متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

توفر على microfluidics الحبرية منبرا للعلم الأحياء إنتاجية عالية من compartmentalizing التجارب في عدد كبير من قطرات مائية معلقة في الناقل للنفط 1. وقد استخدمت قطرات لتطبيقات متنوعة مثل تحليل خلية واحدة البلمرة الرقمي سلسلة من ردود الفعل (PCR) وانزيم تطور 4. المقايسات الفلورسنت هي الوضع العادي من الكشف عن على microfluidics الحبرية، وإشاراتها مشرقة وزمن الاستجابة سريعة متوافقة مع اكتشاف كميات قطرات نانولتر الفرعي في معدلات كيلوهيرتز. تتطلب العديد من التطبيقات الكشف عن مضان لمدة سنتين على الأقل الألوان في وقت واحد. على سبيل المثال، لدينا مختبر يؤدي عادة PCR تنشيط قطرة فرز التجارب التي تستخدم القناة كشف واحد لنتيجة لفحص، ويستخدم صبغة خلفية الثانوي لجعل-فحص سلبي قطرة قابل للعد 5.

محطات الكشف نموذجية لعلى microfluidics الحبرية هي باالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على المجاهر epifluorescence، وتتطلب معقدة مخططات التلاعب الخفيفة لإدخال ضوء الإثارة من الليزر مساحة حرة داخل المجهر لأن تركز على العينة. بعد خروجه مضان من قطرات، يتم تصفية ضوء fluoresced المنبعثة بحيث تستخدم كل قناة الكشف عن أنبوب مضخم واحد (PMT) تركزت على نطاق الطول الموجي. توفر أنظمة الكشف البصري Epifluorescence أساس المجهر عائقا أمام دخول السوق بسبب نفقتهم والتعقيد، وتتطلب صيانة. توفر الألياف البصرية وسيلة لبناء نظام كشف مبسط وقوية، منذ الألياف يمكن إدراجها يدويا في أجهزة ميكروفلويديك، وإزالة الحاجة لالقائم على مرآة ضوء التوجيه، والسماح للمسارات الضوء على أن ربطه باستخدام موصلات الألياف البصرية.

في هذه الورقة، ونحن تصف الجمعية والمصادقة على مخطط صغير وحدات لأداء كشف مضان متعدد الألوان من خلال الاستفادة من مجموعة من الألياف البصرية لدا مكشاف ضوئي واحد (6). تقترن الألياف البصرية ليزر الفردية وإدراج طبيعية لقناة تدفق شكل حرف L في إزاحة المكانية العادية. وتوجه والألياف جمع مضان موازية للمناطق الإثارة ويرتبط إلى PMT واحد. لأن قطرات يمر عبر أشعة الليزر في أوقات مختلفة، والبيانات التي سجلتها PMT يظهر الزمنية تعويض التي تسمح للمستخدم للتمييز بين مضان المنبعثة بعد هو متحمس الحبرية كل شعاع الليزر واضح. هذا التحول الزمني يلغي الحاجة لفصل الضوء المنبعث من هذه الفرق منفصلة باستخدام سلسلة من المرايا مزدوج اللون والمرشحات ممر الموجة. للتحقق من صحة فعالية للكشف، ونحن quantitate مضان في السكان قطرة التغليف الأصباغ من لون مختلف والتركيز. تم دراسة حساسية نظام واحد كشف اللون فلوريسئين، ويظهر القدرة على الكشف عن قطرات مع تركيزات الى 0.1 نانومتر، حساسية الظهور 200Xovement بالمقارنة مع النهج الألياف مقرها الأخيرة التي أعلن عنها في الأدب 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU8 تصنيع ماستر

  1. تصميم الهياكل الموائع الدقيقة لمدة ثلاثة طبقة تلفيق باستخدام برامج التصميم ولها التصميمات المطبوعة من قبل بائع على الفيلم لوحة الدوائر مع 10 ميكرون القرار. وترد تفاصيل تصميم الجهاز في إشارة تعلق 6 وترد في هندستها القناة في الشكل 1. وينبغي أن تشمل طبقات علامات المحاذاة للمساعدة في رصف الميزات من كل طبقة تلفيق 8.
  2. وضع 3 بوصة قطرها رقاقة السيليكون تنظيفها مسبقا على المغطي تدور وتشغيل فراغ ليضعوا لها تشوك. تطبيق 1 مل من SU8-3050 في وسط رقاقة وتدور لمدة 20 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم 30 ثانية في 1750 دورة في الدقيقة، وتوفير سماكة طبقة من 80 ميكرون.
  3. إزالة الرقاقة وتخبز على 135 درجة مئوية موقد لمدة 30 دقيقة. تسمح الرقاقة لتبريد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  4. فضح الرقاقة المغلفة للشارع قناع طبقة 1 تحت موازى 190 مترW، 365 نانومتر الصمام لمدة 3 دقائق. بعد التعرض، ووضع رقاقة على 135 درجة مئوية موقد لمدة 1 دقيقة، ثم بارد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  5. وضع رقاقة على المغطي تدور وتشغيل فراغ ليضعوا لها تشوك. تطبيق 1 مل من SU8-3050 في وسط رقاقة وتدور لمدة 20 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم 30 ثانية في 5000 دورة في الدقيقة، مما أدى إلى الطبقة التي توفر سمك إضافي من 40 ميكرون.
  6. إزالة الرقاقة وتخبز على 135 درجة مئوية موقد لمدة 30 دقيقة، ثم بارد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  7. محاذاة قناع طبقة الثانية 2 على هندسة نمط 1.3 وفضح الرقاقة المغلفة لموازى 190 ميغاواط، 365 نانومتر الصمام لمدة 3 دقائق. بعد التعرض، ووضع على 135 درجة مئوية موقد لمدة 4 دقائق و 30 ثانية، ثم بارد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  8. وضع رقاقة على المغطي تدور وتشغيل فراغ ليضعوا لها تشوك. تطبيق 1 مل من SU8-3050 في وسط رقاقة وتدور لمدة 20 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم 30ثانية في 1000 دورة في الدقيقة، مما أدى إلى الطبقة التي توفر سمك إضافي من 100 ميكرون.
  9. إزالة الرقاقة وتخبز على 135 درجة مئوية موقد لمدة 30 دقيقة، ثم بارد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  10. محاذاة قناع طبقة 3 الثالثة على هندسة نمط 1.3 وفضح الرقاقة المغلفة لموازى 190 ميغاواط، 365 نانومتر الصمام لمدة 3 دقائق. بعد التعرض، ووضع على 135 درجة مئوية موقد لمدة 9 دقائق، ثم تبرد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  11. تطوير الأقنعة عن طريق غمر في حمام أثار من البروبيلين غليكول monomethyl الأثير خلات لمدة 30 دقيقة. غسل الرقاقة في الأيسوبروبانول وتخبز على 135 درجة مئوية موقد لمدة 1 دقيقة. وضع سيد وضعت في صحن 100 ملم بيتري لثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) صب.

2. PDMS تصنيع الأجهزة

  1. إعداد 10: 1 PDMS من خلال الجمع بين 50 غراما من قاعدة السيليكون مع 5 غرام من وكيل علاج في كوب من البلاستيك. خلط المحتويات مع أداة دوارة مزودة عصا ضجة. درجةكما الخليط داخل المجفف لمدة 30 دقيقة، أو حتى يتم إزالة جميع فقاعات الهواء.
  2. صب PDMS لإعطاء سماكة 3 ملم على الماجستير والمكان مرة أخرى في مجفف لمزيد من التفريغ. حالما تتم إزالة جميع فقاعات، خبز الجهاز على 80 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة.
  3. قطع الجهاز من العفن باستخدام مشرط ومكان على سطح نظيف مع الجانب منقوشة صعودا ولكمة مداخل ومنافذ الموائعية مع خزعة لكمة 0.75 مم. يجب أن تقطع الجهاز بحيث 120 ميكرون و 220 ميكرون هندستها طويل القامة يمكن الوصول إليها من جانب الجهاز.
  4. البلازما علاج الجهاز، مع الجانب ميزة تصل، جنبا إلى جنب مع ما قبل تنظيفها 2 بوصة بنسبة 3 بوصة شريحة زجاجية في 1 مللي بار O 2 البلازما لمدة 20 ثانية في نظافة البلازما 300 واط. السندات الجهاز PDMS عن طريق وضع الجانب منقوشة من الجهاز PDMS على الجانب المعالجة البلازما من شريحة زجاجية. وضع الجهاز في C الفرن 80 درجة وتخبز الجهاز تجميعها لمدة 40 دقيقة.
  5. جعل قنواتمسعور باستخدام حقنة لمسح الجهاز مع المفلورة سائل المعالجة السطحية. على الفور خبز الجهاز على 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتتبخر المذيب.

3. إعداد مكونات البصرية

  1. تحضير الألياف الإثارة ليزر عن طريق إزالة العزل من 5 ملم الأخير من 105 ميكرون الأساسية، 125 ميكرون الكسوة، NA = 0.22 الألياف البصرية.
  2. إعداد 2 الثانية ليزر ملونة الألياف الإثارة بتكرار 3.1 لألياف متطابقة 2 الثانية.
  3. تحضير الألياف لجمع إشارة مضان بتكرار 3.1 ل200 ميكرون الأساسية، 225 ميكرون الكسوة، NA = 0.39 الألياف البصرية.
  4. تفقد النصائح من كل ألياف - إذا النصائح لا تنتهي في سطح مستو، وإعادة يلتصق-نهايات مع الكاتب الألياف.
  5. إرفاق مقرنة الألياف الليزر إلى 50 ميغاواط، 405 نانومتر ليزر ونعلق واحدة من 105 ميكرون الألياف الأساسية لليزر. توجيه نهاية جردت على استشعار قوة الليزرمتر، واستخدام التعديلات غرامة مقرنة الليزر لتحقيق أقصى قدر من قوة الليزر.
  6. كرر 3.5 لنانومتر الليزر 50 ميغاواط، 473.
  7. شن 446/510/581/703 نانومتر مرشحات ممر الموجة رباعية على PMT باستخدام أنابيب عدسة لمنع ضوء الليزر ونقل مضان المنبعثة. إرفاق مقرنة الألياف بحيث ينتقل هذا الضوء من خلال مرشحات قبل أن تصل إلى PMT.
  8. إرفاق الألياف من 3.3 إلى وحدة مجمعة في 3.7.

4. الجيل مستحلب مختلط غير متصل

  1. الحصول على التركيز تدفق الجهاز على microfluidics dropmaker مع 60 ميكرون × 60 ميكرون فتحة.
  2. ملء حقنة 1 مل مع HFE 7500 الزيوت مع 2٪ الفلورية الأيونية 9.
  3. ملء سلسلة من 1 مل المحاقن مع المجموعات التالية من فلوريسئين (FITC) وديكستران مترافق الأصباغ الزرقاء (CB) في برنامج تلفزيوني: 1 نانومتر FITC / 10 نانومتر CB، 10 نانومتر FITC / 10 نانومتر CB، 1 نانومتر FITC / 100 نانومتر CB، و 10 نانومتر FITC / 100 نانومتر CB.
  4. تركيب جهاز dropmaker على مرحلة من مراحل ميكرو مقلوبمواجهة ومائي والنفط الحقن على مضخات الحقنة. زوجان المحاقن إلى الأجهزة التي تستخدم PE-2 الأنابيب.
  5. تشغيل مضخات حقنة في 500 ميكرولتر / ساعة للنفط و 250 ميكرولتر / ساعة لالمحاليل المائية، وخلق مزيج من 80 ميكرون قطرات تحتوي على حلول من 4.3. لكل نوع من عينة المائية، واستخدام جهاز dropmaker جديدة للقضاء على انتقال التلوث. جمع ~ 200 ميكرولتر من مستحلب من كل مزيج صبغة في حقنة فارغة.
  6. بعد أن تم جمع قطرات أنواع 4 في حقنة مجموعة واحدة، ومزيج مستحلب من قبل مرارا وتكرارا الدورية للحقنة.
  7. كرر الخطوات من 4،2-4،6 مع المحاليل المائية التي تحتوي على 0.1، 1، 10، و 100 نانومتر FITC في برنامج تلفزيوني.

5. الألياف البصرية الإدراج

  1. وضع رقاقة ميكروفلويديك ملفقة في الخطوة 2 على مرحلة مجهر مقلوب إلى جانب وجود كاميرا رقمية قادرة على <100 μsec سرعات مصراع.
  2. العمل بعناية من جانب، INSERT الألياف بالإضافة إلى نانومتر ليزر 473 إلى أبعد المنبع قناة ميكرون 120، مع الحرص على عدم ثقب من خلال لقناة التدفق الرئيسية.
  3. إدراج الألياف بالإضافة إلى نانومتر ليزر 405 إلى ابعد المصب 120 قناة ميكرون الجانب عالية، وتوفير التباعد الألياف من 300 ميكرون.
  4. تضاف الألياف إلى جانب PMT-في قناة طويل القامة 220 ميكرون العادية لاثنين من الألياف الإثارة الليزر.

6. كشف الإسفار من المستحلبات المختلطة

  1. جبل حقنة 5 مل مملوءة HFE 7500 مع 2٪ الفلورية الأيونية إلى مدخل النفط فاصل من جهاز الكشف مع PE-2 الأنابيب.
  2. جبل حقنة تحتوي على المختلط FITC / CB مستحلب على ضخ حقنة موجه عموديا والزوجان إلى مدخل قطرة إعادة حقن الجهاز باستخدام PE-2 الأنابيب. توصيل طول أنابيب PE-2 من مخرج الجهاز إلى حاوية النفايات.
  3. رئيس الجهاز عن طريق تشغيل كل من المضخات في 1000 ميكرولتر / ساعة حتى على حد سواءوينظر النفط وقطرات إلى أن الجمع بين بانتظام في الجهاز والتي تتدفق المصب.
  4. ضبط معدلات التدفق بحيث النفط هل يعمل على 6000 ميكرولتر / ساعة وقطرات في 100 ميكرولتر / ساعة، وتوفير تباعد كبير بين قطرات السفر من خلال المنطقة الكشف.
  5. بدوره على الليزر، بدء تشغيل البرنامج الحصول على البيانات، وضبط الربح PMT في تقديم إشارات التي هي أكثر من 100X الطابق ضجيج خط الأساس. ضبط قوة الليزر حتى يتسنى لجميع من قمم صدرة تكون مرئية بشكل واضح على واحدة، timetrace تحجيم خطيا.
  6. الحصول على 60 ثانية من timetrace PMT الجهد في لا يقل عن 20 كيلو هرتز. استيراد البيانات إلى برنامج الحوسبة مثل ماتلاب وقياس ارتفاعات قمم الحلل سجلت باستخدام البرنامج النصي برنامج الحوسبة حسب الطلب.
    ملاحظة: يتم توفير هذه كمعلومات إضافية.
  7. كرر الخطوات من 6،2-6،7 باستخدام FITC فقط مستحلب مختلطة تم إنشاؤها في 4.7، مع نانومتر ليزر 405 إيقاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تصنيع جهاز PDMS التي تسمح لإدخال الألياف البصرية يتطلب إجراء ضوئيه متعددة الخطوات لإنشاء قنوات متفاوتة الارتفاع (الشكل 1). أولا، يتم نسج 80 ميكرون طبقة طويل القامة من SU-8 على رقاقة السيليكون ومنقوشة باستخدام قناع لخلق التعامل مع هندسة السوائل. المقبل، ونسج على 40 ميكرون طبقة إضافية من SU-8 على الرقاقة، ومنقوشة باستخدام قناع الثاني لخلق الميزات التي ستشكل 120 ميكرون ليزر طويل القامة قنوات الألياف الإدراج. وأخيرا، ونسج 100 ميكرون أكثر SU-8 على الرقاقة، ونقوش لإعطاء 220 ميكرون كشف طويل القامة قنوات الألياف الإدراج. تم تطوير سيد وتستخدم لالعفن جهاز PDMS، والذي بدوره المستعبدين من شريحة زجاجية. يحتوي على تلفيق النهائي 80 ميكرومتر الهندسة تدفق طويل القامة، والوصول إليها من خلال ثقبا في الجزء العلوي من الجهاز، و 120 ميكرومتر و 220 ميكرومتر قنوات الألياف البصرية طويل القامة الوصول إليها من خلال الجانب منجهاز.

ويرد هندسة الجهاز المستخدم للكشف في الشكل 2، ويتم إعادة حقن ولدت خارجيا 80 ميكرون المستحلبات بمنفذ قطرة إعادة حقن ومتباعدة من النفط فاصل قبل أن تصب في قناة الكشف عن شكل L. يتم إدراج اثنين من الألياف بالإضافة إلى الليزر توفر 120 ميكرون قنوات طويل القامة الإثارة في المواقع المكانية منفصلة في قناة التدفق. لأن الألياف المتعدد إدراجها في هذه القنوات ويبلغ قطرها الخارجي 125 ميكرون ويبلغ قطرها الأساسية 105 ميكرون، مضاءة المقطع العرضي كامل من قناة تدفق ضوء الليزر. في الجهاز لدينا قناة تدفق كشف يجعل منعطفا 90 درجة المفاجئ بعد مشاركة المنطقة الإثارة الليزر لإنشاء وصول البصرية وثيق للألياف OD 225 ميكرون تستخدم لكشف مضان المنبعثة. يتم استخدام الألياف أكبر بسبب الفتحة العالية العددية (NA = 0.39)، والذي يشبه إلى الهدف المجهر القياسية.

قطرات تتدفق من خلال قناة الكشف عن لقاءات مناطق الإثارة منفصلة أمام كل من الألياف البصرية إلى جانب ليزر (الشكل 3A). وPMT واحد بالإضافة إلى السجلات الألياف كشف تنبعث مضان مع التحول الزمني الخرائط إلى مصدر الإثارة. لقطرات تحتوي على الأصباغ التي تثير في 473 نانومتر (المنطقة "1" في الشكل 3A) وفي 405 نانومتر (المنطقة "2" في الشكل 3B)، إشارة PMT الناتجة تحتوي على صدرة إشارة مع فصل الذروة الذي يرتبط مع الوقت الذي يستغرقه قطرات للانتقال من منطقة الإثارة واحدة إلى أخرى. بواسطة زمنيا ترميز البيانات الطيفية في هذه الطريقة، يتم التخلص من الحاجة إلى مزيد من تصفية الخفيفة وهذه الفرق منفصلة لكل لون fluorophore ويبين الشكل 3B الحلل إشارة للقطار من 4 قطرات مع مجموعات صبغ مختلفة. الذروة الأولى في تتوافق مزدوجة الصورة لمضان المنبعثة بعد الإثارة التي كتبها ليزر 473 نانومتر في المنطقة "1" والذروة الثانية يتوافق مع مضان المنبعثة بعد الإثارة التي كتبها ليزر 405 نانومتر في المنطقة "2".

تم اختبار فعالية نظام الكشف عن طريق الكشف عن مستحلب مختلطة من قطرات تحتوي على الأصباغ التي تثير في 405 نانومتر (-ديكستران مترافق الأزرق، CB) وفي 473 نانومتر (فلوريسئين، FITC). وتدفقت قطرات من خلال مناطق كشف على ما يقرب من 50 هرتز و تم تسجيل البيانات لمدة 60 ثانية، ثم بعد معالجتها مع برنامج نصي برنامج الحوسبة. يتم رسم البيانات في الشكل (4)، ويظهر فصل واضح بين أنواع قطرات أربع حقن إعادة. لأنه لا يفرق نظام الكشف بين ألوان مختلفة من الضوء المنبعث، يوصف كل قطرة من الحد الأقصى الكلي مضان لها بعد أن متحمس في المنطقة "1" (قمة 1) وفي المنطقة 2 (الذروة 2).

ف together.within الصفحات = "1"> النطاق الديناميكي ويتم التحقيق حساسية مطلقة للكشف عن طريق إيقاف نانومتر الليزر 405 وقياس مضان من مستحلب تحتوي على قطرات-فلوريسئين فقط (الشكل 5). تظهر البيانات القدرة على الكشف عن تركيز الصبغة التي تتراوح ،1-100 نانومتر FITC على كشف واحد مع إعدادات الكشف عن نفسها.

الشكل 1
الشكل 1. متعدد الطبقات ضوئيه. ملفقة الجهاز ميكروفلويديك من خلال خلق رئيسية مع ثلاثة مرتفعات ميزة مختلفة. أولا، يتم نسج 80 ميكرون طبقة طويل القامة من SU-8 على ومنقوشة باستخدام قناع للقنوات السوائل. المقبل، ونسج 40 ميكرون أكثر SU-8 على ومنقوشة 120 ميكرون ملامح طويل القامة مع 2 الثانية قناع من خلال كل من SU-8 طبقات لانتاج الهندسة لاستيعاب 125 ميكرون الألياف البصرية العالية. بعد هذا، 1ونسج 00 ميكرون أكثر SU-8 على والمزخرف مع قناع 3 الثالثة لانتاج 225 ميكرون الميزات العالية. بعد النامية، PDMS الصب، وارتباط البلازما على الزجاج، جهاز الناتجة يحتوي على قنوات كبيرة يمكن الوصول إليها من جانب لإدخال الألياف، بالإضافة إلى قنوات السوائل المغلقة القياسية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
شخصية تصميم 2. جهاز والتخطيط البصري. وتتكون أجزاء الموائعية الجهاز من reinjector قطرة وهل النفط، بالإضافة إلى قناة على شكل حرف L. يتم إدراج الألياف بالإضافة إلى الليزر الفردية العادي لاتجاه تدفق. يتم إدراج الألياف كشف عمودي على ألياف الليزر من أجل جمع ضوء الفلورسنت. يتم تصفية هذا الضوء من خلال أبandpass التصفية، قبل أن يتم اكتشافها من قبل PMT واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3. الترميز الزمني للمعلومات متعدد الألوان. (A) قطرات تتدفق من خلال مناطق الإثارة "1" و "2" في أوقات مختلفة، وتوفير التحول الوقت الذي يسمح بتحديد الضوء المنبعث. (ب) البيانات من قطار من 4 قطرات المختلفة التي تتدفق من خلال قناة الكشف. ذروة الأولى من كل صدرة يتوافق مع مضان المنبعثة بعد الإثارة في المنطقة "1" والذروة الثانية في كل يتوافق مزدوجة لمضان المنبعثة بعد الإثارة في المنطقة "2". ارتفاع قمم قطرة تتناسب وكمية من الصبغة متحمس في لنظرا الطول الموجي، إلا عندما يحدث نزيف الطيفي الواجب لاستخدام الأصباغ مع تداخل الإثارة الأطياف. يتم تحديد عرض القمم بمقدار الوقت الذي يستغرقه قطرات لتمر عبر منطقة الإثارة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. كشف متعدد الألوان من السكان قطرة مختلطة. مؤامرة مبعثر يظهر أقصى شدة الحبرية للسكان قطرة مختلطة بعد الإثارة وانبعاث من 473 نانومتر ليزر (قمة 1) والليزر 405 نانومتر (الذروة 2). قطرات تحتوي على مزيج من فلوريسئين (FITC) وسلسلة الأزرق (CB) في تركيزات نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالشكل.

الرقم 5
الرقم 5. كشف لون واحد على السكان قطرات متنوعة للغاية. الرسم البياني للانبعاثات من قبل السكان قطرة مختلطة تحتوي على ،1-100 نانومتر من فلوريسئين بعد الإثارة التي كتبها ليزر 473 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كشف الألياف البصرية يتطلب محاذاة الألياف البصرية فيما يتعلق قنوات السوائل. لأن لدينا جهاز يستخدم القنوات دليل ملفقة مع ضوئيه متعدد الطبقات، وضع أقنعة مع الاحترام لبعضهما البعض هو من أهمية كبيرة. إذا كانت القنوات دليل الألياف هي قريبة جدا من قناة السوائل، وهناك احتمال لتسرب السوائل؛ إذا توجد قنوات دليل بعيدة جدا أو المنحرفة، إشارة مضان من الألياف كشف تجمع قد تضاءل بشكل ملحوظ. المحاذاة الصحيحة يمكن بمساعدة من تصميم علامات المحاذاة، مثل دوائر متحدة المركز إلى أقنعة لتكون متواجدا خلال تنميط الصورة. بالإضافة إلى ذلك، الإدراج اليدوي من الألياف الضوئية في الجهاز هو عملية دقيقة مع القدرة على كسر نصائح من الألياف داخل الجهاز، مما يجعلها غير صالحة للاستعمال. تقييد الألياف ضد شريحة زجاجية المستعبدين من الجهاز PDMS وإدخال الألياف ببطء مع مراعاة مع المجهر ومفاتيح successful الألياف الإدراج. يجب أن يحدث الماضي، إعادة حقن مستحلبات شكلت قبل مع الحد الأدنى من التعامل معها. من الناحية المثالية، مرة واحدة يتم مستحلب وأودعت مباشرة إلى حقنة فارغة، فإنه لا ينبغي أن يتم تحويلها حتى يتم استخدامه لإعادة حقن قطرة.

يتطلب كشف متعدد الألوان التي القمم في صدرة إشارة على أن تكون متميزة عن بعضها البعض وأن إشارات من قطرات متتالية لا تتداخل. إعداد كشف أن نستخدم هنا يستخدم زوج من 125 ميكرون الألياف البصرية فصل على مسافة مركز إلى مركز من 300 ميكرون، وتوفير منطقة غير مضيئة من ~ 175 ميكرون بين مناطق الإثارة. هذا يسمح للقطيرة 80 ميكرون إلى أن السعادة حسب مصدر ضوء واحد فقط في المرة الواحدة، ويضمن أن كل واحدة من قمم في صدرة هو فقط نتيجة لنوع واحد من الإثارة ليزر. التصاميم حيث فصل بين مناطق الإثارة يشبه القطر قطرة تعطي إشارات مشاكل مع تداخل الحلل ذروة الانبعاثات. تكان العرض إشارة صدرة يرتبط إلى الوقت الذي يستغرقه الحافة الأمامية من قطرات لدخول مناطق الإثارة أول مرة على الحافة من الحبرية لمغادرة المنطقة الإثارة النهائية، على مسافة ~ 500 ميكرون في جهاز وصفنا. من أجل الحفاظ على الطابع المميز من قطرات الكشف المجاورة، يجب متباعدة من قبل منطقة إشارة منخفضة على الأقل واسعة كما صدرة إشارة الحلل إشارة. لتكوين الموصوفة هنا، متباعدة 80 ميكرومتر قطرات 1 مم على الأقل على حدة.

وعلى الرغم من كشف متعددة الألوان مع مكشاف ضوئي واحد يسمح لتحقيق وفورات كبيرة من حيث التكلفة والتعقيد بالمقارنة مع التقنيات القياسية، هناك بعض الخسائر في قوة لأنه لم يتم تصفيتها الضوء المنبعث من الطول الموجي. هذا يمكن أن يكون مشكلة عندما كشف قطرات التي تحتوي على fluorophores المتعددة التي تثير في نفس الأطوال الموجية، لأن مصدر مضان لا يمكن تمييزه. ويمكن لهذه القيود يجب أن overcلى بعد عن طريق إجراء التجارب مع التشكيلات الإثارة غير متداخلة، أو من خلال تصميم التجارب حيث الطيفية تنزف على لا يحدث في "قناة" حيث يتم تنفيذ فحص حساسية. هذا هو متوافق مع العديد من قطرات تطبيقات الكشف ميكروفلويديك، حيث يتم استخدام صبغة خلفية مشرق للإشارة إلى وجود قطرات، ويتم استخدام fluorophore الثاني للإبلاغ عن نتيجة لعلم الأحياء الجزيئي فحص 10،11.

بالمقارنة مع التقنيات القياسية، نهجنا واثنين من المزايا الرئيسية: 1) مناطق الإثارة مسجل مكانيا للقضاء على الحاجة لتصفية ضوء معقدة، و2) استخدام الألياف البصرية يزيل احتياجات المجهر والأجهزة البصرية للضوء المباشر. لأننا معالجة الشواغل الفنية المشتركة مع أنظمة الكشف عن الموائع الدقيقة، وضعت المحققين السابق الطرق لمعالجة مخاوف مماثلة. على سبيل المثال، مارتيني وآخرون تردد ترميز متعدد الألوان مضان تسجيلبواسطة كاشف واحد من خلال إبراز مصدر الإثارة من خلال نمط فريد "باركود" بتصفية 12. استخدامنا لمجموعة الألياف الضوئية يسمح استخدام نظام ترميز الزمني مماثل باستخدام معيار، عناصر من الجرف. يظهر الأدب العديد من التقنيات اقتران البصرية البصرية التي هي أكثر يسيطر أن الإدراج الألياف بسيط هو أن وصفنا. النعيم وآخرون استخدام السائل شغل أدلة موجة الضوئية لتقديم تسيطر عليها بعناية وجمع الضوء من مواقع متناهية محددة 13، مارتينيز فاسكيز آخرون استخدام الدليل الموجي محفورا بالليزر إلى ركائز السيليكا تنصهر لتقديم ضوء الإثارة 14، وVishnubhatla آخرون هم قادرة على افتعال بالضبط قنوات الإدراج الألياف باستخدام مزيج من أشعة الليزر والمواد الكيميائية الحفر 15. كل من هذه التقنيات تتطلب خطوات إضافية غير تلك المستخدمة لصنع قاعدة العمارة الموائعية من microflرقاقة uidic. في حين أن هذه الإجراءات تلفيق قد تكون ضرورية لتطبيقات الكشف حساسة للغاية، وجدنا أن الألياف الإدراج إلى قناة PDMS مصبوب غير كافية لمعظم التطبيقات اليومية في مختبرنا. وكان نظام الكشف قادرة على الكشف عن تركيزات FITC وصولا الى 100 م في 80 ميكرون قطرات، أي ما يعادل تقريبا للكشف عن ~ 17،000 جزيئات fluorophore. هذه الحساسية هي كافية لمعظم التطبيقات الكشف في المختبر لدينا حاليا باستخدام نظام قائم على epifluorescence، والأكثر شيوعا منها يجري PCR تنشيط فرز الخلايا من فحص قطرات الإيجابية التي تحتوي على ما يعادل 10 6 جزيئات fluorophore 11. حساسية الكشف يقارن أيضا بشكل إيجابي إلى ذكرت مؤخرا حساسيات النظم الأخرى القائمة على الألياف البصرية - على سبيل المثال، فمن 200X أكثر حساسية من الحد الكشف عن 20 نانومتر من اليكسا فلور 488 التي أعلن عنها في> 100 ميكرون قطرات 7.

Wوقد قدم ه قطرات المدمجة وحدات ميكروفلويديك متعددة الألوان مخطط كشف كبديل لأنظمة أكثر تكلفة ومعقدة، وذات الحجم الكبير القائم epifluorescence المجهر. مكونات الكشف الضرورية المستخدمة هنا (الليزر والألياف، محولات الألياف، والتصفية، وPMT) يمكن شراؤها ل<10000 $، مما يجعل الكشف الحبرية متعددة الألوان في متناول عدد كبير من المحققين، والسماح للمحققين الأفراد على تحمل محطات الكشف متعددة في المختبر. النظام أيضا إزالة بعض الحواجز القائمة على الخبرة اللازمة لدخول، كما هو مطلوب درجة من الألفة لمواءمة النظم البصرية مساحة حرة بالتزامن مع مجهر epifluorescence. وبالإضافة إلى حجم صغير من الإعداد المكتشفة يجعلها مناسبة بشكل مثالي لتطبيقات المحمول والتشخيص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (14), 4004 (2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8, (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15, (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85, (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85, (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12, (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7, (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17, (10), 8685-8695 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats