Экстракорпоральное культуры эпикардиального клеток из эмбриональных сердца

* These authors contributed equally
Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramesh, S., Singh, A., Cibi, D. M., Hausenloy, D. J., Singh, M. K. In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart. J. Vis. Exp. (110), e53993, doi:10.3791/53993 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Богатство экспериментальных данных показано, что Эпикард влияет на критические шаги в развитии сердца. В процессе разработки, перегородку transversum приводит к глыбе мезотелиальной клеток , известных как proepicardium 1-4. Клетки из proepicardium затем мигрируют и конверт миокард, образующий эпикарда. Вслед за этим подмножеством эпикарда клетки подвергаются ЕМТ порождая миграционным популяции эпикарда клеток, полученных (EPDCs), которые впоследствии проникают в миокард. Генетический а также ретровирусный родословная отслеживании эксперименты показали, что EPDCs дифференцироваться в различные клоны, включая гладкомышечные клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки и кардиомиоциты (если таковые имеются). Поэтому EPDCs вносят значительный вклад в развитие коронарных сосудов и миокарда архитектуры 1,2,4-9. Кроме того, эпикарда имеет важное значение для развития желудочковой компактного слоя 10-12. При еXample Gittenberger-де Грут и др. показали , что ингибирование вырост proepicardium приводит к массиву дефектов , таких как тонкий миокарда, дефицитной зацикливание сердца и аномальному образованию межжелудочковой перегородки и в результате, к эмбриональной летальности 13. ПАРАКРИННОЙ факторы, секретируемые из эмбрионального эпикарда модулировать пролиферацию кардиомиоцитов и дифференцировки. В соответствии с этим, эпикарда конкретных удаление сигнальных путей , таких как ретиноевая кислота (RA), факторы роста фибробластов (ФРФ) и Wnt / -катенина привело к дефектной роста миокарда и эмбриональной летальности 14-16.

Хотя эпикарда , как полагают, в состоянии покоя у взрослых сердец, недавние исследования показали , что программа развития будет возобновлена ​​в эпикарда после остановки травмы 17,18. После активации клетки подвергаются быстрой пролиферации и EMT, которые приводят к образованию EPDC. Эти клетки демонстрируют CapacitY дифференцироваться в фибробластах и клетках гладкой мускулатуры , но не кардиомиоцитов или эндотелиальных клеток 18. Кроме того, EPDCs секретируют проангиогенные факторы, которые помогают в васкуляризации поврежденной области и тем самым облегчают улучшенную функцию сердца за счет уменьшения размера инфаркта. Из-за этих выводов Эпикард приобрел интерес к изучению сердечно-сосудистых заболеваний, развития и регенерации.

Трансгенные технологии произвели революцию медицинских исследований в 21-м веке. С помощью трансгенных технологий, заболевшие мышиные модели, имитирующие человеческое состояние метаболически и патофизиологически были успешно разработаны. Однако, изучая эпикарда поведение клеток в этих мутантов было проблемой, главным образом из-за ранней эмбриональной летальности. Учитывая значительную роль , которую играет в эпикарда сердца развития и регенерации, мы создали систему культивирования в пробирке для epicardia мышил клетки. Этот метод позволяет долгосрочную культуру эпикарда клеток и облегчает детальное изучение двух важных свойств эпикарда: его способность мигрировать и дифференцироваться. Исключены желудочки от мыши могли быть культивированы на коллагеновые гели, которые могут быть использованы для проведения анализов миграции. Культивируются в 3D - матрицу , которая повторяет коллаген богатых внеклеточного матрицу субэпикардиального слоя лучше повторяет в естественных условиях физиологии клетки. В качестве альтернативы они могут быть культивированы на камерные слайды в целях создания эпикарда монослой, который затем может быть использован для различных последующих применений. Этот монослой может быть использован для окрашивания для плотных соединений белков, которые будут обеспечивать представление о способности эпикарда претерпевать EMT что имеет решающее значение для миграции. Кроме того, эксперименты дифференцировки также могут быть выполнены на этих клетках. Кроме того, профиль экспрессии генов может быть проанализирован путем экстракции РНК из клеток ивыполняя количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР). И, наконец, монослои также можно лечить с агентами, за которыми следует молекулярный анализ, чтобы проверить на потенциальных терапевтических средств. Соединенный, эта система эпикардиальная культура дает нам возможность визуализировать и собирать молекулярные данные, которые наше понимание улучшить систему о эпикардиального развития.

Другим желательным признаком этого способа заключается в том, что он прост и не требует дополнительных настроек. Вкратце, зародыши собирают на E11.5 или E12.5, после чего вырезают сердце. Желудочки затем культивировали на любом коллагеновым гелем или камерные слайды. Затем эти клетки могут быть использованы для проведения экспериментов ниже по течению.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты были одобрены Institutional уходу и использованию животных комитета Duke-NUS Высшей медицинской школы путем.

1. Получение эмбриональных желудочки

  1. Пожертвуйте приурочено беременной мыши на желаемом эмбриональной стадии (E11.5 или E12.5), используя эвтаназии камеру с подачи газообразного диоксида углерода или другого утвержденного метода эвтаназии.
  2. Поместите мышь на спине на секционном столе. Лечить живот самки с 70% -ным этанолом. Подтяжка кожи над животом и сделать небольшой разрез (1-2 см) с лезвием, а затем, удерживая кожу обеими руками и отодвинуться, чтобы обнажить брюшную стенку.
  3. Теперь вырежьте брюшной стенки разоблачить рога матки. Используйте стерильного пинцета, чтобы поднять рог матки и аккуратно срезана жировые ткани и кровеносные сосуды, прикрепленные к роге матки. Вырезать на шейку матки для извлечения матки.
  4. Поместите рога матки в чашку Петри, содержащую стерильный холодный 1x фосфатного Буфф Ered физиологический раствор (PBS) и промыть аккуратно. Поместите чашку Петри на льду.
  5. Используйте ножницы, чтобы вырезать через среднюю линию рога матки (напротив того места, где находится плацента), чтобы выставить эмбрионов, которые до сих пор внутри желтка и прикрепляется к стенке матки через плаценту.
  6. Использование стерильного пинцета, разрезали эмбрионального желтка, чтобы освободить эмбриона.
  7. Поместите эмбрион в новую чашку Петри, содержащую стерильный холодный 1x PBS. Обезглавьте эмбриона и разместить его на своей спине. Разрежьте стенки грудной клетки, чтобы разоблачить сердце.
  8. Используйте стерильного пинцета, чтобы поднять сердце и отсекли сосуды вокруг него, чтобы освободить сердце от грудной стенки. Обратите особое внимание, чтобы не повредить эпикарда сердца с хирургическими инструментами.
  9. Обрежьте тракта оттока и оба предсердия. Передача желудочек другому блюдо с холодным 1x PBS. Поместите блюдо на льду.
  10. Повторите шаги 1,6-1,9 пока все желудочки найденную.
ле "> 2. эпикардиального эксплант

Примечание: Культура эти эпикардиальные эксплантов либо на стекле камеры горках или на коллагеновый гель для последующих применений.

  1. Стеклянная палата Слайды
    1. Для приготовления культуральных сред, добавить 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина / стрептомицина и 2 нг / мл фактора роста фибробластов рекомбинантный 2 (FGF2) в среду Дульбекко, модифицированную по Игла (DMEM). Выполните все действия, описанные в ламинарном потоке.
    2. Добавить 500 мкл культуральной среды в каждую лунку 8-луночного камеры.
    3. Поместите каждую вырезанную желудочек в центре колодца. Сориентируйте желудочек, чтобы держать расчлененный стороной вниз на нижней поверхности скважины.
    4. Осторожно положите пластинку в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатор для культивирования клеток.
    5. Поддерживать культуру с минимальным нарушением, чтобы позволить эксплантов придерживаться. Формирование эпикарда монослой можно наблюдать через 48-72 ч.
    6. Для дифференциации epicardIAL клеток в гладкие мышечные клетки, культуры эпикардиального монослой клеток в среде для дифференцировки в течение еще 6 дней. Для приготовления дифференцировки, добавить 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 50 нг / мл рекомбинантного трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF- 1) к среде DMEM.
    7. Изменение культуральной среды на разные дни.
  2. Коллаген гель
    1. Подготовка коллагеновый гель в 96-луночный планшет с использованием коммерческого набора 3D Коллаген культуры в соответствии с протоколом производителя.
    2. Для получения нужного объема коллагеновый гель, смешать соответствующее количество раствора коллагена с 5х из DMEM и пипетки вверх и вниз. Решение должно желтеют.
    3. Добавьте соответствующий объем нейтрализации раствора и хорошо сразу перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Решение станет розовым.
    4. Пипетка 100 мкл этой смеси в каждую лунку 96-луночного планшета. Поместите пластинку в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 30-60 мин в Альнизкий гель полимеризуется.
    5. Добавить 200 мкл культуральной среды, описанных выше, в каждую лунку.
    6. Поместите каждую вырезанную желудочек в центре колодца. Orient желудочек держать расчлененный стороной вниз на коллагеновый гель (верхушки желудочка должна быть обращена к экспериментатору). Осторожно положите пластину обратно в инкубатор для культивирования клеток.
    7. После 3-х дней, удалите желудочки. Поместите пластину обратно в клеточную культуральную инкубаторе в течение еще 2-х дней.
    8. Изменение культуральной среды на разные дни.

3. Закрепление и визуализация

Примечание: эпикарда клетки могут быть визуализированы на любой из палат слайдах из стекла или коллагеновый гель.

  1. Аспирацию из средств массовой культуры и добавляют равный объем стерильного 1x PBS, чтобы промыть клетки.
  2. Добавьте только достаточно 4% параформальдегида (PFA), чтобы покрыть клетки. Закрепить клетки в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  3. Удалить PFA и мыть эксплантов с 1x PBST (1x PBS с0,1% Тритон Х-100), чтобы клетки проницаемыми.
  4. Immunostain с желаемого антитела (например , Alexa Fluor 488-фаллоидином; ZO-1, α-тубулина и α-актин гладких мышц) 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При использовании этого протокола культуры, первичные эпикарда клетки могут быть выделены с высокой степенью чистоты для последующих применений. Культивируемые клетки способны подвергаться EMT, мигрируют и дифференцируются как клетки эпикарда делать в естественных условиях.

Для определения чистоты нашей первичной эпикардиального культуры клеток, мы проанализировали эпикардиальные эксплантов , сгенерированные из Sema3d GFPCre / +; R26 Том / + эмбрионов. Sema3d выражается в эпикарда клеток на ранних стадиях развития сердца, таким образом, эпикардиальные клетки, полученные из этих эмбрионов будут помечены RFP. Мы выделили желудочки от Sema3d GFPCre / +; R26 Том / + эмбрионов для эпикардиальные эксплантов. После 48-72 часов, мы смогли увидеть монослой клеток эпикарда. Накладывая ЗП иммунофлюоресценции и Светлое изображения показали, что большинствоклеток , которые мигрировали из желудочков имеют эпикардиального происхождения (рис 1А - С). Мы дополнительно подтверждена наши результаты путем выделения РНК из первичных клеток эпикарда и выполнения КПЦР , которые показали сильную экспрессию эпикарда специфических генов (Tbx18 и WT1) в отличие от гена маркера кардиомиоцитов (Nkx2.5) (рис 1C).

Далее мы исследовали способность клеток к ЕМТ путем анализа клеточной полярности и межклеточных контактов из эпикарда клеток. ЕМТ представляет собой биологический процесс, который позволяет эпителиальные клетки потерять свою полярность клеток и межклеточных контактов для того, чтобы превратить в миграционном мезенхимальной клетки. Первым шагом EMT является отслойка межклеточных контактов. Мы иммуноокрашиванию эпикардиальные клетки с ZO-1 (также известный как Tjp1, плотный узел белка 1), который показал локализацию ZO-1 к плазматической мембране показывая, что клетки имеютеще пройти EMT (фиг.2А). Далее мы провели иммунным для альфа-тубулина (рис 2В) , с тем , чтобы наблюдать за организацию микротрубочек в эпикардиальные эксплантов, показавших поляризованный выравнивания , которая облегчает направленную миграцию клеток эпикарда. Кроме того, для определения дифференциации потенциал эпикарда клеток, мы культивировали их в течение 6 дней в среде для дифференцировки, содержащей рекомбинантный TGF- 1. Иммуногистохимическое SMA продемонстрировала успешную дифференциацию эпикарда клеток в клетки гладких мышц (рис 2С).

И, наконец, для анализа эпикарда происхождения миграции клеток и эпикарда EMT, мы также провели коллагеновый гель вторжения анализа. Эпикарда клетки, полученные из визуализировали фаллоидином иммуноокрашивания. Успешная миграция эпикарда клеток , полученных можно увидеть все вокруг эксплантов (рис 3А). Для определения Depth проникновения клеток в матрицу коллагена, 3D-реконструкция генерируется из конфокальных изображений. Проникновение эпикарда клеток , полученных можно увидеть в Z-стеки (фигура 3В).

Рисунок 1
. Рисунок 1: Первичная культура эпикардиального клеток из эмбриональных мыши сердец Представитель светлое (А) и RFP иммунофлюоресценции (B) изображения первичных эпикарда клеток , полученных от E12.5 Sema3d GFPCre / +; R26 / Том + сердца. Объединять и иммунофлюоресценции светлое изображение (C). Относительные уровни экспрессии мРНК эпикарда маркеров (Tbx18 и WT1) и маркера кардиомиоцитов (Nkx2.5) в первичных эпикарда клеток (D). Результаты были нормированы к экспрессии GAPDH, и Относительные уровни экспрессии приведены в качестве кратную разницу по сравнению с выражением Nkx2.5 (п = 3). Данные представлены в виде среднего значения ± SD. Шкала бар = 200 мкм. *, Р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Первичный эпикардиального клетки сохраняют способность претерпевать EMT и дифференцировку иммунным окрашиванием на эпикардиальные эксплантов для ZO-1 (A, зеленый) или α-тубулина (B, зеленый).. DAPI используются для визуализации ядер (синий). Эпикардиального клетки дифференцируются в клетки гладких мышц в течение 6 дней и окрашивали альфа-актин гладких мышц (SMA) (C, красный). Шкала бар = 100 мкм.3993fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Эпикарда Миграция клеток на поверхности коллагеновый гель Желудочки от E12.5 эмбрионов культивировали на трехмерной матрице геля коллагена и окрашивали Alexa Fluor 488-фаллоидином визуализировать эпикарда происхождения миграции клеток и проникновение (а). Конфокальные изображения были использованы для построения трехмерного изображения , чтобы определить проникновение клеток вдоль Z-оси (B). Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это имеет решающее значение для разработки методов, которые облегчают изучение эпикарда для удовлетворения растущего значения эпикарда сердечного развития и регенерации. Система эпикардиальная культуры создает значительные преимущества для эпикардиального исследований.

Альтернативный способ изолировать эпикардиальные клетки является использование флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS). Этот метод основан на использовании эпикарда маркеров (или эпикарда-клеточно-специфической трансгенной экспрессии гена флуоресцентного белка), чтобы отделить эпикардиальные клетки из других родов. Тем не менее, все большее количество доказательств показало, что эпикардиальные маркеры не экспрессируется исключительно в эпикарда. Например, Tbx18 выражается в миокарде межжелудочковой перегородки (IVS) в то время как Wt1 выражается в эндотелии 19-21. Следовательно, чистота популяции эпикарда клеток, выделенных сомнительна. В противоположность этому, способ культивирования описанный здесь занимаетdvantage миграционного характера эпикарда клеток. Это позволяет изоляции с высокой степенью чистоты популяции клеток эпикарда, как показали наши генетические эксперименты маркировки. Другой способ получения эпикардиальные клеток будет дифференциация человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в эпикарда клеток путем модуляции главным образом в BMP, WNT и путей передачи сигналов ретиноевой кислоты. Эти дифференцированные клетки очень похожи на физические и молекулярные характеристики эмбриональных клеток эпикарда. Они не только способны подвергаться EMT , но также способны дифференцироваться в фибробласты и клетки гладкой мускулатуры 22,23. Хотя этот метод является весьма перспективным, он значительно более сложным и трудоемким, чем эпикардиального культуры, описанной в этой статье время.

Кроме того, эта техника культура не требует дополнительного специализированного оборудования и существующей установки для культуры ткани является достаточным. Следуя этому протоколу, крайне важно, чтобы заплатить SПЕЦИАЛЬНЫЙ внимание, чтобы не повредить эпикарда с хирургическими инструментами при извлечении сердца. Кроме того, очень важно, чтобы ориентировать вырезанную желудочек с рассеченной стороной, обращенной либо к поверхности коллагенового геля или камеру горкой, чтобы облегчить миграцию клеток эпикарда. И наконец, культура должна поддерживаться с минимальным нарушением, с тем, чтобы позволить эксплантов придерживаться культуры блюдо.

Популяция клеток, полученных затем могут быть использованы для выполнения различных последующих экспериментов, будет способствовать дальнейшему наше понимание эпикардиального клеточной биологии. Культивирование эксплантов на камере слайдах обеспечивает эпикардиальные монослоев для различных экспериментов, включая эпикардиального клеточную пролиферацию, выживание, миграцию, EMT и дифференцировки в сердечных родословных. Он также предоставляет возможность проверить влияние препаратов на клеточных свойств эпикарда, а также изменения экспрессии генов, связанный с лекарственной терапии. Кроме того, у.е.lturing эпикарда на коллагеновые гели позволяет анализировать клетки в 3D - матрице вместо традиционной 2D матрицы, что обеспечивает более точную иллюстрацию в естественных условиях физиологии.

Однако недостатком этого метода будет то, что этот метод может быть использован только для культуры эпикарда клеток из эмбриональных сердец между E11.5-E12.5. Во время поздней беременности или в неонатальном периоде Эпикард теряет способность к пролиферации и миграции. Таким образом, трудно использовать этот метод культуры, чтобы изолировать эпикардиальные клетки от поздних эмбриональных стадий или взрослых мышей.

Несмотря на это ограничение, этот метод использует базовые навыки культивирования и установки , чтобы способствовать росту клеток эпикарда бывших естественных условиях , которые было бы очень полезно для изучения эпикарда и его роли в развитии сердца и регенерации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана за счет средств DUKE-НУК Высшей медицинской школы Сингапура, Goh фонда и Сингапур NRF общения (NRF-NRFF2016-01) до Manvendra К. Сингх.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Life tech invitrogen  11995065
Penicillin/streptomycin solution Life tech invitrogen  15140122
Fetal bovine serum (FBS)  Life tech invitrogen  10500064
Paraformaldehyde Sigma P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) PeproTech 100-21
ZO-1 antibody Life tech invitrogen  40-2200
α-Tubulin antibody Sigma T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody Sigma A 2547
Phalloidin antibody Life tech invitrogen  A12379
3D Collagen Culture kit  Millipore  ECM 675
8-well chamber slide Fisher Scientific NNU 154534-PK
Trizol reagent Life Technologies 15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System Life Technologies 4453536
Superscript First Strand Synthesis kit Life Technologies 11904-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
  2. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  3. Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
  4. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  5. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  6. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  7. Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
  8. Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
  9. Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
  10. Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
  11. Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
  12. Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
  13. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
  14. Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  15. Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
  16. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
  17. Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
  18. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  19. Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
  20. Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
  21. Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
  22. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  23. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics