afbildes ved anvendelse af standard 2D-SIM med ubetydelig ud-af-fokus baggrund. Derudover anvendelsen af forbedrede optiske sektionering rekonstruktionsalgoritmer undertrykke ude af fokus lys udvide brugen af 2D-SIM til optisk tykke prøver, omend hvor aksial opløsning fordobling kræves ikke 21.

    I MSIM prøven belyst af en sparsom gitter af excitation foci 36. Denne modalitet kan implementeres ved blot at fjerne den rumlige maske (SM) Og erstatte den med en polarisator. SLM fungerer nu som en amplitude modulator. De binære SIM gitre vises på SLM kan erstattes af en 2D gitter af pletter, med størrelsen af ​​pletterne valgt til at være lig med størrelsen af ​​en diffraktion begrænsede fokus i billedplanet. I figur 7A, er et gitter af 4 x 4 pixel kvadrater vises på SLM (indsat), som når demagnified på prøven genererer diffraktion begrænset foci på 150 x 150 nm, i betragtning af den fysiske SLM pixelstørrelse på 13,62 um. Excitation foci kan derefter blive omsat ved at flytte gittermønster på SLM og dette gentages flere gange for at belyse hele synsfeltet. Billeder erhverves for hver oversat mønster position og stakken er efterbehandlet til opnåelse af et rekonstrueret billede med forbedret opløsning på op til en faktor ligning og reduceret ude af fokus lys i forhold til den tilsvarende Widefield billedet30. Denne modalitet kan være nyttige til afbildning tykke, tætte prøver, for hvilke standard SIM er uegnet, for eksempel lav kontrast strukturer, såsom farvede røde blodlegemer (figur 7c), selv om købet tid øges på grund af det store antal rå frames kræves per synsfelt (i dette tilfælde N = 168).

    Endelig kan opsætningen modificeres for at muliggøre enten høj-NA lineære TIRF-SIM eller mønstret aktivering ikke-lineær SIM (PA NL-SIM), som for nylig er Li et al., Ved anvendelse af et ultrahøjt 1,7 NA mål eller tilsætning af en 405 nm fotoaktivering laser og omhyggelig optimering af SLM rist mønstre 35.

    Fremtidige applikationer

    SIM er stadig en rivende udvikling teknik og mange applikationer i biovidenskab vil blive aktiveret i fremtiden. Hastigheden, opløsning og kontrast forbedringer af teknikken og evnen til at bruge standard fluorophorer mEAN at for bioimaging, er SIM indstillet til at erstatte konventionelle mange mikroskopsystemer såsom konfokale og brede felt platforme. Kommercielle SIM-systemer er allerede tilgængelige i dag med udestående tekniske specifikationer, men de er ud over den økonomiske rækkevidde af mange forskningslaboratorier, og først og fremmest, at de er ufleksible skal modificeres og udvikles til at gennemføre de nyeste forskningsresultater udvikling på området. De mangler også den afgørende evne til at "blive tilpasset til forsøget ved hånden«, ofte en kritisk flaskehals i banebrydende life science forskning. Den her beskrevne system vil blive særligt velegnet til at studere dynamiske processer nær celleoverfladen, til in vitro undersøgelser af rekonstituerede dobbeltlag systemer, for at studere overfladen kemi i de materialer og fysiske videnskaber, f.eks. af 2D materialer, og mange andre anvendelser.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Leverhulme Trust, Engineering og Physical Sciences Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [ARUK-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089.703 / Z / 09 / Z] og Medical Research Council [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Vi takker E. Avezov og M. Lu til transfektion af LifeAct-GFP og cytosoliske-GFP-celler henholdsvis og W. Chen til fremstilling af HEK293 kultur. Vi takker også K. O'Holleran for hjælp med design af mikroskopet, og L. Shao og R. Heintzmann for nyttige drøftelser og forslag.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    488 nm laser Toptica iBeam SMART with digital modulation
    561 nm laser Coherent OBIS LS with digital modulation
    640 nm laser Cobolt MLD with digital modulation
    Long-pass dichroic mirrors  Thorlabs for combining excitation beams
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
    Quad band dichroic mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc From same batch as above, 25 x 25 mm
    1" square kinematic mount Edmund Optics 58-860
    Glan-Taylor calcite polarizers Thorlabs GT5-A For alignment of LCVR
    Glan-Taylor mount Thorlabs SM05PM5
    Achromatic half wave plate Thorlabs AHWP05M-600 400-800 nm
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M For HWP
    Liquid Crystal Variable Retarder Meadowlark Optics SWIFT Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
    LCVR controller Meadowlark Optics D3060HV Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
    Achromatic quarter wave plate Meadowlark Optics AQM-100-0545
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1P/M For QWP
    10 mm achromatic doublet Thorlabs AC080-010-A-ML For beam expander
    200 mm achromatic doublet Thorlabs AC254-200-A-ML For beam expander
    Cage XY Translators Thorlabs CXY1
    Ferroelectric spatial light modulator Forth Dimension Displays M0787-00249     SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
    SLM mounting frame Forth Dimension Displays M0787-10014 Fixed to custom built aluminium mount
    Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount Thorlabs GM200/M For SLM mounting
    Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform Thorlabs XYR1/M For SLM mounting
    Rail carrier Newport M-PRC-3 For SLM mounting
    Precision Optical Rail Newport PRL-6 For SLM mounting
    300 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 273 322  f = 300 mm, 31.5 mm diameter
    140 mm achromatic doublet lens Qioptiq G322 239 322 f = 140 mm, 31.5 mm diameter
    Precision XY Translation Mounts Thorlabs LM2XY
    Lens Mounting Adapters Thorlabs SM2AD32 For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
    Translation stages Comar 12XT65 Dovetail, side drive
    XY Translator with Differential Drives Thorlabs ST1XY-D/M for spatial filter
    Rotation cage mount Thorlabs CRM1/M for spatial filter
    300 mm achromatic doublet Thorlabs AC508-300-A-ML Excitation tube lens
    Automated XY stage with Z-piezo top plate ASI PZ-2150-XYFT-PZ-IX71  with MS-2000 controller
    Inverted microscope frame Olympus IX-71
    Objective lens Olympus UAPON100XOTIRF 100X/1.49NA
    High speed filter wheel Prior Scientific HF110A with Prior ProScan III controller
    Bandpass emission filters Semrock FF01-525/30, FF01-676/29
    sCMOS camera Hamamatsu ORCA Flash v4.0
    Stage top incubator OKO Lab H301-K-FRAME For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
    Stainless steel optical posts Thorlabs TR series for mounting optical components
    Post holders Thorlabs PH series for mounting optical components
    Kinematic mirror mounts Thorlabs KM100 for mounting 1" mirrors
    Shearing interferometer Thorlabs SI100
    100 nm fluorescent microspheres Life Technologies T-7279 Tetraspeck
    Rhodamine 6G Sigma Aldrich 83697-250MG
    8 well glass bottom dishes ibidi 80827 with #1.5 coverglass
    Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155409 with #1.5 coverglass
    0.01 mm microscope reticle slide EMS 68039-22
    CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher Scientific C10613

    References

    1. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).
    2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, (2), 82-87 (2000).
    3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (35), 13978-13983 (2012).
    4. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys. J. 101, (5), 1277-1284 (2011).
    5. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Mol. Cell. 58, (4), 644-659 (2015).
    6. Westphal, V., et al. Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement. Science. 320, (5873), 246-249 (2008).
    7. Davies, T., et al. CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation. PLOS Biol. 13, (4), e1002121 (2015).
    8. Laine, R. F., et al. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat. Commun. 6, 5980 (2015).
    9. Pinotsi, D., et al. Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy. Nano Lett. 14, (1), 339-345 (2014).
    10. Esbjörner, E. K., et al. Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation. Chem. Biol. 21, (6), 732-742 (2014).
    11. Michel, C. H., et al. Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology. J. Biol. Chem. 289, (2), 956-967 (2014).
    12. Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques. Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).
    13. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, (1), 141-145 (1981).
    14. Cragg, G. E., So, P. T. Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves. Opt. Lett. 25, (1), 46-48 (2000).
    15. Chung, E., Kim, D., So, P. T. Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy. Opt. Lett. 31, (7), 945 (2006).
    16. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6, (5), 339-342 (2009).
    17. Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (14), 5311-5315 (2012).
    18. Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks. Opt. Express. 21, (22), 26162-26173 (2013).
    19. Förster, R., et al. Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator. Opt. Express. 22, (17), 20663 (2014).
    20. Lu-Walther, H. W., et al. fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy. Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).
    21. Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. High speed structured illumination microscopy in optically thick samples. Methods. (2015).
    22. von Olshausen, P. Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. University of Freiburg. (2012).
    23. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, (12), 4957-4970 (2008).
    24. Meadowlark Optics Inc. Basic Polarization Techniques and Devices. (2005).
    25. O'Holleran, K., Shaw, M. Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy. Opt. Lett. 37, (22), 4603 (2012).
    26. Brankner, S. Z., Hobson, M. Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf (2013).
    27. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, (12), 4957-4970 (2008).
    28. Wicker, K. Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space. Opt. Express. 21, (21), 24692 (2013).
    29. Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy. 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3, (1), 995-998 (2014).
    30. Ströhl, F., Kaminski, C. F. A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data. Methods Appl. Fluoresc. 3, (1), 014002 (2015).
    31. Mudry, E., et al. Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns. Nat. Photonics. 6, (5), 312-315 (2012).
    32. Ayuk, R., et al. Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm. Opt. Lett. 38, (22), 4723 (2013).
    33. Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Sci. Rep. 5, 15915 (2015).
    34. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
    35. Li, D., et al. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349, (6251), (2015).
    36. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter