Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

anti-kanser ilaçları ile tek hücre yanıtı Popülasyon yanıtı belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır ve bu nedenle genel bir sonuç önemli bir faktördür. Bağışıklık, akım sitometri ve sabit hücre deneyleri genellikle hücreler anti-kanser ilaçlar nasıl tepki incelemek için kullanılır. Bu yöntemler önemlidir, ancak onlar birkaç eksiklikler var. kanser ve normal hücreler arasındaki ve farklı kanser kaynaklı hücreler ve geçici ve nadir yanıtları arasındaki ilaç yanıtları değişkenlik nüfus ortalama analizleri kullanılarak doğrudan izlemek ve uzunlamasına bunları analiz edebilmek olmadan anlamak zordur. mikroskop, özellikle de görüntü canlı hücreler için uygundur. teknolojideki ilerlemeler, sadece hücre izleme değil, aynı zamanda hücresel yanıtların çeşitli gözlem sağlayan bir çözünürlükte rutin görüntü hücreleri sağlamaktadır. Biz sürekli time-lapse görüntüleme sağlayan detaylı bir yaklaşım tarifesasen sürece genellikle 96 saat kadar istediğiniz gibi ilaç yanıtı sırasında hücreler. yaklaşımın çeşitleri kullanılarak, hücreler hafta içinde izlenebilir. genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler sayısız süreçler, yolları ve tepkilerinin istihdam ile takip edilebilir. Bu izleme ve hücre büyümesi ve hücre döngüsü ilerlemesinin, kromozom dinamiği, DNA hasarının ölçme ve hücre ölümünü içerir örnekleri göstermektedir. Biz de teknik ve esnekliği çeşitlerini tartışmak ve bazı ortak tuzaklar vurgulayın.

Introduction

Canlı hücre mikroskopi ve tek hücre boyuna izleme yeni bir teknik değildir. Erken mikroskoplar, meraklıları ve bilim adamları tek hücreler ve organizmalar, onların davranışlarını ve gelişimini 1-3 gözlenen ve inceledik. 1950'lerde Vanderbilt Üniversitesi'nde geç David Rogers ünlü bir örnek, bir Staphylococcus aureus bakterisi ve fagositoz 4 sonunda sürecini kovalayan bir kan yaymasında bir insan nötrofil gösterir. Bu canlı hücre film tek bir deneyde gözlenen ve korelasyon nasıl birden çok işlem mükemmel bir örnektir: Bir kimyasal degrade, mekanik ve hücre hareketi hızı algılama, hücre dinamikleri, yapışma, ve bir patojenin fagositozu şekillendirir.

tam otomatik mikroskopları ve son derece hassas dijital kameralar gelişi hücre biyolojisi değişen f temel soru sormak için mikroskobu kullanarak araştırmacılar bir çok artan sayılarda sonuçlandıHücreler 5,6 taşımak ve dinamikleri ve membran ticaretini 9-11 organel 7,8 bölmek nasıl rom. Floresan olmayan, 1953 yılında Frits Zernike için Nobel Ödülü topladı faz-kontrast (PC), ve diferansiyel girişim kontrast da dahil olmak üzere aydınlık mikroskobu (DIC) mikrotübül demetleri dahil hücre ve çekirdeklerin aynı zamanda alt hücresel yapıların gözlem için izin , kromozomlar, nükleol, organel dinamikleri ve kalın aktin lifleri 12. Genetik floresan proteinleri kodlanmış ve organeller karşı floresan boyaların geliştirilmesi önemli ölçüde time-lapse mikroskopi 13-15 etkiledi. Bu yazının odağı değil iken, hücre sferoidler ve in situ (Intravital mikroskopi) konfokal ve multiphoton mikroskopi kullanılarak görüntüleme yaklaşımının başka genişleme temsil ve kullanımı ve bu yaklaşımları 16-19 tartışmak seçkin makaleleri vardır.

Anti-Canc hücre tepkilerier ilaçlar veya doğal ürünler moleküler ve hücresel ölçekte belirlenir. Anlamak hücre yanıtları ve kaderleri aşağıdaki tedavisi genellikle tek hücreleri ölçmek nüfus ortalama deneyleri (örn., Immünoblotting, bütün kuyu ölçüleri), ya da immunofluorescent algılama ile sabit zaman noktaları ve akım sitometri, içerir. bir popülasyon içindeki ilaç tek hücre yanıtlarında heterojenliği, tümörler, özellikle de doygunluğuna aynı ilaç ile muamele edilir hücre hatları ve tümör boyunca görülen yanıt olarak değişkenlik bazı açıklayabilir. Belirli bir tek hücre ya da hücrelerin bir popülasyonu aşağıdaki uzunlamasına yaklaşımlar uzun süreli moleküler cevap yollarının doğrudan çalışma için olanak sağlayan daha az sık ama çok güçlü bir yaklaşım, farklı fenotipleri (örn., Hücre ölümü veya hücrenin bölme), gözlem hücre-hücre bir popülasyon içindeki değişkenliği ve nasıl bu faktörler popülasyon yanıtı dinamikleri 20-22 katkıda bulunur. Iyimser, güçlü olmakgözlemlemek ve uyuşturucu bazen başarısız neden çalışmak ve en iyi nasıl bunları kullanmak için nasıl anlayışımızı geliştirmemize yardımcı olacaktır tek hücre yanıtlarını ölçmek için.

Uzun vadeli time-lapse mikroskobu, uzunlamasına izleme ve ilaç yanıtları analiz tekniği birçok araştırmacı tarafından kullanılabilir ve fenotip yanıtları 20,21 gözlemlemek için sadece iletilen ışık kullanarak, basit olabilir. yaklaşımının ana bileşenleri şunlardır: ilgi hücreleri uygun hazırlanması, çevre haznesi ile otomatik mikroskop, kamera kazanmak ve zaman atlamalı yorumlayan görüntüleri saklamak, yazılım ve ölçmek ve hücreleri analiz etmek için bir bilgisayar ile entegre ve herhangi bir floresan biyosensörler. Biz aydınlık ve / veya widefield epifluorescent mikroskopi kullanılarak sürece birkaç gün kültür hücreleri time-lapse mikroskobu yürütmek için birçok ipuçları ile ayrıntılı bir protokol sağlar. kültüründe yetiştirilebilir herhangi bir hücre hattı için kullanılabilir Bu protokolanti-kanser tedavilerinin kendi yanıtlarını incelemek için. Biz elde edilen verilerin örneklerini sunmak ve kısaca farklı prob türleri, avantaj ve uzun vadeli time-lapse ve boyuna izleme dezavantajlarını tartışmak çok farklı genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler ve faz-kontrast mikroskobu örneği kullanılarak analiz, ne olabilir, olmayan doğrudan yaklaşımlar ve biz yaklaşımı kullanılarak kabul değil deneyimsiz araştırmacıların ilgi ve değer olacağını umuyoruz bazı değişimlerden anlaşılması zor ve deneyimli araştırmacılara bu yaklaşım için öğrendim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki protokol, Şekiller 4 ve 6 ile ilgili olarak elde etme ayarları ve deney koşullarında deneyler ile tanımlanan parametreleri kullanır. Bu parametrelerin çoğu, diğer deneyler uyacak şekilde değiştirilebilir (örneğin, maruz kalma süreleri, gruplama, floresan kanalları, vs.).. Tüm işlemler, kurumsal kurallar ve düzenlemelere uymak zorundadır ve kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından onaylanmalıdır. Mikroskop üretici web siteleri canlı hücre görüntüleme için mükemmel bilgiler içermektedir.

1. mikroskoplar ve Görüntüleme Yazılımı

  1. ters mikroskoplar çok çeşitli canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. En yaygın mikroskoplar Epifloresans ve eğirme diskli konfokal Geniş alanlı edilir. Burada, 200 watt metal halide ışık kaynağı ile bir otomatik ve motorlu widefield Epifloresans mikroskop kullanıyoruz.
  2. Bir sahne top almak veya çevre odasına mikroskop. Burada, bir sahne t kullanmakop çevre odası.
  3. time-lapse mikroskobu yürütmek için programları ile mikroskopları çalıştırmak için ticari yazılım kullanın.
  4. Görüntü analizi için ticari olarak temin edilebilen yazılımı veya ImageJ kullanın. Diğer birçok analiz araçları piyasada mevcuttur ve 8,18 yayınlanmış olan birçok ısmarlama programları vardır.

2. Hücresel Süreçler ve Fenotipik Yanıtlar görselleştirme

  1. aydınlık mikroskobu ile hücrelerin görselleştirmek. yalnız Diferansiyel girişim kontrast ve faz kontrast anti-kanser ilaç yanıtları yanıtları incelemek için çok bilgilendirici olabilir. Bu süreçler mitoz, hücre motilitesi ve apoptoz içerebilir.
  2. floresan biyosensörler ile hücre yapıları, organelleri ve süreçleri gözünüzde canlandırın. Floresan sondalar spesifik hücre içi süreçleri izleme bilgilendirici. Bunlar mikrotübül dinamiklerini, mitokondriyal ve endoplazmik retikulum dinamikleri, protein birikimi ve lokalizasyonu ve içerebilirmoleküler sinyal (örn., fosforilasyon, kalsiyum).

Numunelerin 3. hazırlanması

  1. Standart bir hücre kültürü sertifikalı kap içinde bulunan hücreler büyümek, nemlendirilmiş hücre kültürü yetiştirme cihazı kullanılmaktadır (örneğin, 37 o C,% 5 CO2,% 80 bağıl nem).
    1. EBSS'ye ile MEM HT1080 hücreleri büyütün. % 10 h / h FBS,% 1 h / h Pen / Strep,% 1 hac / hac sodyum piruvat ve% 1 h / h esansiyel olmayan amino asitler ile, ortam takviyesi.
  2. görüntüleme İki gün önce, sertifikalı steril laminer akış kaputun içindeki bir 12-iyi # 1.5 cam alt çanak 3 kuyu içine plaka 50,000 HT1080 FUCCI hücreleri. Deneyin başlaması için ~% 60 izdiham elde etmek için kaplama hücrelerinin sayısını ayarlar. hücre çizgisi ve deney hücre yoğunluğu doğasına bağlı olarak daha az olabilir.
    Not: Hücre yoğunluğu, hücre kuşağının büyümesinin ve deney sonuçları üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. en aza indirmek için hücreleri saymak deneme-to-deney variabilityoğunluğuna bağlı Y.
    1. çevre odasında ve deney için gerekli olan koşullar, tek bölmeli tepsilerde levha hücreler (genellikle 35-veya 60-mm), 4 de 35 mm'lik tabaklar, 6-, 12 veya 24-iyi hücre kültür plakaları ya da bağlı olarak çeşitli biçimlerde slaytlar lamel. Hücre kültürü plastik yoluyla # 1.5 en objektif lensler cam bu kalınlık için optimize edilmiştir cam ve görüntüleme ile cam-alt tabak kullanın çok kötüdür.
      Not: Bazı hücre hatları büyür ve camın üzerine hayatta yoktur. Bu gibi durumlarda, cam (örn., Poli-lisin ya da kolajen), hücre yapışmasını arttırmak için kaplanabilmektedir. Bu uygun bir seçenek olup olmadığını Bazı şirketler, bu ampirik olarak tespit edilmelidir optik hücre kültürü plastik imalatı.

4. Çevre Odası Kurulumu

  1. Önceden herhangi bir deney için, set-up çevre odasını 37 o C 80% nem ~ çalışır ve böylece örnek konumunda sıcaklık böylece. En kültürlenmiş hücreler nedeniyle ortam içinde, sodyum bikarbonat tamponu% 5 CO2 / denge hava atmosferinde büyür. Set-up bağlı olarak, ya% 5 CO 2 çevre kontrolörü ayarlamak ve hava ile% 100 CO 2 karıştırın, ya da% 5 CO 2 / denge hava gazı sertifikalı, önceden karıştırılmış kullanacaktır. Gaz akış hızları için üreticinin talimatlarını izlemelidir.
    Not: bazı hücre çizgileri de CO2 olmaksızın muhafaza edilebilir ve bu durumda, CO 2 bağımsız ortamda büyür. Özel olarak tasarlanmış görüntüleme medya autofluorescent bileşiklerinin eklenmesini sınırlar da mevcuttur. İstenen bir hücre tipi için tezler ortamlarda büyüme deneysel olarak daha önce tespit edilmelidir.
  2. görüntüleme önce su deposu steril damıtılmış su ile (üreticinin talimatlarına sonra) dolu olduğundan emin olun. İstenilen sıcaklık ayarına çevre odasında açın ve mikroskop sahne içerlek içine yerleştirin. gaz kaydetmek için, bu noktada akışını başlatmak yok.
    Not: sahne top haznesi ve sahne içerlek ve / veya deneye hareket eserleri tanıtmak olabilir odasına bağlantı kablolarının herhangi bir gerilim arasında herhangi bir boş alan varsa.
    1. sahneye çift içine odasına odasını takmadan önce sahne gömme açılış kenarları üzerinde parafin filmin parçalarını Lay ve hiçbir bağlantı odasının çekerek emin olun.
  3. Odası 37 o C gelmesini sağlayınız Hücre fizyolojisini etkileyen ve sürüklenme tanıtabilirsiniz görüntüleme sırasında sıcaklık dalgalanmaları önlemek için istikrarlı bir sıcaklık korumak. Ulaşan sıcaklık dengeleme genellikle ortama bağlı olarak 1 saat 30 dakika gerektirir.
    1. ısıtılırken odasına kuyulardan su ile bir 'kukla' çanak yerleştirin. odasına sağlamak yardımcı su taklit ile örnek dolu bir görüntüleme çanak, yeterince ısınmış ve stabilize edilir. Önceden ısıtılmış steril su ile bölme doldurmaIsı dengelenmesi için gerekli olan zamanı azaltır ve deneysel örnek ilavesinden sonra sıcaklık düşmesini minimuma indirir.

5. Mikroskop Set-up

  1. mikroskop, ilişkili bilgisayar, ve gerekli çevre birimlerini açın.
    1. Işık kaynağına bağlı olarak, gerekli kadar açmak için sabırsızlanıyorum (örn., LED).
  2. Düşük pozisyonda objektif taret, kullanılacak 20X 0.7 NA hedefi seçin.
  3. amaç üzerinde örnek yerleştirin - Bu örnek odasına olduğunda daha kolay hücreleri bulmak için yapacaktır.
  4. önceki deneylerden biliniyorsa, şu anda görüntüleme parametreleri tanımlayın.

6. Mikroskop ve Odası'na Hücreler taşınması

  1. Taşıma hücreleri, çevresel bölmeye inkübatör yansıması. Bu nispeten düşük CO2 etkilerini sınırlamak için hızlı bir şekilde yapılır emin olun
  2. Büyük çevre değişiklikleri önlemek için kapalı bir Strafor kap veya yalıtılmış torba hücreleri yerleştirin.
  • üreticinin talimatlarına aşağıdaki odasına örnek görüntüleme çanak yerleştirin.
  • Hücre, çevresel bölme içinde tespit edildikten sonra, kararlı bir ortam sağlamak hemen atmosferik gaz kaynak (lar) açmak için bölme mühür.
    1. bazı çevresel odaları sıkı, mühürlü kapağı kullanmak yok gibi, büyüme ortamının üstüne buharlaşmasını, steril bir katman, embriyo sertifikalı madeni yağ geciktirir. Cam görüntüleme alanını engellemeyecek için dikkatli olmak örnek çanak çevre-kenarlarda gaz geçirgen parafin filmi sarın. Lokalize, ikincil nemlendirme yöntemleri kullanılabilir. performasını azaltabilir örnek çanak kapağı üzerinde yoğunlaşmaaydınlık mikroskobu mance.
  • Erken deney sırasında termal sürüklenme etkisini en aza indirmek amacıyla, time-lapse başlamadan önce 30 dakika bekleyin. Gerekli zamanlı görüntüleme çanak büyüklüğü ve diğer faktörlere bağlı olarak değişir. ampirik belirleyin.
  • 7. Görüntüleme kurma

    1. en iyi veri temsil edecek seçin görüntüleme koşulları. , Pozlama süreleri sınırlayıcı düşük yoğunlukta ışık kullanılarak ve ışığın uzun dalga boylarına göre heyecanlıyız sondalar seçerek fototoksisite önlemek için gerekli tedbirleri alın.
    2. Her bir konum için X, Y ve Z düzlemi ve istenen dalga boyu (ları) nın, görüntülenecek. Zaman çözünürlüklü pozisyonları ve dalga boyu sayısı ile sınırlıdır. En hücresel süreçlerin uzun vadeli time-lapse, bir görüntü her 10 elde - 20 dakika; yüksek zaman çözünürlüğü (kısa aralıklar, örneğin., 1 dk) daha fazla veri noktaları ve bu nedenle daha güçlü hücre izleme sağlar, fakat aynı zamanda daha entegre sonuçlanırışığa maruz kalma ve daha büyük veri setleri.
      1. - 50 msn, Texas Red / TRITC - 40 msn, aydınlık - 20 milisaniye FITC / GFP: HT1080 FUCCI dinamik, yeşil ve kırmızı floresan proteinleri olduğu gibi (Temsilcisi Sonuçlar bakınız), aşağıdaki poz kez kullanabilirsiniz. 2 x 2 bin kullanın.
    3. Gelişmiş ayarları altında, varsayılan parametreler kullanılarak yazılım kontrollü otomatik netleme etkinleştirin. Tavsiye adım büyüklüğü ile 10 mikron bir otofokus aralığını tanımlayın. time-lapse başlamadan önce bu yaptığınızdan emin olun. Aydınlık görüntüleri ile otofokus ve asla floresan ile fototoksisite ve photobleaching azaltmak için.
      1. motorlu bir sahne ile herhangi bir mikroskop yazılım kontrollü otomatik netleme sistemleri kullanmak ve doğrudan örnek üzerinde odaklanmak. Ancak, deney edinme hızını sınırlayabilir. Sürekli odaklama sistemleri daha fazla pozisyon için izin time-lapse mikroskopi için iyi çalışır ve hızını artırmak kontrollü donanım görüntülü veya devralma daha yüksek bir oran olması. Bununla birlikte,Hava-cam arayüzü tespiti güveniyor ve kuyunun üzerinden cam kalınlığı varyasyonları ile numunenin odağı kaybedebilir.
    4. Medya 37 o C ısıtılmış olmuştur istenen ilaç konsantrasyonu içeren medyanın yarısını Değiştir Kısmi medya yedek termal sürüklenme azaltmaya yardımcı olur. Bu deneyde koşulları araç (DMSO), 1 uM selinexor ve 10 uM PD0332991 vardır.
      Not: Bu adım aynı zamanda duraklatma ve deney yeniden başlatarak satın başlattıktan sonra yapılabilir. Bu tek hücre öncesi ve sonrası ilaç etkileşimleri uzunlamasına izleme sağlar. İlaç kararlılığı ya da metabolizma eğer duraklatma ve medya aynı yöntemle yapılabilir yerine, bir husustur. İlaç bozulması veya metabolizma testi için, muamele edilmiş hücreler ortam, aynı zamanda ilaç etkisini test etmek için saf hücrelerde yerleştirilebilir.
    5. time-lapse başlatın.
    6. Zaman atlamalı çalışır gibi, görüntülü alanlar odak ve Chambe içinde kalmasını sağlamakr nemli 37 o C korur
      1. zaman noktaları arasındaki zaman boşluğu sırasında edinme duraklatarak gerektiği gibi odağı ayarlayın.
    7. Gerekirse, uzun deneyler sırasında bölmeye su ilave edilir. 37 o C'de önceden ısıtılmış steril damıtılmış su eklemek suretiyle soğutma odalı önlemek

    8. Time-lapse Bitiş

    1. Deney tamamlanma tükendi zaman otomatik olarak durdurmak için ayarlanmamış ise, satın durdurun.
    2. düzgün veri kaybı olabilir bitmiş değilse çoğu yazılım paketleri otomatik olarak satın alma sırasında tasarruf rağmen time-lapse, sabit diske düzgün kaydedildi emin olun.
    3. mikroskop odasına çıkarın ve onaylı kurumsal biyogüvenlik prosedürleri takip biyolojik tehlikeli atık haline hücrelerin imha edin.

    9. Boyuna Takip ve Analiz Zaman atlamalı Verilerinin

    1. bir analiz için metodoloji seçinilgi biyolojik süreçler için uygundur. Birçok ImageJ için eklentileri, MATLAB kullanarak programları ve özel platformlar özel uygulamalar için üretilmiştir. Şekiller 4 ve 5'te gösterildiği gibi, aşağıdaki yöntem çekirdeklerin nükleer flüoresan analiz izleme kapsar.
    2. ImageJ kullanılan kanallar için tif görüntü yığınlarını açın. Alternatif olarak, Bioformats eklentisi kullanarak doğrudan ImageJ satın alma programı açık yerli dosyaları.
    3. aydınlık görüntü veya (eğer kullanılıyorsa) nükleer etiket kanalını kullanarak bir hücrenin çekirdeğinde içinde faiz (ROI) bir bölge çizin ve ROI yöneticisi ekleyin. Not: görüntülü hücreler nükleer etiketi varsa (örneğin, histon H2B EGFP.), Daha sonra otomatik hücre izleme süresi faiz (ROI) bireysel çekirdekleri temsil bölgeleri oluşturmak için kullanılabilir.
    4. dahaki sefere noktasına geçin ve aynı nucleu içinde ROI konumlandırmaks. ROI yöneticisi ROI ekleyin.
    5. Izlemek ve hücresel bir olay (mitoz, apoptoz, vb.) Veya hücre artık izlenebilir kalmayıncaya kadar bireysel hücre için İB'leri yapmaya devam (yani., Çerçevenin dışına taşır veya deney biter).
    6. ROI onlar alanında bulunmaktadır zaman içinde hücreler için kurulduğunda, ilgi floresan kanalları üzerine onları üst üste. Her bir zaman noktası için her kanalda floresans ortalama yoğunluğu ölçülür. daha sonra kullanmak üzere ROI listesini kaydedin.
      1. Çeşitli ölçümler farklı deneyler uygulamalar için ROI içinde yapılabilir. (Örneğin. ROI, entegre yoğunluğu, vb içinde ortalama yoğunluğu.) Analitik yöntemi seçmek için bir menüyü getirmek için ... Analiz → Set Ölçümleri tıklayın.
    7. Izlerken tek tek hücrelerin hücre kaderi (örn., Apoptoz, bölünme, hayatta kalma) unutmayın. Bu hayatta kalma eğrileri ve furthe yaratılması için izinr populasyon çözümlemesi.
    8. Her iki kanal için ortalama yoğunluğu ile, terapötik (Şekil 5B, Cı) yanıt olarak hücre döngüsü dinamikleri görüntülemek için bir dağılım grafiği oluşturur.
      Not: Lineer zaman tek tek hücreler için oluşturulan veya izlenen bir hücre popülasyonu üzerinden ortalaması olabilir. Kantitatif görüntüleme kanser tedavi tepki olarak karmaşık tepkiler ve hücre ilişkilerin kurulması için çok önemli olabilir. Uzun vadeli time-lapse mikroskopi, uzunlamasına izleme ve veri analiz mikroskopisi ve analiz araçları türü için birçok seçenek ile, bir çok adımlı bir süreçtir ve Şekil 1'de verilen genel hatlarıyla izlemektedir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Uzun vadeli time-lapse mikroskopi ve doğrudan uzunlamasına izleme ilaç yanıtı sırasında birçok anti-kanser etkileri çalışma için izin verir. Şekil 1 'de genel hatları sonra hücreler çeşitli örnekleri takip anti-kanser ilaçları ile tedavi edilen doğrulanmış floresan haberci ifade gösterilmiştir ve farklı yaklaşımlar kullanılarak analiz edilmiştir.

    Tek başına faz kontrast mikroskop çok bilgilendirici ve sağlam mitoz bölünme, mitoz süresi ve tutuklama, anormal hücre bölünmesi ve hücre ölümüne 21,23,24 karşı interfaz bildiriyor. Hücre bölünmesi hedefleyen ilaçlar, çoğunlukla olarak adlandırılan anti-mitotik ilaçlar. Geliştirilmeye devam 500 ile tedavi edilen 2 ve Filmler 1 ve p53 statüsünden sadece farklı eşleşen göğüs kanseri türevi MCF7 hücre çizgilerinin bir çift 2 örneklerini gösterir; Şekil bu hedefler, bir anti-kanser ilaç, bir tür nMve uzun süren mitoz 20 sonuçlanan mitotik motorlu protein, kinesin-5 (KSP1, Kif11, Eg5), engeller. Yabani tip MCF7 hücreleri (Şekil 2A), p53-kaynaklı hücre siklüs hapsi 25-27 incelemek için bir paradigma bulunmaktadır. Yabani tip hücreler sonunda ayrılmak ve büyük ölçüde p53 25 indüksiyonu ile tutuklama, mitoz girmek birkaç saat kalır. P53 istikrarlı p53 demonte (MCF7 sh p53) tarafından kaldırıldığında, bunun yerine mitoz ayrıldıktan sonra tutuklamak, hücreler tekrarlanan döngüler (Şekil 2B) geçer. Hücreler elle izlendi ve ikinci mitoz girmek mitotik indeks ve hücrelerin yüzdesi (Şekil 2C, D) attı bulundu. Biz mitoz oldukça tutuklama ve bölünme olmadan mitoz bırakarak daha ikinci turda girdiğinde sh p53 hücre böler izlenen görüyoruz. Burada mitotik olayların süresini gösterilmemiş olmasına rağmen, ardışık mitoz, hücre bölünmeleri yüzde ve ilişkili hücre ölümü olaylar arasındaki zamanı da s olabilir20,21 özlü.

    taksanlar, örneğin paklitaksel ve dosetaksel, pankreas ve gelişmiş göğüs gibi tedavi etmek zordur de dahil olmak üzere birçok kanser için ortak kemoterapidir. Paklitaksel mikrotübül dinamik artı sonuna bağlanır ve normal fonksiyonlarını engelleyen, onları stabilize eder. Paklitaksel doza bağımlı etkileri belirttiği ve düşük konsantrasyonlarda bile mitotik ilerlemesi ve kromozom segregasyon 16 Normal perturb edebilirsiniz. Kromozom sadık ayrışma, normal hücre çoğalması ve anormal hücre siklüs hapsine neden olmaktadır, ancak, aynı zamanda, kanser ilerlemesinde bir sürücü olarak hareket edebilir anöploidinin neden olabilir için gereklidir. Kararlı biçimde kromatin eksprese 3 ve Film 3, önceki servikal karsinom türevi HeLa hücreleri Şekil markör histon-2b mCherry kaynaşmış ve normal büyüme ortamında (gösterilmemiştir) eGFP ile füzyona beta-tubulin 1 nM paklitaksel ile işlemden geçirildi. Bundaörnek, mitoz yoluyla girmesinin ve ilerleme takip edilebilir. mitoz zamanlaması ancak kromozom hizalama ve ayrışma kötü kromozom ayrımı gösteren yapılardır nükleer çıkıntılar ve mikronükleuslar sonuçlanan değil, bu hücrede normal görünür. Mikronuklei kromozomlar veya kromatin büyük ölçekli parçalanma olduğu DNA hasarı ve chromothripsis, yatkındır - Bu tümör evrim 28,29 önemli etkileri vardır. Burada gösterilmemiş olan, diğer mitotik yapılara göre ve bu hücrelerin kaderini sahip mikroçekirdek kökenli direkt olarak, uzun süreli bir zaman atlamalı kullanılarak takip edebilir. DNA hasarı muhabiri kromozom ayrımı, mikronukleus ve DNA hasarı arasındaki ilişkiyi kurmak için kullanılan olabilir ile daha fazla, bir kromatin işaretleyici ifade etti.

    enumerable hücre süreçleri takip edilecek ve yeni muhabirler sürekli geliştirilmektedir için Floresan gazetecilere izin verir. exGeniş, hücre döngüsü Şekil 4., anti-kanser terapötik hedef geliştirirken özellikle ilgi çekici olan aşamadan oluşur ve Film 4, fibrosarkom türetilmiş hücre soyu, iki muhabir olarak adlandırılan eş ifade (HT1080), flüoresan ubikuitin hücre döngüsü göstergeleri gösterilmektedir (FUCCI), 30. Burada sistemde, Cdt1 polipeptidin bir bölümü G1 fazında mKO2 (monomerik Kusabira Orange 2) ve artar kaynaştırılır ve erken S-faz parçalanır ve geminin bir kısmının Mag kaynaştırılır (monomerik Azami yeşil) ve orta S-faz artar ve anafaz üzerine düşer. Bu hücre, normal büyüme ortamında ve 15 saat. Şekil 5A, B ve film 5 10 uM PD0332991, bir CDK4 / 6 inhibitörü ile tedavi edilen normal ortam içinde aynı hücreleri gösteren hücre döngüsü yoluyla ilerler. Hücreler G2 faz yoluyla ilerleme ve normal bölmek ve güçlü etkisi potansiyeli gösteren, daha sonraki G1 fazında tutuklamaçeşitli tümörler sitostatik etkilerini ive. Şekil 5C, D ve Film 6 exportin-1 (XPO1, diğer adıyla CRM1, küçük bir molekül olarak adlandırılır selinexor (KPT-330), çekirdek ihraç proteini engelleme güçlü bir ile tedavi edilen normal ortam içinde aynı hücreleri göstermektedir ). Bu bileşikler, araştırma 31,32 aşamasındadır nükleer ihracat (sinüs) ve anti-kanser etkilerini seçici inhibitörleri olarak adlandırılır. Güçlü hücre döngüsü fenotipleri ve hücre ölümü 33,34 olarak SINE tedavi sonuçları. Bu örnek, normal kinetik (yaklaşık 6 saat) ile G1-faz üzerinden ilerleyen bir hücre gösterir, ancak tedavi SİNÜS içinde hem kırmızı hem de yeşil sinyali (yaklaşık 3 saat kontrol ama 10 ile dönemin gösterdiği gibi S-fazı ilerlemesinde gecikme yaşandığında ). Bu hücre 21 saat 30 dakika sonra geç S- veya G2 fazında ölür; normal hücre döngüsü yaklaşık olarak 15 saattir. Selinexor etkileri farklı kan ve solid tümörlerin 35 çalışılmaktadır.

    36 ifade 6 ve Film 7 gösteri HT1080 hücreleri Şekil ortam, 10 uM etoposid (VP-16), bir topoizomeraz II zehiri ile işlenir. Bu raportör DNA, çift kordonlu kesme Alanı proteinin bir kısmının, mCherry kaynaştırılır 53BP1 oluşur. Bu hücrenin çekirdeği USI takip edildiImageJ entegre mCherry BP1-2 sinyal analiz partiküller eklentisi ng çözülebilen çekirdek prob elendiği değerlerini eşikleme sonra her bir kare ölçülmüştür. DNA hasarı, ilk 10 saat için en az bir ve daha sonra sürekli olarak artar. Topoizomeraz II inhibitörleri, enzim 37,38 en aktif olduğunda özellikle, S ve G 2-faz etkilediği bilinmektedir. hücre döngüsü ile ilişkili hasar göstergesi olabilir bu örnekte gözlenen kinetik; FUCCI gazetecilere MCherry-BP1-2 birleştirerek sonra kaderi hücre ile bağlantılı olabilir hasar zamanlamasını göstermek olabilir.

    Şekil 1
    Anti-kanser ilaç Yanıtı Eğitim için uzun vadeli Zaman atlamalı Mikroskopi ve Boyuna Takip Kullanımının Şekil 1. Genel. Istediğiniz gibi etiketli uygun canlı hücre görüntüleme yemekleri hücreler hücreleri veya ilgi bölgeleri izlenir, görüntülü ve veri analiz. Birçok yöntemler bazı burada gösterilir, hücreleri izlemek ve ölçmek için var. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    şekil 2
    Şekil 2. Faz kontrast zaman atlamalı mikroskopi anti-mitotik İlaç Tedavisi. Vahşi tip (A) ve p53 demonte (B) MCF7 hücreleri, 500 nM kinesin-5 inhibitörü ile muamele edilmiş ve 96 için her 10 dakikada bir görüntülenmiştir sonra p53 bağımlılığını gösterir 20X PH2 0.70 NA lens ile faz-kontrast mikroskobu saat. Bireysel hücreleri elle izlenen ve yüzde mitoz ve hücre time-lapse sırasında tekrar başka bir mitoz ilerler eğer skorlandı. Oklar izleniyorsa hücreyi gösterir. sh p53 hücre (B) ikinci bir mitoz girdikten sonra böler. (C) Her iki hücre dizisi shoYüksek tepe yüzde (ilk mavi ve kırmızı oklarla) mitoz ile belirtildiği gibi w uzamış mitotik tutuklama. (C, D) yaklaşık 90 p53 olmadan hücrelerin% (sh p53, n = 87) 20 vahşi tipli% (n = 130) ile karşılaştırıldığında gösterisi devam ilerleme (kırmızı oklar). Hata çubukları standart sapmayı belirtir. Bar = 20 mikron. Film 1 ve 2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3. Kromatin Marker Histon 2b Düşük doz Paklitaksel tedavisi. Paklitaksel, hücre büyümesi ve bölünmesi kompleks, konsantrasyona bağımlı kusurlar ile sonuçlanan bir mikrotübül hedefli ilaç sonra kromozom segregasyonu patolojileri ortaya çıkarır. kromatin organizasyonu aşamasında da dahil olmak üzere, farklı hücre devletlere bildirirmitoz ve hücre ölümü. HeLa hücreleri kararlı bir şekilde 1 nM paklitaksel ile muamele edildi -CbH2b mCherry ve β-tübülin-EGFP hem de ifade. Bu hücre, interfaz başlangıçta mitoz ve böler aşamalarında ilerler. mitoz zaman normal görünür iken, (oklar) çözümlenir kromozom eki ve segregasyon hataları kanıt yoktur. Bu hücrelerin kaderini boyuna takip doğrudan belirlenebilir. (Gösterilmemiştir) faz-kontrast ve floresan görüntüleri 20X Ph2 0.70 NA lens ile 10 dakika başına 1 karede elde edildi. Bar = 10 mm. Film 3. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 4,
    Şekil 4. Floresan Hücre Döngüsü Belirteçleri Hücre Döngüsü ilerleme Doğrudan İzleme izin ver.(A) Faz-kontrast ve floresan tarafından görüntülendi FUCCI sistemini ifade canlı HT1080 fibrosarkom hücrelerinin bir alan. (B, C) ​​Panel A'da kesikli kutuya mitotik hücre izlemektedir. Normal olarak, yaklaşık 15 saat içinde, hücre döngüsü yoluyla ilerleme. mitoz sonra, hücreler kısaca loş ve bunlar içine ve G1-faz yoluyla ilerleme olarak daha sonra kırmızı olur. Hücreler S-faz girdiğinizde, kırmızı Cdt1 prob bozulmuş ve yeşil geminin prob artar. Her iki sondalar mevcut kısa yaklaşık 3 saat süre, erken S-evresini gösterir. Hücreler S- ve G2-faz üzerinden ve sonraki mitoz içine ilerledikçe yeşil kalır. yeşil prob hücre bölünmesinin anafaz üzerine düşer. Faz-kontrast ve floresan görüntüleri 20X PH2 0.70 NA lens ile 10 dakika başına 1 karede elde edildi. Bar = 10 mm. Film 4. Vi için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu Ew.

    Şekil 5,
    Şekil 5. Hücre devre özel etkileri ve bağlantılı hücre ölümü. Aynı hücre Şekil 4'teki gibi ancak farklı hattı anti-kanser hedefleri temsil eden iki farklı molekülü ile muamele edilmiştir. tedaviden sonra Kez gösterilir. 10 uM PD0332991 CDK4 / 6 inhibitörü ile bir geç S / G2 faz hücre muameleden sonra (A, B), hücre mitoz (M) ve böler normal ilerler. Bir kızı hücre çekirdeğinde ilgi bölgedeki kırmızı ve yeşil floresan yoğunlukları ölçerek izlenir. Hücre yaklaşık 40 saat boyunca G1 fazında tutuklandı kalır. 1 uM selinexor bir geç G2 faz hücre muameleden sonra (C, D), hücre mitoz (M) ve böler normal ilerler. Bir yavru hücre izlenir ve G1-faz girer boyunca ilerledikçe edilirBir uzamış erken S-fazı (kırmızı ve yeşil sinyal), münhasıran yeşil geçişler ve 21 saat 30 dakika sonra ölür. Veri S-fazı ilerlemesi selinexor tedavi etkilenir düşündürmektedir. Faz-kontrast ve floresan görüntüleri 20X PH2 0.70 NA lens ile 10 dakika başına 1 karede elde edildi. Bar = 10 mm. Film 5 ve 6. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 6,
    İlaç Tedavisi. Birçok anti-kanser tedavilerinin ardından Şekil 6. DNA Hasarı Dynamics derinden hücre yanıtı ve tedavi başarısını etkileyebilir DNA hasarına neden. HT1080 hücreleri stabil şekilde eksprese eden hem de çift kordonlu DNA hasar işareti MCherry-BP1-2 ve -CbH2b-EGFP (gösterilmemiş olan) topoizomeraz II ilacı etoposid ve DNA D 10 uM ile tedavi edildiAmage takip edildi. (A) numarası ve etoposid sonra odakları artış yoğunluğu. Bir gecikme Etoposidin bilinen mekanizma ile tutarlı olası hücre döngüsü etkilerini gösteren, başlangıçta vardır. 22 saat 50 dakika ile bu hücre hasarının yüksek düzeyde birikmiş. Burada gösterilmemiş olmasına rağmen, bu hücrenin kaderi doğrudan takibi ile belirlenebilir. (B) -CbH2b EGFP sinyali ile elde edilen çekirdeğe gelen bir ROI ImageJ parçacık izleme ile izlenebilen ve entegre BP1-2 mCherry sinyali sayısal ve zamanla çizilmiştir. yaklaşık 10 saat kadar sinyalde gecikme kalıcı artış izledi, kaydetti. Floresan görüntüleri 40X PH2 0.75 NA lens ile 10 dakika başına 1 karede elde edildi. Bar = 10 mm. Film 7. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


    Anti-mitotik İlaç Tedavisi. Yabani türde MCF7 hücrelerinde sonra Yabani türde MCF7 hücreleri Film 1 Faz kontrast zaman atlamalı mikroskopi 500 nM kinesin-5 inhibitörü ile işlemden geçirildi ve 20X PH2 faz kontrast mikroskopisi kullanılarak 96 saat boyunca her 10 dakikada bir görüntülenmiştir 0.70 NA lens. Şekil 2'de açıklandığı gibi mitoz uzatılmış mitotik tutuklama ve çıkış, görülebilir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

    moive 2
    Kararlı biçimde indirgenmesi için p53 hedefleme küçük bir saç tokası RNA eksprese eden Anti-mitotik İlaç Tedavisi. MCF7 hücrelerinde sonra p53 demonte MCF7 hücreleri Film 2. Faz kontrast zaman atlamalı mikroskopi 500 nM kinesin-5 inhibitörü ile tedavi edildi ve 20X PH2 0.70 NA lens ile faz kontrast mikroskopisi kullanılarak 96 saat boyunca her 10 dakikada bir görüntüsü alınmıştır. Şekil 2'de açıklandığı gibi Uzamış mitotik tutuklama ve mitoz birden mermi, görülebilir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

    moive 3
    Kararlı biçimde H2B mCherry eksprese Düşük doz Paklitaksel tedavisi. HeLa hücreleri ve β-tübülin-EGFP sonra HeLa hücrelerinin Film 3. Floresan zaman atlamalı mikroskopi 1 nM paklitaksel ile muamele edildi. Şekil 3'te açıklandığı gibi kromozom eki ve segregasyon sorunları görülebilir. Görüntüler 20X PH2 0.70 NA lens ile her 10 dakikada elde edildi. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

    ove_content "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> moive 4
    Film 4. Floresan Hücre Döngüsü Belirteçleri Hücre Döngüsü ilerleme Doğrudan İzleme bekleyin. FUCCI sistemini ifade HT1080 hücreleri uzunlamasına time-lapse mikroskopi sırasında takip edildi. Hücre mitoz çıktıktan sonra loş gider ve daha sonra hücre G1-faz üzerinden ilerledikçe kırmızı olur. Hücre S-faz girerken yeşil geminin prob artar ve kırmızı Cdt1 prob bozulmuş gibi, o sarı olur. o S- ve G2-faz üzerinden ilerledikçe hücre yeşil kalır. Hücreler anafaz girdiği yeşil düşürür. Bu hücrenin miktarının belirlenmesi Şekil 4'te gösterilmiştir. Görüntüler 20X PH2 0.70 NA lens ile her 10 dakikada elde edildi. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

    Moive 5 "src =" / files / ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
    G1-fazı inhibitörü ile muamele edildikten sonra floresan hücre döngüsü markerleri ifade Film 5. HT1080 hücre. FUCCI sistemini ifade HT1080 hücreleri, 10 uM PD0332991, bir CDK4 / 6 inhibitörü ile tedavi edildi. izlenen hücre mitoz ve böler normalde ilerler. Bir kızı takip ve film süresince G1 kırmızı kalır. Niceleme Şekil 5'te gösterilmiştir. Görüntüler 20X PH2 0.70 NA lens ile her 10 dakikada elde edildi. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

    moive 6
    Exportin-1 inhibitörü, Selinexor. FUCCI sistemini ifade HT1080 hücreler ile Tedavi sonrasında Floresan Hücre Döngüsü İşaretleyiciler ifade Film 6. HT1080 Hücre tedavi edildi1 uM selinexor ED. Bu geç G2 faz mitoz yoluyla takip edildi. Bir kızı hücre daha sonra G1-faz (kırmızı) boyunca ilerledikçe ve S-faz (sarı) girer. Geç-S / G2-fazına girer ve 21 saat tedavi 30 dakika sonra ölene kadar hücre S-aşamalardan yavaş ilerler. Niceleme Şekil 5'te gösterilmiştir. Görüntüler 20X PH2 0.70 NA lens ile her 10 dakikada elde edildi. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

    moive 7
    Bir topoizomeraz II inhibitörü. HT1080 hücreleri kararlı bir şekilde, çift iplikli DNA hasar işaretleyici MCherry-BP1-2 ve H2B-EGFP ifade ile muamele edildikten sonra Film 7. DNA hasarı Dynamics 10 uM etoposid, bir topoizomeraz II inhibitörü ile tedavi edildi. MCherry-BP1-2 filmde görüntülenir. Tedavi olarak devams, MCherry-BP1-2 artar sinyal, çift iplikli DNA hasarı arttı belirten. Niceleme Şekil 6'da gösterilmiştir. Görüntüler 40X PH2 0.75 NA lens ile her 10 dakikada elde edildi. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Time-lapse Mikroskopi ve Boyuna İzleme Avantajları

    bu araştırmacılar, bireysel hücreleri ve kaderlerini yanı sıra tüm nüfusu izlemenize olanak sağlar olarak mikroskop ilaç yanıtının uzunlamasına çalışmalar için ideal bir araçtır. bir hücre popülasyonu içinde, ilaç yanıtındaki değişkenliği, anti-kanser terapötik tasarımı için önemli bir sorundur. tek hücre Boyuna izleme araştırmacılar bu değişkenliği gözlemlemek ve hücre popülasyonu ile ilgilidir olarak yatan mekanizmaları ve sonuçlarını anlamaya başlamak için izin verir. flüoresan çeşitli kullanan gözlemlemek ve yaygın ve nadir tepki fenotipleri hem anlamak için yollar çok sayıda sağlar. Nüfus yanıt zamanlaması ve farklı hücre kaderi katkısı, tedaviden sonra hücre hatları veya devlet arasında tepki olarak belirli fenotip ve kaderi, ve farklılıklar arasındaki ilişkiler öğrenilebilir ne örnekleridir. Birçok kanser ile ilgili süreçler ele alınabilir. Bu makalede vurgulanan olmadığını bazı apoptoz, otofaji ile hücre ölümü ve nekroz gazetecilere 39-42, hücre işgali 43,44 ve hücre kaderi kararlarını 27 belirleyen p53 dinamikleri içerir. Buna ek olarak, bu yaklaşım, bir anti-kanser tedavi edici çalışmalarda çalışmalar ile sınırlı değildir. Aynı ilkeler 48 sinyalizasyon mitoz 45 iskeleti dinamikleri 46,47 ve hücre içi de dahil olmak üzere diğer birçok biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabilir.

    Time-lapse floresan mikroskopi ayrıca proteinler ve ilgi moleküllerin lokalizasyonu ve şiddeti verileri sağlayabilir. Sadece ilaç yanıtı önemli protein düzeyinde değişiklikler, ancak hücre içinde proteinlerin doğru (veya yanlış) yerelleştirme anlayışı yanıtı için kritik öneme sahiptir. Time-lapse mikroskobu (proteinler lokalize nerede verileri sağlar, örneğin., Çekirdek, sitosol, özel organeller,vb.), ilaç tedavisi ve nasıl lokalizasyonu ve toplam seviyeleri tek bir hücre ve toplum düzeyinde zamanla değiştirdikten sonra.

    Zorluklar ve Sınırlamalar

    time-lapse mikroskopi ve tek hücre boyuna analiz güçlü olmasına rağmen, sınırlamalar vardır. Floresan muhabirleri kendi istikrar ve özgünlüğü ile sınırlıdır. floresan füzyon proteinleri tasarlarken, foto stabil ve parlak bir prob seçmek için önemlidir, ancak normal fonksiyon ve düzgün lokalize yeteneği ile ilgili ilgi proteine ​​bağlı olmak floresan etiketi etkilerini de göz önünde bulundurmak gerekmektedir . Bu konular başka yerlerde ayrıntılı olarak tartışılmış ve 15,49,50 yayınlanmış birçok kullanılabilir floresan etiketli proteinler vardır. Diğer floresan etiket veya etiketleri hücrelere eklenebilir ve bakım toksik olmayan sağlamak için alınmalıdır. Bizim tecrübelerimize göre, bu pelbiseler, örneğin mitokondriyal etiket (membran potansiyeli) veya hücre geçirgen DNA boyalar için kolay ağartmak eğilimi nedeniyle hücre çoğalması seyreltilmiş-out olacak.

    Buna ek olarak, büyüyen ve bir mikroskop hücreleri inceleyerek birçok teknik zorluklar vardır. sıcaklık, nem, atmosfer ve ışık açısından istikrarsızlık veri kaybı hatta tüm deney sonucunda, hücreler üzerinde büyük etkileri olacaktır. Görüntü yakalama konusunda kararlılık sorunları Filmler 1 ve 2'de görülebilir. Bu etki (4.2 bakınız) parafin filmin kullanımı ile minimize edilebilir. ImageJ (NIH) kullanılarak, örneğin alım sonrası işleme uygun görüntü sabitleme algoritmaları, de vardır. genellikle gözardı edilir, uzun vadeli time-lapse bir yönü veri yönetimi ve dosya boyutu. veri binning bile, tek bir time-lapse deneyi 30 gigabayt aşan genellikle. Yüksek kapasite, yüksek hızlı, güvenilir veri depolama ve transfer güçlüly teşvik etti. görüntülü floresan biyosensör (ler) bağlı olarak, örnek nükleer veya sitoplazmik sensörler için tam çözünürlüklü görüntüleri, elde etmek için çoğu zaman gerekli değildir. Mümkün olduğunda Biz, kolay sonuçlanan veriler, daha az talepkar bilgisayar ihtiyaçları ve gelişmiş iş akışı ile küçük çalışma boyutları dosya tutmak için gerekli önlemleri almak için, tavsiye ederiz.

    uzun vadeli time-lapse mikroskobu yaparken fototoksisite önemli bir husustur. Yüksek yoğunluklu ışık ve uzun pozlama floresan probları, hücre stres ve hücre ölümü photobleaching yol açabilir. Bu etkiler, veriler üzerinde büyük bir etkiye sahip ve deney yanlış yol açabilir. Kamera binning ve kazanç maruz kalma sürelerini azaltmak için kullanılabilir. ışık yolu nötral yoğunluk filtreleri örnek üzerinde ışığın yoğunluğunu azaltır. görüntü için kullanılan ışık dalga boyları da hücreleri etkiler. Kısa dalga boyları (UV, yakın UV) hücrelere daha zararlı ve daha hızlı oranlarda fotoğraf ağartma nedenuzun dalga boyları (örneğin., kırmızı, çok kırmızı). objektif seçimi de şartları görüntüleme etkileyebilir. Daha yüksek sayısal açıklık (NA) lensler daha yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir, ancak daha yüksek bir büyütme az ışık Yüksek poz kat veya daha fazla yoğun ışık elde numuneden iletilmesini sağlar. Objektif bir oversampling olmadan ilgi nesnesi çözeceğini uygun bir NA ve büyütme ile seçilmelidir. Birçok durumda, en yüksek amaç en uygun seçim olmayabilir. Daha büyük bir alanı istenen nesnenin çözünürlüğünü ödün vermeden, etkin bir örnek sayısının artırılması, çekilecek nükleer sondalar (Şekil 4, 5) ile, düşük büyütme hedefi sağlar. Üç boyutlu uzun vadeli time-lapse nedeniyle entegre ışık maruz kalma dikkatli yapılmalıdır. Bir iplik diski konfokal mikroskop, duyarlı kamera kullanılarak (örneğin., EM-CCD), kamera kazanç ve z-serisi için hızlı bir piezo motoru suggeste olduğunud ışık maruziyeti azaltmak için. Hızlı z-serisi toplama edinme dönemi sırasında meydana gelen hücre hareketi ve dinamikleri nedeniyle hareket eserler en aza indirmek için de önemlidir. Birçok farklı ayarları kullanarak muamele edilmemiş hücrelerin deneysel analizi, herhangi bir hücre hattı veya muhabir floresan ışık etkisini belirlemede yararlı olabilir. Buna ek olarak, işlemden geçirilmemiş bir kontrol deneysel ayarları sitotoksik etkilerini belirlemek için her bir deney dahil edilmelidir.

    Tekniğin Varyasyonları

    Uzun vadeli time-lapse sağlam ve çok esnektir. ko-kültürü teknikleri, farklı hücre hatları ya da farklı muhabir ifade, aynı hücre soyları kullanılarak kullanılabilir. Bu göze çarpan örneği, bir anti-kanser ilaca yanıt olarak ölmektedir hedef hücrelerle fagositik hücrelere görüntülenmesidir. Başka bir örnek ilaç naif hücreleri komşu hücrelerin yanıt etkisini incelemek için olabilir. foto-activa ile birleştiğindeteable, fotoğraf-Cabrio ve fotoğraf değiştirilebilir floresan proteinleri ve belirli etkileri tetiklemek için ışık ile aktive edilebilir mühendislik proteinler (örneğin., KillerRed), birçok olasılık vardır. Daha karmaşık yaklaşımlar, örneğin, Förster rezonans enerji transferi (FRET) photobleaching sonra floresan yeniden dağıtılması ve süper çözünürlük (örn., Stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (Fırtına), yapısal aydınlatma mikroskobu (SIM) olarak mikroskopi çeşitli özel tiplerini kullanmak olduğunu kullanılabilir veya uyarılmış emisyon tükenmesi (STED)), ve diğerleri ve avantajları ve her yaklaşımın sınırlamalar vardır.

    Uzun süreli (örn., Hafta, ay) yanıtlar ve ilaç çıkarılmasından sonra hücrelerin geri anti-kanser ilaç etkisini anlamak için merkezi öneme sahiptir. Gridded cam alt yemekleri tekrar tekrar bir nüfus / alan içinde belirli hücreler veya bölgeleri izlemek için değerli bir araçtır. Örneğin, bir ızgarah çanak ile ilk drug yanıt ilacın çıkarılabilir bir zaman atlamalı kullanılarak görüntülenebilir ve ızgara belirli alanlarda arzu edilen zaman zaman görüntülü veya ek geçen zaman tabi tutulabilir. yemekler cam alt bir kâtip aracıyla ya kesme veya başka bir ticari reaktif kullanılarak kaldırılabilir ve cam üzerine hücreler örnek yaşlanması ilişkili β-galactocidase etkinlik için diğer ilgi çekici belirteçler için lekeli olabilir ve karşılaştırıldığında time-lapse hücreleri bu durumu nasıl ulaştığını tarihini anlamak için. Hücre popülasyonu yeterince büyükse de immunoblotting tabi veya akış sitometrisi olabilir.

    Kalın örnekleri geleneksel olarak çeşitli jel malzemeleri ve matrisler örnek küremsi için görüntünün zor olmuştur. Yeni hücreleri, anti-kanser terapötik yanıt kadar in situ anlaşılması bir yaklaşım uzatmak için kullanılabilir floresan konfokal veya çoklu foton mikroskopi 16,18,19,51 içeren yaklaşımlar.se çalışmaları ve anti-kanser ilaçları kullanmak yeteneğimizi geliştirmemize yardımcı olacaktır tek hücre farmakodinamik bir anlayış geliştirmeye yönelik hareket ediyor 24,52-54 açıkça göstermektedir anti-kanser ilaç yanıtını incelemek için zaman atlamalı kullanarak bilim adamları giderek artan sayıda daha etkin ve belki de anti-kanser ilaç yanıtı tahmin.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
    2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
    3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
    4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
    5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
    6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
    7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9, (e93718), (2014).
    8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
    9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
    10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
    11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
    12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. (2008).
    13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
    14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
    15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
    16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
    17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
    18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
    19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
    20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
    21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
    22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
    23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
    24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
    25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
    26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7, (488), (2011).
    27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
    28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
    29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
    30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
    32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7, (46), (2014).
    33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
    34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
    35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
    36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
    37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
    38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. (2015).
    39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
    40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
    41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
    42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
    43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
    44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7, (e30605), (2012).
    45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
    46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
    47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
    48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
    49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
    50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
    51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
    52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
    53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
    54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics