माउस भ्रूणीय दिल से एपिकार्डियल प्रकोष्ठों के इन विट्रो संस्कृति में

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Ramesh, S., Singh, A., Cibi, D. M., Hausenloy, D. J., Singh, M. K. In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart. J. Vis. Exp. (110), e53993, doi:10.3791/53993 (2016).

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Abstract

Introduction

प्रयोगात्मक डेटा का खजाना है कि epicardium हृदय विकास में महत्वपूर्ण कदम प्रभावित करती है सचित्र है। विकास के दौरान, पट transversum mesothelial proepicardium 1-4 रूप में जाना जाता कोशिकाओं का एक पेड़ों का झुरमुट को जन्म देता है। proepicardium से कोशिकाओं तो विस्थापित और मायोकार्डियम epicardium गठन लिफाफा। इस के बाद, epicardial कोशिकाओं के एक सबसेट epicardium व्युत्पन्न कोशिकाओं (EPDCs) है कि बाद में मायोकार्डियम पर आक्रमण के एक प्रवासी आबादी के लिए EMT जन्म देने से गुजरना। जेनेटिक रूप में अच्छी तरह रेट्रोवायरल वंश प्रयोगों अनुरेखण दिखा दिया है कि EPDCs चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं और cardiomyocytes (यदि हो तो) सहित विभिन्न प्रजातियों में अंतर है। इसलिए EPDCs कोरोनरी वाहिका और दौरे वास्तुकला 1,2,4-9 के विकास में महत्वपूर्ण योगदान करते हैं। इसके अलावा, epicardium वेंट्रिकुलर कॉम्पैक्ट परत 10-12 के विकास के लिए आवश्यक है। ई के लिएXAMPLE Gittenberger-de Groot एट अल। दिखा दिया है कि proepicardium के परिणाम बाधा इस तरह के एक पतली मायोकार्डियम, दिल और असामान्य interventricular पट गठन की कमी पाशन के रूप में और एक परिणाम है, भ्रूण मारक 13 के रूप में दोष की एक सरणी के लिए होता है। भ्रूण epicardium से स्रावित पैराक्राइन कारकों cardiomyocyte प्रसार और भेदभाव मिलाना। इस के साथ संगत, ऐसे retinoic एसिड (आरए), fibroblast वृद्धि कारक (FGFs) और Wnt / β-catenin के रूप में संकेत दे रास्ते के epicardium-विशिष्ट विलोपन दोषपूर्ण दौरे विकास और भ्रूण मारक 14-16 में हुई।

हालांकि epicardium वयस्क दिलों में मौन माना जा रहा था, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि विकास कार्यक्रम हृदय चोट 17,18 निम्नलिखित epicardium में सक्रिय है। सक्रियण पर, कोशिकाओं तेजी से प्रसार और EMT कि EPDC गठन में परिणाम से गुजरना। इन कोशिकाओं को capacit का प्रदर्शनY fibroblast और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, लेकिन नहीं cardiomyocytes या endothelial कोशिकाओं 18 में अंतर करने के लिए। इसके अलावा, EPDCs proangiogenic कारक है कि घायल क्षेत्र के vascularization में सहायता और इस तरह रोधगलितांश आकार कम करने से हृदय समारोह में सुधार की सुविधा छिपाना। इन निष्कर्षों के कारण, epicardium हृदय विकास, रोग और उत्थान के अध्ययन में ब्याज का फायदा हुआ है।

ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकी 21 वीं सदी में चिकित्सा अनुसंधान क्रांति ला दी है। ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों की सहायता के साथ, रोगग्रस्त माउस पाचन और pathophysiologically मानव हालत नकल उतार मॉडल को सफलतापूर्वक विकसित किया गया है। हालांकि, इन म्यूटेंट में epicardial सेल व्यवहार का अध्ययन मुख्य रूप से जल्दी भ्रूण मारक के कारण एक चुनौती रहा है। महत्वपूर्ण भूमिका है कि epicardium हृदय विकास और उत्थान में खेलता ध्यान में रखते हुए, हम माउस epicardia के लिए इन विट्रो संस्कृति प्रणाली की स्थापना की हैएल कोशिकाओं। इस विधि epicardial कोशिकाओं की लंबी अवधि संस्कृति की अनुमति देता है और epicardium के दो महत्वपूर्ण गुणों का विस्तृत अध्ययन की सुविधा: विस्थापित और अंतर करने की क्षमता। माउस से excised निलय कोलेजन जैल जो प्रवास assays के संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर संवर्धित किया जा सकता है। एक 3 डी मैट्रिक्स है कि कोलेजन युक्त subepicardial परत के बाह्य मैट्रिक्स बेहतर प्रतिकृति इन विवो सेल फिजियोलॉजी स्मरण दिलाता में संवर्धित किया जा रहा है। वैकल्पिक रूप से वे एक आदेश epicardial monolayer जो तब बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्थापित करने के लिए कक्ष स्लाइड पर संवर्धित किया जा सकता है। इस monolayer तंग जंक्शन प्रोटीन है जो epicardium की क्षमता EMT गुजरना करने के लिए जो प्रवास के लिए महत्वपूर्ण है पर अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा के लिए दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, भेदभाव प्रयोगों भी इन कोशिकाओं पर बाहर किया जा सकता है। इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल कोशिकाओं से शाही सेना निकालने के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है औरमात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) प्रदर्शन। अन्त में, monolayers भी एक आणविक विश्लेषण के बाद संभावित चिकित्सा विज्ञान के लिए परीक्षण करने के लिए एजेंटों के साथ इलाज किया जा सकता है। एक साथ रखो, इस epicardial संस्कृति प्रणाली कल्पना और आणविक डेटा जो epicardial विकास के बारे में हमारी समझ को आगे इकट्ठा करने के लिए अवसर के साथ हमें प्रदान करता है।

इस पद्धति का एक और वांछनीय विशेषता यह है कि यह स्पष्ट है और कोई विस्तृत सेटअप की आवश्यकता है। संक्षेप में, भ्रूण E11.5 या E12.5 जिसके बाद दिल excised है पर काटा जाता है। निलय तो या तो कोलेजन जेल या चैम्बर स्लाइड पर सुसंस्कृत हैं। बाद में, इन कोशिकाओं को नीचे की ओर प्रयोगों का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोगों ड्यूक-एनयूएस ग्रेजुएट मेडिकल स्कूल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. भ्रूण निलय पुन: प्राप्त

  1. वांछित भ्रूण चरण (E11.5 या E12.5) कार्बन डाइऑक्साइड गैस की आपूर्ति को मंजूरी दे दी है या किसी अन्य इच्छामृत्यु विधि के साथ एक इच्छामृत्यु चैम्बर का उपयोग करने पर एक समय पर गर्भवती माउस बलिदान।
  2. एक विदारक मेज पर अपनी पीठ पर माउस रखें। 70% इथेनॉल के साथ महिला के पेट कीटाणुरहित। पेट पर त्वचा लिफ्ट और एक ब्लेड के साथ एक छोटा सा चीरा (1-2 सेमी) है, तो दोनों हाथों से त्वचा पकड़ और दूर खींच पेट की दीवार को बेनकाब करने के लिए।
  3. अब गर्भाशय सींग का पर्दाफाश करने के लिए पेट की दीवार काट दिया। गर्भाशय सींग उठा बाँझ संदंश का प्रयोग करें और ध्यान से वसा ऊतकों और रक्त वाहिकाओं गर्भाशय सींग से जुड़ी दूर कटौती। गर्भाशय ग्रीवा में कटौती गर्भाशय निकालते हैं।
  4. बाँझ ठंड 1x फॉस्फेट शौकीन युक्त एक पेट्री डिश में गर्भाशय सींग की जगह जुटी खारा (पीबीएस) और धीरे से कुल्ला। बर्फ पर पेट्री डिश रखें।
  5. भ्रूण है कि अभी भी जर्दी थैली के अंदर हैं और प्लेसेंटा के माध्यम से गर्भाशय की दीवार से जुड़ी बेनकाब करने के लिए गर्भाशय सींग (विपरीत साइट है जहाँ नाल स्थित है) के midline के माध्यम से कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
  6. बाँझ संदंश का प्रयोग, भ्रूण मुक्त करने के लिए भ्रूण की जर्दी थैली खुले में कटौती।
  7. बाँझ ठंड 1x पीबीएस युक्त एक नया पेट्री डिश में भ्रूण रखें। भ्रूण सिर काटना और अपनी पीठ पर जगह है। दिल को बेनकाब करने के सीने में दीवार काट खुला।
  8. दिल उठा और उसके चारों ओर जहाजों छाती दीवार से दिल मुक्त करने के लिए दूर कटौती करने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें। विशेष ध्यान शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ दिल की epicardium नुकसान नहीं है।
  9. बहिर्वाह पथ और दोनों अटरिया बंद ट्रिम। ठंड 1x पीबीएस के साथ एक और डिश के लिए वेंट्रिकल स्थानांतरण। बर्फ पर पकवान रखें।
  10. दोहराएँ 1.6-1.9 तक सभी निलय प्राप्त कर रहे हैं कदम।
Le "> 2। एपिकार्डियल explant संस्कृति

नोट: संस्कृति या तो कांच कक्ष स्लाइड पर या बहाव के अनुप्रयोगों के लिए कोलेजन जेल पर इन epicardial explants।

  1. ग्लास कक्ष स्लाइड
    1. संस्कृति मीडिया तैयार करते हैं, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 एनजी / एमएल पुनः संयोजक fibroblast वृद्धि कारक 2 (FGF2) जोड़ें। लामिना का प्रवाह हुड में सभी चरणों का प्रदर्शन।
    2. एक 8 अच्छी तरह से चैम्बर के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 500 μl संस्कृति मीडिया जोड़ें।
    3. एक अच्छी तरह से केंद्र में प्रत्येक excised वेंट्रिकल रखें। वेंट्रिकल ओरिएंट विच्छेदित पक्ष अच्छी तरह से नीचे की सतह पर नीचे रखने के लिए।
    4. धीरे से एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली रख दिया।
    5. न्यूनतम अशांति के साथ संस्कृति को बनाए रखने explants पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए। epicardial monolayer के गठन 48-72 घंटे के बाद देखा जा सकता है।
    6. epicard के भेदभाव के लिएचिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, संस्कृति और 6 दिनों के लिए भेदभाव मीडिया में epicardial monolayer कोशिकाओं में ial कोशिकाओं। भेदभाव मीडिया को तैयार करने के लिए, DMEM 10% FBS, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 50 एनजी / एमएल पुनः संयोजक बदलने वृद्धि कारक बीटा 1 (TGF-β1) जोड़ें।
    7. वैकल्पिक दिनों पर संस्कृति मीडिया बदलें।
  2. कोलेजन जेल
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक 3 डी कोलेजन संस्कृति किट का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोलेजन जेल तैयार करें।
    2. कोलेजन जेल की वांछित मात्रा तैयार करते हैं, DMEM के 5x और पिपेट ऊपर और नीचे के साथ कोलेजन समाधान का उचित मात्रा में मिला लें। समाधान पीले रंग की बारी चाहिए।
    3. निराकरण समाधान की एक इसी मात्रा में जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से तुरंत मिश्रण। समाधान गुलाबी हो जाएगा।
    4. पिपेट एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 100 μl। अल करने के लिए 30-60 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली प्लेसकम जेल भाजन करने के लिए।
    5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ऊपर वर्णित संस्कृति मीडिया के 200 μl जोड़ें।
    6. एक अच्छी तरह से केंद्र में प्रत्येक excised वेंट्रिकल रखें। ओरिएंट वेंट्रिकल कोलेजन जेल पर विच्छेदित पक्ष रखने के लिए नीचे (वेंट्रिकल की सर्वोच्च प्रयोगकर्ता का सामना करना चाहिए)। धीरे थाली सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया।
    7. 3 दिनों के बाद, निलय को हटा दें। प्लेट एक और 2 दिनों के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया।
    8. वैकल्पिक दिनों पर संस्कृति मीडिया बदलें।

3. फिक्सेशन और दृश्य

नोट: एपिकार्डियल कोशिकाओं या तो कांच कक्ष स्लाइड या कोलेजन जेल पर देखे जा सकते हैं।

  1. बाहर संस्कृति मीडिया महाप्राण और कोशिकाओं को धोने के लिए बाँझ 1x पीबीएस के एक बराबर मात्रा में जोड़ें।
  2. अभी पर्याप्त 4% paraformaldehyde (पीएफए) कोशिकाओं को कवर करने के लिए जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. पीएफए ​​निकालें और 1x PBST (साथ 1x पीबीएस के साथ explants धोने0.1% ट्राइटन X-100) कोशिकाओं permeabilize करने के लिए।
  4. वांछित एंटीबॉडी (जैसे एलेक्सा स्त्राव 488 phalloidin; ZO-1, α ट्यूबिलिन और α चिकनी पेशी actin) के साथ immunostain 7।

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Representative Results

इस संस्कृति प्रोटोकॉल का प्रयोग, प्राथमिक epicardial कोशिकाओं बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उच्च शुद्धता के साथ अलग किया जा सकता है। संवर्धित कोशिकाओं, EMT गुजरना विस्थापित और अंतर epicardial कोशिकाओं विवो में बस के रूप में करने में सक्षम हैं।

हमारे प्राथमिक epicardial सेल संस्कृति की पवित्रता का निर्धारण करने के लिए, हम Sema3d GFPCre / + से उत्पन्न epicardial explants विश्लेषण किया; R26 टॉम / + भ्रूण। Sema3d epicardial कोशिकाओं में जल्दी हृदय विकास के दौरान इन भ्रूण से निकाली गई आरएफपी लेबल किया जाएगा epicardial कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, इस प्रकार। R26 टॉम / + epicardial explants के लिए भ्रूण, हम Sema3d GFPCre / + से निलय को अलग किया। 48-72 घंटे के बाद, हम epicardial कोशिकाओं की एक monolayer देखने के लिए सक्षम थे। आरएफपी immunofluorescence और brightfield छवियों superimposing से पता चला है कि बहुमतकोशिकाओं है कि निलय से पलायन की epicardial मूल (- सी चित्रा 1 ए) के हैं। हम आगे प्राथमिक epicardial कोशिकाओं से शाही सेना को अलग-थलग और qPCR जो epicardial विशिष्ट जीन (Tbx18 और WT1) के रूप में एक cardiomyocyte मार्कर जीन (Nkx2.5) (चित्रा 1 सी) का विरोध करने के लिए एक मजबूत अभिव्यक्ति दिखाया प्रदर्शन से हमारे परिणाम मान्य।

अगले हम epicardial कोशिकाओं की कोशिका polarity और सेल सेल संपर्क का विश्लेषण करके EMT गुजरना करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता की जांच की। EMT एक जैविक प्रक्रिया है कि एक उपकला सेल के क्रम में एक प्रवासी mesenchymal सेल में बदलना अपने सेल polarity और सेल सेल संपर्क खोने के लिए अनुमति देता है। EMT का पहला कदम सेल सेल संपर्कों की टुकड़ी है। हम ZO-1 (यह भी Tjp1 के रूप में जाना जाता है, तंग जंक्शन प्रोटीन 1) जो प्लाज्मा झिल्ली को ZO-1 के स्थानीयकरण से पता चला है यह दर्शाता है कि कोशिकाओं के साथ epicardial कोशिकाओं immunostainedअभी तक EMT (2A चित्रा) से गुजरना है। अगले हम α ट्यूबिलिन (चित्रा 2 बी) के लिए immunostaining के रूप में तो epicardial explants में सूक्ष्मनलिकाएं है, जो एक ध्रुवीकृत संरेखण कि epicardial कोशिकाओं के दिशात्मक प्रवास की सुविधा से पता चला है की संगठन निरीक्षण करने के लिए प्रदर्शन किया। इसके अलावा, epicardial कोशिकाओं के भेदभाव क्षमता का निर्धारण करने के लिए, हम उन्हें एक भेदभाव मीडिया में 6 दिन पुनः संयोजक TGF-β1 युक्त लिए सुसंस्कृत। SMA के लिए Immunostaining चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (चित्रा -2) में epicardial कोशिकाओं के सफल भेदभाव का प्रदर्शन किया।

अन्त में, epicardium व्युत्पन्न सेल प्रवास और epicardial EMT का विश्लेषण करने के लिए, हम भी एक कोलेजन जेल आक्रमण परख प्रदर्शन किया। Epicardium व्युत्पन्न कोशिकाओं immunostaining phalloidin द्वारा कल्पना थे। Epicardium व्युत्पन्न कोशिकाओं के सफल प्रवास explant (चित्रा 3) के चारों ओर सब देखा जा सकता है। डी निर्धारित करने के लिएकोलेजन मैट्रिक्स में सेल प्रवेश की epth, 3 डी पुनर्निर्माण confocal छवियों से उत्पन्न किया गया था। Epicardium व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रवेश Z ढेर (चित्रा 3 बी) में देखा जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: भ्रूण माउस दिल से एपिकार्डियल कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति प्रतिनिधि brightfield (ए) और आरएफपी immunofluorescence (बी) के प्राथमिक epicardial E12.5 Sema3d GFPCre / + से उत्पन्न कोशिकाओं की छवियों; R26 टॉम / + दिल। विलय कर दिया brightfield और immunofluorescence छवि (सी)। Epicardial मार्कर (Tbx18 और WT1) और cardiomyocyte मार्कर (Nkx2.5) प्राथमिक epicardial कोशिकाओं (डी) में के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति का स्तर। परिणाम GAPDH अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत थे, और रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर Nkx2.5 अभिव्यक्ति की तुलना में एक गुना अंतर के रूप में दिया जाता है (एन = 3)। डेटा ± एसडी मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन। *, पी <0.05। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्राइमरी एपिकार्डियल प्रकोष्ठों ZO-1 (ए, हरा) या α ट्यूबिलिन के लिए epicardial explants पर EMT और भेदभाव Immunostaining गुजरना करने के लिए (बी, हरा) अपनी क्षमता को बनाये रखें। DAPI नाभिक (नीला) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एपिकार्डियल कोशिकाओं 6 दिनों के लिए चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में भेदभाव और α चिकनी पेशी actin (SMA) (सी, लाल) के साथ दाग रहे थे। स्केल बार = 100 माइक्रोन।3993fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। कोलेजन जेल सतह पर एपिकार्डियल सेल प्रवास E12.5 भ्रूण से निलय एक तीन आयामी कोलेजन जेल मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत थे और epicardium व्युत्पन्न सेल प्रवास और प्रवेश (ए) कल्पना करने के लिए एलेक्सा स्त्राव 488 phalloidin साथ दाग। Confocal छवियों एक तीन आयामी छवि का निर्माण करने के लिए जेड कुल्हाड़ियों (बी) के साथ सेल पैठ निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह तकनीक है कि epicardium के अध्ययन की सुविधा हृदय के विकास और उत्थान में epicardium के बढ़ते महत्व को पूरा करने के लिए विकसित करने के लिए निर्णायक है। epicardial संस्कृति प्रणाली epicardial अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण लाभ बन गया है।

epicardial कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग है। इस विधि epicardial मार्कर (या epicardium-सेल विशिष्ट एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति) के उपयोग की अन्य प्रजातियों से epicardial कोशिकाओं को अलग करने पर निर्भर करता है। हालांकि, सबूत के एक बढ़ती हुई राशि से पता चला है कि epicardial मार्कर विशेष रूप से epicardium में व्यक्त नहीं कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, Tbx18 interventricular पट (IVS) के मायोकार्डियम में व्यक्त करते हुए WT1 endothelium 19-21 में व्यक्त किया जाता है। इसलिए, अलग-थलग epicardial कोशिकाओं की आबादी की शुद्धता संदिग्ध है। इसके विपरीत, संस्कृति विधि यहाँ बताया लेता है एकepicardial कोशिकाओं के प्रवासी प्रकृति के dvantage। इस epicardial कोशिकाओं का एक अत्यधिक शुद्ध आबादी के अलगाव के रूप में हमारे आनुवंशिक लेबलिंग प्रयोगों के द्वारा दिखाया सक्षम बनाता है। एक और तरीका है epicardial कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए मुख्य रूप से बीएमपी, wnt और retinoic एसिड संकेत दे रास्ते नियमन करने से मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) epicardial कोशिकाओं में भेदभाव के लिए किया जाएगा। ये विभेदित कोशिकाओं को बारीकी से भ्रूण epicardial कोशिकाओं के शारीरिक और आणविक विशेषताओं जैसे लगते हैं। वे न केवल EMT से गुजरना करने में सक्षम हैं, लेकिन यह भी fibroblasts और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं 22,23 में अंतर करने में सक्षम हैं। हालांकि इस पद्धति बहुत ही होनहार है, यह काफी अधिक जटिल और समय इस पत्र में वर्णित epicardial संस्कृति की तुलना में लेने वाली है।

इसके अलावा, इस संस्कृति तकनीक अतिरिक्त विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और एक मौजूदा टिशू कल्चर सेटअप के लिए पर्याप्त है। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, यह भुगतान करने के लिए महत्वपूर्ण हैजब दिल को पुन: प्राप्त pecial ध्यान शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ epicardium नुकसान नहीं है। इसके अलावा, यह विच्छेदित पक्ष आदेश epicardial सेल प्रवास की सुविधा के लिए या तो कोलेजन जेल या चैम्बर स्लाइड की सतह का सामना करना पड़ के साथ excised वेंट्रिकल उन्मुख करने के लिए महत्वपूर्ण है। अन्त में, संस्कृति के रूप में तो explant संस्कृति पकवान का पालन करने की अनुमति देने के लिए कम से कम अशांति के साथ बनाए रखा जाना चाहिए।

प्राप्त कोशिकाओं की आबादी फिर नीचे की ओर प्रयोगों जो epicardial कोशिका जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे जाएगा की एक किस्म प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चैम्बर स्लाइड्स पर explants संवर्धन epicardial सेल प्रसार, अस्तित्व, प्रवास, EMT और भेदभाव हृदय प्रजातियों में सहित विभिन्न प्रयोगों के लिए epicardial monolayers प्रदान करता है। यह भी नशीली दवाओं के उपचार के साथ जुड़े epicardium के सेलुलर संपत्तियों पर दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक अवसर के रूप में अच्छी तरह से जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन प्रदान करता है। इसके अलावा, घनकोलेजन जैल पर epicardium lturing एक 3 डी मैट्रिक्स के बजाय पारंपरिक 2d मैट्रिक्स, जो इन विवो शरीर क्रिया विज्ञान के एक अधिक सटीक उदाहरण प्रदान करता है में कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है।

हालांकि, इस तकनीक का एक दोष यह होगा कि इस विधि केवल E11.5-E12.5 के बीच भ्रूण दिल से संस्कृति epicardial कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बाद में गर्भ के दौरान या नवजात की अवधि में epicardium पैदा करना और विस्थापित करने की क्षमता खो देता है। इस प्रकार यह बाद में भ्रूण चरणों या वयस्क चूहों से epicardial कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस संस्कृति विधि का उपयोग करने के लिए मुश्किल है।

इस सीमा के बावजूद, इस तकनीक को बुनियादी कौशल संवर्धन और सेटअप का उपयोग करता epicardial कोशिकाओं पूर्व vivo जो epicardium और हृदय के विकास और उत्थान में अपनी भूमिकाओं के अध्ययन के लिए बहुत फायदेमंद होगा के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए।

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Acknowledgments

इस काम के ड्यूक-एनयूएस ग्रेजुएट मेडिकल स्कूल सिंगापुर, गोह नींव और सिंगापुर एनआरएफ फैलोशिप (एनआरएफ-NRFF2016-01) मानवेंद्र कुमार सिंह से धन के द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Life tech invitrogen  11995065
Penicillin/streptomycin solution Life tech invitrogen  15140122
Fetal bovine serum (FBS)  Life tech invitrogen  10500064
Paraformaldehyde Sigma P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) PeproTech 100-21
ZO-1 antibody Life tech invitrogen  40-2200
α-Tubulin antibody Sigma T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody Sigma A 2547
Phalloidin antibody Life tech invitrogen  A12379
3D Collagen Culture kit  Millipore  ECM 675
8-well chamber slide Fisher Scientific NNU 154534-PK
Trizol reagent Life Technologies 15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System Life Technologies 4453536
Superscript First Strand Synthesis kit Life Technologies 11904-018

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References

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