במבחנה והתרבות של תאי Epicardial מתוך לב העכבר עוברי

* These authors contributed equally
Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramesh, S., Singh, A., Cibi, D. M., Hausenloy, D. J., Singh, M. K. In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart. J. Vis. Exp. (110), e53993, doi:10.3791/53993 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

שפע של נתוני ניסוי הדגים כי epicardium משפיע שלבים קריטיים בפיתוח לב. במהלך הפיתוח, מחצה transversum מוליד גוש של תאים mesothelial המכונה proepicardium 1-4. תאים מן proepicardium מכן להעביר ומעטפת שריר הלב להרכיב את epicardium. בעקבות זאת, תת קבוצה של תאים epicardial לעבור והוליד EMT לאוכלוסייה הנדידה של תאים שמקורם epicardium (EPDCs) כי לאחר מכן לפלוש שריר הלב. שושלת גנטית וכן retroviral התחקות ניסויים הוכיחה כי EPDCs להתמיין שושלות שונות, כולל תאי שריר חלק, פיברובלסטים, אנדותל תאי cardiomyocytes (אם בכלל). לכן EPDCs לתרום רבות להתפתחות של כלי הדם הכליליים ואדריכלות שריר הלב 1,2,4-9. יתר על כן, epicardium חיוני לפיתוח השכבה הקומפקטית חדרית 10-12. לקבלת דוארxample Gittenberger-דה גרוט et al., הוכיח כי עיכוב התולדה של proepicardium מוביל מערך של ליקויים כגון שריר לב רזה, looping הלקוי של לב היווצרות מחץ interventricular נורמלית וכתוצאה מכך, 13 הקטלניות עובריות. גורמי paracrine מופרשי epicardium העוברי לווסת התפשטות cardiomyocyte והבחנה. בקנה אחד עם זו, מחיקה ספציפי epicardium של מסלולי איתות כגון חומצה רטינואית (RA), גורמי גדילה פיברובלסטים (FGFs) ו Wnt / β-קטנין הביאה לצמיחת שריר לב פגומה קטלנית עוברי 14-16.

למרות epicardium היה ככל הנראה רדום לבבות מבוגרים, מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי תכנית התפתחותית מחדש של epicardium הבא לב פציעת 17,18. לאחר ההפעלה, התאים עוברים התפשטות מהירה EMT שתוצאתן היווצרות EPDC. תאים אלה מציגים את capacity להתמיין פיברובלסטים ותאי שריר חלק אבל לא cardiomyocytes או תאי האנדותל 18. בנוסף, EPDCs מפריש גורמי proangiogenic שסיוע של כלי הדם של האזור הפגוע ובכך להקל על תפקוד לב משופר על ידי הקטנת הגודל האוטם. בשל ממצאים אלה, epicardium צברה עניין במחקר של פיתוח, מחלות לב וכלי דם והתחדשות.

טכנולוגיה מהונדסת יש מהפכה במחקר רפואי במאות ה -21. בעזרת טכנולוגיות מהונדסות, במודלים של עכברים חולים מחקו את המצב האנושי מבחינה מטבולית ו pathophysiologically פותחו בהצלחה. עם זאת, לומד את התנהגות התא epicardial מוטנטים אלה כבר אתגר בעיקר בשל הקטלניות עובריים מוקדם. בהתחשב תפקיד משמעותי כי epicardium משחק בפיתוח והתחדשות לב, הקמנו מערכת תרבות במבחנה לעכבר epicardiaתאי l. שיטה זו מאפשרת תרבות ארוכת הטווח של תאי epicardial ומקל על מחקר מפורט של שני המאפיינים החשובים של epicardium: יכולתו להעביר ולבדל. תעלות חדרי המוח נכרת מן העכבר יכול להיות מתורבת על ג'ל קולגן אשר ניתן להשתמש בהם כדי לנהל מבחני הגירה. בתרבית במטריצה ​​3D כי משכפל את תאי מטריקס עשיר קולגן של השכבה subepicardial טוב משכפלת את הפיזיולוגיה תא vivo. לחלופין, הם יכולים להיות מתורבתים בשקופיות קאמריות כדי להקים monolayer epicardial אז מה שיכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים במורד זרם. בשכבה זו יכולה לשמש כדי להכתים חלבונים צומת חזק אשר יספק תובנות על היכולת של epicardium לעבור EMT שהוא חיוני עבור הגירה. בנוסף, ניסויים בידול יכול גם להתבצע על תאים אלה. יתר על כן, פרופיל ביטוי גנים יכול להיות מנותח על ידי חילוץ RNA מן התאיםביצוע תגובת שרשרת פולימראז כמותיים (qPCR). לבסוף, monolayers יכול גם להיות מטופלות בעזרת חומרי ואחריו ניתוח מולקולרי לבדוק רפויים פוטנציאלי. להרכיב, מערכת תרבות epicardial זה מספקת לנו את ההזדמנות כדי להמחיש ולאסוף נתונים מולקולריים אשר מסייע להבנה על פיתוח epicardial.

עוד תכונה רצויה של שיטה זו היא שהיא פשוטה ולא הגדרה מורכבת נדרשת. בקיצור, את העוברים נקצרים בכל הבאה E11.5 או E12.5 בו הלב הוא נכרת. תעלות חדרי המוח אז בתרבית על ג'ל או קולגן או שקופיות קאמריות. כתוצאה מכך, התאים האלה יכולים לשמש כדי לבצע ניסויים במורד זרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים הספר לרפואה בוגר Duke-NUS ושימוש.

1. אחזור העוברי החדרים

  1. קורבן עכבר בהריון בעיתוי בשלב העוברי הרצוי (E11.5 או E12.5) באמצעות תא המתת חסד עם אספקת גז דו תחמוצת הפחמן או שיטה אחרת המתת חסד אושרה.
  2. מניחים את העכבר על גבו על שולחן הניתוחים. לחטא את הבטן של הנקבה עם אתנול 70%. הרם את העור מעל הבטן ולעשות חתך קטן (1-2 ס"מ) עם להב, ולאחר מכן החזק את העור בשתי ידיים מתרחק כדי לחשוף את דופן הבטן.
  3. עכשיו לחתוך את דופן הבטן לחשוף את קרן הרחם. שימוש במלקחיים סטרילי כדי להרים את קרן הרחם ובזהירות לחתוך את רקמות השומן וכלי דם מצורפות קרן הרחם. חותכים את צוואר הרחם כדי לאחזר את הרחם.
  4. מניחים את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה Buff פוספט 1x קר סטרילי ered מלוח (PBS) ולשטוף בעדינות. מניחים את צלחת פטרי על הקרח.
  5. השתמש במספריים לחתוך את קו האמצע של קרן הרחם (מול לאתר שבו השליה ממוקמת) לחשוף את העוברים כי עדיין בתוך שק החלמון ואת המחובר לקיר הרחם דרך השליה.
  6. בעזרת מלקחיים סטריליות, לבתק את שק החלמון העוברי לשחרר את העובר.
  7. מניחים את העובר בצלחת פטרי חדשה המכילה PBS 1x קר סטרילי. לערוף את העובר ומניחים אותו על גבו. גזור לפתוח את בית החזה כדי לחשוף את הלב.
  8. שימוש במלקחיים סטרילי כדי לרומם את הרוח וחתך את הכלי סביבו כדי לשחרר את הלב מקיר החזה. שימו לב מיוחדת שלא לפגוע epicardium של הלב עם כלים כירורגיים.
  9. חתוך את דרכי היצוא ושניהם פרוזדורים. מעביר את החדר כדי צלחת נוספת עם PBS 1x הקר. מניח את הצלחת על קרח.
  10. חזור על שלבים 1.6-1.9 עד שכל החדרים מאוחזרות.
le "> 2. Epicardial explant תרבות

הערה: תרבות explants epicardial אלה גם בשקופיות קאמרית זכוכית או על ג'ל קולגן עבור יישומים במורד הזרם.

  1. זכוכית לשכת שקופיות
    1. כדי להכין את התקשורת והתרבות, להוסיף 10% בסרום שור העובר (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 ng / צמיחה פיברובלסטים רקומביננטי מ"ל גורם 2 (FGF2) עד בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM). בצע את כל שלבי ברדס הזרימה למינרית.
    2. הוסף מדיה התרבות 500 μl היטב בכל תא 8-היטב.
    3. מניח כל חדר ניכר במרכז באר. אוריינט החדר כדי לשמור על הצד גזור למטה על פני השטח התחתון של הבאר.
    4. בעדינות לשים את הצלחת חממת תרבית תאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    5. שמירה על תרבות עם הפרעה מינימלית כדי לאפשר את explants לדבוק. כינונה של monolayer epicardial ניתן לראות לאחר 48-72 שעות.
    6. לבידול של epicardתאי ial לתאי שריר חלק, תרבות תאים בשכבה epicardial בתקשורת בידול עבור 6 ימים נוספים. כדי להכין את התקשורת בידול, להוסיף 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -50 ng / גורם הגדילה ששינתה את המציאות רקומביננטי מ"ל 1 בטא (TGF-β1) כדי DMEM.
    7. שנה את התקשורת והתרבות לסירוגין.
  2. קולגן ג'ל
    1. הכן את ג'ל קולגן צלחת 96-היטב באמצעות ערכת מסחרי 3D קולגן תרבות על פי פרוטוקול של היצרן.
    2. כדי להכין את העוצמה הרצויה של ג'ל קולגן, לערבב את הכמות המתאימה של פתרון קולגן עם 5x של DMEM ו פיפטה למעלה ולמטה. הפתרון צריך להפוך צהוב.
    3. הוספת נפח מקביל של פתרון נטרול ומערבב היטב מייד על ידי pipetting למעלה ולמטה. הפתרון יהפוך ורוד.
    4. פיפטה 100 μl של תערובת זו לבאר כל צלחת 96-היטב. מניחים את צלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 30-60 דקות עד אלהג'ל נמוך לפלמר.
    5. הוסף 200 μl של התקשורת בתרבות שתוארו לעיל היטב כל אחד.
    6. מניח כל חדר ניכר במרכז באר. כוונו את החדר כדי לשמור על הצד הגזור למטה על ג'ל קולגן (הקודקוד של החדר צריך להתמודד עם הנסיין). בעדינות לשים את הצלחת בחזרה בחממת תרבית תאים.
    7. לאחר 3 ימים, להסיר את החדרים. מכניס את הצלחת בחזרה לתוך חממת תרבית תאים עבור 2 ימים נוספים.
    8. שנה את התקשורת והתרבות לסירוגין.

קיבוע ויזואליזציה 3.

הערה: תאי Epicardial ניתן דמיינו על זכוכית או שקופיות קאמריות או ג'ל קולגן.

  1. לשאוב את התקשורת והתרבות ולהוסיף נפח שווה של PBS 1x סטרילי כדי לשטוף את התאים.
  2. להוסיף מספיק 4% paraformaldehyde (PFA) כדי לכסות את התאים. תקן את התאים במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  3. הסר PFA ולשטוף explants עם 1x PBST (1x PBS עם0.1% טריטון X-100) כדי permeabilize התאים.
  4. Immunostain עם נוגדן הרצוי (למשל אלקסה פלואוריד 488-phalloidin; ZO-1, α-טובולין ו אקטין שריר חלקה α) 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש זה פרוטוקול התרבות, תאי epicardial עיקריים יכולים להיות מבודדים עם טוהר גבוה עבור יישומים במורד זרם. התאים בתרבית מסוגלים לעבור EMT, להעביר ולבדל רק כתאים epicardial לעשות in vivo.

כדי לקבוע את הטוהר של תרבית תאי epicardial העיקרית שלנו, נתחנו את explants epicardial המופק Sema3d GFPCre / +; R26 טום / + עובר. Sema3d מתבטא בתאי epicardial במהלך התפתחות לב מוקדם, ובכך תאי epicardial שמקורם בעוברים אלה יתויג RFP. בודדנו החדרים מן Sema3d GFPCre / +; R26 טום / + עוברים explants epicardial. לאחר 48-72 שעות, הצלחנו לראות בשכבה של תאים epicardial. יצירת ערמת immunofluorescence RFP ותמונות brightfield עולה כי רובשל התאים נדדו מן החדרים הם ממוצא epicardial (איור 1 א - ג). בנוסף, אנו תוקפים התוצאות שלנו על ידי בידוד RNA מתאי epicardial העיקריים וביצוע qPCR אשר הראה ביטוי חזק של גנים ספציפיים epicardial (Tbx18 ו Wt1) להבדיל גן סמן cardiomyocyte (Nkx2.5) (תרשים 1C).

הבא בחנו את יכולת התאים לעבור EMT ידי ניתוח קוטביות תא תאי תאי הקשר של תאי epicardial. EMT הוא תהליך ביולוגי המאפשר תא אפיתל לאבד קוטביות בתא שלו וקשר תאי תאים כדי להפוך לתא mesenchymal נודד. הצעד הראשון של EMT הוא הניתוק של קשר תאי תאים. אנחנו immunostained תאים epicardial עם ZO-1 (הידוע גם בשם Tjp1, חלבון צומת צמודה 1) שהראה לוקליזציה של ZO-1 קרום הפלזמה המציין כי התאים ישעדיין לעבור EMT (איור 2 א). הבא ביצענו immunostaining עבור α-טובולין (איור 2 ב) כדי לבחון את הארגון של microtubules ב explants epicardial, אשר הראה יישור מקוטב המאפשרת הגירה כיוונית של תאים epicardial. בנוסף, על מנת לקבוע את פוטנציאל ההתמיינות של תאי epicardial, אנו מתורבתים אותם במשך 6 ימי תקשורת בידול המכילים β1 TGF רקומביננטי. Immunostaining עבור SMA הפגין בידול מוצלח של תאי epicardial לתאי שריר חלק (איור 2 ג).

לבסוף, לנתח נדידת תאים שמקורם epicardium ו EMT epicardial, אנחנו גם בצענו assay פלישת ג'ל קולגן. תאי Epicardium הנגזרת היו דמיינו ידי phalloidin immunostaining. הגירה מוצלחת של תאים שמקורם epicardium ניתן לראות בכל רחבי explant (איור 3 א). כדי לקבוע את דepth החדירה לתא לתוך המטריצה ​​קולגן,-שחזור 3D נוצר מתמונות confocal. חדירה של תאים שמקורם epicardium ניתן לראות Z- ערימות (איור 3 ב).

איור 1
. איור 1: תרבות הראשית של תאי Epicardial מן עובריים עכבר לבבות brightfield נציג (א) ו immunofluorescence RFP (ב) תמונות של תאי epicardial העיקריים המופקים E12.5 Sema3d GFPCre / +; R26 טום / + לבבות. תמונה brightfield ו immunofluorescence הממוזגת (C). רמות ביטוי mRNA יחסית של סמני epicardial (Tbx18 ו Wt1) סמן cardiomyocyte (Nkx2.5) בתאי epicardial העיקריים (D). התוצאות היו מנורמל ביטוי GAPDH, ואת רמות ביטוי יחסיות מקבלות כהבדל לקפל לעומת ביטוי Nkx2.5 (n = 3). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. *, P <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ראשי תאי Epicardial שמורים אפשרות לעבור EMT והבחנת Immunostaining על explants epicardial עבור ZO-1 (A, ירוק) או α-טובולין (B, ירוק).. DAPI שמש לדמיין גרעינים (כחול). תאי Epicardial הובדלו לתאי שריר חלק במשך 6 ימים ו מוכתם יקטין שריר α-חלקה (SMA) (C, אדום). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.3993fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. נדידת תאי Epicardial על משטח ג'ל קולגן חדרים מעוברים E12.5 היו בתרבית על מטריצת ג'ל תלת ממדי קולגן מוכתם אלקסה פלואוריד 488-phalloidin לדמיין נדידת תאים שמקורם epicardium והחדיר (א). תמונות Confocal ששמשו לבניית תמונה תלת-ממדית כדי לקבוע חדירת תא לאורך צירי z (B). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זה הוא מכריע לפתח טכניקות להקל על המחקר של epicardium כדי לשרת את המשמעות הגוברת של epicardium בפיתוח לב והתחדשות. מערכת התרבות epicardial תנוחות יתרונות משמעותיים למחקר epicardial.

דרך חלופית לבודד תאים epicardial היא להשתמש מיון התא המופעל פלואורסצנטי (FACS). שיטה זו מסתמכת על שימוש סמני epicardial (או ביטוי מהונדס epicardium-תא ספציפי של חלבון פלואורסצנטי) כדי להפריד תאי epicardial משורות אחרות. עם זאת, סכום של ראיות הגדלה הראה כי סמני epicardial אינם באים לידי הביטוי באופן בלעדי epicardium. לדוגמה, Tbx18 מתבטא לשריר הלב של מחצה interventricular (IVS) תוך Wt1 מתבטא האנדותל 19-21. לפיכך, את הטוהר של אוכלוסיית תאי epicardial המבודדת מוטל בספק. לעומת זאת, שיטת התרבות שתוארה לעיל לוקחתdvantage של טבע הנדידה של תאי epicardial. זה מאפשר בידוד של אוכלוסייה טהורה מאוד של תאי epicardial כפי שמוצג על ידי ניסויי התיוג הגנטיים שלנו. דרך נוספת להשיג תאים epicardial יהיה הבידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים האדם (hPSCs) לתאים epicardial ידי ויסות בעיקר BMP, Wnt מסלולי איתות החומצה הרטינואית. תאים מובחנים אלה דומים המאפיינים הפיסיים ומולקולריים של תאים עובריים epicardial. הם לא רק מסוגלים לעבור EMT אבל הם גם מסוגלים להתמיין פיברובלסטים ותאי שריר חלק 22,23. למרות שיטה זו היא מבטיחה מאוד, הוא משמעותי יותר מסובך וזמן רב יותר מאשר בתרבות epicardial המתואר במאמר זה.

בנוסף, טכניקת התרבות זו אינה דורשת ציוד מיוחד נוסף התקנה בתרבית רקמה קיימת מספיקה. בעוד בעקבות פרוטוקול זה, חשוב לשלם sתשומת pecial שלא לפגוע epicardium עם כלים כירורגיים בעת אחזור בלב. בנוסף, זה קריטי כדי לכוון את החדר ניכר עם הצד הגזור פונה אל פני השטח של ג'ל קולגן או השקופיות קאמריות כדי להקל נדידת תאי epicardial. לבסוף, התרבות צריכה להישמר עם הפרעה מינימאלית כדי לאפשר explant לדבוק מנת התרבות.

אוכלוסיית תאים המתקבלים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבצע מגוון של ניסויים במורד זרם אשר יקדמו את הבנתנו הביולוגיה של תא epicardial. Culturing את explants על שקופיות קאמרית מספק monolayers epicardial לניסויים שונים כולל התפשטות תאים epicardial, הישרדות, הגירה, EMT והבחנה לתוך שושלות לב. הוא גם מספק הזדמנות לבחון את ההשפעה של תרופות על המאפיינים הסלולר של epicardium וכן שינויים בביטוי גנים הקשורים לטיפול התרופתי. בנוסף, מ"קlturing epicardium על ג'ל קולגן מאפשר ניתוח של תאים במטריצה ​​3D במקום 2D מטריקס המסורתית, אשר מספק המחשה מדויקת יותר של הפיזיולוגיה vivo.

עם זאת, חסרון של שיטה זו יהיה כי שיטה זו יכולה לשמש רק לתאי epicardial תרבות מלבבות עובריות בין-E12.5 E11.5. במהלך מאוחר ההיריון או בתקופת הילוד epicardium מאבד את היכולת להתרבות ולהעביר. לכן קשה להשתמש בשיטה זו התרבות לבודד תאים epicardial מן בשלבים עובריים מאוחר יותר או עכברים בוגרים.

למרות מגבלה זו, טכניקה זו משתמשת מיומנויות culturing בסיס התקנה כדי להקל את הצמיחה של תאי epicardial vivo לשעבר אשר יהיו מועיל מאוד עבור המחקר של epicardium ותפקידיה בפיתוח לב והתחדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מסינגפור הספר לרפואה בוגר DUKE-NUS, קרן גו וסינגפור המילגה NRF (NRF-NRFF2016-01) כדי Manvendra ק סינג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Life tech invitrogen  11995065
Penicillin/streptomycin solution Life tech invitrogen  15140122
Fetal bovine serum (FBS)  Life tech invitrogen  10500064
Paraformaldehyde Sigma P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) PeproTech 100-21
ZO-1 antibody Life tech invitrogen  40-2200
α-Tubulin antibody Sigma T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody Sigma A 2547
Phalloidin antibody Life tech invitrogen  A12379
3D Collagen Culture kit  Millipore  ECM 675
8-well chamber slide Fisher Scientific NNU 154534-PK
Trizol reagent Life Technologies 15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System Life Technologies 4453536
Superscript First Strand Synthesis kit Life Technologies 11904-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
  2. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  3. Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
  4. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  5. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  6. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  7. Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
  8. Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
  9. Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
  10. Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
  11. Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
  12. Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
  13. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
  14. Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  15. Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
  16. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
  17. Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
  18. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  19. Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
  20. Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
  21. Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
  22. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  23. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics