Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

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Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

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Abstract

A resposta de células únicas para fármacos anti-cancro contribui significativamente para a determinação da resposta da população, e, portanto, é um factor importante que contribui para o resultado global. Immunoblotting, citometria de fluxo e experimentos com células fixas são frequentemente usados ​​para estudar como as células respondem a drogas anti-câncer. Estes métodos são importantes, mas eles têm várias deficiências. A variabilidade nas respostas ao fármaco entre o cancro e as células normais, e entre células de cancro de origem diferente, e transiente e respostas raras são difíceis de entender utilizando ensaios de média da população e sem ser capaz de controlar directamente e analisá-las longitudinalmente. O microscópio é particularmente bem adequado para células vivas imagem. Os avanços na tecnologia permitem-nos rotineiramente células de imagens em uma resolução que permite não só o acompanhamento de células, mas também a observação de uma variedade de respostas celulares. Nós descrevemos uma abordagem pormenorizada que permita a imagem contínua de lapso de tempo decélulas durante a resposta da droga para, essencialmente, desde que desejado, tipicamente até 96 horas. Utilizando variantes da abordagem, as células podem ser monitorados durante semanas. Com o emprego de codificados geneticamente biossensores fluorescentes numerosos processos, caminhos e respostas pode ser seguido. Mostramos exemplos que incluem acompanhamento e quantificação do crescimento celular e na progressão do ciclo celular, a dinâmica de cromossomas, danos no ADN e morte celular. Discutimos, também, variações da técnica e sua flexibilidade, e destacar algumas armadilhas comuns.

Introduction

microscopia de células vivas e acompanhamento longitudinal de células individuais não é uma técnica nova. Desde os primeiros microscópios, os entusiastas e cientistas têm observado e estudado células individuais e organismos, seus comportamentos e desenvolvimento 1-3. Um exemplo famoso do falecido David Rogers na Universidade de Vanderbilt na década de 1950 mostra um neutrófilo humano em um esfregaço de sangue perseguindo uma bactéria Staphylococcus aureus e, eventualmente, o processo de fagocitose 4. Este filme-célula viva é um excelente exemplo de como os processos múltiplos podem ser observados e correlacionados em um único experimento: detecção de um gradiente químico, mecânica e velocidade da motilidade celular, celular formas dinâmicas, adesão e fagocitose de um patógeno.

O advento de microscópios totalmente automatizados e câmeras digitais altamente sensíveis resultou em um aumento do número de investigadores por meio de microscopia de fazer perguntas fundamentais em biologia celular variando from como as células mover 5,6 e dividir 7,8 a organela dinâmica e tráfico de membrana 9-11. Não fluorescente, microscopia de campo claro, inclusive de contraste de fase (PC), que recebeu o Prêmio Nobel de Frits Zernike em 1953, e contraste de interferência diferencial (DIC) permitem a observação de células e núcleos, mas também estruturas sub-celulares, incluindo feixes de microtúbulos , cromossomas, nucléolo, dinâmica de organelos, e fibras de actina grossas 12. Geneticamente codificado proteínas fluorescentes e no desenvolvimento de corantes fluorescentes contra organelas têm impactado drasticamente a microscopia de lapso de tempo 13-15. Embora não seja o foco deste artigo, a imagem latente em esferóides celulares e in situ (microscopia intravital) usando confocal e microscopia multiphoton representam uma nova expansão da abordagem, e há artigos pendentes que usam e discutir estas abordagens 16-19.

As respostas de células a anti-Cancer drogas ou produtos naturais são determinados na escala molecular e celular. Compreender as respostas das células e destinos após o tratamento muitas vezes envolve a população ensaios de média (por exemplo., Immunoblotting, medidas bem inteiras), ou pontos de tempo fixos com a detecção de imunofluorescência e citometria de fluxo, que medem células individuais. A heterogeneidade das respostas de células únicas para fármacos dentro de uma população, em especial em tumores, pode explicar alguns dos a variabilidade na resposta observada através de linhas de células e tumores que são tratados com o mesmo fármaco em saturação. A longo prazo abordagens longitudinais seguir uma dada célula individual ou uma população de células é uma abordagem menos comum mas muito poderosa que permite o estudo directo de vias de resposta moleculares, diferentes fenótipos (por ex., Morte celular ou a divisão celular), a observação de variabilidade célula-a-célula dentro de uma população, e como estes factores contribuem para a dinâmica de resposta população 20-22. Optimista, podendopara observar e quantificar respostas de célula única vai ajudar a melhorar a nossa compreensão de como os medicamentos funcionam, por que eles às vezes não, e como melhor utilizá-los.

A técnica de microscopia de longo prazo de lapso de tempo, o acompanhamento longitudinal e análise das respostas de drogas está disponível para muitos investigadores e pode ser simples, usando a luz transmitidas apenas para observar respostas fenótipo 20,21. Os principais componentes da abordagem incluem: preparação adequada das células de interesse, um microscópio automatizado com câmara ambiental, uma câmera integrada com um computador para adquirir e armazenar as imagens e software para analisar o lapso de tempo e medir e analisar as células e quaisquer biossensores fluorescentes. Nós fornecemos um protocolo detalhado com muitas dicas para a realização de microscopia de lapso de tempo de células cultivadas, enquanto vários dias usando claro e / ou microscopia de epifluorescência widefield. Este protocolo pode ser utilizado para qualquer linha de células que podem ser cultivadas em culturapara estudar as suas respostas às terapias anti-câncer. Nós fornecemos exemplos de dados adquiridos e analisados ​​utilizando vários biossensores fluorescentes geneticamente codificados diferentes e um exemplo de microscopia de contraste de fase, discutir brevemente os diferentes tipos de sondas, as vantagens e desvantagens de longo prazo de lapso de tempo e acompanhamento longitudinal, o que pode ser aprendidas para esta abordagem que é difícil de compreender a partir de abordagens não-directos, e algumas variações que esperamos que venha a ser de interesse e valor para pesquisadores inexperientes que não ter considerado usando a abordagem, e para investigadores experientes.

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Protocol

O protocolo seguinte utiliza parâmetros definidos pelas experiências nas Figuras 4 e 6 com respeito às definições de aquisição e condições experimentais. Muitos destes parâmetros pode ser modificado para caber outras experiências (isto é, os tempos de exposição, binning, canais fluorescentes, etc.). Todos os procedimentos devem aderir às diretrizes e regulamentos institucionais e ser aprovado pela comissão de biossegurança institucional. Web site do fabricante de microscópio contém excelentes informações para imagens de células vivas.

1. Microscópios e Software Imaging

  1. Execute imagens de células vivas em uma ampla variedade de microscópios invertidos. Os microscópios mais comuns são widefield epifluorescência e confocal girando-disco. Aqui, usar um microscópio automatizado e motorizado widefield epifluorescência, com fonte de luz de iodetos metálicos de 200 watt.
  2. Obter um estágio-top ou um microscópio câmara ambiental. Aqui, usar uma etapa-tcâmara ambiental op.
  3. Use um software comercial para operar microscópios com utilitários para executar a microscopia de lapso de tempo.
  4. Use software disponível comercialmente ou ImageJ para análise de imagem. Muitas outras ferramentas de análise estão disponíveis comercialmente, e há programas feitos sob medida, muitos dos quais foram publicados 8,18.

2. A visualização de processos celulares e respostas fenotípicas

  1. Visualize as células com microscopia de campo claro. Diferencial de contraste de interferência e de contraste de fase por si só pode ser muito informativo para estudar as respostas para as respostas de drogas anti-cancro. Estes processos podem incluir a mitose, a motilidade celular e a apoptose.
  2. Visualizar estruturas celulares, organelas e processos com biossensores fluorescentes. As sondas fluorescentes são informativos no rastreamento de processos subcelulares específicos. Estes podem incluir dinâmica dos microtúbulos, mitocondrial e da dinâmica do retículo endoplasmático, o acúmulo de proteína e localização, esinalização molecular (por ex., fosforilação, cálcio).

3. Preparação de Amostras

  1. Cultivar células em pratos de cultura de células certificados num padrão, incubadora humidificada de cultura de células (por exemplo, 37 ° C, 5% de CO2, 80% de humidade relativa).
    1. Cultivar células HT1080 em MEM com EBSS. Suplementar o meio com 10% v / v de FBS, 1% v / v de Pen / Strep a 1% v / v de piruvato de sódio e 1% v / v de aminoácidos não-essenciais.
  2. Dois dias antes da imagem, as células placa 50.000 HT1080 Fucci em 3 poços de uma de 12 poços prato fundo # 1.5 de vidro em uma capa de fluxo laminar estéril certificada. Ajustar o número de células plaqueadas para alcançar ~ 60% de confluência para o início da experiência. Dependendo da linha celular e a natureza da experiência a densidade celular pode ser menos.
    Nota: A densidade celular pode ter grande influência sobre o crescimento da linha celular e os resultados experimentais. Contagem de células para minimizar experimento-a-experimento variability devido à densidade.
    1. Dependendo da câmara ambiental e as condições necessárias para a experiência, as células em pratos de placas único poço (tipicamente 35- ou 60-mm), 4 bem placas de 35 mm, 6-, placas de cultura de células de 12 ou 24 cavidades, ou lamela slides em vários formatos. Utilize placas com fundo de vidro com vidro # 1.5 como a maioria das lentes objetivas são otimizados para esta espessura do vidro, e imagens através de plástico de cultura de células é muito pobre.
      Nota: Algumas linhas celulares não crescer e sobreviver em vidro. Nestes casos, o vidro pode ser revestido, a fim de melhorar a aderência das células (por ex., Poli-lisina ou colagénio). Algumas empresas fabricam plástico de cultura de células ópticas, é necessário determinar empiricamente se esta é uma opção viável.

4. Câmara Ambiental Set-up

  1. Antes de qualquer experimentação, definir-se a câmara com ambiente de modo a que opera em ~ 80% de humidade e assim a temperatura à posição da amostra é de 37 ° C. A maioria das células cultivadas crescem em 5% de atmosfera de ar, CO 2 / equilíbrio devido ao tampão de bicarbonato de sódio no meio. Dependendo da configuração, defina o controlador ambiental a 5% de CO 2 e vai misturar 100% CO 2 com o ar, ou use pré-misturado, certificada 5% de CO 2 / balanço de gás de ar. Siga as instruções do fabricante para o gás de caudais.
    Nota: Alguns linhas de células crescer em meio de CO 2 -independente, caso em que pode ser mantido sem CO 2. meios de imagem concebidas especificamente está também disponível que limita a adição de compostos autofluorescentes. Crescimento em meios de teses para o tipo de célula desejado deve ser previamente determinada empiricamente.
  2. Antes da imagem, certifique-se o reservatório de água está cheio (seguindo as instruções do fabricante) com água destilada estéril. Ligue a câmara ambiental para o ajuste de temperatura desejada e coloque-o na inserção palco microscópio. Para poupar gás, não ligue o fluxo neste momento.
    Nota: Se houver algum espaço livre entre a câmara de estágio-top e inserir estágio e / ou qualquer tensão em cabos de ligação para a câmara pode introduzir artefatos de movimento para o experimento.
    1. Coloque pedaços de filme de parafina sobre as bordas da abertura de inserção estágio antes de inserir a câmara para ela, para acoplar a câmara para o palco, e se certificar de que não há conexões estão puxando na câmara.
  3. Permitir que a câmara de equilibrar a 37 o C. Manter uma temperatura estável para evitar flutuações de temperatura durante o exame que pode afetar a fisiologia celular e introduzir deriva. Alcançar equilíbrio de temperatura geralmente requer de 30 min a 1 hora, dependendo do ambiente.
    1. Insira um prato 'fictício' com água nos poços para a câmara durante o aquecimento. Um prato de imagem cheio com água imita a amostra, ajudando a garantir que a câmara seja suficientemente aquecido e estabilizada. Enchendo a câmara com água estéril pré-aquecidoreduz o tempo necessário à estabilização da temperatura e minimiza a queda de temperatura após a adição da amostra experimental.

5. Microscópio Set-up

  1. Ligue o microscópio, computador associado, e todos os periféricos necessários.
    1. Dependendo da fonte de luz, espere para ligá-lo até que seja necessário (por exemplo., LED).
  2. Com o objectivo de torre numa posição baixa, seleccionar a 20X 0,7 NA objectivo de ser utilizada.
  3. Coloque a amostra sobre o objetivo - o que irá torná-lo mais fácil de encontrar as células quando a amostra está na câmara.
  4. Definir parâmetros de imagem neste momento, se eles são conhecidos a partir de experiências anteriores.

6. Transportando Células de microscópio e para a câmara

  1. Transportar as células a ser trabalhada a partir da incubadora para a câmara ambiental. Garantir que isso seja feito rapidamente para limitar os efeitos de um comparativamente baixo CO 2
  2. Coloque as células em um recipiente de isopor selada ou saco isolados para evitar grandes mudanças ambientais.
  • Insira o prato imaging amostras para a câmara seguindo as instruções do fabricante.
  • Depois que as células foram garantidos dentro da câmara ambiental, selar a câmara para manter um ambiente estável e desligue imediatamente a fonte (s) de gás atmosférico.
    1. Como algumas câmaras ambientais não utilizam uma tampa apertada, selado, para retardar a evaporação, a camada estéril, óleo mineral certificada-embrião no topo do meio de crescimento. Envolver a película de parafina gás permeante em torno do perímetro-bordas do prato de amostras tomando cuidado para não obstruir a área de imagem de vidro. , os métodos de humidificação secundárias localizadas podem ser empregues. A condensação na tampa do prato de amostras pode diminuir desemmance de microscopia de campo claro.
  • A fim de minimizar os efeitos da deriva térmica mais cedo durante o experimento, espere 30 minutos antes de iniciar o lapso de tempo. O tempo necessário varia com base no tamanho do prato de imagens e de outros factores. Determinar empiricamente.
  • 7. Configurando Imaging

    1. condições de imagem Seleccione que melhor representam os dados. Tomar precauções para evitar fototoxicidade, limitando o tempo de exposição, utilizando menor intensidade de luz e selecionando sondas que são excitados por longos comprimentos de onda da luz.
    2. Definir X, Y e Z-plano e desejado comprimento de onda (s) para cada posição a ser trabalhada. A resolução de tempo é limitado pelo número de posições e comprimentos de onda. Para longo prazo de lapso de tempo da maioria dos processos celulares, adquire uma imagem a cada 10-20 min; maior resolução de tempo (intervalos curtos, por exemplo., 1 min) fornece mais pontos de dados de seguimento e de células, por conseguinte, mais robusta, mas também resulta em mais integradaexposição à luz e conjuntos de dados maiores.
      1. Como HT1080 FUCCI têm proteínas fluorescentes verde e vermelho dinâmicas (ver resultados representativos), use os seguintes tempos de exposição: FITC / GFP - 50 ms, Texas Red / TRITC - 40 ms, campo claro - 20 ms. Use uma lata de 2 x 2.
    3. Ativar a focagem automática controlada software usando os parâmetros padrão em Configurações avançadas. Definir um intervalo de focagem automática de 10 mm com o tamanho recomendado etapa. Certifique-se de fazer isso antes de iniciar o lapso de tempo. Autofoco com imagens de campo claro e nunca com fluorescência para reduzir fototoxicidade e fotodegradação.
      1. Utilizar sistemas de focagem automática de software controlado em qualquer microscópio com um palco motorizado, e concentrar-se directamente sobre a amostra. No entanto, eles podem limitar a velocidade de aquisição do experimento. Hardware controlado sistemas com foco contínuo funcionar bem para a microscopia de lapso de tempo e melhorar a velocidade, permitindo mais posições a ser trabalhada ou uma maior taxa de aquisição. No entanto, elesconfiar na detecção da interface ar-vidro e pode perder o foco da amostra com variações na espessura do vidro através do poço.
    4. Substituir metade da mídia com a mídia contendo a concentração da droga desejado que tenha sido aquecido a 37 o C. substituição da mídia parcial ajuda a reduzir a dispersão térmica. As condições deste experimento são Veículo (DMSO), 1 mM selinexor e 10 mM PD0332991.
      Nota: Esta etapa também pode ser feito depois de iniciar a aquisição, fazendo uma pausa e reiniciar o experimento. Isto permite o acompanhamento das respostas longitudinal pré e pós-droga de células individuais. Se a estabilidade da droga ou o metabolismo é uma preocupação, parando e substituindo os meios podem ser feitos com o mesmo método. Para testar a degradação ou metabolismo de drogas, meios de células tratadas podem também ser colocadas em células naive para testar a acção do fármaco.
    5. Comece o lapso de tempo.
    6. À medida que o lapso de tempo é executado, garantir que os campos fotografada permanecem no foco eo chamber mantém uma úmido 37 o C.
      1. Ajustar o foco, conforme necessário, fazendo uma pausa a aquisição durante o intervalo de tempo entre pontos de tempo.
    7. Se necessário, adicione água para a câmara durante as experiências mais longas. Evitar o arrefecimento da câmara através da adição de pré-aquecido, a água destilada estéril a 37 o C.

    8. Acabar com a Time-lapse

    1. Quando o experimento foi executado para conclusão, parar a aquisição se não foi definido para parar automaticamente.
    2. Certifique-se de que o lapso de tempo foi salva corretamente para o disco rígido, embora a maioria dos pacotes de software de salvar automaticamente durante a aquisição se não for concluído de forma adequada os dados podem ser perdidos.
    3. Retire a câmara do microscópio e eliminar as células para resíduos com risco biológico seguindo procedimentos de biossegurança institucional aprovados.

    9. Acompanhamento Longitudinal e Análise de Time-lapse de dados

    1. Escolha a metodologia de análise que éapropriado para o processo biológico de interesse. Muitos plugins para ImageJ, programas Matlab e plataformas personalizadas foram produzidas para aplicações específicas. A seguinte metodologia abrange acompanhamento dos núcleos e análise de sondas fluorescentes nucleares como demonstrado nas Figuras 4 e 5.
    2. Abra as pilhas de imagens .tif para os canais utilizados em ImageJ. Alternativamente, arquivos nativos abertas a partir do programa de aquisição diretamente no ImageJ usando o plugin Bioformats.
    3. Desenhe uma região de interesse (ROI) dentro do núcleo de uma célula usando a imagem de campo claro ou o canal rótulo nuclear (se utilizado) e adicioná-lo ao gerente do ROI. Nota: Se as células fotografadas tem uma etiqueta nuclear (por exemplo, a histona H2B-EGFP.), Seguida de seguimento automático de células pode ser utilizado para criar as regiões de interesse (ROI) que representa núcleos individuais ao longo do tempo.
    4. Avance para o próximo ponto de tempo e posicione o ROI dentro do mesmo nucleus. Adicione o ROI com o gerente de ROI.
    5. Continuar a controlar e fazer ROIs para a célula individual até que haja um evento celular (mitose, apoptose, etc.) Ou a célula já não podem ser rastreados (isto é., Move-se para fora da armação ou a experiência termina).
    6. Quando ROIs foram estabelecidas para as células através do tempo eles estão no campo, sobrepô-las para os canais fluorescentes de interesse. Medir a intensidade média da fluorescência em cada canal para cada ponto de tempo. Salvar a lista de ROI para uso posterior.
      1. Várias medidas podem ser feitas dentro do ROI para aplicações em diferentes experimentos. Clique Análise → Definir Medidas ... para abrir um menu para escolher o método analítico (por exemplo., A intensidade dentro do ROI, intensidade integrada, etc dizer.).
    7. Nota destinos celulares de células individuais (eg., Apoptose, divisão, de sobrevivência), enquanto rastreamento. Isto permite a criação de curvas de sobrevivência e furtheanálise da população r.
    8. Com a intensidade média para os dois canais, criar um gráfico de dispersão para exibir dinâmica do ciclo celular em resposta a agentes terapêuticos (Figura 5B, C).
      Nota: A parcela pode ser criado para células individuais ao longo do tempo ou, calculados sobre uma população de células controladas. imagiologia quantitativa pode ser crucial para o estabelecimento de respostas complexas e relações de células em resposta à terapêutica do cancro. Microscopia de lapso de tempo de longo prazo, o acompanhamento longitudinal e análise de dados é um processo multi-passo, com muitas opções para o tipo de ferramentas de microscopia e análise, e segue o contorno geral previsto na Figura 1.

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    Representative Results

    Longo prazo microscopia de lapso de tempo e acompanhamento longitudinal direta permite o estudo de muitos efeitos anti-câncer durante a resposta à droga. Seguindo o esquema geral na Figura 1, vários exemplos de células são mostradas expressar repórteres fluorescentes validados que tratada com drogas anti-cancro, rastreados e analisados ​​utilizando diferentes abordagens.

    Microscopia de contraste de fase por si só é muito informativo e robustamente relatórios sobre interfase contra a mitose, duração mitótico e parada, a divisão celular anormal e morte celular 21,23,24. Drogas que visam a divisão celular, muitas vezes denominados medicamentos anti-mitóticas, continuará a ser desenvolvido. Figura 2 e Filmes 1 e 2 mostram exemplos de um par de linhas celulares MCF7 combinados de mama derivada de câncer que diferem apenas em seu estado de p53, tratados com 500 nM de um tipo de droga anti-câncer que alvose inibe a proteína do motor mitótico, cinesina-5 (KSP1, Kif11, Eg5), resultando em mitose prolongada 20. Células MCF-7 de tipo selvagem (Figura 2A) é um paradigma para estudar a paragem do ciclo celular dependentes de p53 25-27. Células selvagens entrar mitose, permanecer por várias horas, eventualmente, sair e prender em grande parte com a indução de p53 25. Quando a p53 é removido por knockdown estável de p53 (p53 MCF7 sh), ao invés de prender depois de deixarem a mitose, as células passam por ciclos repetidos (Figura 2B). As células foram rastreados manualmente e o índice mitótico e a percentagem de células que entram num segundo mitose foram marcados (Figura 2C, D). Observa-se que a célula p53 sh rastreados divide quando entra uma segunda rodada de mitose em vez de prender e deixando a mitose sem divisão. Embora não seja mostrado aqui a duração de eventos mitóticas, o tempo entre sucessivas mitoses por cento, de divisões celulares, e acontecimentos de morte celular associados também pode ser Scored 20,21.

    Os taxanos, por exemplo paclitaxel e docetaxel, são a quimioterapia comum para muitos tipos de câncer, incluindo aqueles que são difíceis de tratar como peito de pâncreas e avançado. O paclitaxel liga-se à extremidade mais-dinâmico dos microtúbulos, estabilizando-os, impedindo a sua função normal. Paclitaxel observou efeitos dose-dependentes, e até mesmo em baixas concentrações pode perturbar a progressão mitótico e segregação cromossomo 16 normal. Segregação fiel de cromossomos é essencial para a proliferação de células normais e quando anormal pode resultar em aneuploidia que podem provocar a parada do ciclo celular, mas também agir como um condutor de progressão do cancro. Figura 3 e Filme 3 mostram células HeLa derivadas de carcinoma cervical expressam de forma estável a cromatina marcador de histona-2b fundido com mCherry e beta-tubulina fundido com EGFP (não mostrado) em meio de crescimento normal, tratadas com 1 nM de paclitaxel. Nissoexemplo, a entrada ea progressão através da mitose pode ser seguido. O momento da mitose parece normal nesta célula, no entanto o alinhamento dos cromossomas e segregação não é, resultando em bojos nucleares e micronúcleos, que são estruturas que indicam má segregação cromossômica. Micronúcleos são propensos a danos no ADN e chromothripsis, que é a fragmentação em grande escala de cromossomas ou cromatina - Isto tem importantes implicações na evolução tumoral 28,29. Embora não seja mostrado aqui, a origem de micronúcleos em relação a outras estruturas de mitose e o destino destas células pode ser directamente rastreados usando a longo prazo de lapso de tempo. Além disso, um marcador expresso cromatina com um repórter de danos no ADN pode ser utilizada para estabelecer a relação entre a segregação cromossoma, micronúcleos e danos no ADN.

    repórteres fluorescentes permitem processos celulares enumeráveis ​​a ser rastreado e novas repórteres estão continuamente a ser desenvolvido. para exampla, o ciclo celular consiste de fases que são de particular interesse em desenvolver direcionados terapias anti-câncer. Figura 4 e Filme 4 mostra uma linha de células derivadas de fibrosarcoma (HT1080) que estavelmente co-expressa dois repórteres denominado, os indicadores do ciclo celular ubiquitina fluorescente (FUCCI) 30. No sistema aqui, uma porção do polipéptido CDT1 está fundido com mKO2 (monomérica laranja Kusabira 2) e aumentos no G1-fase e degrada-se na fase S precoce, e uma porção de geminin é fundido a MAG (monomérica verde Azami) e aumenta em meados da década de fase S e é degradado em cima anaphase. Esta célula está em meio de crescimento normal e progride através do ciclo celular em 15 h. A Figura 5A, B e Filme 5 mostram as mesmas células em meio normal tratados com 10 uM PD0332991, um inibidor de Cdk4 / 6. As células progredir através de G2-fase e dividir normalmente, e prender firmemente na fase G1-subsequente, indicando o potencial para efeitosive efeitos citostáticos em tumores em crescimento. Figura 5C, D e Filme 6 mostram as mesmas células em meio normal tratado com uma pequena molécula chamada selinexor (KPT-330), um potente inibidor da proteína exportação nuclear, exportina-1 (XPO1, também conhecido como CRM1 ). Estes compostos são chamados de inibidores seletivos de exportação nuclear (SINE) e seus efeitos anti-câncer são atualmente sob investigação 31,32. Tratamento SINE resulta em fenótipos ciclo celular fortes e 33,34 morte celular. Este exemplo mostra uma célula que progride através G1-fase com uma cinética normais (aproximadamente 6 horas), mas as experiências atraso na progressão da fase S, tal como indicado pelo período com ambos sinal vermelho e verde (cerca de 3 horas no controle, mas 10 no SINE tratada ). Esta célula morre em S- atrasado ou G2-fase após 21 h 30 min; um ciclo celular normal é de aproximadamente 15 h. Os efeitos da selinexor estão sendo estudadas para o sangue diferente e tumores sólidos 35.

    Figura células HT1080 6 e 7 mostram filme que expressam de forma estável um repórter danos no ADN de cadeia dupla, mCherry BP1-2-36 em crescimento normal meio tratado com 10 uM de etoposido (VP-16), um inibidor da topoisomerase II. Este repórter é composta por uma parte do ADN de cadeia dupla da proteína local da fractura, 53BP1 que está fundido com mCherry. O núcleo desta célula foi monitorado using o plugin Analisar partículas em ImageJ eo sinal mCherry-BP1-2 integrada foi medido em cada quadro após limiarizar a valores que eliminaram sonda nuclear solúvel. dano do ADN é mínimo para o primeiro 10 hr e, em seguida, aumenta de forma constante. Inibidores da topoisomerase II são conhecidos por afectar particularmente em fase G2 e S, quando a enzima é mais activo 37,38. A cinética observados neste exemplo poderia indicar ciclo celular danos associados; combinando mCherry-BP1-2 com repórteres Fucci poderia demonstrar o sincronismo dos danos que podem então ser ligados a célula destino.

    figura 1
    Figura 1. Visão Geral do Uso de longo prazo Microscopia Time-lapse e Acompanhamento Longitudinal para estudar anti-câncer de resposta à droga. As células em pratos de imagem em células vivas apropriadas rotulados como desejado são gravadas, as células ou regiões de interesse são rastreadas, e os dados são analisado. Existem muitos métodos para monitorar e quantificar células, alguns são indicados aqui. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 2
    Figura 2. Fase de contraste Lapso de tempo Microscopia Mostra a dependência da p53-anti-mitótica após tratamento da toxicodependência. Tipo selvagem (A) e p53-knockdown (B) células de MCF7 foram tratadas com 500 nM de cinesina-5 inibidor e fotografada a cada 10 min durante 96 HR usando microscopia de contraste de fase com uma lente de 20X NA PH2 0,70. As células individuais foram rastreados por cento manualmente e a mitose e se a célula progride para outro mitose novamente durante o lapso de tempo foram marcados. As setas indicam a célula que está sendo monitorado. A célula sh p53 (B) divide ao entrar uma segunda mitose. (C) As duas linhas de células shoparagem da mitose prolongada W como indicado pela percentagem mitose pico elevado (primeiro azul e setas vermelhas). (C, D) Cerca de 90% das células sem p53 (p53 SH, n = 87) mostram a progressão continuada (setas vermelhas) em comparação com 20% do tipo selvagem (n = 130). As barras de erro indicam o desvio padrão. Bar = 20 mm. Filmes 1 e 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 3
    Figura 3. A cromatina marcador Histona 2b revela evidência de Cromossoma Segregação Anormalidades depois de baixa dose de paclitaxel tratamento. O paclitaxel é um fármaco alvo-microtúbulos, que resulta em defeitos complexos, dependentes da concentração em crescimento e divisão celular. A organização da cromatina informa em diferentes estados celulares, incluindo a faseda mitose e a morte celular. células HeLa que expressam de forma estável tanto H2b-mCherry e β-tubulina-EGFP foram tratadas com 1 nM de paclitaxel. Esta célula é inicialmente na interfase, progride através dos estágios de mitose e divide. Embora o tempo em mitose parece normal, não há evidência de erros de fixação cromossoma e de segregação que são resolvidas (setas). O destino destas células pode ser determinada directamente por rastreamento longitudinal. De contraste de fase (não representado) e as imagens fluorescentes foram adquiridas a um quadro por 10 min com uma objectiva 20X NA Ph2 0,70. Bar = 10 mm. Filme 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 4
    Figura 4. Marcadores ciclo celular fluorescentes permitem a monitoração direta da progressão do ciclo celular.(A) Um campo de células HT1080 fibrossarcoma vivos que expressam o sistema FUCCI fotografada por contraste de fase e fluorescência. (B, C) ​​A célula mitótica na caixa tracejada no painel A é seguido. Normalmente o progresso através do ciclo celular em aproximadamente 15 horas. Após a mitose, as células são brevemente dim, e, em seguida, tornar-se vermelho à medida que progridem para dentro e através G1 fase. Quando as células entram S-fase, a sonda CDT1 vermelho é degradada e os verdes aumenta sonda geminin. O breve período de aproximadamente 3 horas, onde ambas as sondas estão presentes, indica S-fase inicial. Como as células progredir através S e G2-fase e para o próximo mitose eles permanecem verdes. A sonda verde é degradado em cima anáfase da divisão celular. De contraste de fase e imagens fluorescentes foram adquiridas em 1 quadro por 10 min com uma lente NA 20X PH2 0,70. Bar = 10 mm. Filme 4. Por favor clique aqui para view uma versão maior desta figura.

    Figura 5
    Figura 5. Ciclo celular efeitos específicos e associadas a morte celular. A mesma linha celular como na Figura 4, mas tratado com duas moléculas diferentes que representam diferentes alvos anti-câncer. Vezes após o tratamento são indicadas. (A, B) Após o tratamento de uma célula /-fase G2 tardia S com 10 uM PD0332991 inibidor de Cdk4 / 6, que normalmente célula progride para a mitose (M) e divide. Uma célula filha é monitorado medindo intensidades fluorescentes vermelhas e verdes na região de interesse no núcleo. A célula permanece preso em G1-fase por cerca de 40 horas. (C, D) Após o tratamento de uma célula em fase G2 tardia com 1 uM selinexor, que normalmente célula progride para a mitose (M) e divide. Uma célula filha é rastreado e entra G1 fase, progride atravésum início de fase S prolongado (sinal vermelho e verde), passa para apenas verde e morre depois de 21 h 30 min. Os dados sugerem a progressão da fase S é afectada pelo tratamento selinexor. De contraste de fase e imagens fluorescentes foram adquiridas em 1 quadro por 10 min com uma lente NA 20X PH2 0,70. Bar = 10 mm. Filmes 5 e 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 6
    Figura 6. Dynamics DNA danos após tratamento medicamentoso. Muitas terapias anti-câncer resultar em danos no DNA que podem impactar profundamente a resposta das células e sucesso do tratamento. células HT1080 que expressam estavelmente tanto a cadeia dupla de ADN marcador de danos mCherry-BP1-2 e H2b-EGFP (não mostrado) foram tratadas com 10? M do fármaco etoposido a topoisomerase II e o ADN dAmage foi rastreado. (A) O número ea intensidade do aumento de focos após etoposídeo. Existe inicialmente um desfasamento, indicando possíveis efeitos no ciclo celular consistentes com o mecanismo conhecido de etoposido. Até 22 hr 50 min esta célula tem acumulado elevados níveis de danos. Embora não seja mostrado aqui, o destino dessa célula pode ser determinado pelo seguimento directa. (B) um ROI correspondente ao núcleo obtido por meio do sinal de H2b-EGFP foi controlado com o controlo de partículas em ImageJ e o sinal BP1-2 mCherry integrado foi quantificada e representada graficamente ao longo do tempo. O atraso no sinal de até cerca de 10 horas é observado, seguido por um aumento persistente. imagens fluorescentes foram adquiridas em 1 quadro por 10 min com uma lente NA 40X PH2 0,75. Bar = 10 mm. Filme 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


    Filme 1. Fase de contraste de Microscopia Time-lapse de células tipo selvagem MCF7 após o tratamento. Células tipo selvagem MCF7 Anti-mitótico drogas foram tratadas com 500 nM Cinesina-5 inibidor e fotografada a cada 10 minutos durante 96 horas usando microscopia de contraste de fase com um 20X PH2 0,70 lente de NA. Paragem da mitose prolongada e saída da mitose podem ser observados, como descrito na Figura 2. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

    Moive 2
    Filme 2. Fase de contraste de Microscopia Time-lapse de knockdown-p53 As células MCF-7 após células anti-mitótico Drug Treatment. MCF7 expressam de forma estável um pequeno RNA hairpin segmentação p53 para a degradação foram tratadas com 500 nM Cinesina-5 inibidor e fotografada a cada 10 minutos durante 96 horas utilizando microscopia de contraste de fase com uma lente de 20X NA PH2 0,70. Paragem da mitose prolongada e várias rodadas de mitose podem ser observados, como descrito na Figura 2. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

    Moive 3
    Filme 3. Microscopia fluorescente Time-lapse de células HeLa após células Paclitaxel tratamento. HeLa de baixa dose expressam de forma estável H2B-mCherry e β-tubulina-EGFP foram tratados com 1 nM paclitaxel. Apego cromossomo e as questões de segregação pode ser observado, como descrito na Figura 3. As imagens foram adquiridas a cada 10 minutos com uma lente NA 20X PH2 0,70. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

    ove_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Moive 4
    Filme 4. Marcadores ciclo celular fluorescentes permitem a monitoração direta da progressão do ciclo celular. Células HT1080 que expressam o sistema FUCCI foram longitudinalmente controlados durante a microscopia de lapso de tempo. A célula vai dim depois de sair a mitose, e depois torna-se vermelha como a célula progride através G1 fase. À medida que a célula entra S-fase, torna-se amarela como os verdes aumenta sonda geminin e a sonda CDT1 vermelho é degradada. A célula permanece verde à medida que progride através de S e G2-fase. O verde diminui à medida que as células entra anaphase. Quantificação desta célula é mostrado na Figura 4. As imagens foram adquiridas a cada 10 minutos com uma lente NA 20X PH2 0,70. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

    Moive 5 "src =" / files / ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
    5. Filme celular HT1080 Expressando marcadores fluorescentes com o ciclo celular após o tratamento com um inibidor da fase G1. Células HT1080 que expressam o sistema FUCCI foram tratadas com 10? M PD0332991, um inibidor de Cdk4 / 6. A célula rastreados progride normalmente a mitose e divide. Uma filha é monitorado, e continua a ser vermelho no G1 para a duração do filme. A quantificação é mostrado na Figura 5. As imagens foram adquiridas a cada 10 minutos com uma lente NA 20X PH2 0,70. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

    Moive 6
    Filme 6. HT1080 celulares que expressam marcadores fluorescentes ciclo celular após o tratamento com o exportina-1 Inhibitor, Selinexor. Células HT1080 que expressam o sistema FUCCI foram deleiteed com selinexor 1? M. Esta célula de fase G2 tarde foi monitorado através de mitose. Uma célula filha, em seguida, progride através da fase G1-(vermelho) e entra na fase S (amarelo). A célula progride lentamente através de S-fases até à sua entrada / G2-fase tardia-S e morre depois de 21 h 30 min do tratamento. A quantificação é mostrado na Figura 5. As imagens foram adquiridas a cada 10 minutos com uma lente NA 20X PH2 0,70. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

    Moive 7
    7. Filme de ADN Dynamics danos após tratamento com uma topoisomerase II células HT1080 inibidor. Expressando estavelmente a cadeia dupla de ADN marcador de danos mCherry-BP1-2 e H2B-EGFP foram tratadas com 10? M de etoposido, um inibidor de topoisomerase II. O mCherry-BP1-2 é apresentada no filme. Como o tratamento continuars, o sinal de mCherry-BP1-2 aumenta, indicando um aumento de danos dupla vertente DNA. A quantificação é mostrado na Figura 6. As imagens foram adquiridas a cada 10 minutos com uma lente NA 40X PH2 0,75. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

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    Discussion

    Vantagens de Microscopia Time-lapse e Acompanhamento Longitudinal

    O microscópio é um instrumento ideal para os estudos longitudinais de resposta à droga, uma vez que permite aos investigadores para rastrear as células individuais e os seus destinos, bem como a totalidade da população. A variabilidade na resposta à droga dentro de uma população de células é uma questão importante para anti-câncer projeto terapêutico. acompanhamento longitudinal de células individuais permite aos investigadores para observar essa variabilidade e começar a entender os mecanismos subjacentes e as consequências no que se refere à população de células. Utilizando uma variedade de sondas fluorescentes proporciona uma infinidade de maneiras de observar e compreender ambos os fenótipos de resposta comuns e raras. O calendário ea contribuição de diferentes destinos celulares à resposta da população, as relações entre os fenótipos e destinos específicos, e diferenças na resposta entre linhas celulares ou o estado após tratamento são exemplos do que pode ser aprendido. Muitos processos relacionados com o cancro pode ser estudada. Alguns que não são destacados neste artigo incluem a morte celular com apoptose, autofagia, e os repórteres de necrose 39-42, invasão celular 43,44, ea dinâmica de p53 que determinam as decisões do destino da célula 27. Além disso, esta abordagem não é limitado a estudos em estudos terapêuticos anti-cancro. Os mesmos princípios podem ser usadas para estudar muitos outros processos biológicos, incluindo a mitose 45 a dinâmica do citoesqueleto intracelular e 46,47 sinalização 48.

    microscopia de fluorescência de lapso de tempo também pode fornecer localização e intensidade de dados de proteínas e moléculas de interesse. Não só estão as mudanças no nível de proteína importante para a resposta à droga, mas a localização correcta (ou inadequada) de proteínas dentro da célula é fundamental para compreensão resposta. Microscopia de lapso de tempo fornece dados sobre onde as proteínas são localizadas (por exemplo., Núcleo, citoplasma, organelas específicas,etc.) após o tratamento de drogas e como a localização e os níveis totais de mudar ao longo do tempo em um único nível celular e população.

    Desafios e Limitações

    Apesar dos pontos fortes da microscopia de lapso de tempo e análise longitudinal de células individuais, existem limitações. repórteres fluorescência estão limitadas pela sua estabilidade e especificidade. Ao conceber proteínas de fusão fluorescentes, é importante escolher uma sonda que é foto-estável e brilhante, mas é também necessário considerar os efeitos da marcação fluorescente está ligado à proteína de interesse relativamente à sua função normal e capacidade de localizar adequadamente . Estas questões foram discutidas em detalhe em outro lugar e há muitas proteínas fluorescentes etiquetadas disponíveis que foram publicados 15,49,50. Outros marcadores fluorescentes ou marcadores podem ser adicionados às células, e deve ser tomado cuidado para assegurar que não são tóxicos. Em nossa experiência, estes pmantos, por exemplo, etiquetas mitocondriais (potencial de membrana) ou célula permeável corantes de ADN, tendem a branquear mais fácil e vai ser diluída-se devido à proliferação celular.

    Além disso, existem muitos desafios técnicos com crescente e observar as células em um microscópio. Instabilidade com relação a temperatura, a humidade, atmosfera e luz vai ter grandes efeitos sobre as células, resultando em perda de dados ou até mesmo todo o experimento. Estabilidade questões quanto à captura de imagem pode ser visto em filmes 1 e 2. Este efeito pode ser minimizado através da utilização de uma película de parafina (ver 4.2). Há também algoritmos de estabilização de imagem disponíveis para o processamento pós-aquisição, por exemplo usando ImageJ (NIH). Um aspecto de longo prazo de lapso de tempo que é frequentemente esquecido é a gestão de dados e tamanho do arquivo. Mesmo quando o binning de dados, numa única experiência de lapso de tempo é muitas vezes em excesso de 30 gigabytes. Alta capacidade, de alta velocidade, armazenamento de dados confiável e de transferência são fortesly incentivada. Dependendo do biossensor fluorescente (s) a ser trabalhada, muitas vezes não é necessária a aquisição de imagens de resolução completa, por exemplo nucleares ou citoplasmáticas sensores. Recomendamos sempre que possível, tomar medidas para manter arquivos pequenos, resultando em mais fácil trabalhar com dados, as necessidades de computação menos exigentes, e melhorou o fluxo de trabalho.

    Fototoxicidade é uma grande preocupação quando se realiza a microscopia de lapso de tempo a longo prazo. Luz de alta intensidade e exposições longas podem levar à fotodegradação de sondas fluorescentes, estresse celular e morte celular. Estes efeitos podem ter grandes efeitos sobre os dados e levar a deturpação do experimento. arrumação de câmara e o ganho pode ser utilizado para reduzir os tempos de exposição. Os filtros de densidade neutra no caminho da luz reduzir a intensidade da luz na amostra. Os comprimentos de onda da luz usada para a imagem também afetará as células. comprimentos de onda mais curtos (UV, perto UV) são mais prejudiciais para as células e resultar em foto-branqueamento em taxas mais rápidas do quecomprimentos de onda mais longos (por ex., vermelho, vermelho longínquo). Escolha de objetivo também pode afetar as condições de imagem. abertura numérica (NA) lentes maiores produzem imagens de alta resolução, mas maior ampliação permite que menos luz a ser transmitida a partir da amostra, resultando em tempos de exposição mais elevados ou luz mais intensa. Um objetivo deve ser selecionado com um NA e ampliação apropriado que irá resolver o seu objeto de interesse, sem oversampling. Em muitos casos, o maior objectivo pode não ser a escolha mais adequada. Com sondas nucleares (Figuras 4, 5), uma objectiva de baixa ampliação permite um campo maior para ser capturado, de forma eficaz o aumento do tamanho da amostra, sem comprometer a resolução do objeto desejado. De longo prazo de lapso de tempo em três dimensões deve ser realizada com cautela, devido à exposição à luz integrada. Usando um disco giratório microscópio confocal, câmera sensíveis (eg., EM-CCD), ganho de câmera, e um motor piezo rápido para z-series é suggested para reduzir a exposição à luz. Rápida aquisição da série z também é importante para minimizar artefatos de movimento devido ao movimento e dinâmica celular que ocorrem durante o período de aquisição. análise empírica de células não tratadas usando várias configurações diferentes pode ser útil para determinar os efeitos de luz fluorescente em qualquer linha de células de dados ou repórter. Além disso, a ausência de tratamento devem ser incluídos em cada experiência para determinar os efeitos citotóxicos das condições experimentais.

    Variações da técnica

    De longo prazo de lapso de tempo é robusto e muito flexível. Usando técnicas de co-cultura, diferentes linhas celulares ou as mesmas linhas celulares que expressam diferentes repórteres pode ser usado. Um excelente exemplo disso é imagiologia células fagocíticas com células-alvo que estão morrendo em resposta a uma droga anti-câncer. Outro exemplo poderia ser a de estudar o impacto das células de responder em células naive drogas vizinho. Juntamente com foto-activateable, foto-conversível, e proteínas fluorescentes foto-comutável, e as proteínas modificadas que podem ser ativadas pela luz para desencadear efeitos específicos (por exemplo., KillerRed), há muitas possibilidades. Abordagens mais complexos podem ser usados ​​que empregam vários tipos especializados de microscopia, tais como a redistribuição de fluorescência após a fotodegradação, Förster transferência de energia de ressonância (FRET) e de super-resolução (por exemplo., Microscopia reconstrução óptico estocástica (TEMPESTADE), microscopia de iluminação estrutural (SIM), ou o esgotamento emissão estimulada (STED)), e muitos outros, e há vantagens e limitações de cada abordagem.

    Longo prazo (por exemplo., Semanas, meses) respostas e a recuperação de células após a retirada da droga é fundamental para compreender a ação de drogas anti-câncer. pratos com fundo de vidro em grade são uma ferramenta valiosa para monitorar as células ou regiões específicas dentro de uma população / área repetidamente. Por exemplo, com um prato em grade, o dr inicialresposta UG podem ser visualizados utilizando um lapso de tempo, a droga pode ser removida, e em áreas específicas da grelha pode ser trabalhada ao longo do tempo ou submetido a lapso de tempo adicional no momento desejado. O fundo de vidro sobre os pratos podem ser removidos por qualquer de corte com uma ferramenta de escriba ou utilizando um reagente comercial, e as células no vidro pode ser corada para outros marcadores de interesse, para a actividade β-galactocidase associada exemplo senescência, e em comparação com o lapso de tempo para entender a história de como as células atingiram este estado. Se a população de células é suficientemente grande, pode também ser submetida a imunotransf erência ou citometria de fluxo.

    amostras grossas têm sido tradicionalmente difíceis de imagem, por exemplo, esferóides de gel em vários materiais e matrizes. Mais recente aproxima incluindo confocal de fluorescência ou microscopia multi-fotão 16,18,19,51 pode ser usado para estender a abordagem para uma compreensão situ de como as células respondem à terapêutica anti-câncer. oestudos de si e um número crescente de cientistas usando lapso de tempo para estudar a resposta à droga anti-câncer 24,52-54 demonstram claramente que estamos nos movendo para o desenvolvimento de uma compreensão de farmacodinâmica de célula única que irá ajudar a melhorar a nossa capacidade de usar drogas anti-câncer de forma mais eficaz e talvez prever a resposta de drogas anti-câncer.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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