מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התגובה של תאים בודדים לתרופות אנטי-סרטניות תורמת באופן משמעותי בקביעת תגובת האוכלוסייה, ולכן הוא גורם מרכזי תורם בתוצאה הכללית. Immunoblotting, cytometry זרימה וניסויי תא קבוע משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד כיצד תאים מגיבים לתרופות אנטי-סרטניות. שיטות אלה חשובות, אבל יש להם חסרונות רבים. משתנה הם תגובות סמים בין סרטן תאים נורמלים, ובין תאים ממוצא הסרטן שונה, וחולף ותגובות נדירות שקשה להבין באמצעות מבחני מיצוע אוכלוסייה וללא יכולת לעקוב ישירות ולנתח אותם אורכים. המיקרוסקופ הוא גם מתאים במיוחד לתאים חיים תמונה. התקדמות הטכנולוגיה מאפשרת לנו תאי תמונה שגרתי ברזולוציה המאפשרת לא מעקב תא בלבד, אלא גם את התצפית של מגוון תגובות הסלולר. אנו מתארים גישה בפירוט המאפשר הדמיה זמן לשגות רציפה שלתאים במהלך תגובת התרופה בעצם כל עוד רצוי, בדרך כלל עד 96 שעות. באמצעות וריאציות של הגישה, ניתן לנטר תאים במשך שבועות. עם העסקה של תהליכים רבים biosensors פלורסנט מקודד גנטי, שבילים ותגובות יכולה להיות אחריו. אנו מציגים דוגמאות הכוללות מעקב וכימות של גדילת התא התקדמות מחזור התא, דינמיקה כרומוזום, נזק לדנ"א, מוות של תאים. כמו כן נדונו וריאציות של הטכניקה והגמישות שלה, ולהאיר כמה מלכודות נפוצות.

Introduction

מיקרוסקופיה Live- תא מעקב אורך של תאים בודדים היא לא טכניקה חדשה. מתוך המיקרוסקופים המוקדמים, חובבי מדענים הבחינו ולומדים תאים בודדים ואורגניזמים, ההתנהגויות שלהם, ופיתוח 1-3. דוגמה מפורסמת מן דיוויד רוג'רס המנוח באוניברסיטת ונדרבילט בשנת 1950 מראה נויטרופילים האדם כתם דם רודפים חיידק סטפילוקוקוס ולבסוף בתהליך של phagocytosis 4. חי בסרט תא זו הוא המחשה מצוינת לאופן שבו מספר רב של תהליכים שניתן לצפות בקורלציה בניסוי יחיד: חישה של שיפוע כימי, מכניקה ומהירות תנועתיות תא, תא מעצבת דינמיקה, הדבקה, ואת phagocytosis של פתוגן.

הופעתו של מיקרוסקופים אוטומטיים לחלוטין ומצלמות דיגיטליות רגישות גבוהה הביאה מספר גדל והולך של חוקרים באמצעות מיקרוסקופ לשאול שאלות יסוד f החל הביולוגיה של תאrom כיצד תאים להעביר 5,6 ולחלק 7,8 כדי אברון הדינמיקה וסחר הממברנה 9-11. ללא פלורסנט, מיקרוסקופיה brightfield, כולל שלב בניגוד (PC), אשר זכה בפרס נובל פריץ Zernike בשנת 1953, ואת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) לאפשר תצפית של תאים גרעינים, אלא גם במבנים המשנה הסלולר כולל חבילות microtubule , כרומוזומים, nucleoli, דינמיקת אברון, וסיבים יקטינו עבים 12. מקודד גנטית חלבוני ניאון לבין התפתחות של צבעי ניאון נגד אברונים השפיעו באופן דרמטי זמן לשגות מיקרוסקופית 13-15. אמנם לא המוקד של מאמר זה, הדמית spheroids תא באתרו (מיקרוסקופיה intravital) באמצעות confocal במיקרוסקופ multiphoton מייצגת הרחבה נוספת של הגישה, ויש מאמרים מצטיינים המשתמשים ולדון הגישות הללו 16-19.

התגובות של תאי אל-canc אנטיתרופות אה או מוצרים טבעיים נקבעות על הסולם המולקולרי תאי. לאחר טיפול תגובות גורלות תא הבנה כרוך לעתים קרובות מבחני מיצוע אוכלוסייה (למשל., Immunoblotting, אמצעים היטב שלמים), או בזמן נקודות קבועות עם זיהוי immunofluorescent ו cytometry זרימה, אשר מודדים תאים בודדים. הטרוגניות בתגובות תא בודדות לסמים בקרב אוכלוסייה, בפרט בגידולים, עשויות להסביר חלק ההשתנות בתגובה לראות פני שורות תאים וגידולים כי מטופלים עם התרופה הזהה ב רוויה. לטווח ארוך גישות האורך לעקוב תא בודד נתון או אוכלוסייה של תאים הוא גישה נפוצה פחות, אבל רב עצמה המאפשרת לחקר הישיר של מסלולי תגובה מולקולריים, פנוטיפים שונים (למשל., מוות של תאים או חלוקת תא), תצפית של תא אל תא השתנות בתוך אוכלוסייה, ואיך הגורמים הללו תורמים דינמיקה בתגובת אוכלוסיית 20-22. באופטימיות, יכולתלהתבונן ולכמת התגובות תא בודד יעזור לשפר את הבנתנו כיצד תרופות לעבוד, למה הם לפעמים נכשלים, וכיצד להשתמש בהם בצורה הטובה ביותר.

הטכניקה של מיקרוסקופיה לטווח ארוכת זמן לשגות, מעקב אורך, וניתוח תגובות סמים היא העומד לרשות חוקרים רבים והוא יכול להיות פשוט, באמצעות אור המועבר רק להתבונן תגובות פנוטיפ 20,21. הרכיבים העיקריים של הגישה כוללים: ההיערכות מתאימה של התאים בעלי עניין, מיקרוסקופ אוטומטי עם תא סביבתי, מצלמה משולבת עם מחשב לרכוש ולאחסן את התמונות, ותוכנה לעיין לשגות זמן למדוד ולנתח את התאים וכל biosensors ניאון. אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם טיפים רבים לניהול מיקרוסקופיה זמן לשגות של תאים בתרבית למשך עוד כמה ימים באמצעות brightfield ו / או מיקרוסקופיה epifluorescent widefield. פרוטוקול זה יכול לשמש לכל שורת תאים שניתן גדלים בתרביתללמוד התגובות שלהם לטיפולים אנטי-סרטניים. אנו מספקים דוגמאות של נתונים רכשה ונותחו באמצעות חיישנים ביולוגיים פלורסנט גנטית בקידוד שונה מרובים דוגמה מיקרוסקופיה שלב בניגוד, לדון סוגים שונים בקצרה של בדיקות, את היתרונות והחסרונות של זמן לשגות לטווח ארוך ומעקב האורך, מה יכול להיות מלומדת הגישה הזאת כי קשה להבין מן הערוצים הלא ישירים, וכמה וריאציות שאנו מקווים יהיה עניין וערך לחוקרים מנוסים שלא נחשבו בגישה, וכדי חוקרים מנוסים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הבא נעשה שימוש בפרמטרים שהוגדרו על ידי ניסויי איורים 4 ו -6 הגדרות רכישה לגבי תנאי ניסוי. רבי פרמטרים אלו ניתן לשנות כדי להתאים ניסויים אחרים (כלומר, זמני חשיפה, binning, ערוצי ניאון, וכו '.). כל הנהלים חייבים לציית להנחיות ולתקנות מוסדיות יאושרו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית. אתרי היצרן מיקרוסקופ מכילים מידע מעולה עבור הדמיה תא חי.

מיקרוסקופי 1. ותוכנת הדמיה

  1. בצע הדמית תא חייה על מגוון רחב של מיקרוסקופים הפוכים. מיקרוסקופים הנפוצים ביותר הם widefield epifluorescence ו confocal ספינינג-דיסק. הנה, משתמש במיקרוסקופ epifluorescence widefield אוטומטי הממונע עם 200 ואט מקור מתכת הליד אור.
  2. השג-גבי במה או מיקרוסקופ חדר סביבתי. הנה, להשתמש במה-tבתא סביבתי op.
  3. השתמש בתוכנה מסחרית לפעול מיקרוסקופים עם כלי עזר לביצוע מיקרוסקופיה זמן לשגות.
  4. השתמש זמינה מסחרי תוכנה או ImageJ לניתוח תמונה. רבי כלי ניתוח אחרים זמינים מסחרי, ויש מחוייט תוכניות שרבים מהם פורסם 8,18.

2. חזותי תהליכים תאיים ותגובות פנוטיפי

  1. דמיינו תאים עם מיקרוסקופיה brightfield. בניגוד ניגודיות שלב התערבות הפרש לבד יכול להיות מאוד אינפורמטיבי ללמוד תגובות לתגובות תרופה אנטי-סרטניות. תהליכים אלו יכולים לכלול מיטוזה, תנועתיות התא אפופטוזיס.
  2. דמיינו מבנים תאיים, אברונים ותהליכים עם biosensors ניאון. בדיקות ניאון הם למידע בלבד מעקב תהליכים subcellular ספציפיים. אלו יכולים לכלול הדינמיקה microtubule, המיטוכונדריה ודינמיקה reticulum endoplasmic, הצטברות חלבון ולוקליזציה, ואיתות מולקולרית (למשל., זרחון, סידן).

3. הכנת דוגמאות

  1. לגדל תאי מנות מוסמכות תרבות תאי סטנדרט, תרבית תאי חממת humidified (למשל, 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2, 80% לחות יחסית).
    1. לגדל תאים HT1080 ב MEM עם EBSS. מוסף התקשורת עם FBS v / v 10%, 1% v / v פן / סטרפטוקוקוס, 1% v / פירובט נתרן נ ו 1% v / v חומצות אמינו לא חיוניות.
  2. ימים לפני ההדמיה, צלחת 50,000 תאי HT1080 FUCCI לתוך 3 בארות של צלחת 12-טובה # 1.5 זכוכית תחתונה במנדף למינרית זרימת סטרילי מוסמכת. התאם את מספר תאים מצופים להשיג ~ 60% מפגש לתחילת הניסוי. בהתאם לקו התא ואופי הניסוי צפיפות התאים עשוי להיות פחות.
    הערה: צפיפות התאים עלולה להיות השפעה עמוקה על הצמיחה של הקו הסלולרי ועל תוצאות הניסוי. ספירת תאים כדי למזער ניסוי אל ניסוי variability עקב צפיפות.
    1. בהתאם הקאמרי הסביבתי התנאים הדרושים לצורך הניסוי, תאי צלחת במנות גם אחת (בדרך כלל 35 או 60 מ"מימ), 4 גם מנות בגודל 35 מ"מ, 6, 12 או 24 גם צלחות תרבית תאים, או coverslip שקופיות בפורמטים שונים. השתמשו צלחות זכוכית תחתונה עם # 1.5 זכוכית כמו רוב העדשות האובייקטיביות ממוטבים עבור עובי זה של זכוכית, והדמיה באמצעות פלסטיק תרבית תאים שהוא ברמה מאוד ירוד.
      הערה: שורות תאים מסוימים אינם לגדול ולשרוד על זכוכית. במקרים אלה, הזכוכית יכולה להיות מצופה על מנת לשפר דבקות התא (למשל., פולי-ליזין או קולגן). חברות מסוימות לייצור פלסטיק תרבית תאים אופטי, זה צריך להיקבע באופן אמפירי אם זה הוא אפשרות מעשית.

4. סביבת לשכת קמה

  1. לפני כל התנסות, הגדרת התא הסביבתי, כך היא פועלת בתנאי לחות ~ 80% וכן הלאה הטמפרטורה במיקום המדגם היא 37 מעלות צלסיוס. רוב התאים בתרבית לגדול ב 5% CO 2 / איזון אווירת אוויר עקב חיץ סודיום ביקרבונט במדיום. בהתאם ההגדרה, או להגדיר את הבקר הסביבתי עד 5% CO 2 וזה יהיה לערבב 100% CO 2 באוויר, או להשתמש מראש מעורב, מוסמך 5% CO 2 / איזון גז באוויר. עקוב להנחיות יצרן בנוגע לספיקת גז.
    הערה: שורות תאי חלק לגדול ב- CO 2 בינוני עצמאי ובמקרה כזה הם יכולים להישמר ללא CO 2. באופן ספציפי תקשורת הדמית תוכנן זמינה גם שמגבילה תוספת של תרכובות autofluorescent. צמיחת מדיומי תזות עבור סוג התא הרצוי צריכה להיקבע באופן אמפירי מראש.
  2. לפני הדמיה, להבטיח את מאגר המים מלא (אם עוקבים אחרי ההוראות של היצרן) עם מים מזוקקים סטריליים. הפעל את בתא הסביבתי להגדרה לטמפרטורה הרצויה ומניח אותו לתוך ההבלעה הבמה מיקרוסקופ. כדי לחסוך דלק, לא להתחיל את הזרימה בשלב זה.
    הערה: אם יש מקום פנוי בין תא במה העליון ושלב ההבלעה ו / או כל מתח על כבלי חיבור לתא הוא עשוי להציג ממצא תנועה לתוך הניסוי.
    1. הנח פיסות סרט פרפין על הקצוות של פתיחת שלב ההבלעה לפני החדרת התא לתוכו כדי זוג בתא עד השלב, ולוודא כי אין קשרים מושכים על החדר.
  3. ולאפשר החדר כדי לאזן ל -37 מעלות צלסיוס לשמור על טמפרטורה יציבה כדי למנוע תנודות טמפרטורה במהלך הדמיה אשר עשוי להשפיע על פיזיולוגית תא להציג להיסחף. איזון טמפרטורה להגיע בדרך כלל דורש 30 דקות עד 1 שעה, בהתאם לסביבה.
    1. הכנס צלחת 'דמה' עם מים בקידוחי ההחדרה תוך ההתחממות. מנת הדמיה מלאה מחק מים המדגמים, עוזרת להבטיח החדר מחוממת מספיק התייצבה. מילוי הקאמרי עם מים סטריליים מחוממים מראשמפחית את הזמן הנדרש כדי ייצוב טמפרטורה וממזער הירידה בטמפרטורה על תוספת של המדגם הניסיון.

5. מיקרוסקופ הגדרה

  1. הפעל את המיקרוסקופ, המחשב קשור, וכל ציוד היקפי נדרש.
    1. בהתאם למקור האור, לחכות כדי להפעיל אותו עד הצורך (למשל., LED).
  2. עם הצריח אובייקטיבי במצב נמוך, בחר את המטרה 20X 0.7 NA לשמש.
  3. מקם את המדגם על המטרה - זה יעשה את זה קל יותר למצוא את התאים כאשר המדגם הוא בתא.
  4. הגדרת פרמטרים הדמיה בשלב זה אם הם ידועים מניסויים קודמים.

6. הובלה לתאים מיקרוסקופ ולתוך הקאמרי

  1. הובלת התאים להיות צלמו מן החממה לתא הסביבתי. ודא כי זה נעשה במהירות להגביל את ההשפעות של CO הנמוכה יחסית 2
  2. מניח את התאים מיכל קלקר אטום או שקית מבודדת כדי למנוע שינויים סביבתיים גדולים.
  • הכנס את צלחת ההדמיה מדגם לתוך התא הבא להוראות היצרן.
  • אחרי התאים כבר מובטחים בתוך החדר הסביבתי, לאטום את החדר כדי לשמור על סביבה יציבה ומייד להפעיל את המקור (ים) של גז האטמוספרי.
    1. כמו תאים סביבתיים מסוימים לא לנצל מכסה הדוק, אטום, כדי לעכב אידוי, שכבת סטרילית, שמן מינרלים-מוסמך העובר על גבי מדיום הגידול. סרט לעטוף פרפין permeant-גז מסביב לקצוות-ההיקף של צלחת המדגם נזהר שלא לחסום את אזור הדמית זכוכית. יכולות להיות מועסקות מקומיות, שיטות humidification משניות. עיבוי על המכסה של צלחת המדגם יכול להפחית performance של מיקרוסקופיה brightfield.
  • על מנת למזער את ההשפעות של סחיפה תרמית מוקדם במהלך הניסוי, לחכות 30 דקות לפני תחילת זמן לשגות. זמן הדרוש משתנה בהתאם לגודל מנת הדמיה וגורמים אחרים. לקבוע באופן אמפירי.
  • 7. הגדרת ההדמיה

    1. תנאי הדמיה בחרו בצורה טובה ביותר ייצגו את הנתונים. לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע phototoxicity ידי הגבלת החשיפה פעמים, באמצעות אור בעוצמה נמוכה יותר ובחירת בדיקות כי הם נרגשים אורכי גל ארוכים יותר של אור.
    2. גדר x, y ו- z-המטוס רצוי אורך גל (ות) עבור כל עמדה להיות צלם. החלטת הזמן מוגבלת במספר עמדות אורכי הגל. עבור זמן לשגות לטווח ארוך של רוב תהליכים תאיים, לרכוש תמונה אחת כל 10 - 20 דקות; ברזולוצית זמן גבוהה (בפרקי זמן קצרים, למשל., 1 דקות) מספקת נקודות נתונים יותר ולכן מעקב תא חזק יותר, אבל גם תוצאות יותר משולבחשיפה לאור ערכות נתונים גדולות יותר.
      1. כמו HT1080 FUCCI יש חלבוני ניאון ירוק ואדום דינמיים (ראה תוצאות נציג), השתמש פעמי החשיפה הבאות: FITC / GFP - 50 msec, טקסס האדומה / TRITC - 40 msec, Brightfield - 20 msec. השתמש סל 2 x 2.
    3. אפשר autofocusing תוכנה נשלט באמצעות הפרמטרים של ברירת המחדל תחת הגדרות מתקדמות. גדר טווח פוקוס אוטומטי של 10 מיקרומטר עם גודל הצעד המומלץ. הקפד לעשות זאת לפני תחילת זמן לשגות. פוקוס אוטומטי עם תמונות brightfield ולעולם עם הקרינה להפחית phototoxicity ואת photobleaching.
      1. השתמש מערכות autofocusing מבוקרי תוכנה על כל מיקרוסקופ עם במה ממונעת, ולהתמקד ישירות על המדגם. עם זאת, הם יכולים להגביל את מהירות הרכישה של הניסוי. חומרת מבוקר מערכות התמקדות רציפה לעבוד גם עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות ולשפר את מהירות, המאפשרות עמדות יותר להיות צלמה או שיעור גבוה יותר של רכישה. עם זאת, הםלהסתמך על זיהוי של ממשק זכוכית האוויר ועלול לאבד את הפוקוס של המדגם עם וריאציות עובי זכוכית על פני הבאר.
    4. חלף חצי התקשורת עם תקשורת המכילה את ריכוז התרופה הרצויה כי כבר חמם עד 37 מעלות צלסיוס מדיה חלופית חלקית עוזר להפחית סחיפה תרמית. התנאים בניסוי זה הם רכב (DMSO), 1 selinexor מיקרומטר ו 10 מיקרומטר PD0332991.
      הערה: שלב זה יכול להיעשות גם לאחר תחילת הרכישה על ידי השהיית והפעלה מחדש של הניסוי. זה מאפשר מעקב אורך של תגובות לפני ואחרי תרופה של תאים בודדים. אם את יציבות התרופה או מטבוליזם היא דאגה, משתהה והחלפת התקשורת יכולה להיעשות עם אותה שיטה. כדי לבדוק שפלה או מטבוליזם תרופה, מדיה מתאי שטופל ניתן להציב גם על תא נאיבי לבדוק פעולת תרופה.
    5. הפעל את הזמן לשגות.
    6. ככל שהזמן לשגות פועל, ודא שהשדות צילמו להישאר בפוקוס ואת chamber שומרת על לח 37 o C.
      1. להתאים את המיקוד לפי הצורך על ידי השהיית הרכישה במהלך פער זמן בין נקודות הזמן.
    7. אם יש צורך, מוסיפים מים לתא במהלך הניסויים כבר. הימנע קירור החדר על ידי הוספת מראש התחמם, מים מזוקקים סטריליים על 37 מעלות צלסיוס

    8. סיום זמן לשגות

    1. כאשר הניסוי יש להפעיל להשלמה, להפסיק את הרכישה אם זה לא היה מוגדר להפסיק באופן אוטומטי.
    2. ודא הזמן לשגות נשמר כראוי על גבי הכונן הקשיח, אם כי חבילות התוכנה ביותר לשמור באופן אוטומטי במהלך הרכישה אם לא הסתיים נתונים כראוי יכולים ללכת לאיבוד.
    3. הסר את התא המיקרוסקופ ועושה את התאים לתוך פסולת ביולוגית מסוכנת בעקבות הליכי בטיחות ביולוגיים מוסדית מאושרים.

    9. מעקב אורך וניתוח של נתוני זמן לשגות

    1. בחר את המתודולוגיה לניתוח כי הואלנכס את התהליכים הביולוגיים של עניין. רבי plugins עבור ImageJ, תוכניות באמצעות Matlab, ופלטפורמות מנהג הופקו עבור יישומים ספציפיים. המתודולוגיה הבאה מכסה מעקב של גרעינים וניתוח של בדיקות ניאון גרעינית כפי שמודגם איורים 4 ו -5.
    2. פתח את ערימות תמונת .tif עבור הערוצים מנוצלים ImageJ. לחלופין, קבצי יליד פתוח מתוכנית הרכישה ישירות ImageJ באמצעות תוסף Bioformats.
    3. צייר אזור של (ROI) ואינטרסים בתוך גרעין של תא אחד באמצעות תמונה brightfield או בערוץ התווית גרעיני (אם משתמשים בו) ולהוסיף אותו מנהל ROI. הערה: אם התאים צלמו יש תווית גרעינית (למשל, היסטון H2B-EGFP.), ולאחר מכן מעקב תא אוטומטי עשוי להיות מנוצל כדי ליצור אזורים של עניין (ROIs) המייצג גרעינים בודדים לאורך זמן.
    4. להמשיך עד לנקודה בפעם הבאה ומקם את ההחזר על ההשקעה בתוך אותו nucleuים. מוסיפים את ההחזר על ההשקעה למנהל ROI.
    5. המשך לעקוב אחר ולעשות ROIs עבור תאים בודדים עד שלא יהיה אירוע הסלולר (מיטוזה, אפופטוזיס, וכו.) או התא כבר לא יכול להיות במעקב (כלומר., נע מחוץ למסגרת או שהניסוי מסתיים).
    6. כאשר ROIs הוקם תאים באמצעות הזמן הם בתחום, להרכיב אותם על ערוצי הניאון של עניין. למדוד את עוצמת הממוצע של הקרינה בכל אחד מהערוצים לכל נקודת זמן. שמור את רשימת ROI לשימוש מאוחר יותר.
      1. מדידות שונות יכולות להתבצע בתוך ההחזר על ההשקעה עבור יישומים בניסויים שונים. לחץ מדידות סט ניתוח → ... כדי להציג תפריט כדי לבחור את השיטה האנליטית (למשל., אומר עוצמת בתוך ROI, עוצמת משולבת, וכו.).
    7. הערת גורלות תא עבור תאים בודדים (למשל., אפופטוזיס, חלוקה, הישרדות) תוך מעקב. זה מאפשר יצירת עקומות הישרדות furtheניתוח אוכלוסיית r.
    8. עם עוצמת הממוצע של שני הערוצים, ליצור פיזור עלילה להציג דינמיקת מחזור התא בתגובה רפויה (איור 5 ב, ג).
      הערה: מגרשים ניתן ליצור עבור תאים בודדים לאורך זמן או בממוצע לכל אוכלוסיה של תאים במעקב. הדמיה כמוני יכולה להיות קריטית עבור הקמת תגובות מורכבות ומערכות יחסי תא בתגובה בריפוי הסרטן. מיקרוסקופיה זמן לשגות לטווח ארוך, מעקב אורך וניתוח נתונים הוא תהליך רב שלבים, עם אפשרויות רבות עבור הסוג של כלי מיקרוסקופיה וניתוח, ועוקבת אחר בקווים הכלליים הניתנים באיור 1.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    הזמן לשגות לטווח ארוך מיקרוסקופיה מעקב אורך ישיר מאפשר לחקר השפעות רבות נגד הסרטן במהלך תגובת תרופה. בעקבות בקווים הכלליים באיור 1, מספר דוגמאות של תאים מוצגות להביע כתבי ניאון תוקפים כי שטופלו בתרופות אנטי-סרטניות, במעקב, ונותחו באמצעות גישות שונות.

    מיקרוסקופ לעומת שלב לבד הוא מאוד אינפורמטיבי מדווח וחסון על שלבי ביניים לעומת מיטוזה, משך mitotic ומעצר, חלוקת תאים נורמלית, ותא מוות 21,23,24. תרופות למקד חלוקת התא, לעתים קרובות תרופות אנטי mitotic כינה, להמשיך להתפתח. איור 2 ו סרטים 1 ו -2 דוגמאות הפגנת זוג שורות תאים בשד מתאימים MCF7 הנגזרות סרטן, שההבדל היחיד ביניהן מצב p53 שלהם, שטופלו 500 ננומטר של סוג של תרופה אנטי-סרטנית כי מטרותומעכב את חלבון מנוע mitotic, Kinesin-5 (KSP1, Kif11, Eg5), וכתוצאה מכך מיטוזה הממושכת 20. סוג פרוע תאי MCF7 (איור 2 א) הם פרדיגמה ללמוד עיכוב מחזור התא תלוי-p53 25-27. תאים מסוג Wild להיכנס מיטוזה, להישאר במשך מספר שעות, ובסופו של דבר לעזוב ולעצור בעיקר עם אינדוקציה של p53 25. כאשר p53 הוא הוסר על ידי מציאת p53 יציבה (p53 sh MCF7), במקום לעצור אחרי שהם עוזבים מיטוזה, התאים עוברים מחזורים חוזרים ונשנים (איור 2 ב). תאים היו במעקב ידני ומדד mitotic ואחוז התאים להזין מיטוזה שני דורגו (איור 2 ג, ד). אנו צופים כי התא p53 sh במעקב מחלק כאשר הוא נכנס לסיבוב שני של מיטוזה ולא עוצרים ולהשאיר מיטוזה ללא חלוקה. בעוד לא מוצג כאן משך אירועי mitotic, זמן בין רצופים mitoses, אחוז חלוקות תא, ואירועי מוות של התאים הקשורים יכול להיות גם שלcored 20,21.

    Taxanes, למשל paclitaxel ו- docetaxel, הם כימותרפיה נפוץ סרטן רבים, כולל אלה שקשה לטפל כמו שד הלבלב ומתקדם. פקליטקסל נקשר פלוס-הסוף הדינמי של microtubules ומייצב אותם, למנוע התפקוד התקין שלהם. פקליטקסל ציין תופעות תלויות במינון, ואף בריכוזים נמוכים יכול להפריע רגיל התקדמות mitotic וכרומוזום פרדה 16. פרדה נאמנת של כרומוזומים חיונית התפשטות תאים נורמלית ומתי לא תקין יכול לגרום aneuploidy שעלול לגרום עיכוב מחזור התא, אלא גם לפעול כנהג התקדמות הסרטן. איור 3 ולהראות Movie 3 תאי הלה צוואר רחם נגזר קרצינומה ביציבות להביע הכרומטין היסטון-2b סמן התמזג mCherry ובטא טובולין התמזג EGFP (לא מוצג) ב מטופלי מדיום גידול רגיל עם 1 paclitaxel ננומטר. בזהלמשל, כניסה והתקדמות באמצעות מיטוזה יכולים להיות אחריו. העיתוי של מיטוזה נראה נורמלי בתא הזה, אולם יישור כרומוזום וההפרדה אינו, וכתוצאה מכך בליטות גרעיניות גרעינונים כי הם מבנים מציינים פרדת כרומוזום עניה. גרעינונים מועדים לנזק ב- DNA chromothripsis, המהווה את הפיצול בקנה מידה גדול של כרומוזומים או הכרומטין - יש לכך השלכות חשובות באבולוציה הגידול 28,29. בעוד לא מוצג כאן, מקורם של גרעינונים ביחס למבנים mitotic אחרים ואת גורלו של תאים אלה ניתן לעקוב ישירות באמצעות זמן לשגות לטווח ארוך. יתר על כן, סמן הכרומטין הביע עם כתבת נזק לדנ"א יכול לשמש כדי לבסס את הקשר בין הפרדה כרומוזום, גרעינונים ונזק DNA.

    כתבים פלורסנט לאפשר תהליכים בתא מנייה להיות במעקב וכתבים חדשים מפותחים ללא הרף. לקבלת לשעברבשפע, מחזור התא מורכב שלבים כי הם בעלי עניין מיוחד בפיתוח ממוקד הרפוי נגד סרטן. איור 4 ו- Movie 4 מראה שורת תאים שמקורם fibrosarcoma (HT1080) וששיתוף מבטא ביציבות שני כתבים כינה, אינדיקטורים מחזור התא פלורסנט היוביקוויטין (FUCCI) 30. במערכת כאן, חלק מן פוליפפטיד Cdt1 הוא התמזג mKO2 (כתום Kusabira monomeric 2) ועליית פאזיים G1 ו נפגע מוקדם S-שלב, ומנת geminin הוא התמזג מג (ירוק Azami monomeric) ועלייה-S-שלב באמצע והוא מושפל על anaphase. תא זה הוא במדיום הגידול נורמלי התקדמות דרך מחזור התא ב 15 שעות. איור 5 א ', ב' ו- Movie 5 להראות אותם תאים במדיום נורמלי שטופלו 10 מיקרומטר PD0332991, מעכב cdk4 / 6. התאים להתקדם דרך שלב G2 ולחלק בדרך כלל, בתוקף לעצור את G1-השלב הבא, המציינים את פוטנציאל ההשפעה ive תופעות cytostatic בגידולים גדל. איור 5 ג, D ו- Movie 6 להראות אותם תאים במדיום נורמלי שטופלו selinexor נקרא מולקולה קטנה (KPT-330) חברה חזק מעכב חלבון ייצוא גרעיני, exportin-1 (XPO1, aka CRM1 ). תרכובות אלה מכונים מעכבי סלקטיבית של יצוא גרעיני (SINE) ואת ההשפעות האנטי-סרטניות שלהם כרגע תחת חקירה 31,32. תוצאות טיפול SINE ב פנוטיפים מחזור התא חזקים 33,34 בתא הנידונים למוות. דוגמא זו מראה תא כי התקדמות דרך פאזיים G1 עם קינטיקה רגיל (כ -6 שעות), אבל חוותה עיכוב בהתקדמות S-שלב כפי שצוינה על ידי התקופה עם אות אדום וירוק הוא (כ 3 שעות בשליטה אבל 10 ב SINE מטופלים ). תא זה מת S- או G2-שלב מאוחר אחרי 21 שעה ו -30 דקות; מחזור תא נורמלי הוא כ 15 שעות. ההשפעות של selinexor להתוויה של דם שונה וגידולים 35.

    FO: keep-together.within-page = "1"> עמוד התווך של טיפול נגד סרטן הוא cytotoxicity באמצעות נזק לדנ"א קטסטרופלי. נזק לדנ"א יכול להיגרם באמצעות טיפולים רבים, כולל קרינה, adducts מבוססי פלטינה, ותרופות מולקולה קטנה - למשל, אלה למקד שאני topoisomerase ו / או השנייה. טיפולים משולבים רבים תוקפים גם את ציר נזק לדנ"א על ​​ידי אחד גרימת נזק דרך מסלולים נפרדים או חוסם את היכולת של התאים לתקן את הנזק. קינטיקה ורמת נזק ואם ואיך זה גורם מוות של תאים הוא בעל חשיבות נפוצה הרפוי התפתחותית. איור 6 ולהראות סרט 7 HT1080 תאים ביציבות להביע עיתונאי נזק לדנ"א דו-גדיל, mCherry-BP1-2 36 בצמיחה נורמלית בינוני שטופלו 10 מיקרומטר etoposide (VP-16), רעל topoisomerase II. הכתב הזה מורכב חלק של חלבון האתר לשבור פעמים גדיל DNA, 53BP1 כי הוא התמזג mCherry. הגרעין של תא זה היה במעקב using תוסף החלקיקים לנתח ImageJ ואת אות mCherry-BP1-2 המשולב נמדד בכל מסגרת לאחר thresholding את הערכים בוטלו בדיקה גרעינית מסיסה. הניזק לדנ"א הוא מינימאלי עבור 10 השעות הראשונות ולאחר מכן גדל בהתמדה. Topoisomerase II מעכבים ידועים בהשפעתם במיוחד S- ו G2 פאזיים, כאשר האנזים הוא הכי פעיל 37,38. קינטיקה שנצפתה בדוגמה זו יכול להצביע על נזק הקשורים מחזור התא; שילוב mCherry-BP1-2 עם כתבים FUCCI יכול להדגים את העיתוי של נזק זה יכול להיות קשור אז לתא גורל.

    איור 1
    הסקירה כללית באיור 1. שימוש זמן לשגות מיקרוסקופי לזמן ארוך מעקב לאורך שנים כדי ללמוד תגובת תרופה אנטי-סרטנית. תאים בצלחות הדמיה מתאימות לחיות תאים שכותרתו מועדפים הם צלמו, תאים או אזורים של עניין הם עוקבים, והנתונים מְנוּתָח. שיטות רבות קיימות כדי לעקוב ולכמת תאים, חלקם מסומנות כאן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    איור 2. שלב בניגוד זמן לשגות מיקרוסקופית מופעים-התלות p53 לאחר טיפול תרופתי אנטי-mitotic. Wildtype (א) ו-מציאה p53 (ב) בתאים MCF7 טופלו 500 ננומטר Kinesin-5 מעכב צילמו כל 10 דקות למשך 96 hr באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד עם עדשה NA 20X PH2 0.70. תאים בודדים אותרו ידני ואת מיטוזה האחוז ואם התא מתקדם מיטוזה אחרת שוב במהלך הזמן לשגות דורגו. החצים מצביעים על תאים כי מתבצע מעקב. תא p53 sh (B) מחלק על הזנת מיטוזה שנייה. (ג) שתי שורות תאים shoמעצר mitotic w ממושך כפי שצוין על ידי מיטוזה אחוזים שיא גבוהה (חיצים כחולים ואדומים הראשון). (C, D) קרוב ל -90% של תאים ללא p53 (p53 sh, n = 87) התקדמות המשיך להראות (חצים אדומים) לעומת 20% של wildtype (n = 130). ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. בר = 20 מיקרומטר. סרטים 1 ו -2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3. 2b היסטון דה מרקר הכרומטין חושף ראיות של כרומוזום פרדה חריג לאחר במינון נמוך פקליטקסל טיפול. פקליטקסל היא תרופה במיקוד microtubule שתוצאתו מורכב, פגמים תלויי ריכוז צמיחת תאים וחילוק. ארגון הכרומטין מודיע על מדינות תאים שונים, לרבות שלבשל מיטוזה תהליכי המוות התאי. תאי הלה שמבטאים H2B-mCherry ו β טובולין-EGFP טופלו ביציבות עם 1 paclitaxel ננומטר. תא זה הוא תחילה הביניים, התקדמות דרך שלבי מיטוזה מחלק. בעוד זמן מיטוזה נראה נורמלי, יש ראיות של טעויות מצורפות והפרדת כרומוזום נפתרות (חיצים). גורלו של תאים אלה יכולים להיקבע באופן ישיר על ידי מעקב האורך. ניגודיות שלב (לא מוצג) ותמונות פלורסנט נרכשו ב 1 מסגרת לכל 10 דקות עם עדשה NA 0.70 20X PH2. בר = 10 מיקרומטר. סרט 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    סמני איור 4. מחזור תא פלורסנט אפשר לניטור ישיר של התקדמות מחזור התא.(א) בתחום של תאי fibrosarcoma חיים HT1080 המבטאים את מערכת FUCCI צלמה ידי שלב בניגוד קרינה. (B, C) ​​תא mitotic בתיבה מקווקו בפאנל אחריו. בדרך כלל להתקדם דרך מחזור התא בתוך כ -15 שעות. לאחר מיטוזה, התאים עמומים בקצרה, ולאחר מכן להיות אדום כפי שהם התקדמות לתוך ודרך פאזיים G1. כאשר תאים להיכנס S-שלב, חללית אדום Cdt1 נפגעת והעליות החלליות geminin הירוקות. התקציר כ תקופת hr 3 שבו הבדיקות הן נוכחים, מציין S-שלב מוקדם. ככל שהתאים להתקדם דרך S- ו G2 פאזיים ולתוך מיטוזה הבא הם נשארים ירוקים. החללית הירוקה היא מושפלת על anaphase של חלוקת תא. שלב בניגוד ותמונות פלורסנט נרכשו ב 1 מסגרת לכל 10 דקות עם עדשה NA 20X PH2 0.70. בר = 10 מיקרומטר. סרט 4. נא ללחוץ כאן VIEW גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 5
    איור 5. מחזור תא השפעות ספציפיות ומות תא Associated. באותו קו התא כמו באיור 4 אבל שטופל שתי מולקולות שונות המייצגות מטרות אנטי סרטניות שונות. טיימס לאחר הטיפול מסומן. (A, B) לאחר טיפול של תא S / G2-שלב מאוחר עם 10 מיקרומטר PD0332991 cdk4 / 6 מעכב, זה התא התקדמות בדרך כלל מיטוזה (M) ו מחלק. תא בת אחת הוא אתר על ידי מדידת עוצמות ניאון אדומות וירוקות באזור של עניין הגרעין. התא נשאר נעצר G1 פאזיים כ 40 שעות. (C, D) לאחר טיפול של תא G2-שלב מאוחר עם 1 מיקרומטר selinexor, זה התא התקדמות בדרך כלל מיטוזה (M) ו מחלק. תא בת אחת הוא אתר וזה נכנס G1 פאזיים, התקדמות דרךשלב S-מוקדם וממושך (אות אדומה וירוקה), מעבר לירוק אך ורק ומת לאחר 21 שעות 30 דקות. הנתונים מראים התקדמות S-שלב מושפע טיפול selinexor. שלב בניגוד ותמונות פלורסנט נרכשו ב 1 מסגרת לכל 10 דקות עם עדשה NA 20X PH2 0.70. בר = 10 מיקרומטר. סרטים 5 ו -6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 6
    נזק לדנ"א איור 6. Dynamics לאחר טיפול תרופתי. טיפולים אנטי סרטניים רבים לגרום נזק לדנ"א שיכולים להשפיע עמוקות בתגובה התא הצלחת הטיפול. HT1080 תאים המבטאים ביציבות הן נזק לדנ"א דו-גדיל סמן mCherry-BP1-2 ו H2B-EGFP (לא מוצג) טופלו 10 מיקרומטר של etoposide התרופה topoisomerase II ו- ד DNA amage היה במעקב. (א) מספר ועוצמת העלייה מוקדים לאחר etoposide. יש בתחילה בפיגור, המציין תופעות מחזור התא אפשריות בקנה אחד עם המנגנון הידוע של etoposide. ב -22 שעות 50 דקות בתא הזה צבר רמות גבוהות של ניזק. בעוד לא מוצג כאן, גורלם של תא זה יכול להיקבע על ידי מעקב ישיר. (ב) ROI המתאים לגרעין שהושג באמצעות אות H2B-EGFP היה למעקב באמצעות מעקב חלקיקי ImageJ ואת אות BP1-2 mCherry המשולבת הייתה לכמת זממה לאורך זמן. פיגור האות עד כ 10 שעות יצוין, ואחריו את גידול מתמיד. תמונות פלורסנט נרכשו ב 1 מסגרת לכל 10 דקות עם עדשה NA 40X PH2 0.75. בר = 10 מיקרומטר. סרט 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    .within-page = "1"> moive 1
    זמן לשגות מיקרוסקופי שלב ניגודיות סרט 1. של תאי wildtype MCF7 לאחר אנטי mitotic ותרופות טיפול. תאי wildtype MCF7 טופלו 500 ננומטר Kinesin-5 מעכב צלם כל 10 דקות במשך 96 שעות באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד עם PH2 20X 0.70 עדשת NA. מעצר mitotic ממושך ויציאה מן מיטוזה ניתן לצפות, כמתואר באיור 2. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    moive 2
    סרט 2. זמן לשגות מיקרוסקופי שלב ניגודיות של תאי MCF7-מציאת p53 לאחר הטיפול התרופתי אנטי-mitotic. תאי MCF7 להביע RNA סיכת ראש קטן מיקוד p53 ביציבות שפל טופלו 500 ננומטר Kinesin-5 מעכב צלם כל 10 דקות במשך 96 שעות באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד עם עדשת NA 20X PH2 0.70. מעצר mitotic ממושך סבבים רבים של מיטוזה ניתן לצפות, כמתואר באיור 2. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

    moive 3
    זמן לשגות מיקרוסקופית פלורסנט סרט 3. הלה תאים לאחר טיפול פקליטקסל במינון נמוך. תאים הלה להביע ביציבות H2B-mCherry ו β טובולין-EGFP טופלו 1 paclitaxel ננומטר. מצורף כרומוזום ונושאים הפרדה ניתן לצפות, כמתואר באיור 3. תמונות נרכשו כל 10 דקות עם עדשה NA 20X PH2 0.70. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    ove_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> moive 4
    סמנים סרט 4. מחזור התא פלורסנט אפשר לניטור ישיר של התקדמות מחזור התא. HT1080 תאים המבטאים את מערכת FUCCI אותרו longitudinally במהלך מיקרוסקופיה זמן לשגות. התא עובר עמום לאחר היציאה מיטוזה, ולאחר מכן הופך אדום כמו תא התקדמות דרך פאזיים G1. כפי התא נכנס S-שלב, הוא הופך להיות צהוב כמו העליות החלליות geminin הירוקים חללית Cdt1 האדומה נפגעות. התא נשאר ירוק תוך כדי התקדמות דרך S- ו-שלב G2. הירוק מדרדר כמו התאים נכנסו anaphase. כימות של התא הזה מוצג באיור 4. תמונות נרכשו כל 10 דקות עם עדשה NA 20X PH2 0.70. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    5 moive "src =" / files / ftp_upload / 53,994 / 53994movie5.jpg "/>
    Cell סרט 5. HT1080 הבעת מרקרים מחזור התא פלורסנט לאחר טיפול עם מונעי G1 פאזיים. HT1080 תאים המבטאים את מערכת FUCCI טופלו 10 מיקרומטר PD0332991, מעכב cdk4 / 6. התא מעקב התקדמות בדרך כלל מיטוזה מחלק. בת אחת היא במעקב, ונשארה אדום ב- G1 למשך הסרט. כימות מוצג באיור 5. תמונות נרכשו כל 10 דקות עם עדשה NA 20X PH2 0.70. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    moive 6
    Cell HT1080 סרט 6. הבעת מרקרים מחזור התא פלורסנט לאחר טיפול עם מונעי exportin-1, Selinexor. HT1080 תאים המבטאים את מערכת FUCCI היו תענוגאד עם 1 מיקרומטר selinexor. תא G2-שלב מאוחר זה היה במעקב באמצעות מיטוזה. תא הבת אז התקדמות דרך G1 פאזיים (אדום) ונכנס S-פאזי (צהוב). התא מתקדם לאט דרך S-שלבים עד שהוא נכנס מאוחר-S / G2 פאזיים ומת לאחר 21 שעות 30 דקות של טיפול. כימות מוצג באיור 5. תמונות נרכשו כל 10 דקות עם עדשה NA 20X PH2 0.70. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    moive 7
    Dynamics נזק הסרט 7. DNA לאחר טיפול עם HT1080 תאים topoisomerase II מונעי. ביציבות להביע את הסמן לנזק ב- DNA פעמיים גדיל mCherry-BP1-2 ו H2B-EGFP טופלו 10 מיקרומטר etoposide, מעכב topoisomerase II. MCherry-BP1-2 מוצג בסרט. כפי להמטיךים, האות של עליות mCherry-BP1-2, המציין גדל נזק לדנ"א דו-גדיל. כימות מוצג באיור 6. תמונות נרכשו כל 10 דקות עם עדשה NA 40X PH2 0.75. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    יתרונות של זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב לאורך שנים

    המיקרוסקופ הוא מכשיר אידיאלי עבור מחקרים ארוכי טווח התגובה התרופה כפי שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תאים בודדים גורלם וכן את כלל האוכלוסייה. השתנות בתגובת סמים בתוך אוכלוסייה של תאים היא בעיה רצינית עבור עיצוב טיפולי נגד הסרטן. מעקב אורכית תאים בודדים מאפשר לחוקרים להתבונן השונות הזאת ולהתחיל להבין את המנגנונים ואת ההשלכות הבסיסיות כפי שהוא נוגע אוכלוסיית התא. ניצול מגוון של בדיקות ניאון מספק שפע של דרכים להתבונן ולהבין הוא פנוטיפים תגובה נפוצים ונדירים. התזמון תרומת גורלות תאים שונים על התגובה האוכלוסייה, יחסים בין פנוטיפים מסוימים גורלות, ואת ההבדלים בתגובה בין שורות תאים או המדינה על הטיפול הן דוגמאות למה שניתן ללמוד. ניתן ללמוד תהליכים רבים הקשורים לסרטן. כמה שאינם הדגיש במאמר זה כוללים מוות של תאים עם אפופטוזיס, autophagy, וכתבים נמק 39-42, תא הפלישה 43,44, ודינמיקה p53 הקובעים החלטות גורל התא 27. בנוסף, גישה זו אינה מוגבלת מחקרים במחקרים רפויים נגד סרטן. אותם עקרונות ניתן להשתמש כדי ללמוד רבות תהליכים ביולוגיים אחרים כולל הדינמיקה cytoskeleton מיטוזה 45 46,47 ו איתות תאיים 48.

    מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות יכול גם לספק נתוני לוקליזציה ועוצמת חלבונים ומולקולות של עניין. לא רק הם שינויים ברמת חלבון חשוב בתגובה לתרופה, אך הלוקליזציה הנכונה (או לא תקינה) של חלבונים בתוך התא היא קריטית עבור תגובת הבנה. זמן לשגות מיקרוסקופית מספק נתונים על שם חלבונים הם נקודתיים (למשל., גרעין, cytosol, אברונים ספציפיים,וכו.) לאחר טיפול תרופתי ואיך הלוקליזציה והרמות הכוללות להשתנות עם זמן ברמת תא מאוכלוסייה אחת.

    אתגרים ומגבלות

    למרות החוזק של מיקרוסקופיה זמן לשגות וניתוח האורך של תאים בודדים, יש מגבלות. כתבי קרינה מוגבלים על ידי היציבות והספציפית שלהם. בעת תכנון חלבוני היתוך ניאון, חשוב לבחור בדיקה כי הוא צילום יציב ובהיר, אבל יש גם צורך להביא בחשבון את ההשלכות של תג פלורסנט להיות מחובר לחלבון של עניין לגבי תפקוד והיכולת הרגילים שצריך לבצע לוקליזציה . נושאים אלה נדונו בהרחבה במקום אחר ויש חלבונים רבים זמינים מתויג ניאון אשר פורסמו 15,49,50. תוויות ניאון אחרות או תגים ניתן להוסיף את התאים, וטיפול יש לנקוט כדי להבטיח שהם לא רעילים. מניסיוננו, אלה pגלימות, עבור תוויות המיטוכונדריה למשל (פוטנציאל הממברנה) או צבעי DNA חדיר תא, נוטות להלבין קלות תהיה מדולל-אאוט עקב התפשטות תאים.

    בנוסף, ישנם אתגרים טכניים רבים עם צומח התבוננות בתאים על מיקרוסקופ. חוסר יציבות לגבי טמפרטורה, לחות, האווירה, ואור יהיו השפעות גדולות על התאים, והתוצאה היא אובדן של נתונים או אפילו הניסוי כולו. בעיות יציבות לגבי לכידת תמונה ניתן לראות סרטי 1 ו -2. השפעה זו ניתן למזער באמצעות סרט פרפין (ראה 4.2). יש גם אלגוריתמים ייצוב תמונה זמין לעיבוד שלאחר הרכישה, למשל באמצעות ImageJ (NIH). היבט של זמן לשגות לטווח ארוך כי הוא לעתים קרובות התעלם הוא ניהול נתונים ואת גודל קובץ. גם כאשר binning הנתונים, ניסוי זמן לשגות יחיד הוא בדרך כלל העולה על 30 ג 'יגה בייט. קיבולת גבוהה, במהירות גבוהה, אחסון נתונים אמין והעברה חזקותly עודד. בהתאם biosensor ניאון (ים) להיות הדמיה, היא לעתים קרובות אין צורך לרכוש תמונות ברזולוציה מלאה, עבור גרעיני למשל או חיישנים cytoplasmic. אנו ממליצים במידת האפשר, לנקוט צעדים כדי לשמור קובץ בגדלים קטנים, וכתוצאה מכך קל יותר לעבוד עם נתונים, פחות צרכי המחשוב התובעניים, ותזרים עבודה משופר.

    Phototoxicity הוא החשש העיקרי בעת ביצוע מיקרוסקופיה זמן לשגות לטווח ארוך. אור בעוצמה גבוהה וחשיפות ארוכות יכול להוביל photobleaching של בדיקות ניאון, מתח התא מוות של תאים. תופעות אלה יכולים להיות בעלי השפעה גדולה על נתונים ולהוביל מצג שווא של הניסוי. binning ורווח מצלמה שניתן להשתמש בהם כדי להפחית את זמני החשיפה. מסנני צפיפות ניטראליים נתיב האור להפחית את עוצמת האור על המדגם. אורכי הגל של אור המשמשים תמונה ישפיעו גם על התאים. אורכי גל קצרים יותר (UV, UV הקרוב) הם מזיקים יותר לתאים ולגרום צילום הלבנה בשיעורים מהר יותראורכי גל ארוכים יותר (למשל., אדום, הרבה אדום). בחירה של מטרה יכולה להשפיע גם הדמית תנאי. עדשות צמצם מספרי גבוהות (NA) תפקנה תמונות ברזולוציה גבוהות יותר, אבל בהגדלה גבוהה יותר מאפשרת פחות אור כדי להיות מועבר מן המדגם וכתוצאה מכך פעמי חשיפה גבוהות יותר או אור חזק יותר. אובייקטיבי יש לבחור עם NA וגדלה מתאימות כי תפתור את האובייקט של עניין ללא לדגימת יתר. במקרים רבים, המטרה הגבוהה לא יכולה להיות הבחירה המתאימה ביותר. עם בדיקות גרעיני (איורים 4, 5), מטרה בהגדלה נמוכה מאפשרת שדה גדול כדי ליפול בפח, הגדלת גודל המדגם ביעילות, מבלי להתפשר על רזולוציה של האובייקט הרצוי. זמן לשגות לטווח ארוך בממדים שלושה צריכות להתבצע בזהירות בשל חשיפה לאור משולבת. באמצעות דיסק מסתובב מיקרוסקופ confocal, מצלמה רגישה (למשל., EM-CCD), רווח המצלמה, ומנוע פייזו מהיר עבור z-Series הוא suggesteד להקטין את החשיפה לאור. רכישת z-סדרה מהירה כמו כן, חשוב למזער ממצא תנועה בשל תנועת התא ודינמיקה המתרחשות במהלך תקופת הרכישה. ניתוח אמפירי של תאים שלא טופלו באמצעות הגדרות רבות ושונות יכול להיות שימושי בקביעת האפקטים של אור הניאון על כל קו תא נתון או עיתונאי. בנוסף, קבוצת ביקורת צריכה להיכלל כל ניסוי כדי לקבוע את השפעות ציטוטוקסיות של גדרות ניסוי.

    וריאציות של הטכניקה

    לטווח ארוך זמן לשגות הוא חזק מאוד גמיש. שימוש בטכניקות תרבות-שיתוף, שורות תאים שונות או באותו שורות תאי מבטאי כתבים שונים יכול לשמש. אחת הדוגמאות הבולטות לכך היא הדמיה תאים phagocytic עם תאים היעד ההולכים וגוועים בתגובה תרופה אנטי-סרטנית. דוגמא נוספת יכולה להיות ללמוד את השפעת להגיב תאים על תאי שכני סמים נאיביים. יחד עם צילום ACTIVAteable, צילום המירות, וחלבונים ניאון להחלפה צילום, וחלבונים מהונדסים שיכול להיות מופעל על ידי אור כדי לעורר השפעות ספציפיות (למשל., KillerRed), יש הרבה אפשרויות. עוד גישות מורכבות ניתן להשתמש המעסיקות סוגים מיוחדים שונים של מיקרוסקופיה כגון חלוקה מחדש פלורסנט לאחר photobleaching, תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג), ורזולוציה סופר (למשל., מיקרוסקופיה שחזור האופטית סטוכסטיים (STORM), מיקרוסקופיה תאורה מבנית (SIM), או דלדול פליטה מאולץ (STED)), ורבים אחרים ויש יתרונות ומגבלות של כל גישה.

    לטווח ארוך (למשל., שבועות, חודשים) תגובות וההתאוששות של תאים לאחר הסרת התרופה היא מרכזיים להבנת פעולת תרופה אנטי-סרטנית. מנות זכוכית תחתונה gridded הן כלים רבי ערך כדי לפקח תאים או אזורים ספציפיים בתוך אוכלוסייה / שטח שוב ושוב. לדוגמא, עם צלחת gridded, את ד"ר הראשוניבתגובה UG ניתן הדמיה באמצעות זמן לשגות, התרופה ניתן להסיר, ואזורים ספציפיים ברשת ניתן הדמיה לאורך זמן או נתון זמן לשגות נוספים בזמן הרצוי. תחתית הזכוכית על הכלים ניתן להסיר על ידי אחד חיתוך עם כלי סופר או באמצעות ריאגנט מסחרי, והתאים על זכוכית יכול להיות מוכתם עבור סמנים אחרים בעלי עניין, לפעילות β-galactocidase הקשורים להזדקנות למשל, ולעומת את הזמן לשגות להבין את ההיסטוריה של כמה תאים הגיעו למצב כזה. אם אוכלוסיית תאים גדול מספיק זה יכול להיות גם נתון immunoblotting או cytometry זרימה.

    דגימות עבות היו קשות באופן מסורתי תמונה עבור spheroids למשל בחומרים ומטריצות ג'ל שונים. חדש יותר גישות כולל confocal פלורסנט או במיקרוסקופ רב פוטון 16,18,19,51 יכול לשמש כדי להרחיב את הגישה אל בהבנה באתרו של כיצד תאי מגיבים רפויים נגד סרטן. הse מחקרים ומספר גדל והולך של מדענים באמצעות זמן לשגות ללמוד בתגובה תרופה אנטי-סרטנית 24,52-54 להפגין בבירור כי אנו נעים לקראת פיתוח הבנה של פרמקודינמיקה תא בודד שיעזור לשפר את יכולתנו להשתמש בסמים אנטי סרטניים בצורה יעילה יותר ואולי לנבא תגובת תרופה אנטי-סרטנית.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
    2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
    3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
    4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
    5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
    6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
    7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9, (e93718), (2014).
    8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
    9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
    10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
    11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
    12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. (2008).
    13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
    14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
    15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
    16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
    17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
    18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
    19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
    20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
    21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
    22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
    23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
    24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
    25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
    26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7, (488), (2011).
    27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
    28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
    29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
    30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
    32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7, (46), (2014).
    33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
    34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
    35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
    36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
    37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
    38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. (2015).
    39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
    40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
    41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
    42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
    43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
    44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7, (e30605), (2012).
    45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
    46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
    47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
    48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
    49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
    50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
    51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
    52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
    53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
    54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics