siRNA Transfection e l'EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Genetics

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Summary

Questo protocollo descrive un metodo per trasfezione efficiente siRNA in appena isolate citotrofoblasti villi umani con microperforazione e identificando complessi DNA-proteina in queste cellule. cellule trasfettate possono essere monitorati da Western Blot e EMSA analisi durante il tempo della cultura di 4 giorni.

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Lokossou, A. G., Toufaily, C., Vargas, A., Barbeau, B. siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts. J. Vis. Exp. (115), e53995, doi:10.3791/53995 (2016).

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Abstract

Protocol

Il comitato etico ha approvato UQAM questi protocolli, che sono in accordo con le linee guida del comitato etico di St-Luc Ospedale del Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Canada). I partecipanti hanno firmato un modulo di consenso informato.

1. Preparazione medio e isolamento delle primarie dei villi citotrofoblasti

  1. Preparare terreno di coltura per citotrofoblasti villi primari umani, completandolo Modified Media Dulbecco di Eagle (DMEM) con 25 mM HEPES, 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Filtrare il mezzo preparato attraverso sterile filtro 0,22 micron e conservare in un freezer a -20 ° C in aliquote di 50 ml.
  2. Isolare citotrofoblasti villi primari da placente freschi seguenti protocolli standard 3.
    1. Utilizzando pinze, rimuovere la membrana fetale dal tessuto da graffi delicatamente fuori, facendo attenzione a non rimuovere il tessuto dei villi. Taglia ilrimanendo villi della placenta in cubetti di circa 3 x 3 cm utilizzando bisturi e le forbici. Lavare accuratamente con acqua contenente 0,9% di NaCl per rimuovere sangue materno.
      1. Tenendo ogni cubo con le pinze, rimuovere con attenzione il tessuto dei villi da rimanenti navi e forbici tessuti utilizzando fibrose.
      2. Da 15 a 30 mg di tessuto dei villi, digerire quattro volte in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente tripsina (da 9,6 x 10 5 1,8 x 10 6 U; concentrazione finale 1,2 mg / ml) e deossiribonucleasi I (DNasi I) ( concentrazione finale 200 ug / ml) per 30 min a 37 ° C in un bagno d'acqua con agitazione continua.
        Nota: Utilizzare 150 ml di volume totale per la prima digestione, 100 ml per il secondo digestione e 75 ml per i due digestioni rimanenti.
    2. Raccogliere il surnatante contenente cellule disperse e centrifugare a 1250 xg per 15 minuti senza freno. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di DMEM contenente preriscaldata1% di penicillina / streptomicina.
    3. Strato le cellule disperse sulla cima di una discontinua 5% - pendenza 70% polivinilpirrolidone rivestite di silice (vedi Tabella 1 per la preparazione gradiente) e centrifugare per 23 min a 507 xg senza freno. Rimuovere lo strato di densità tra 1.017 al 1.033 per aspirazione e raccogliere gli strati tra il 40% e il 50% in gradiente con una nuova pipetta. Lavare le cellule estensivamente con 10 ml di preriscaldata DMEM contenente 1% di penicillina / streptomicina.
      Nota: La frazione raccolta corrisponde alla densità tra i 1.048 e 1.062, che ospita trofoblasto.
    4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. In breve, le cellule mescolare e aggiungere 10 ml in una nuova provetta. Aggiungere 10 ml di trypan blu e mescolare delicatamente di nuovo. Stilare la sospensione cellulare e riempire le camere emocitometro. Contare le cellule sotto obiettivo 10X.
    5. Mettere 1 x 10 6 e 4,5 x 10 6 cellule in tubi separati per l'impiego nelle sezioni 1.3 e 2, rispettivamentely. Seme le cellule rimanenti ad una densità di 1,5 x 10 6 cellule / pozzetto in terreno DMEM e cultura a 37 ° C e 5% CO 2 per un massimo di 4 giorni per altri esperimenti.
  3. Valutazione della purezza dei isolate citotrofoblasti villi primarie
    1. Spin 1 x 10 6 delle citotrofoblasti appena isolate in tubi microcentrifuga a 300 x g. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di preriscaldata PBS (PBS). cellule centrifugare a 300 xg e rimuovere PBS mediante aspirazione.
    2. Aggiungere 1 ml di metanolo freddo per cellule e incubare a -20 ° C per 20 min. cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti e rimuovere il metanolo per aspirazione.
      Attenzione: Utilizzare maschera scatola metallica, occhiali protettivi e guanti di gomma durante la manipolazione metanolo.
    3. Aggiungere 1 ml di PBS a temperatura ambiente per reidratare cellule, centrifugare a 300 xg e rimuovere PBS per aspirazione.
    4. Incubare le cellule in PBS contenente FBS (1:50 [v / v] diluizione) e un FcRreagente bloccante (1,10) per 45 min a temperatura ambiente per eliminare legami non specifici.
    5. Lavare due volte con 500 microlitri di PBS temperatura ambiente, cellule centrifugare a 300 xg per 5 min e rimuovere PBS per aspirazione. Risospendere le cellule in 100 microlitri temperatura ambiente PBS.
    6. Incubare le cellule con un isotiocianato monoclonale di topo fluoresceina (FITC) coniugata LP5K antiumano citocheratina-7 anticorpi clone (1: 200) o un anticorpo di controllo isotipo-matched non specifico in PBS contenente 0,2% BSA per 45 min a temperatura ambiente in il buio. Lavare le cellule in PBS.
    7. Analizzare le cellule mediante citometria di flusso 3. Utilizzare preparazioni cellulari, che dimostrano un minimo del 96% di cellule CK-7-positivi mediante citometria di flusso per ulteriori esperimenti.

2. siRNA Transfection di primari umani dei villi citotrofoblasti

  1. Transfection di umani citotrofoblasti villi principale utilizzando un dispositivo microperforazione
    1. Preparare 6 pozzetti contenenti2 ml di terreno DMEM per l'incubazione di cellule microporated.
    2. Dopo l'isolamento di citotrofoblasti primari (vedi paragrafo 1.2), prendere una aliquota di cellule in sospensione e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
    3. Trasferire 1,5 x 10 6 cellule in una provetta e le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule con 1 ml di PBS Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -free) e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule delicatamente in 100 ml di buffer di risospensione.
      Nota: Evitare di tenere sospensione cellulare per più di 15-30 min a temperatura ambiente, per massimizzare la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione.
    5. Aggiungere 300 ng di sincitina-2 siRNA (o di controllo-scrambled siRNA) al tubo di 1,5 ml microcentrifuga e aspirare la miscela di cellule-siRNA utilizzando un 100 ul trasfezione pipetta. Inserirela pipetta nella stazione (vedi elenco dei materiali) e fatte salve le cellule ad una 1300 V singolo impulso di 30 msec.
    6. trasferire immediatamente le cellule a 6 pozzetti (previste al punto 2.1.1) contenenti terreno integrato 37 ° C pre-riscaldato per evitare danni alle cellule.
    7. Ripetere i punti 2.1.5 e 2.1.6 per i restanti campioni.
    8. oscillare delicatamente la piastra per 30 secondi per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare la piastra a 37 ° C in un umidificata CO 2 incubatore per 24 a 48 ore. Aggiornare terreno di coltura 24 ore dopo la trasfezione.
    9. Valutare l'efficienza di trasfezione da analisi Western Blot (vedere i passi da 3 a 6).
  2. Lipofezione di siRNA in citotrofoblasti primari umani
    1. Dopo l'isolamento di cytotrophoblasts villi, seme le cellule ad una densità di 1,5 x 10 6 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti in 2 ml di terreno di coltura e incubare per 18 ore.
    2. Diluire 300 ng di sincitina-2-specifici siRNA (o di controllo-strapazzatesiRNA) e 5 ml di base lipidica reagente di trasfezione in distinte provette 1,5 ml in un volume totale di 10 ml di mezzo agli antibiotici e privo di siero. Incubare per 5 min.
    3. Mescolare i reagenti diluiti e incubare per altri 20 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso trasfezione. Aggiungere 90 ml di mezzo agli antibiotici e privo di siero alla miscela per un volume finale di 100 microlitri.
    4. Togliere terreno di coltura dalle 6 pozzetti (passo 2.2.1). Aggiungere 2 ml di mezzo fresco e la trasfezione mix 100 ml ad ogni pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 24 a 48 ore. Aggiornare terreno di coltura 24 ore dopo la trasfezione.
    5. Valutare l'efficienza di trasfezione da analisi Western Blot (vedere i passi da 3 a 6).

3. Preparazione di lisati da tutta la cultura cellulare

  1. Rimuovere il supporto e lavare ogni pozzetto (dai passi 2.1.8 e 2.2.4) utilizzando DPBS pre-riscaldato (Mg 2+, Ca 2+ gratuito). Aspirare il DPBS e aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare per 1-3 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2. Interrompere il trattamento tripsina con l'aggiunta di 500 ml di siero contenente terreni di crescita.
    Nota: utilizzare il volume supporto appropriato in base al tipo di pallone / piatto: 1 ml per 10 7 cellule / 100 mm piatto / 150 cm 2 fiasco; 0,5 ml per 5 x 10 6 cellule / 60 millimetri piatto / 75 cm 2 pallone.
  2. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -free) e le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. Posizionare la provetta in ghiaccio. Risospendere il pellet in 50-200 ml di buffer ghiacciata Radio-Saggio di immunoprecipitazione (RIPA) (vedi Tabella 2 per la composizione del buffer) contenente appena aggiungereEd proteasi e gli inibitori della fosfatasi ad una concentrazione finale 1x. Brevemente, agitare la provetta e lasciare in ghiaccio per 30 min.
  4. Spin a 16.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. posizionare con cura il tubo in ghiaccio. Usando una pipetta, trasferire il surnatante in una provetta fresco pre-raffreddata tenuti in ghiaccio. Eliminare il pellet.

4. Preparazione di estratti nucleari da cellule in coltura

  1. Per ogni (fase 1.2.5) bene, lavare citotrofoblasti coltivate due volte con 1 ml di pre-riscaldato DPBS (Mg 2+, Ca 2+ gratuito). Aspirare DPBS e aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina / EDTA. Incubare per 1-3 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2 e interrompere il trattamento tripsina aggiungendo 500 ml di siero contenente mezzi di crescita.
  2. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con DPBS (Mg 2+, Ca 2+-free) e le cellule pellet per centrifugazionea 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione tutto il surnatante senza disturbare il pellet e posizionare il tubo in ghiaccio.
  3. Estrarre proteina nucleare in base alle istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione di proteine ​​di ogni campione utilizzando test della proteina quantificazione (Bradford e il dosaggio dell'acido bicinconinico (BCA)).

5. Preparazione del campione e elettroforesi

  1. Determinare la concentrazione di proteine ​​per ogni estratto cellulare utilizzando un saggio proteico quantificazione (ad esempio, Bradford 8 o 9 BCA).
  2. Come da istruzioni del produttore (se anticorpi potrebbero essere utilizzati in condizioni di riduzione e denaturazione), aggiungere un volume equivalente di 2x Laemmli Sample Buffer (Tabella 2) per 20-30 mg di proteine ​​totali.
  3. lisati cellulari bollire a 100 ° C per 5 min. Aliquota 50-100 ml di lisato di evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento e memorizzare i tubi rimanenti a -20 ° C per un uso futuro. Mentre i campioni sono il riscaldamento, preparare 1 L di 1x tampone di corsa (Tabella 2).
  4. Spin i campioni a 16.000 xg per pochi secondi e disporli sul ghiaccio.
  5. Caricare uguale quantità di proteina in ciascun pozzetto di un gel SDS-PAGE 12% (vedi Tabella 2 per la composizione gel), insieme ad un marcatore di peso molecolare. Eseguire il gel per 1 a 2 ore a 100 V.

6. Trasferimento del Protein dal gel alla membrana

  1. Attiva polivinilidenfluoruro membrana (PVDF) con metanolo per 1 min e risciacquare con trasferimento 1x soluzione tampone / 10% metanolo. Secondo le istruzioni del produttore, trasferire per 30 minuti a 1 ora a seconda delle dimensioni della proteina.
    Nota: l'efficienza di trasferimento può essere valutata utilizzando Ponceau Red colorazione prima della fase di bloccaggio.

7. colorazione degli anticorpi

  1. Bloccare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C con la soluzione di bloccaggio 5%.
  2. Incubare la membrana con sincitina-2 anti-anticorpi (4 mg / ml; 1: 5.000) 6 o anti-gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 0,4 mg / ml; 1: 500) in soluzione di saturazione 5% notte a 4 ° C (anti-sincitina-2) o per 45 min a temperatura ambiente. Lavare la membrana tre volte in soluzione salina tamponata con Tris Tween (TBST; vedi Tabella 2 per la composizione buffer) per 5 min.
  3. Incubare la membrana con appropriata perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-coniglio o anticorpi anti-topo (1: 10.000) in 5% in tampone di bloccaggio TBST a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la membrana tre volte in TBST per 5 minuti e poi risciacquare in TBS. Rilevare segnali mediante il substrato blotting chemiluminescenza-based.

8. radiomarcatura di oligonucleotidi a singolo filamento

  1. reazione di fosforilazione
    1. In una provetta, aggiungere 50 ng di un oligonucleotide avanti con 1x tampone T4 polinucleotide chinasi, 1 UT4 polinucleotide chinasi e 20 pCi (γ- 32 P) ATP e portare il volume di reazione di 20 microlitri di acqua priva di nucleasi.
    2. Incubare a 37 ° C per 30 min. Arrestare la reazione aggiungendo 5 ml di 0,5 M EDTA. Portare al volume di 50 ml con acqua priva di nucleasi.
  2. La rimozione dei nucleotidi prive di personalità giuridica da oligonucleotidi
    1. Preparare una colonna G-25 equilibrata con tampone TE (Tabella 2) seguendo le istruzioni del produttore. Porre la colonna in 1,5 ml provetta fresco-free DNasi.
    2. Aggiungere lentamente 50 ml di sonda (dal punto 8.1.2) sopra la resina, facendo attenzione a non disturbare il letto di resina. Spin per 2 min a 350 xg per raccogliere il campione purificato nella provetta da 1,5 ml. Lavare la colonna G-25 con 36 ml di acqua priva di nucleasi e rotazione per 2 min a 350 xg per raccogliere nella provetta.
  3. Ibridazione con l'OL filamento complementareigonucleotide
    1. Trasferire la sonda radiomarcata (86 mL) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 200 ng del oligonucleotide inversa e 1x di tampone ricottura (Tabella 2). Riscaldare 5 min a 95 ° C e lasciare per una notte a temperatura ambiente per il raffreddamento.
    2. Preparare non radioattivi oligonucleotidi a doppio filamento con l'aggiunta di 50 ng di senza etichetta in avanti e oligonucleotidi e 1x di tampone ricottura invertire in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Portare al volume di 100 ml con acqua priva di nucleasi. Il calore e mantenerlo a temperatura ambiente come descritto al punto 8.3.1.

9. Preparazione di un gel poliacrilammide non denaturante per EMSA

  1. Preparare un gel nativo 4% (10 x 12 cm) con 1,5 mm di spazio-pettine (vedi Tabella 2 per la composizione di gel). Pulire tutte le lastre di vetro con acqua distillata.
    Nota: E 'fondamentale che le piastre di essere completamente privo di detergente ionico, come SDS.
  2. immediatamente pnostra soluzione acrilammide tra le piastre e permettere polimerizzazione procedere (circa 30 min).
  3. Montare l'apparato di elettroforesi e riempire il serbatoio con 0.5x TBE. Pre-eseguire il gel per 30 minuti a 1 ora a 150 V prima di caricamento del campione.

10. DNA reazione di legame

  1. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 10 mg di estratto nucleare (passo 4.3) 1x Gel Spostamento Binding Buffer (Tabella 2) e portare il volume finale di 10 ml con acqua priva di nucleasi. Come controllo, predisporre un tubo senza estratto nucleare. Per la reazione della concorrenza, aggiungere 1 ml di non-specifica o specifiche oligonucleotide a doppio filamento a freddo (punto 8.3.2).
  2. Aggiungere 1 ml di sonda radioattiva dal punto 8.3.1 a ogni reazione. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungere 1 ml di tampone di caricamento 10x gel per reazione e caricare ogni campione sul gel preparata nella sezione 9.
  3. Eseguire il gel per 1 1/2 a 2 ore a 150 V. Dopo la migrazione, avvolgere il gel e il vetro in un involucro di plastica e la posizione in una cassetta esposizione al di sotto uno schermo al fosforo. Lasciare cassette a 4 ° C per 24 ore.
  4. Rimuovere lo schermo dalla cassetta di esposizione e inserire nel dispositivo di imaging di fosforo per la scansione.

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Representative Results

placente freschi dal gravidanze termine sono stati usati per isolare citotrofoblasti villi primari umani per condurre la serie di esperimenti presentati nella sezione Protocollo. Dopo l'isolamento, abbiamo prima analizzato la purezza cytotrophoblasts attraverso l'uso del marcatore citocheratina-7 (Figura 1). Preparazioni di cellule sono state quindi colorati con un anticorpo monoclonale anti-citocheratina-7 anticorpi. La figura 1 rappresenta i risultati di un tipico esperimento seguente purificazione citotrofoblasti villi primaria, analizzato da citometria di flusso standard. Dopo la fase di gradiente di densità, cellule> 97% (in questo caso, il 99%) sono colorate positivamente per citocheratina-7 in esperimenti standard dimostrando così un elevato grado di efficienza nella purificazione di questo tipo di cellule.

Dopo il loro isolamento, citotrofoblasti primari umani possono essere utilizzati direttamente per Transfection. Due diversi protocolli sono stati valutati, cioè, microperforazione e trasfezione base lipidica. Entrambi i protocolli sono stati testati con siRNA specifico sincitina-2 mRNA e confrontati con un siRNA criptato (controllo negativo). efficienza di trasfezione è stata prossima valutata mediante analisi Western Blot. I risultati hanno confermato che sincitina-2 era significativamente tacere negli estratti citotrofoblasto derivato upon microperforazione (Figura 2). D'altra parte, non silenziamento significativo è stato osservato quando siRNA state trasfettate dal reattivo trasfezione base lipidica.

Abbiamo anche condotto esperimenti EMSA su citotrofoblasti appena isolati. Una sonda radiomarcata che ha avuto origine da una regione del promotore sincitina-2 è stato sintetizzato. La sonda sintetizzato (chiamato WT; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') è stato precedentemente dimostrato di legare fattori di trascrizione CREB-correlate 7. In presenza di estr nucleare atti da 24 e 48 hr coltivate cytotrophoblasts villi, la sonda sincitina-2-promotore-derivato mostrato la presenza di due complessi DNA-proteina. Aggiunta di 100x fredda oligonucleotide WT competizione per la formazione del complesso, mentre nessun concorso simile con un eccesso di un oligonucleotide non correlato fredda (topo cresta neurale Enhancer 2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') è stato osservato, confermando la specificità di entrambi i segnali ( Figura 3).

Figura 1
Figura 1. Valutazione della purezza dei villi citotrofoblasti primarie attraverso citometria a flusso. Appena isolato preparazioni di citotrofoblasti villi sono stati permeabilizzate e poi etichettati con l'anticorpo controllo isotipico (linea rossa) o anticorpo monoclonale specifico per citocheratina-7 (linea nera). Le cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Confronto di siRNA efficienze di trasfezione tra transfezione lipidi-based e microperforazione. Appena isolati citotrofoblasti villi sono state trasfettate con 300 ng di sincitina-2-specifici siRNA contro un siRNA di controllo codificato utilizzando il reagente a base lipidica o microperforazione. (A) analisi Western Blot sono stati effettuati su estratti cellulari da ogni condizione di trasfezione usando anti-sincitina-2 e gli anticorpi anti-GAPDH. (B) i livelli sincitina-2 proteine da analisi Western Blot sono stati quantificati in termini di intensità di banda seguenti normalizzazione con corrispondenti segnali GAPDH (barre di errore sono definiti come SD, *** p <0.001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. complessi DNA-proteina identificate attraverso l'analisi EMSA. Estratti nucleari da citotrofoblasti villi primari in coltura per 24 o 48 ore sono stati incubati con una sonda WT corrispondente ad una regione del promotore di sincitina-2, con o senza eccesso (100x) di specifica o non specifica oligonucleotidi freddo. complessi DNA-proteina sono stati separati su migrazione su un gel nativo. segnali specifici e sonde libere sono indicate sul lato destro del gel. Sonda WT incubate in assenza di estratto nucleare è stato anche utilizzato come controllo negativo. CT NE = estratti nucleari citotrofoblasto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

% Di Percoll finale Volume di Percoll (90%) (ml) Volume di HBSS (ml)
70 2.33 0.67
65 2.17 0.83
60 2.00 1.00
55 1.83 1.17
50 1.67 1.33
45 1,50 1,50
40 1.33 1.67
35 1.17 1.83
30 1.00 2.00
25 0.83 2.17
20 0.67 2.33
15 0.50 2,50
10 0,33 2.67
5 0,17 2.83

Tabella 1. 5% -70% di pendenza impostazione di silice polivinilpirrolidone rivestite.

Buffer Composizione Commenti / Descrizione
PBS 1x 0.9 mM CaCl 2, 2.7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM MgCl 2, 136,9 mM NaCl e 0,8 mM Na 2 HPO 4
RIPA buffer 150 mM NaCl, 1,0% NP-40 allo 0,1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS (dodecil solfato di sodio), 50 mM Tris-HCl pH 8.0
Sample Buffer Laemmli 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glicerolo, 0,004% blu di bromofenolo, 0,125 M Tris-HCl, pH 6.8
10x tampone di corsa 25 mm di base Tris, 190 mm glicina, 0,1% SDS
buffer di trasferimento 10x 25 mm di base Tris, 192 mm Glycine
tampone TBST 1x 10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0,05% Tween 20 a pH 7 Mescolare bene e filtrare. La mancata filtro può portare a "macchia" della membrana.
tampone di bloccaggio 5% di latte o di BSA (albumina sierica bovina) aggiunti TBST 1x tampone
TE Buffer 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA
buffer di ricottura 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl 2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT
5x Gel Spostamento Binding Buffer 20% glycerol, 5 mM MgCl 2, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 0,25 mg / ml poly (dI-dC).
tampone di caricamento 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2% blu di bromofenolo e il 40% glicerolo
TBE 5x Sciogliere 54 g di Tris base e 27,5 g di acido borico in 1 L di acqua deionizzata, che comprende 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8
4% gel nativo tampone TBE 5x 6,0 ml
29: 1 acrilamide / bisacrilammide (30% w / v) 10 ml
40% di acrilammide (w / v) 0,75 ml
100% glicerolo 1,5 ml
Acqua distillata 41.5 ml
Ammonio persolfato 25% 250 ml
TEMED 75 ml
4% Stacre Gel (6 ml) per SDS-PAGE DDH 2 O 4.1 ml
30% acrilamide 1,0 ml
1.0 M Tris 0,75 ml
10% SDS 60 ml
10% APS 60 ml
TEMED 6 ml
12% separazione Gel (10 ml) per SDS-PAGE DDH 2 O 3,3 ml
30% acrilamide 4,0 ml
1.5 M Tris 2,5 ml
10% SDS 100 pl
10% APS 100pl
TEMED 4 pl

Tabella 2. Composizione di buffer.

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Discussion

Gli studi sulla funzione della placenta umana e lo sviluppo sono state notevolmente migliorate dai protocolli volti ad ottimizzare l'isolamento di varie popolazioni di cellule placentari. Uno dei migliori popolazione di cellule placentari studiata rimane il citotrofoblasti villi, il cui studio ha notevolmente beneficiato di protocolli ottimizzati che permettono l'isolamento efficiente e affidabile. Questo ha permesso inoltre una serie di esperimenti, come gli studi di trasfezione e promotore. Utilizzando un protocollo precedentemente descritto 3, le popolazioni pure di citotrofoblasti villi primarie possono essere ottenuti. CK-7 è una proteina filamenti intermedi, che si esprime in cytotrophoblasts. Gli anticorpi monoclonali contro questa proteina vengono utilizzati per determinare la purezza di questa popolazione trofoblasto dopo il loro isolamento dalla placenta 10. I preparativi sono definiti per essere puro quando il 96% delle cellule sono positive per CK-7. Le celle possono essere successivamente utilizzati direttamente per la trasfezione. protocolli di trasfezioneche coinvolgono approcci a base di lipidi sono ampiamente utilizzati per il trasferimento di acidi nucleici nelle cellule primarie 11,12. Tuttavia, la tossicità di formulazione lipidica in alcune cellule diventa uno svantaggio. Microperforazione è una tecnologia di elettroporazione utilizzando un puntale come spazio elettroporazione, che genera calore minima, la dissoluzione di ioni metallici, la variazione del pH e la formazione di ossido; ognuno dei quali può essere deleterio per le cellule. Sulla base dei dati presentati nel presente documento, microperforazione rappresenta un approccio più efficiente per la consegna di siRNA rispetto al protocollo di trasfezione a base lipidica, come giudicato da analisi Western Blot. Usando un approccio EMSA, una sonda progettata contro una regione selezionata del promotore sincitina-2 che è noto per legarsi fattori importanti per la sua attività 7 è stato testato. La sonda è stata incubata con estratto nucleare da citotrofoblasti isolati. Come illustrato nella figura 3, i segnali specifici sono stati ottenuti.

I diversi protocolli descritti nel presente documento have stato ottimizzato negli ultimi anni. Tuttavia, tutti si basano sulla preparazione citotrofoblasto alta qualità, che dipendono da un certo numero di passaggi critici. In primo luogo, dopo la nascita, la placenta devono essere tenuti in una soluzione tampone e le cellule devono essere isolati da loro non più di 5 ore dopo essere stato immerso nella soluzione. trattamenti tripsina e DNasi sono anche di grande importanza e dovrebbero essere intraprese con attenzione per massimizzare la qualità della preparazione citotrofoblasto. Estensivo lavaggio dei villi placenta e riduzione del tempo necessario per il loro isolamento sono entrambi ulteriori miglioramenti, che possono fortemente aggiornare l'efficienza dell'isolamento numero di cellule. La resa di questo protocollo dipende più avanti centrifugazione ottimale durante la fase di gradiente di densità, che devono essere attentamente monitorati. La mancata bilanciare correttamente i tubi porterà anche ad una distorsione della sfumatura e ridurre fortemente il numero di cellule.

Il protocollo di trasfezione descrivered qui è stato testato per diversi anni. Anche se le condizioni necessarie per la microperforazione sono generalmente semplici, ottimizzazione dei trasfezione per le varie celle primarie sono comunque necessari. Ciò comporta anche l'ottimizzazione della quantità di acido nucleico trasfettate (siRNA o DNA plasmide). Così, per il protocollo qui descritto, è consigliabile l'ottimizzazione di varie concentrazioni siRNA per identificare un siRNA reprimere efficiente. L'aggiunta di un volume di sospensione adeguato al pellet cellulare prima microperforazione e la sospensione completa delle cellule sono ulteriori fattori che influenzano l'efficienza di trasfezione.

esperimenti EMSA hanno reso necessario l'ottimizzazione. Data l'eterogeneità associata con i donatori placenta e le diverse efficienze di isolamento citotrofoblasto e purezze, esperimenti EMSA devono essere ripetute fino a 5 volte per confermare i risultati. Inoltre, con un numero elevato di cellule è importante assicurare prote sufficientiin livelli in preparati estratto nucleare e la conseguente individuazione dei complessi di proteine ​​/ DNA. Inoltre, sonde oligonucleotidiche altamente radioattive devono essere preparati, e deve essere preparato fresco da ATP radioattivo recentemente acquistato.

Una serie di limitazioni va sottolineata nel protocollo presentato. Ha bisogno prima di essere sottolineato che citometria a flusso analisi non in grado di valutare la potenziale presenza di frammenti sinciziotrofoblasto in preparazioni cellulari. Altri protocolli sono stati proposti per risolvere questo problema, come ad esempio l'ordinamento mediante citometria a flusso o l'uso di sfere magnetiche anticorpi-bound 13,14. Va ricordato però che questi frammenti normalmente non aderiscono ai pozzetti di coltura cellulare e sono spesso rimossi dopo la fase di lavaggio delle cellule. Un'altra limitazione al protocollo presentato è che citotrofoblasti villi primarie hanno un tempo di sopravvivenza molto limitato nelle cellule in coltura. Quindi, indipendentemente dal metodo scelto, trasfezione stabile di vilcitotrofoblasti Lous rimarrà irraggiungibile. EMSA analisi, come descritto in questo protocollo, hanno anche alcune limitazioni. Anche se la specificità dei segnali può essere facilmente valutata mediante esperimenti di competizione con oligonucleotidi senza etichetta in eccesso, i fattori legati possono essere identificati solo con anticorpi contro specifici fattori di trascrizione conseguente segnali supershifted. Esperimenti EMSA, inoltre, sono ancora limitati in quanto gli studi in vitro le interazioni proteina-DNA. Esperimenti con le impostazioni più rappresentativi, come il test di chip, e più recente, nei protocolli in vivo sono necessari per confermare ulteriormente il risultato EMSA.

I protocolli descritti per l'isolamento citotrofoblasto e trasfezione hanno importanti applicazioni per gli studi in cui è necessaria silenziamento transitoria o sovraespressione di geni specifici per comprendere il loro ruolo nella funzione, la proliferazione o la differenziazione di uno specifico tipo di cellula trofoblasto. Inoltre, su trasfezione, tversioni agged di proteine ​​espresse saranno adatto ad inseguimento intracellulare ed analisi mediante tecniche standard, come la microscopia confocale e citometria a flusso. Il protocollo EMSA può essere utilizzato per studiare intricati dettagli relativi alla regolazione promotore e fattori di trascrizione implicati. Inoltre, questo approccio sperimentale permetterà ai ricercatori di identificare i fattori coinvolti nello sviluppo di alcune malattie legate alla carenza di placentazione e l'alterata regolazione di geni espressi in citotrofoblasti villi.

In conclusione, citotrofoblasti primari umani possono essere facilmente isolate da placenta e sono suscettibili di protocolli standard, come siRNA transfection e l'EMSA. Anche se diverse procedure di trasfezione, come lipofezione 15 e 16 nucleofection sono disponibili, microperforazione sembra un metodo molto efficace per siRNA transfection di isolati citotrofoblasti villi, offrendo un approccio con limitata cellule death e relativamente a basso costo. Nel contesto di citotrofoblasti villi, questo approccio dovrebbe consentire il silenziamento di diversi geni e la valutazione della loro implicazione in varie funzioni o le caratteristiche del tipo di cellula. Inoltre, trasfezione di vettori di espressione è anche fattibile utilizzando questo protocollo e produrrà i dati complementari all'approccio siRNA-based. Per quanto riguarda EMSA, questa tecnica fornisce un metodo più rapido e più semplice di valutare complessi proteina-DNA rispetto ad approcci alternativi, come DNasi I footprinting, dosaggio interferenze metilazione, cromatina immunoprecipitazione e cromatina analisi conformazione. Quindi, questa tecnica resta prezioso nel promotore standard di analisi e sperimentazione di altre regioni del DNA / soppressori contenenti enhancer. La nostra dimostrazione del suo utilizzo affidabile per citotrofoblasti villi è importante, in quanto aggiunge informazioni sulla regolazione dei geni, con potenziali implicazioni a livello funzionale. nonostante la lorotempo limitato nella cultura, citotrofoblasti villi primari sono adatti per gli studi standard e dovrebbe essere adattabile a più recente, nonché i metodi informativi.

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Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Scienze e della Ricerca Ingegneria Consiglio Nazionale del Canada (NSERC) (# 298.527) (BB). CT è stato sostenuto da una borsa di studio FARE istituzionale. AV è stato sostenuto da un Ph.D. NSERC Graham Bell Borsa di studio. BB ha tenuto un Canada Research Chair in Retrovirology umana (Livello 2). Grazie a Beatrix Beisner per un aiuto nella revisione del testo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS without  Ca2+, Mg2+  Sigma #H2387
HBSS (10x) Sigma #14060-057
DMEM High Glucose without Hepes Gibco #12100-061
Hepes (1 M) Gibco #15630-080
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) Gibco #15640-055
Amphotericin B  Sigma #A2411
CaCl2 Sigma #C4901
MgSO4.7H2 Sigma #M
Fetal bovine serum Gibco #16170-078 
Percoll  Sigma #P-1644 For density gradient
Syncytin-2 siRNA Ambion Life technologies #AM16708
Scrambled siRNA Qiagen # SI03650318
DNase I Sigma-Aldrich #D5025
Trypsine, type I  Sigma #T8003
DharmaFECT Lipotransfection  reagents  GEhealthcare # T-2001-01
Trypsin/EDTA Life technologies #25300-062
Protease Inhibitor Cocktail Roche Diagnostic #11873580001
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225
BSA Sigma #A7906
TWEEN 20 Sigma #P9416 
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody  Cell Signaling #7074
BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) Roche Diagnostic #11500708001
DPBS  Life technologies #14287-080
T4 Polynucleotide Kinase NEB #M0201S
ATP, [γ-32P] Perkin Elmer #BLU002A100UC
Acrylmide Sigma  #A9099
TEMED Life technologies #17919
Ammonium Persulfate Sigma  #A3678
Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated Millipore CBL194F Dilution 1:200
FcR blocking reagent  Miltenyi Biotec 130- 059-901 Dilution 1:10
Flow Cytometer BD Acuri system Becton Dickinson
Microporator MP-100 apparatus  Digital Bio
Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) Life technologies MPK10096
PVDF membrane  Millipore IPVH00010  Activate with methanol
Anti-human GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology sc-137179 1:500
HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody Cell Signalling #7074 1:10,000
HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody Cell Signalling #7076  1:10,000
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent Thermo Scientific #78833
G-25 column  GE Healthcare #27-5325-01
Chemiluminsescence and fluorescence imaging device Montréal Biotech Fusion FX5
4% native gel Home made
PBS Home made 1x
Personal Molecular Imager (PMI) System BioRad

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References

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