Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Капельные микрофлюидики обеспечивают платформу для высокой пропускной способности биологии путем compartmentalizing экспериментов в большом количестве водных капелек , взвешенных в носителе масла 1. Капельки использовались для применения в качестве различных как одного клеточного анализа 2, цифровой полимеразной цепной реакции (ПЦР) 3, и фермент эволюции 4. Флуоресцентные анализы стандартный режим обнаружения для микрофлюидики капель, так как их яркие сигналы и быстрого времени отклика совместимы с определением объемов капельные суб-nanoliter по ставкам килогерц. Многие приложения требуют обнаружения флуоресценции в течение по крайней мере двух цветов одновременно. Например, наша лаборатория обычно выполняет ПЦР-активированный капельные сортировки экспериментов , которые используют один канал обнаружения для результата анализе, и использует вторичный фон краситель , чтобы сделать тест-отрицательный капелька счетная 5.

Типичные станции обнаружения для микрофлюидики капельных являются баСЭД на эпифлуоресцентной микроскопов, и требуют сложных световых схем манипуляции, чтобы ввести свет возбуждения от свободных космических лазеров в микроскоп, чтобы быть сфокусирован на образце. После того, как флуоресценция испускается из капелькой, испускаемый флуоресцирующих свет фильтруется таким образом, чтобы каждый канал обнаружения использует один фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), завязанный на полосе длин волн. Эпифлуоресцентной микроскоп на основе оптических систем обнаружения обеспечивают барьер для выхода на рынок из-за их счет, сложности и необходимости технического обслуживания. Оптические волокна обеспечивают средства для создания упрощенной и надежной схемы обнаружения, так как волокна могут быть вручную вставлены в микрожидкостных устройств, устраняя необходимость прокладки света зеркала на основе, и позволяя легкие пути к сопрягаться с использованием волоконно-оптических соединителей.

В этой статье мы опишем сборку и проверку компактной и модульной схемы для выполнения многоцветной флуоресцентной детекции с использованием массива оптических волокон апда одиночный фотодетектор 6. Оптические волокна связаны с отдельными лазерами и вставлены нормально к форме L канала потока при регулярных пространственных смещений. Коллекция флюоресценции волокна ориентированы параллельно областей возбуждения и подключен к одному ФЭУ. Поскольку капелька проходит через лазерные лучи в разные моменты времени, данные, записанные с помощью ФЭУ показывает временное смещение, которое позволяет пользователю различать флуоресценции, испускаемой после того, как капелька возбуждается каждого отдельного лазерного луча. Этот временной сдвиг исключает необходимость разделения излучаемого света для отдельных ФЭУ с использованием ряда дихроичных зеркал и полосовых фильтров. Для того, чтобы проверить эффективность детектора, мы количественной оценки флуоресценции в популяциях капельных заключающих красители разного цвета и концентрации. Чувствительность системы исследуется для обнаружения одного цвета флуоресцеина, и показывает способность обнаруживать капли с концентрацией до 0,1 нМ, в 200х чувствительности улучшения мovement по сравнению с последними подходами волокна на основе описанных в литературе 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU8 Мастер изготовления

  1. Конструкция Микрожидкостных структуры для изготовления трехслойного с помощью разработки программного обеспечения и имеют конструкции напечатанные поставщика на печатной плате пленки с разрешением 10 мкм. Детали конструкции прибора приведены в прилагаемой ссылке 6 и геометрические формы каналов показаны на рисунке 1. Слои должны включать меток выравнивания , чтобы помочь расстанавливать функции от каждого изготовления слоя 8.
  2. Поместите предварительно очищенную 3 дюйма диаметром кремниевой пластины на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30 с при 1750 оборотах в минуту, обеспечивая толщину слоя 80 мкм.
  3. Удалите пластину и выпекать на 135 & deg; C плитке в течение 30 мин. Дайте вафля остыть до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  4. Выставляют пластины на 1 - й маски слоя , покрытого под коллимирован- 190 мВт, 365 нм светодиод в течение 3 мин. После экспозиции, поместите пластину на C конфорки 135 ° в течение 1 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  5. Поместите пластину на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30 с при 5000 оборотах в минуту, в результате чего слой, который обеспечивает дополнительную толщину 40 мкм.
  6. Удалите пластину и испечь на 135 ° C плитке в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  7. Совместите маску 2 - й слой на геометрии узорной в 1.3 и подвергать пластины с покрытием коллимированному 190 мВт, 365 нм светодиода в течение 3 мин. После экспозиции, поместите на 135 ° C плитке в течение 4 мин 30 сек, а затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  8. Поместите пластину на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30сек при 1000 оборотах в минуту, в результате чего слой, который обеспечивает дополнительную толщину 100 мкм.
  9. Удалите пластину и испечь на 135 ° C плитке в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  10. Совместите маску 3 - го слоя на геометрию узорной в 1.3 и подвергать пластины с покрытием коллимированному 190 мВт, 365 нм светодиода в течение 3 мин. После экспозиции, поместите на 135 ° C плитке в течение 9 мин, а затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  11. Разработка маски, погружая в перемешиваемой бане монометилового эфира пропиленгликоля ацетата в течение 30 мин. Промыть пластины в изопропаноле и выпекать на 135 ° C плитке в течение 1 мин. Поместите разработанный мастером в 100 мм чашки Петри для полидиметилсилоксана (PDMS) под давлением.

2. PDMS изготовления приборов

  1. Подготовка 10: 1 PDMS путем объединения 50 г силиконового основания с 5 г отвердителя в пластиковую чашку. Смешайте содержимое с помощью роторного инструмента, снабженного перемешивающим палочкой. градусне в качестве смеси внутри эксикаторе в течение 30 мин, или пока все пузырьки воздуха не будут удалены.
  2. Налить PDMS, чтобы дать толщину 3 мм над мастером и поместите обратно в эксикатор для дальнейшей дегазации. После того, как все пузырьки будут удалены, выпекать устройство при температуре 80 ° С в течение 80 мин.
  3. Обрежьте устройство из пресс-формы, используя скальпель и место на чистой поверхности с узорной стороной вверх и удар жидкостный впускные и выпускные отверстия с трепанобиопсия 0,75 мм. Устройство должно быть разрезан таким образом, что высокие геометрий 120 мкм и 220 мкм, доступны со стороны устройства.
  4. Плазменный лечить устройство, с помощью функции стороной вверх, вместе с предварительно очищенную 2 дюйма на 3 дюйма стекло на 1 мбар O 2 плазмы в течение 20 секунд в плазме очиститель 300 Вт. Скрепить устройство PDMS, помещая узорчатую сторону устройства PDMS на плазменной обработки стороне предметного стекла. Поместите устройство в C духовке 80 ° и выпекать собранное устройство в течение 40 мин.
  5. Рендер каналыгидрофобный с помощью шприца для промывки устройства с фторированной обработки поверхности жидкости. Сразу же выпекать устройство при температуре 80 ° С в течение 10 мин для испарения растворителя.

3. Получение оптических компонентов

  1. Подготовьте лазерное волокно возбуждения путем удаления изоляции от последнего 5 мм сердцевины 105 мкм, оболочки 125 мкм, NA = 0,22 оптическое волокно.
  2. Подготовьте 2 - й цветной лазерный волокно возбуждения путем повторения 3.1 для 2 - го идентичного волокна.
  3. Подготовьте волокно для сбора сигнала флуоресценции путем повторения 3.1 для сердцевины 200 мкм, оболочки 225 мкм, NA = 0,39 оптическое волокно.
  4. Проверьте кончики всех волокон - если кончики не заканчиваются на плоской поверхности, повторно расщепляют концы с волокном писца.
  5. Приложить лазерный волоконный ответвитель 50 мВт, 405 нм лазера и прикрепить один из основных волокон к лазеру 105 мкм. Прямой зачищенный конец на датчике мощности лазераметр, и использовать точную настройку лазерного ответвителя, чтобы максимизировать мощность лазера.
  6. Повторите 3.5 для нм лазера 50 мВт, 473.
  7. Смонтировать 446/510/581/703 нм квадроциклов полосовых фильтров на ФЭУ с помощью объектива трубы, чтобы блокировать лазерный луч и передавать испускаемый флуоресценции. Прикрепите волоконный ответвитель так, что свет проходит через фильтры прежде, чем поразить ФЭУ.
  8. Приложите волокно от 3,3 до блока собранного в 3.7.

4. Offline Смешанная Эмульсия Generation

  1. Получить фокус потока микрофлюидики dropmaker устройство с отверстием мкм 60 мкм х 60.
  2. Заполните 1 мл шприц с HFE 7500 масла с 2% ионной фторсодержащего 9.
  3. Заполните серию 1 мл шприцы со следующими комбинациями флуоресцеина (FITC) и декстран-конъюгированные голубых красителей (CB) в PBS: 1 нМ ФИТЦ / 10 нМ CB, 10 нМ ФИТЦ / 10 нМ CB, 1 нМ ФИТЦ / 100 нМ CB, и 10 нМ ФИТЦ / 100 нМ СВ.
  4. Установите устройство dropmaker на сцене перевернутой микроновсправиться и водные и масляные шприцы на шприцевые насосы. Пара шприцы к устройствам с помощью PE-2 трубки.
  5. Запуск шприцевые насосы со скоростью 500 мкл / ч для масла и 250 мкл / ч для водных растворов, создать смесь 80 мкм капель, содержащих растворы с 4,3. Для каждого типа водного образца, используют свежий устройство dropmaker для устранения перекрестного загрязнения. Сбор ~ 200 мкл эмульсии из каждой комбинации красителя в пустой шприц.
  6. После того, как 4 типа капельки были собраны в единую коллекцию шприц, смешайте эмульсию путем многократного вращением шприца.
  7. Повторите шаги 4.2-4.6 с водными растворами, содержащими 0,1, 1, 10 и 100 нМ FITC в PBS.

5. Волоконно-оптические вставки

  1. Поместите микрожидкостных чип, изготовленный на шаге 2 на стадии инвертированного микроскопа в сочетании с цифровой камерой, способной <100 мкс скорости затвора.
  2. тщательно Работая со стороны, InSeк.т. волокно, соединенное с лазером 473 нм в дальний канал вверх по течению 120 мкм, следя за тем, чтобы не через прокол на основной канал потока.
  3. Вставьте волокно, соединенное с лазером 405 нм в самый дальний вниз по течению мкм высокого бокового канала 120, обеспечивая расстояние волокна 300 мкм.
  4. Вставьте ПМТ-соединенный волокно в 220 мкм высотой канала по нормали к двум волокнам лазерного возбуждения.

6. Флуоресцентная Обнаружение смешанных Эмульсии

  1. Монтирование 5 мл шприц, заполненный HFE 7500 с 2% ионной фторсодержащего к распорной входе масла устройства обнаружения с ПЭ-2 трубки.
  2. Установите шприц, содержащий смешанный FITC / CB эмульсии на вертикально ориентированной шприцевой насос, и пара на входе капелька реинжекции устройства с использованием PE-2 трубки. Подключите длину PE-2 трубки от выхода устройства в контейнер для отходов.
  3. Премьер-устройство с помощью не работает каждый из насосов при 1000 мкл / ч до тех пор, какмасла и капельки видно, регулярно совмещая в устройстве и течет вниз по течению.
  4. Регулировка скорости потока таким образом, чтобы распорки масло работает на частоте 6000 мкл / ч и капли в количестве 100 мкл / ч, что обеспечивает значительное расстояние между каплями, проходящих через область детектирования.
  5. Включите лазеров, запустите программу сбора данных, а также регулировки усиления ФЭУ, чтобы обеспечить сигналы, которые более чем 100x базового уровня шума. Регулировка мощности лазера, так что все пики дублетных отчетливо видны на одном, линейно масштабируется timetrace.
  6. Приобретать 60 сек timetrace PMT напряжения по меньшей мере, 20 кГц. Импорт данных в вычислительную программу, такие как Matlab и измерить высоту пиков регистрируемых дублетов с использованием сценария пользовательских вычислений программы.
    Примечание: Это предусмотрено в качестве дополнительной информации.
  7. Повторите шаги 6.2-6.7 с использованием FITC-только смешанную эмульсию, созданную в 4,7, с нм лазер 405 выключен.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изготовление устройства PDMS , который позволяет для вставки оптических волокон требуется многоэтапную процедуру фотолитографии для создания каналов различной высоты (рисунок 1). Во-первых, высокий слой SU-8 80 мкм формуют на кремниевой подложке и с рисунком, используя маску, чтобы создать геометрию обработки жидкости. Далее, еще 40 мкм слой SU-8 вращают на пластину, и с рисунком, используя вторую маску, чтобы создать функции, которые будут формировать высокие лазерные вставки волоконно-каналы 120 мкм. Последний, 100 мкм более СУ-8 вращают на пластину, и с рисунком, чтобы дать высокий обнаружения вставки волоконно-каналы 220 мкм. Мастер разработан и используется для формования PDMS устройство, которое, в свою очередь, св занный с предметное стекло. Окончательное изготовление содержит геометрию высотой потока 80 мкм, получить доступ через отверстий, пробитых в верхней части устройства и 120 мкм и 220 мкм высокими оптоволоконным каналам доступ через боковую сторонуустройство.

Геометрия устройства , используемого для обнаружения показана на рисунке 2. Сгенерированных 80 мкм эмульсии закачиваться в каплю реинжекции порта и отстоят друг от друга распорной масла , прежде чем они перетекают в канал обнаружения L формы. Два лазерных связью волокна вставляются в 120 мкм высокие каналы обеспечивают возбуждение в дискретных точках пространства в проточном канале. Поскольку многомодовых волокон, вставленных в эти каналы имеют внешний диаметр 125 мкм и диаметр сердцевины более 105 мкм, все поперечное сечение канала потока освещается лазерным светом. В нашем устройстве канал потока обнаружения делает резкий поворот на 90 градусов после последнего лазерного области возбуждения для создания тесного оптического доступа для OD волокна 225 мкм, используемая для обнаружения излучаемого флуоресценции. Чем больше волокно используется из-за его высокой числовой апертурой (NA = 0,39), который похож на стандартный объектив микроскопа.

Каплю , протекающий через канал обнаружения обнаруживает отдельные области возбуждения перед каждым из лазерных связанных оптических волокон (рис 3А). Единственный ПМТ в сочетании с волокном обнаружения записей, испускаемых флуоресценции с временным сдвигом карты на источник возбуждения. Для капельке , который содержит красители , которые возбуждают при 473 нм (область "1" на фигуре 3А) и при 405 нм (область "2" на фигуре 3В), то результирующий сигнал ФЭУ содержит дублет сигнала с пиковым разделения , который коррелируется с время, которое требуется капельку, чтобы перейти от одной области возбуждения к следующему. К во времени кодировании спектральных данных таким образом, то необходимость дальнейшей легкой фильтрации и отдельные ФЭУ для каждого цвета флуорофора устраняется. На фиг.3В показан сигнал дублеты для поезда 4 капель с различными комбинациями красителей. Первый пик в двойном соответствуютs к флуоресценции при возбуждении на 473 нм лазера в области "1", а второй пик соответствует флуоресценции после возбуждения 405 нм лазера в области "2".

Эффективность схемы обнаружения была проверена путем обнаружения смешанной эмульсии капелек, содержащих красители, которые возбуждают при 405 нм (декстран-конъюгированные синий, CB) и при 473 нм (флуоресцеин, FITC). Капельки пропускали через области обнаружения при примерно 50 Гц, и данные были записаны в течение 60 секунд, затем обработал с помощью сценария вычислений программы. Данные приведены на рисунке 4 , и показывает четкое разделение между четырьмя закачиваться типов капельке. Поскольку система обнаружения не проводит различий между разными цветами излучаемого света, каждая капелька описывается его максимальной суммарной флуоресценции после того, как возбуждается в области "1" (пик 1), а также в области 2 (пик 2).

(рисунок 5). Данные показывают способность обнаруживать концентрации красителя, которые варьируются от 0,1 до 100 нМ ФИТЦ на одном детекторе с теми же установками обнаружения.

Рисунок 1
Рисунок 1. Многослойная фотолитографии. Микрожидкостных устройство изготавливается путем создания мастер с тремя различными высотами объектов. Во-первых, высокий слой SU-8 80 мкм формуют на и с рисунком, используя маску для каналов для текучей среды. Затем 40 мкм больше , СУ-8 вращают на и 120 мкм высотой особенности узорной с 2 - й маскировать через оба слоя SU-8 , чтобы получить геометрию для размещения 125 мкм высотой оптических волокон. После этого, 100 мкм более СУ-8 раскручивается, и по образцу с 3 - й маски с получением 225 мкм высокие черты. После разработки, PDMS литье, и плазменный склеивание к стеклу, в результате устройство содержит большие каналы , доступные со стороны для вставки волокна, в дополнение к стандартным закрытых проточных каналов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Конструкция устройства и оптическая схема. Жидкостный части устройства состоят из reinjector капельным и масляную спейсера, соединенного с L-образным каналом. Волокна, соединенные с отдельными лазерами вставлены перпендикулярно к направлению потока. Волокно обнаружения вставляется перпендикулярно лазерному волокон с целью сбора флуоресцентного света. Этот свет фильтруется через ABandpass фильтр, перед тем , как обнаружить с помощью одного ФЭУ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Temporal кодирование информации многоцветной. (A) Капельки протекают через возбуждения областей "1" и "2" в разное время, обеспечивая временной сдвиг , который позволяет идентифицировать излучаемого света. (B) Данные из поезда 4 различных капель , протекающей через канал обнаружения. Первый пик каждого дублета соответствует флуоресценции, испускаемой после возбуждения в области "1", а второй пик в каждой двойной соответствует флуоресценции, испускаемой после возбуждения в области "2". Высота пиков капель пропорциональны количества красителя, возбужденного назаданной длины волны, за исключением того, когда спектральная Кровотечение происходит из-за использования красителей с перекрытием спектров возбуждения. Ширина пиков определяется количеством времени , которое требуется капельку , чтобы пройти в область возбуждения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. обнаружение многоцветие смешанной популяции капель. Точечная диаграмма, показывающая максимальные интенсивности капель при смешанной популяции капельной после возбуждения и эмиссии на 473 нм лазера (пик 1) и 405 нм лазер (пик 2). Капли содержат комбинации флуоресцеина (FITC) и каскадной синий (CB) при концентрациях нМ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этогоцифра.

Рисунок 5
Рисунок 5. Одно обнаружение цвета на весьма разнообразной популяции капель. Гистограмма выбросов смешанной популяции капельку , содержащую 0,1-100 нМ флуоресцеина после возбуждения 473 нм лазером. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Обнаружение Оптоволоконный требует выравнивания оптических волокон относительно каналов для текучей среды. Поскольку наше устройство использует каналы программы передач изготавливаемых с многослойным фотолитографии, размещение масок по отношению друг к другу имеет большое значение. Если волоконный каналы расположены слишком близко к каналу жидкости, существует возможность утечки жидкости; если направляющие каналы расположены слишком далеко или криво, сигнал флуоресценции, собранные волокна обнаружения может быть значительно уменьшена. Правильное выравнивание может быть оказана помощь путем создания меток выравнивания, такие как концентрические круги в масках, которые будут размещаться совместно во время фото кучность стрельбы. Кроме того, ручной ввод волоконной оптики в устройство представляет собой сложный процесс с потенциалом, чтобы разорвать кончики волокон внутри устройства, что делает их непригодными для использования. Сдерживая волокно против стекло, связанного с PDMS устройства и медленно вставляя волокон при наблюдении с микроскопом ключи от SUCCessful вставки волокна. Последнее, закачка предварительно сформированных эмульсий должно происходить с минимальными обработки. В идеале, как только эмульсия изготовлена ​​и депонированы непосредственно в пустой шприц, она не должна быть передана, пока она не используется для капельной реинжекцией.

Многоцветный обнаружение требует, чтобы пики дублета сигнала отличаться друг от друга, и что сигналы от последовательных капель не перекрывают друг друга. Настройка обнаружения, что мы используем здесь использует пару 125 мкм оптических волокон, разделенных на некотором расстоянии от центра до центра 300 мкм, обеспечивая не освещаемой области ~ 175 мкм между областями возбуждения. Это позволяет капелька 80 мкм, чтобы быть возбуждена только одного источника света в то время, и гарантирует, что каждый из пиков дублета является исключительно результатом одного типа лазерного возбуждения. Проекты, где разделение между областями возбуждения схож с диаметром капель дают проблемные сигналы с перекрытием пиком излучения дублеты. Tон ширина сигнала дублет коррелируется к тому времени, которое требуется для передней кромки капелькой для ввода первых областей возбуждения к тому времени, заднюю кромку капельке, чтобы оставить конечный области возбуждения, на расстоянии ~ 500 мкм в устройство мы описываем. Для того чтобы поддерживать отчетливость соседних обнаруженных капель, сигнальные дублеты должны быть отделены друг от друга областью низкого сигнала, по меньшей мере по ширине дублета сигнала. Для конфигурации, описанной здесь, капли 80 мкм разнесены по меньшей мере на 1 мм друг от друга.

Хотя обнаружение многоцветные с одним фотоприемником позволяет значительную экономию с точки зрения стоимости и сложности по сравнению со стандартными методами, есть некоторая потеря устойчивости, поскольку излучаемый свет не фильтруются по длине волны. Это может быть проблематичным при обнаружении капель, содержащих несколько флуорофоров, которые возбуждают в тех же самых длинах волн, так как источник флуоресценции неразличима. Эти ограничения могут быть overcОме путем проведения экспериментов с непересекающимися профилями возбуждения, или путем разработки экспериментов, где спектрального перенесётся не происходит в "канал", где выполняется чувствительным анализом. Это совместимо со многими капельных приложений Микрожидкостных обнаружения, где яркий фон краситель используется для обозначения присутствия капельке, а второй флуорофор используется , чтобы сообщить результат анализа на молекулярной биологии 10,11.

По сравнению со стандартными методиками, наш подход имеет два основных преимущества: 1) пространственно зарегистрированные регионы возбуждения устраняет необходимость в сложной фильтрации света, и 2) использование волоконной оптики устраняет потребности в микроскоп и оптического аппаратного обеспечения прямого света. Поскольку мы рассматриваем общие технические проблемы с микрофлюидальных систем обнаружения, предыдущие исследователи разработали методы для решения подобных проблем. Например, Martini и др. Частота закодировать многоцветной флуоресценции , измереннымис помощью одного детектора путем проецирования источника возбуждения через однозначно узорной "штрих - код" 12 фильтров. Наше использование массива оптических волокон позволяет использование подобной временной схемы кодирования с использованием стандартных, компонентов шельфа. В литературе показывает оптические многочисленные оптические методы сочетания, которые более управляемые, что простой вставки волокна, которые мы описываем. Bliss и др. Используют заполненные жидкости направляющие оптической волны для тщательно контролируемой доставки и сбора света от конкретных местоположений микроканалов 13, Мартинес Васкес и др. Используют волноводы лазером в расплавленных подложках диоксида кремния для доставки возбуждения свет 14 и Vishnubhatla и др. Являются в состоянии точно изготовить волокна вставки каналов с использованием комбинации лазерного облучения и химическим травлением 15. Каждый из этих методов требует дополнительных шагов, помимо тех, которые используются для изготовления базовой жидкостный архитектуру microfluidic чип. В то время как эти процедуры изготовления могут быть необходимы для высокочувствительных применений обнаружения, мы обнаружили, что вставка волокон в формованной канал PDMS является адекватным для большинства повседневных приложений в нашей лаборатории. Система обнаружения удалось обнаружить концентрацию FITC до 100 мкм в капельках 80 мкм, что примерно эквивалентно обнаружению ~ 17000 молекул флуорофора. Эта чувствительность достаточна для большинства применений обнаружения в нашей лаборатории в настоящее время с использованием эпифлуоресцентной на основе системы, наиболее распространенным из которых является ПЦР-активированной сортировки клеток анализа положительных капель , содержащих эквивалент 10 6 молекул флуорофора 11. Чувствительность детектора также выигрывает по сравнению с недавно сообщили чувствительностей других систем , основанных волоконно - оптических - например, она 200x более чувствительным , чем предел обнаружения 20 нМ Alexa Fluor 488 сообщили в> 100 мкм капель 7.

Wе представили микрожидком схему обнаружения многоцветной компактной и модульной капли в качестве альтернативы более дорогих, сложных и громоздких систем на основе эпифлуоресцентной микроскопа. Необходимые компоненты для обнаружения, используемые здесь (лазеры, волокна, волокна адаптеры, фильтр, и PMT) можно приобрести за <$ 10000, что делает обнаружение капелька Многоцветные доступным для большого числа исследователей, и позволяет отдельным исследователям позволить себе несколько станций обнаружения в лаборатории. Система также удалить некоторые основанные на экспертной оценке барьеров для входа, как степень знакомства требуется для выравнивания оптических систем свободного пространства в сочетании с эпифлуоресцентной микроскопом. Кроме того, небольшой след установки обнаружений делает его идеально подходит для портативных и диагностических применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (14), 4004 (2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8, (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15, (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85, (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85, (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12, (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7, (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17, (10), 8685-8695 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats