In vitro-odling av epikardiella celler från mus embryonala hjärta

* These authors contributed equally
Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramesh, S., Singh, A., Cibi, D. M., Hausenloy, D. J., Singh, M. K. In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart. J. Vis. Exp. (110), e53993, doi:10.3791/53993 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

En uppsjö av experimentella data har visat att epikardium påverkar kritiska steg i hjärt utveckling. Under utveckling, ger septum transversum upphov till en klump av mesotelceller kallas proepicardium 1-4. Celler från proepicardium vandrar sedan och kuvert hjärtmuskeln bildar epikardium. Efter detta, en delmängd av epikardiella celler undergår EMT ger upphov till en vandrande population av epikardium härledda celler (EPDCs) som därefter invaderar myokardiet. Genetiska såväl som retroviral härstamning spåra experiment har visat att EPDCs differentiera till olika härstamningar, inklusive glatta muskelceller, fibroblaster, endotelceller och kardiomyocyter (om någon). Därför EPDCs bidrar i hög grad till utvecklingen av kranskärlen och hjärtmuskel arkitektur 1,2,4-9. Dessutom är epikardium avgörande för utvecklingen av den ventrikulära kompakta skiktet 10-12. för eXEMPEL Gittenberger-de Groot et al. visade att hämma utväxt av proepicardium leder till en matris av defekter såsom en tunn myokardium, deficient looping av hjärtat och onormal skiljeväggen mellan kamrarna bildning och som ett resultat, 13 embryonal dödlighet. Parakrina faktorer som utsöndras från embryonala epikardium modulera cardiomyocyte proliferation och differentiering. I överensstämmelse med detta, epikardium specifik deletion av signalvägar, såsom retinsyra (RA), fibroblasttillväxtfaktorer (FGF) och Wnt / β-catenin resulterade i defekt myokardiell tillväxt och embryonal dödlighet 14-16.

Även epikardium ansågs vara vilande hos vuxna hjärtan, har nya studier visat att utvecklingsprogrammet återaktiveras i epikardium efter hjärtskada 17,18. Vid aktivering, cellerna undergå snabb proliferation och EMT som resulterar i EPDC bildning. Dessa celler uppvisar capacity att differentieras till fibroblaster och glatta muskelceller men inte hjärtmuskelceller eller endotelceller 18. Dessutom EPDCs utsöndrar proangiogenic faktorer som bidrar till kärl av det skadade området och därmed underlätta en förbättrad hjärtfunktion genom att minska infarktstorleken. På grund av dessa fynd, har epikardium vunnit intresse i studien av hjärt-utveckling, sjukdom och förnyelse.

Transgen teknik har revolutionerat den medicinska forskningen i 21-talet. Med hjälp av transgena teknik, har sjuka musmodeller som efterliknar människans villkor metaboliskt och pathophysiologically har framgångsrikt utvecklat. Men studera epikardiella cellens beteende i dessa mutanter har varit en utmaning främst på grund av tidig embryonal dödlighet. Med tanke på den viktiga roll som epikardium spelar i hjärt utveckling och förnyelse, har vi etablerat ett in vitro-odlingssystem för mus epicardiaL-celler. Denna metod gör det möjligt för långtidsodling av epikardiella celler och underlättar detaljerad studie av de två viktiga egenskaper hos epikardium: dess förmåga att migrera och differentiera. De utskurna ventriklarna från musen kunde odlas på kollagengeler, vilka kan användas för att utföra migrationsanalyser. Som odlas i en 3D-matris som replikerar kollagenrika extracellulära matrisen hos subepicardial skiktet bättre rekapitulerar in vivo cellfysiologi. Alternativt kan de odlas på kammarglas för att fastställa en epikardiell monolager som sedan kan användas för en mängd olika tillämpningar nedströms. Detta cellslager kan användas för att färga för trånga kopplings proteiner som kommer att ge insikter om förmågan hos epikardium genomgå EMT som är avgörande för migration. Dessutom kan differentieringsexperiment även utföras på dessa celler. Vidare kan genuttryck profil analyseras genom att extrahera RNA från cellerna ochutför kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR). Slutligen kunde monoskikten också behandlas med medel följt av en molekylär analys för att testa för potentiella läkemedel. Tillsammans, ger detta epikardiella odlingssystem oss möjlighet att visualisera och samla molekylära data som främjar vår förståelse om epikardiell utveckling.

Ett annat önskvärt särdrag hos denna metod är att den är enkel och ingen komplicerad installation krävs. I korthet, är embryona skördades vid E11.5 eller E12.5 varefter hjärtat skärs ut. Ventriklarna odlas därefter på endera kollagengel eller kammare diabilder. Därefter kan dessa celler användas för att utföra experiment nedströms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment har godkänts av Duke-NUS Graduate Medical School Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Hämta den embryonala ventriklarna

  1. Offra en tidsinställd gravid musen på den önskade fosterstadiet (E11.5 eller E12.5) med hjälp av en dödshjälp kammare med koldioxidgas leverans eller annan godkänd dödshjälp metod.
  2. Placera musen på rygg på en dissekera bord. Desinficera buken av den kvinnliga med 70% etanol. Lyft huden över magen och göra ett litet snitt (1-2 cm) med ett blad, sedan hålla huden med båda händerna och dra bort för att exponera bukväggen.
  3. Nu skär bukväggen att exponera livmoderhornet. Använd sterila pincett för att lyfta upp livmoderhornet och försiktigt skära bort fettvävnader och blodkärl knutna till livmoderhornet. Skär i livmoderhalsen för att hämta livmodern.
  4. Placera livmoderhornet i en petriskål med steril kalla 1x Fosfat Buff Ered Saline (PBS) och skölj försiktigt. Placera petriskål på is.
  5. Använd sax för att klippa genom mittlinjen av livmoderhornet (mitt emot den plats där moderkakan ligger) att exponera embryon som fortfarande inne i gulesäcken och fästa vid livmoderväggen genom moderkakan.
  6. Använda steril pincett, skära upp embryonala gulesäcken att befria embryot.
  7. Placera embryot i en ny petriskål med steril kall 1x PBS. Halshugga embryot och placera den på sin rygg. Skär öppna bröstkorgen att exponera hjärtat.
  8. Använd steril tång för att lyfta hjärtat och skära bort kärlen runt det att befria hjärtat från bröstkorgen. Var särskilt uppmärksam att inte skada epikardium av hjärtat med kirurgiska verktyg.
  9. Trimma bort utflödeskanalen och båda förmaken. Överföra ventrikeln till en annan skålen med kall 1 x PBS. Placera skålen på is.
  10. Upprepa steg 1,6-1,9 tills alla kamrarna hämtas.
le "> 2. epikardiell Explantation Kultur

Obs: Kultur dessa epikardiella explantat antingen på glas kammare diabilder eller på kollagengel för tillämpningar efter.

  1. Glaskammare Slides
    1. För att framställa odlingsmedia, tillsätt 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin och 2 ng / ml rekombinant fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2) till Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM). Utför alla steg i laminärt flöde huva.
    2. Tillsätt 500 | il odlingsmedium till varje brunn i en 8-brunnars kammare.
    3. Placera varje utskurna kammare i mitten av en brunn. Orientera ventrikeln för att hålla dissekeras sidan nedåt på bottenytan av brunnen.
    4. Försiktigt placera plattan i en 37 ° C, 5% CO 2 cellodling inkubator.
    5. Bibehålla kulturen med minimal störning för att låta explantaten att fästa. Bildandet av epikardiella mono kan observeras efter 48-72 timmar.
    6. För differentiering av epicardial celler i glatta muskelceller, kultur de epikardiella monoskikt celler i differentierings medier för ytterligare 6 dagar. För att framställa den differentieringsmedia, tillsätt 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin och 50 ng / ml rekombinant transformerande tillväxtfaktor beta 1 (TGF-β1) till DMEM.
    7. Ändra odlingsmediet varannan dag.
  2. collagen Gel
    1. Förbereda kollagengelen i en platta med 96 brunnar med användning av en kommersiell 3D Collagen Culture kit enligt tillverkarens protokoll.
    2. Att framställa den önskade volymen av kollagengel, blanda lämplig mängd kollagenlösning med 5x DMEM och pipettera upp och ner. Lösningen ska gulna.
    3. Lägga till en motsvarande volym av neutralisation lösning och blanda väl omedelbart genom pipettering upp och ned. Lösningen blir rosa.
    4. Pipettera 100 | il av denna blandning till varje brunn i en 96-brunnsplatta. Placera plattan i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under 30 till 60 min till allåg gelén polymerisera.
    5. Tillsätt 200 | il av odlingsmedier som beskrivits ovan till varje brunn.
    6. Placera varje utskurna kammare i mitten av en brunn. Orient kammaren att hålla dissekeras nedåt på kollagengelen (spetsen av ventrikeln bör möta försöks). sätta försiktigt plattan tillbaka i cellodlingsinkubator.
    7. Efter 3 dagar, ta bort ventriklarna. Sätt plattan tillbaka in i cellodlings inkubator för ytterligare 2 dagar.
    8. Ändra odlingsmediet varannan dag.

3. Fixering och visualisering

Obs: epikardiella celler kan visualiseras på antingen glaskammarobjektglas eller kollagen gel.

  1. Sug ut odlingsmediet och tillsätt en lika stor volym steril 1 x PBS för att tvätta cellerna.
  2. Lägg bara tillräckligt 4% paraformaldehyd (PFA) för att täcka cellerna. Fixera cellerna för 10 min vid 4 ° C.
  3. Ta bort PFA och tvätta explants med 1x PBST (1x PBS med0,1% Triton X-100) för att permeabilisera cellerna.
  4. Immunostain med önskad antikropp (t.ex. Alexa Fluor 488-falloidin, ZO-1, α-tubulin och α-glatt muskulatur aktin) 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av denna kultur protokoll, kan primära epikardiella celler isoleras med hög renhet för tillämpningar efter. De odlade cellerna kan genomgå EMT, migrera och differentiera lika epikardiella celler gör in vivo.

För att bestämma renheten hos vår primära epikardiell cellodling, analyserade vi de epikardiella explantaten genereras från Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + embryon. Sema3d uttrycks i epikardiella celler under tidig hjärt utveckling och därmed epikardiella celler från dessa embryon blir RFP märkta. Vi isolerade kamrarna från Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + embryon för epikardiella explantat. Efter 48-72 timmar, kunde vi se ett monoskikt av epikardiella celler. Lagra RFP immunofluorescens och bright bilder visade att en majoritetav cellerna som migrerade från ventriklarna är av epikardiell ursprung (figur 1 A - C). Vi valideras ytterligare våra resultat genom att isolera RNA från primära epikardiella celler och utföra qPCR som visade en starkt uttryck av epikardiella specifika gener (Tbx18 och WT1) i motsats till en cardiomyocyte markörgen (Nkx2.5) (Figur 1C).

Nästa undersökte vi förmågan hos cellerna att undergå EMT genom att analysera cell polaritet och cell-cellkontakt av epikardiella celler. EMT är en biologisk process som tillåter en epitelcell att förlora sin cell polaritet och cell-cell kontakt för att förvandlas till en vandrande mesenkymala cell. Det första steget i EMT är avskiljandet av cell-cell-kontakter. Vi immunostained epikardiella celler med ZO-1 (även känd som Tjp1, Täta fogar protein 1), som visade lokalisering av ZO-1 till plasmamembranet vilket indikerar att cellerna harännu genomgå EMT (Figur 2A). Nästa vi utfört immunfärgning för α-tubulin (figur 2B) för att observera organisationen av mikrotubuli i epikardiella explantat, som visade en polariserad inriktning som underlättar riktad migrering av epikardiella celler. Dessutom, för att bestämma differentieringspotentialen hos de epikardiella celler, odlade vi dem i 6 dagar i en differentieringsmedia innehållande rekombinant TGF-β1. Immunfärgning för SMA demonstrerade framgångsrik differentiering av epikardiella celler till glatta muskelceller (fig 2C).

Slutligen, för att analysera epikardium härrörande cellmigration och epikardiella EMT, också genomförde vi en kollagengel invasionsanalys. Epikardium härledda celler visualiserades genom phalloidin immunfärgning. Framgångsrik migrering av epikardium-härledda celler kan ses över hela Explantation (Figur 3A). För att bestämma depth av cellpenetration i kollagenmatrisen, var 3D-rekonstruktion genereras från konfokala bilder. Penetration av epikardium härledda celler kan ses i z-stackar (figur 3B).

Figur 1
. Figur 1: Primär kultur av epikardiella Celler från embryonala Mus Hearts representant bright (A) och RFP immunofluorescens (B) bilder av primära epikardiella celler som genereras från E12.5 Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + hjärtan. Sammanslagen bright och immunofluorescens bild (C). Relativa mRNA expressionsnivåer av epikardiella markörer (Tbx18 och WT1) och cardiomyocyte markör (Nkx2.5) i primär epikardiella celler (D). Resultaten normaliserades till GAPDH uttryck, och relativa uttrycksnivåerna ges som en faldig skillnad jämfört med Nkx2.5 uttryck (n = 3). Data presenteras som medelvärde ± SD. Skalstreck = 200 | j, m. *, P <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Primär epikardiella celler bibehåller sin förmåga att genomgå EMT och differentiering immunfärgning på epikardiella explants för ZO-1 (A, grön) eller α-tubulin (B, grön).. DAPI användes för att visualisera kärnor (blå). Epikardiella cellerna differentieras till glatta muskelceller i 6 dagar och färgades med α-glattmuskelaktin (SMA) (C, röd). Skalstreck = 100 | j, m.3993fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Epikardiell Cell Migration på kollagengelen Surface ventriklarna från E12.5 embryon odlades på en tredimensionell kollagengel matris och färgades med Alexa Fluor 488-falloidin för att visualisera epikardium härledda cellmigration och penetrering (A). Konfokala bilder användes för att konstruera en tredimensionell bild för att bestämma cellpenetration längs z-axlarna (B). Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det är avgörande att utveckla tekniker som underlättar studiet av epikardium för att tillgodose den ökande betydelsen av epikardium i hjärt utveckling och förnyelse. Den epikardiella odlingssystem innebär betydande fördelar för epikardiella forskning.

Ett alternativt sätt för att isolera epikardiella celler är att använda fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Denna metod förlitar sig på användningen av epikardiella markörer (eller epikardium-cellspecifik transgen uttryck av ett fluorescerande protein) för att separera epikardiella celler från andra utvecklingslinjer. Däremot har en ökande mängd bevis visat att epikardiella markörer inte enbart uttrycks i epikardium. Till exempel är Tbx18 uttrycks i myokardiet av skiljeväggen mellan kamrarna (IVS) medan WT1 uttrycks i endotelet 19-21. Därför är renheten av befolkningen i epikardiella celler isolerade tveksamt. I kontrast, odlingsmetoden beskriven häri tar endvantage av migrations typ av epikardiella celler. Detta möjliggör isolering av en i hög grad ren population av epikardiella celler såsom visas av våra genetiska märkningsexperiment. Ett annat sätt att få epikardiella celler skulle vara differentieringen av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) till epikardiella celler genom att modulera främst BMP, WNT och retinsyra signalvägar. Dessa differentierade celler liknar mycket den fysiska och molekylära egenskaper hos embryonala epikardiella celler. De är inte bara kan genomgå EMT utan kan också differentieras till fibroblaster och glatta muskelceller 22,23. Även om denna metod är mycket lovande, är det betydligt mer komplicerat och tidskrävande än den epikardiella kultur beskrivs i detta dokument.

Dessutom går denna odlingsteknik inte kräva ytterligare specialutrustning och en existerande vävnadsodlings setup är tillräcklig. Även efter detta protokoll, är det viktigt att betala special uppmärksamhet inte skadar epikardium med kirurgiska verktyg när du hämtar hjärtat. Dessutom är det viktigt att orientera den utskurna ventrikeln med dissekerade sidan mot antingen ytan på kollagengelen eller kammaren sliden för att underlätta epikardiell cell migration. Slutligen bör kulturen upprätthållas med minimal störning för att medge explantatet att vidhäfta till odlingsskålen.

Populationen av celler som erhållits kan sedan användas för att utföra olika experiment nedströms som kommer att ytterligare vår förståelse av epikardiell cellbiologi. Odling explantaten på kammarglas ger epikardiella monolager för olika experiment inklusive epikardiella celltillväxt, överlevnad, migration, EMT och differentiering till hjärt linjerna. Det ger också en möjlighet att testa effekten av läkemedel på de cellulära egenskaperna hos epikardium liksom genuttryck förändringar i samband med läkemedelsbehandling. Dessutom culturing epikardium på kollagengeler möjliggör analysen av cellerna i en 3D-matris i stället för den traditionella 2D matris, vilket ger en mer exakt illustration av in vivo fysiologi.

Däremot skulle en nackdel med denna teknik är att denna metod endast kan användas för att odla epikardiella celler från embryonala hjärtan mellan E11.5-E12.5. Under senare dräktighet eller under nyföddhetsperioden epikardium förlorar förmågan att föröka sig och migrera. Det är således svårt att använda denna kultur metod för att isolera epikardiella celler från senare embryonala stadier eller vuxna möss.

Trots denna begränsning, använder denna teknik grundläggande odlings färdigheter och inställningar för att underlätta tillväxten av epikardiella celler ex vivo, vilket skulle vara mycket fördelaktigt för studiet av epikardium och dess roller i hjärt utveckling och förnyelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av medel från Duke-NUS Graduate Medical School Singapore, Goh foundation och Singapore NRF gemenskap (NRF-NRFF2016-01) till Manvendra K. Singh.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Life tech invitrogen  11995065
Penicillin/streptomycin solution Life tech invitrogen  15140122
Fetal bovine serum (FBS)  Life tech invitrogen  10500064
Paraformaldehyde Sigma P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) PeproTech 100-21
ZO-1 antibody Life tech invitrogen  40-2200
α-Tubulin antibody Sigma T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody Sigma A 2547
Phalloidin antibody Life tech invitrogen  A12379
3D Collagen Culture kit  Millipore  ECM 675
8-well chamber slide Fisher Scientific NNU 154534-PK
Trizol reagent Life Technologies 15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System Life Technologies 4453536
Superscript First Strand Synthesis kit Life Technologies 11904-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
  2. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  3. Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
  4. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  5. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  6. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  7. Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
  8. Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
  9. Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
  10. Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
  11. Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
  12. Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
  13. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
  14. Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  15. Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
  16. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
  17. Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
  18. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  19. Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
  20. Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
  21. Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
  22. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  23. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics