In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz

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Ramesh, S., Singh, A., Cibi, D. M., Hausenloy, D. J., Singh, M. K. In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart. J. Vis. Exp. (110), e53993, doi:10.3791/53993 (2016).

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Abstract

Introduction

Eine Fülle von experimentellen Daten haben gezeigt, dass die Epikard kritischen Schritte in der Herzentwicklung beeinflusst. Während der Entwicklung gibt das Septum transversum Aufstieg zu einem Klumpen von Mesothelzellen als Proepikard bekannt 1-4. Zellen aus dem Proepikard dann wandern und das Myokard Bildung der Epikard umhüllen. Im Anschluss daran durchlaufen eine Untergruppe von Zellen epikardialen EMT was zu einer Population von wandernd Epikard-abgeleiteten Zellen (EPDCs), der anschließend das Myokard eindringen. Genetic sowie retrovirale lineage Verfolgungsexperimente haben gezeigt, dass EPDCs in verschiedenen Abstammungen, einschließlich glatter Muskelzellen differenzieren, Fibroblasten, Endothelzellen und Kardiomyozyten (falls vorhanden). Daher EPDCs tragen wesentlich zur Entwicklung der Koronargefäße und myokardiale Architektur 1,2,4-9. Darüber hinaus ist das Epikard wesentlich für die Entwicklung der ventrikulären Preßkörperschicht 10-12. Für example Gittenberger-de Groot et al. zeigten , daß das Auswachsen der Proepikard Hemmung führt zu einer Reihe von Defekten, wie einer dünnen Myokard defizienten Umschlingung des Herzens und abnormal interventrikulären Septum Bildung und als Ergebnis 13 embryonaler Letalität. Parakrine Faktoren aus dem embryonalen Epikard sezerniert modulieren Kardiomyozyten Proliferation und Differenzierung. Übereinstimmend damit Epikard spezifische Deletion von Signalwegen wie Retinsäure (RA), Fibroblasten - Wachstumsfaktoren (FGFs) und Wnt / β-Catenin in Folge fehlerhaften myocardial Wachstum und embryonaler Letalität 14-16.

Obwohl das Epikard in erwachsenen Herzen Ruhe sein wurde geglaubt, haben neuere Studien gezeigt , dass das Entwicklungsprogramm 17,18 folgenden Herzschädigung in das Epikard reaktiviert. Nach der Aktivierung durchlaufen die Zellen schnelle Verbreitung und EMT, die in EPDC Bildung führen. Diese Zellen zeigen die capacity in Fibroblasten und glatten Muskelzellen zu differenzieren , jedoch nicht Kardiomyozyten oder Endothelzellen 18. Darüber hinaus scheiden die EPDCs proangiogenic Faktoren, die Hilfe bei der Vaskularisierung des verletzten Bereich und somit durch eine Verringerung der Infarktgröße verbesserte Herzfunktion erleichtern. Aufgrund dieser Befunde wurde die Epikard Interesse bei der Untersuchung von Herz-Kreislauf-Entwicklung, der Krankheit und Regeneration gewonnen.

Transgene Technologie hat die medizinische Forschung im 21. Jahrhundert revolutioniert. Mit Hilfe von transgenen Technologien, imitiert erkrankten Maus-Modellen den menschlichen Zustand metabolisch und pathophysiologisch erfolgreich entwickelt. Doch in diesen Mutanten die epikardiale Zellverhalten zu studieren war eine Herausforderung vor allem wegen der frühen embryonalen Letalität gewesen. Angesichts der bedeutenden Rolle, die das Epikard in kardialen Entwicklung und Regeneration spielt, haben wir ein in - vitro - Kultursystem für die Maus etabliert epicardial-Zellen. Dieses Verfahren ermöglicht die langfristige Kultur der epikardialen Zellen und erleichtert die detaillierte Untersuchung der zwei wichtige Eigenschaften des Epikard: ihre Fähigkeit zur Migration und zu differenzieren. Die exzidierten Ventrikel von der Maus konnte auf Kollagen-Gelen gezüchtet werden, die verwendet werden können, um Migrationsassays durchzuführen. Wird in einer 3D - Matrix kultiviert, die das Kollagen-reiche extrazelluläre Matrix der subepikardialen Schicht rekapituliert Physiologie der in vivo - Zelle besser repliziert. Alternativ können sie auf der Kammer gleitet, um kultiviert werden, um eine epikardiale Monoschicht zu schaffen, die dann für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann. Diese Monoschicht kann verwendet werden für tight junction-Proteine ​​zu färben, die Erkenntnisse über die Fähigkeit des Epikard liefert EMT zu unterziehen, die für die Migration von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus können auch auf diesen Zellen durchgeführt Experimente Differenzierung werden. Weiterhin kann Genexpressionsprofil durch Extrahieren von RNA aus den Zellen analysiert werden, undDurchführung quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Schließlich könnten auch die Monoschichten mit Mitteln, durch eine molekulare Analyse gefolgt behandelt werden für potentielle Therapeutika zu testen. Stellen Sie sich diese epikardialen Kultursystem bietet uns die Möglichkeit, zu visualisieren und molekularen Daten sammeln, die unser Verständnis über epikardiale Entwicklung fördert.

Ein weiteres wünschenswertes Merkmal dieses Verfahrens ist, dass es einfach ist und keine aufwendige Einrichtung erforderlich ist. Kurz gesagt, werden die Embryonen bei E11,5 oder E12,5 folgenden geerntet, die das Herz herausgeschnitten wird. Die Ventrikel sind dann kultiviert entweder auf Kollagen-Gel oder eine Kammer gleitet. Anschließend können diese Zellen verwendet werden, stromabwärts Experimente durchzuführen.

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Protocol

Alle Experimente wurden von der Duke-NUS Graduate Medical School Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Abrufen der Embryonale Ventricles

  1. Opfere eine zeitlich schwangere Maus an der gewünschten Embryonalstadium (E11,5 oder E12,5) eine Euthanasie Kammer mit Kohlendioxidgas Versorgung oder einer anderen zugelassenen Euthanasie-Verfahren.
  2. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einem Seziertisch. Desinfizieren Sie den Bauch der Frau mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut über dem Bauch und machen einen kleinen Schnitt (1-2 cm) mit einer Klinge, dann halten Sie die Haut mit beiden Händen und ziehen weg die Bauchdecke zu belichten.
  3. Nun schneiden Sie die Bauchdecke des Uterushorn zu belichten. Verwenden einer sterilen Pinzette das Uterushorn zu heben und vorsichtig die fetten Gewebe und Blutgefäße an der Uterushorn wegschneiden. Schneiden Sie an den Gebärmutterhals in die Gebärmutter zu erhalten.
  4. Legen Sie das Uterushorn in einer Petrischale mit steriler kalt 1x Phosphat Buff Ered Saline (PBS) und spülen Sie vorsichtig. Legen Sie die Petrischale auf Eis.
  5. Mit einer Schere durch die Mittellinie des uterine horn zu schneiden (gegenüber der Seite, wo die Plazenta befindet) die Embryonen zu belichten, die immer noch in den Dottersack und an der Uteruswand durch die Plazenta befestigt.
  6. Mit einer sterilen Pinzette, aufgeschnitten die embryonale Dottersack, den Embryo zu befreien.
  7. Platzieren Sie den Embryo in eine neue Petrischale mit steriler kalt 1x PBS. Enthaupten den Embryo und legen Sie es auf dem Rücken. Schneiden Sie die Brustwand öffnen, um das Herz aussetzen.
  8. Verwenden einer sterilen Pinzette, das Herz zu heben und die Gefäße herum weggeschnitten das Herz aus der Brustwand zu befreien. Besonderes Augenmerk nicht das Epikard des Herzens mit den chirurgischen Instrumenten zu beschädigen.
  9. Schneiden Sie das Ausflusstraktes und beide Vorhöfe. Übertragen Sie die Ventrikel auf eine andere Schale mit kaltem 1x PBS. Die Schale auf dem Eis.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 1,6-1,9 bis alle Ventrikel abgerufen werden.
le "> 2. Epikardiale Explantation Kultur

Hinweis: Kultur diese epikardialen Explantate entweder auf Glaskammer Dias oder auf Kollagen-Gel für Downstream-Anwendungen.

  1. Glaskammer Slides
    1. Zum Kulturmedium herzustellen, mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin und 2 ng / ml rekombinanten Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) zu Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Führen Sie alle Schritte in der Laminar-Flow-Haube.
    2. Hinzufügen 500 ul Kulturmedium zu jeder Vertiefung eines 8-Well-Kammer.
    3. Platzieren Sie jede ausgeschnittene Ventrikel in der Mitte eines gut. Richten Sie den Ventrikel die seziert Seite zu halten auf der Bodenfläche des Brunnens.
    4. Setzen Sie vorsichtig die Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Zellkultur - Inkubator.
    5. Pflegen Sie die Kultur mit einem Minimum an Störung die Explantate zu ermöglichen, zu haften. Die Bildung der epikardialen einschichtigen kann nach 48-72 Stunden beobachtet werden.
    6. Zur Unterscheidung von Epikardder epikardialen einschichtigen Zellen in Differenzierungsmedium für weitere 6 Tage ial Zellen in glatten Muskelzellen, Kultur. Um die Differenzierung Medien vorzubereiten, fügen Sie 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 50 ng / ml rekombinantem transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) bis DMEM.
    7. Ändern Sie den Kulturmedien an abwechselnden Tagen.
  2. Collagen Gel
    1. Bereiten Sie die Kollagen-Gel in einer 96-Well-Platte, die eine kommerzielle 3D-Collagen Kultur-Kit nach dem Protokoll des Herstellers.
    2. Um das gewünschte Volumen von Kollagen-Gel, mischen die entsprechende Menge an Kollagenlösung mit 5-fach von DMEM und Pipette auf und ab vorzubereiten. Die Lösung sollte gelb.
    3. Fügen Sie einen entsprechenden Volumen von Neutralisierungslösung und gut mischen sofort durch Pipettieren von oben und unten. Die Lösung wird sich rosa.
    4. Je 100 ul dieser Mischung in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen. Die Platte wird in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 30-60 min alniedrig das Gel zu polymerisieren.
    5. Zugabe von 200 ul Kulturmedium zu jeder Vertiefung beschrieben.
    6. Platzieren Sie jede ausgeschnittene Ventrikel in der Mitte eines gut. Richten Sie den Ventrikel zu halten, die seziert Seite nach unten auf das Kollagen-Gel (Spitze des Ventrikels sollte den Experimentator Gesicht). setzen Sie vorsichtig die Platte zurück in die Zellkultur-Inkubator.
    7. Nach 3 Tagen, entfernen Sie die Ventrikel. Legen Sie die Platte zurück in die Zellkultur-Inkubator für 2 weitere Tage.
    8. Ändern Sie den Kulturmedien an abwechselnden Tagen.

3. Fixierung und Visualisierung

Hinweis: Epikardiale Zellen können entweder Glaskammer Dias oder Kollagen-Gel sichtbar gemacht werden.

  1. Absaugen aus dem Kulturmedium und ein gleiches Volumen sterilen 1x PBS fügen Sie die Zellen zu waschen.
  2. Fügen Sie gerade genug, um 4% Paraformaldehyd (PFA), um die Zellen zu decken. Fixieren die Zellen für 10 min bei 4 ° C.
  3. Entfernen PFA und waschen Explantate mit 1x PBST (1x PBS mit0,1% Triton X-100), die Zellen zu permeabilisieren.
  4. Immunostain mit gewünschten Antikörper (zB Alexa Fluor 488-Phalloidin; ZO-1, α-Tubulin und α-smooth Aktin Muskel) 7.

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Representative Results

Mit Hilfe dieses Kulturprotokoll können primäre epikardialen Zellen mit hoher Reinheit für Downstream-Anwendungen isoliert werden. Die kultivierten Zellen sind in der Lage EMT zu unterziehen, wandern und zu differenzieren wie epikardialen Zellen in vivo zu tun.

Um die Reinheit unserer primären epikardialen Zellkultur bestimmen, analysierten wir die epikardiale Explantate erzeugt aus Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + Embryonen. Sema3d wird in epikardialen Zellen während der frühen Herzentwicklung zum Ausdruck gebracht, so epikardialen aus diesen Embryonen gewonnenen Zellen werden RFP beschriftet sein. Wir isolierten Kammern von Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + Embryonen für die epikardiale Explantate. Nach 48-72 h konnten wir eine Monoschicht aus epikardialen Zellen zu sehen. Durch Überlagerung der RFP Immunofluoreszenz und Hell- Bilder zeigten, dass die Mehrheitder Zellen , die von den Ventrikeln werden von epikardialen Ursprungs (1A - C) migriert. Wir haben unsere Ergebnisse weiter bestätigt durch RNA aus primären epikardialen Zellen zu isolieren und qPCR durchführen , die eine starke Expression von epikardialen spezifischen Genen (Tbx18 und Wt1) zeigte im Gegensatz zu einem Kardiomyozyten Markergen (Nkx2.5) (1C).

Als nächstes untersuchten wir die Fähigkeit der Zellen durch Analyse der Zellpolarität und Zell-Zell-Kontakt von epikardialen Zellen EMT zu unterziehen. EMT ist ein biologischer Prozess, der eine epitheliale Zelle ermöglicht seine Zellpolarität und Zell-Zell-Kontakt zu verlieren, um in eine wandernde mesenchymale Zelle zu transformieren. Der erste Schritt des EMT ist die Ablösung von Zell-Zell-Kontakten. Wir immunhistochemisch epikardialen Zellen mit ZO-1 (auch als Tjp1 bekannt, Tight Junction Protein 1), die Lokalisierung von ZO-1 zeigte an die Plasmamembran anzeigt, dass Zellennoch EMT (2A) zu unterziehen. Als nächstes führten wir für immunostaining α-Tubulin (2B) , um die Organisation der Mikrotubuli in epikardialen Explantate zu beobachten, die eine polarisierte Ausrichtung zeigte die gerichtete Migration von epikardialen Zellen erleichtert. Darüber hinaus ist die Differenzierungspotential der epikardialen Zellen zu bestimmen, kultiviert man sie für 6 Tage in einem Differenzierungsmedium rekombinanter TGF-β1 enthalten. Immunfärbung für SMA zeigte erfolgreiche Differenzierung von epikardialen Zellen in glatten Muskelzellen (Abbildung 2C).

Schließlich Epikard abgeleitete Zellmigration und epikardialen EMT zu analysieren, führten wir auch eine Kollagen-Gel Invasionstest. Epikard-abgeleitete Zellen wurden durch Immunfärbung Phalloidin sichtbar gemacht. Erfolgreiche Migration von Epikard-abgeleitete Zellen können auf der ganzen Explantat (3A) gesehen werden. Zur Bestimmung der depth der Zellpenetration in die Kollagenmatrix wurde 3D-Rekonstruktion von konfokalen Bildern erzeugt. Penetration von Epikard-abgeleitete Zellen können in z-Stapel (3B) zu sehen ist.

Abbildung 1
. Abbildung 1: Primärkultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Mäuseherzen Vertreter Hell- (A) und RFP Immunofluoreszenz (B) Bilder von primären epikardialen Zellen erzeugt von E12,5 Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + Herzen. Zusammengefügt Hellfeld- und Immunofluoreszenz Bild (C). Relative mRNA Expressionsniveaus von epikardialen Markern (Tbx18 und Wt1) und Kardiomyozyten Markers (Nkx2.5) in primären epikardialen Zellen (D). Die Ergebnisse wurden auf GAPDH - Expression normalisiert und relativen Expressionsniveaus werden als fachen Unterschied im Vergleich zu Nkx2.5 Ausdruck angegeben (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. *, P <0,05. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Primäre Epikardiale Zellen ihre Fähigkeit behalten , EMT zu unterziehen und Differenzierung Immunostaining auf epikardialen Explantate für ZO-1 (A, grün) oder α-Tubulin (B, grün).. DAPI wurde verwendet Kerne sichtbar zu machen (blau). Epicardial Zellen wurden differenziert in die glatten Muskelzellen für 6 Tage und gefärbt mit α-smooth muscle actin (SMA) (C, rot). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m.3993fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abb . 3: Epicardial Zellmigration auf dem Collagen Geloberfläche Ventricles aus E12.5 Embryonen wurden auf einem dreidimensionalen Kollagengel - Matrix und gefärbt mit Alexa Fluor 488-Phalloidin Epikard-abgeleitete Zellmigration und Penetration (A) zu visualisieren. Konfokale Bilder wurden verwendet , um ein dreidimensionales Bild zu konstruieren Zellpenetration entlang der z-Achse (B) zu bestimmen. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Es ist entscheidend, Techniken zu entwickeln, die die Untersuchung der Epikard erleichtern die zunehmende Bedeutung des Epikard in kardialen Entwicklung und Regeneration zu sorgen. Die epikardiale Kultursystem stellt erhebliche Vorteile für epikardiale Forschung.

Eine alternative Möglichkeit epikardialen Zellen zu isolieren, ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) eingesetzt werden. Dieses Verfahren beruht auf der Verwendung von epikardialen Marker (oder Epikard-Zell-spezifischen transgenen Expression eines fluoreszierenden Proteins) epikardialen Zellen von anderen Abstammungen zu trennen. Allerdings hat eine zunehmende Anzahl von Beweisen gezeigt, dass epikardialen Marker sind nicht ausschließlich in das Epikard ausgedrückt. Zum Beispiel Tbx18 wird in das Myokard des interventrikulären Septums (IVS) , während Wt1 im Endothel exprimiert 19-21 exprimiert wird . Daher ist die Reinheit der Population von Zellen isoliert epikardialen fraglich. Im Gegensatz dazu nimmt die Kultur hier beschriebene Verfahren aV orteil der wandernden Art der epikardialen Zellen. Dies ermöglicht die Isolierung eines hochreinen Population von epikardialen Zellen, wie durch unsere genetische Markierungsexperimente gezeigt. Eine andere Möglichkeit, epikardialen Zellen zu erhalten, würde die Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in epikardialen Zellen werden in erster Linie durch die BMP, WNT und Retinsäure-Signalwege modulieren. Diese differenzierten Zellen ähneln, die physikalischen und molekularen Eigenschaften von embryonalen epikardialen Zellen. Sie sind nicht nur in der Lage EMT zu unterziehen , sondern sind auch in Fibroblasten zu differenzieren können , und glatte Muskelzellen 22,23. Obwohl diese Methode sehr vielversprechend ist, ist es wesentlich komplizierter und zeitraubend als die epikardialen Kultur in diesem Papier beschrieben.

Darüber hinaus ist diese Kulturtechnik erfordert keine zusätzliche Spezialausrüstung und eine vorhandene Gewebekulturaufbau ausreichend. Während dieses Protokoll folgend, ist es entscheidend, s zu zahlenpecial Aufmerksamkeit nicht das Epikard mit chirurgischen Instrumenten beschädigt werden, wenn das Herz abruft. Darüber hinaus ist es wichtig, die ausgeschnitten Ventrikel mit der sezierten zugewandten Seite entweder die Oberfläche des Kollagengel oder Kammerobjektträger zu erleichtern, um epikardialen Zellmigration zu orientieren. Schließlich sollte die Kultur mit minimaler Störung aufrecht erhalten werden, um das Explantat zu erlauben, in die Kulturschale anhaften.

Die Population von Zellen erhalten wird, kann dann verwendet werden, um eine Vielzahl von Downstream-Experimente durchzuführen, die unser Verständnis der epikardialen Zellbiologie weiter wird. Die Kultivierung der Explantate auf Chamber Slides bietet epikardialen Monolayern für verschiedene Experimente mit epikardialen Zellproliferation, Überleben, Migration, EMT und Differenzierung in Herzabstammungslinien. Es bietet auch die Möglichkeit, die Wirkung von Medikamenten mit der medikamentösen Behandlung auf die zellulären Eigenschaften des Epikard sowie Veränderungen der Genexpression assoziiert zu testen. Zusätzlich culturing Epikard auf Kollagen - Gelen ermöglicht die Analyse der Zellen in einer 3D - Matrix anstelle der herkömmlichen 2D - Matrix, die eine genauere Darstellung der in vivo Physiologie liefert.

Allerdings würde ein Nachteil dieser Technik ist, dass dieses Verfahren nur zur Kultur epikardialen Zellen aus embryonalen Herzen zwischen E11.5-E12.5 verwendet werden. Bei der späteren Schwangerschaft oder in der Neugeborenenperiode verliert das Epikard die Fähigkeit, sich zu vermehren und zu migrieren. Somit ist es schwierig, dieses Kultivierungsverfahren zu verwenden, um epikardialen Zellen aus späteren Embryonalstadien oder erwachsenen Mäusen zu isolieren.

Trotz dieser Einschränkung verwendet diese Technik grundlegende Kultivierung Fähigkeiten und Aufbau das Wachstum von epikardialen Zellen zu erleichtern ex vivo , die für die Untersuchung der Epikard sehr vorteilhaft sein würde und seine Rolle bei der Herzentwicklung und Regeneration.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus DUKE-NUS Graduate Medical School Singapore, Goh Stiftung und Singapur NRF Gemeinschaft (NRF-NRFF2016-01) zu Manvendra K. Singh unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Life tech invitrogen  11995065
Penicillin/streptomycin solution Life tech invitrogen  15140122
Fetal bovine serum (FBS)  Life tech invitrogen  10500064
Paraformaldehyde Sigma P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) PeproTech 100-21
ZO-1 antibody Life tech invitrogen  40-2200
α-Tubulin antibody Sigma T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody Sigma A 2547
Phalloidin antibody Life tech invitrogen  A12379
3D Collagen Culture kit  Millipore  ECM 675
8-well chamber slide Fisher Scientific NNU 154534-PK
Trizol reagent Life Technologies 15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System Life Technologies 4453536
Superscript First Strand Synthesis kit Life Technologies 11904-018

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References

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