Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
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Bioengineering

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Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

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Abstract

Introduction

Microfluídica Droplet proporcionan una plataforma para alta biología rendimiento por compartimentar experimentos en un gran número de gotitas acuosas suspendidas en un aceite portador 1. Las gotitas se han utilizado para aplicaciones tan diversas como el análisis de células individuales 2, reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR) 3, y la enzima evolución 4. ensayos fluorescentes son el modo estándar de detección para microfluidos de gotitas, ya que sus señales luminosas y tiempo de respuesta rápido son compatibles con la detección de volúmenes de gotitas sub-nanolitros a tasas kilohercios. Muchas aplicaciones requieren la detección de fluorescencia de al menos dos colores simultáneamente. Por ejemplo, nuestro laboratorio realiza comúnmente PCR activadas por la clasificación de gotitas experimentos que utilizan un canal de detección para el resultado de un ensayo, y se utiliza un colorante de fondo secundario para hacer gotita ensayo negativo contable 5.

estaciones de detección típicos para microfluidos de gotas son based en los microscopios de epifluorescencia, y requieren complicados esquemas de manipulaciones de luz para introducir luz de excitación de láseres de espacio libre en el microscopio estar centrado en la muestra. Después de fluorescencia es emitida desde una gota, la luz fluorescente emitida se filtra de modo que cada canal de detección utiliza un tubo fotomultiplicador (PMT) centrada en una banda de longitud de onda. Los sistemas de detección óptica de epifluorescencia a base de microscopio proporcionan una barrera a la entrada, debido a su costo, la complejidad y requieren mantenimiento. Las fibras ópticas proporcionan los medios para la construcción de un esquema de detección simplificada y robusta, ya que las fibras se pueden insertar manualmente en los dispositivos de microfluidos, eliminando la necesidad para el enrutamiento de la luz a base de espejo, y permitir trayectorias de la luz para ser interconectados mediante conectores de fibra óptica.

En este trabajo se describe el montaje y validación de un sistema compacto y modular para realizar la detección de fluorescencia multicolor mediante la utilización de una matriz de fibras de una ópticada fotodetector solo 6. Las fibras ópticas están acopladas a los láseres individuales y se insertan normal a un canal de flujo en forma de L en desplazamientos espaciales regulares. Una fibra de captación de fluorescencia está orientado paralelo a las regiones de excitación y está conectado a un único PMT. Debido a que una gota pasa a través de los haces de láser en diferentes momentos, los datos registrados por el PMT muestra un desplazamiento temporal que permite al usuario distinguir entre la fluorescencia emitida después de la gotita es excitado por cada haz de láser distinto. Este cambio temporal elimina la necesidad de separar la luz emitida a PMT separados utilizando una serie de espejos dicroicos y los filtros de paso de banda. Para validar la eficacia del detector, que cuantificar la fluorescencia en las poblaciones de gotitas que encapsulan tintes de diferente color y la concentración. La sensibilidad del sistema se investiga para la detección de un solo color de fluoresceína, y muestra la capacidad de detectar gotitas con concentraciones de hasta 0,1 nM, un impr sensibilidad 200xovement en comparación con los enfoques basados ​​en fibra recientes en la literatura 7.

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Protocol

Fabricación 1. Maestro SU8

  1. Diseñar las estructuras de microfluidos para la fabricación de tres capas utilizando software de diseño y tienen los diseños impresos por un proveedor en la película placa de circuito con 10 micras de resolución. Los detalles del diseño del dispositivo se dan en una referencia vinculada 6 y las geometrías del canal se muestra en la Figura 1. Las capas deben incluir marcas de alineación para ayudar a collocate características de cada capa de la fabricación 8.
  2. Coloque una oblea de silicio de diámetro previamente limpiadas de 3 pulgadas en una recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30 segundos a 1750 rpm, proporcionando un espesor de capa de 80 micras.
  3. Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos. Dejar que la oblea de enfriar a ta antes de pasar a la siguiente etapa.
  4. Exponer el disco recubierto con la capa de máscara 1 st bajo un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar la oblea en una placa de cocción C 135 ° durante 1 min, después se enfría a RT, antes de proceder al siguiente paso.
  5. Colocar la oblea en la recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30 segundos a 5000 rpm, lo que resulta en una capa que proporciona un espesor adicional de 40 micras.
  6. Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos, dejar enfriar a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso.
  7. Alinear la máscara de capa 2 o en la geometría modelada en 1.3 y exponer la oblea recubierta a un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar en un 135 ° C placa de 4 min 30 seg, y luego se enfría hasta TA antes de proceder al siguiente paso.
  8. Colocar la oblea en la recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30segundos a 1000 rpm, lo que resulta en una capa que proporciona un espesor adicional de 100 micras.
  9. Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos, dejar enfriar a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso.
  10. Alinear la máscara de capa 3 rd en la geometría modelada en 1.3 y exponer la oblea recubierta a un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar en un 135 ° C placa de cocción para 9 min, después se enfría a RT, antes de proceder al siguiente paso.
  11. Desarrollar las máscaras por inmersión en un baño de agitación de propileno glicol monometil éter acetato durante 30 minutos. Lavar la oblea en isopropanol y se cuece al horno en una placa caliente a 135 ° C durante 1 min. Coloque el maestro desarrollado en una placa de Petri de 100 mm para el moldeo de polidimetilsiloxano (PDMS).

2. PDMS fabricación de dispositivos

  1. Preparar 10: 1 PDMS mediante la combinación de 50 g de base de silicona con 5 g de agente de curado en un vaso de plástico. Mezclar el contenido con una herramienta rotativa dotada de una varilla de agitación. degcomo la mezcla dentro de un desecador durante 30 min, o hasta que todas las burbujas de aire se eliminan.
  2. Verter el PDMS para dar un espesor de 3 mm sobre el maestro y colocar de nuevo en el desecador durante más de desgasificación. Una vez que se eliminan todas las burbujas, hornear el dispositivo a 80 ° C durante 80 minutos.
  3. Cortar el dispositivo del molde utilizando un bisturí y el lugar sobre una superficie limpia con el lado estampado y perforar las entradas y salidas de fluidos con un punzón de biopsia de 0,75 mm. El dispositivo debe ser cortada de manera que las 120 micras y 220 micras geometrías altos son accesibles desde el lado del dispositivo.
  4. Plasma trata a un dispositivo, con la cara hacia arriba función, junto con un pre-limpiadas 2 pulgadas por 3 pulgadas portaobjetos de vidrio a 1 mbar plasma de O2 durante 20 segundos en un limpiador de plasma de 300 W. Unir el dispositivo de PDMS colocando el lado estampado del dispositivo de PDMS en el lado tratado con plasma de la lámina de vidrio. Coloque el dispositivo en un horno a 80 ° C y hornear el dispositivo montado durante 40 minutos.
  5. Prestar los canaleshidrófoba mediante el uso de una jeringa para enjuagar el dispositivo con un fluido de tratamiento de superficie fluorada. Inmediatamente hornear el dispositivo a 80 ° C durante 10 min para evaporar el disolvente.

3. Preparación de los componentes ópticos

  1. Preparar la fibra láser de excitación mediante la eliminación del aislamiento de la última 5 mm de un 105 micras núcleo, revestimiento 125 m, NA = 0,22 fibra óptica.
  2. Preparar el color de láser de fibra de excitación repitiendo 3.1 para una fibra idéntica 2º.
  3. Preparar la fibra para recoger la señal de fluorescencia mediante la repetición de un 3,1 por 200 micras núcleo, revestimiento 225 m, NA = 0,39 fibra óptica.
  4. Inspeccionar las puntas de todas las fibras - si la punta no terminan en una superficie plana, vuelva a escindir los extremos con un escriba fibra.
  5. Adjuntar un acoplador de fibra láser a un 50 mW, 405 nm láser y adjuntar una de las 105 micras fibras del núcleo al láser. Dirigir el extremo pelado en el sensor de la potencia del lásermetro, y el uso de los ajustes finos del acoplador de láser para maximizar la potencia del láser.
  6. Repita 3,5 para un láser de 50 mW, 473 nm.
  7. Montar una 446/510/581/703 filtros de paso de banda cuádruple nm en el PMT utilizando tubos de lentes para bloquear la luz láser y transmitir la fluorescencia emitida. Adjuntar acoplador de fibra de modo que la luz viaja a través de los filtros antes de golpear el PMT.
  8. Coloque la fibra de 3,3 a la unidad ensamblada en 3.7.

4. Fuera de línea mixta Generación Emulsión

  1. Obtener un dispositivo de microfluidos dropmaker flujo foco con un 60 micras x 60 micras orificio.
  2. Llene una jeringa de 1 ml con HFE 7500 aceites con 2% fluorado iónica 9.
  3. Llene una serie de jeringas de 1 ml con las siguientes combinaciones de fluoresceína (FITC) y tintes de color azul de dextrano conjugado (CB) en PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, y 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. Montar el dispositivo dropmaker en el escenario de un micros invertidashacer frente y las jeringas acuosas y de aceite en bombas de jeringa. Acoplar las jeringas a los dispositivos que utilizan PE-2 tubos.
  5. Ejecución de bombas de jeringa a 500 l / h para el aceite y 250 l / h para las soluciones acuosas, crear una mezcla de 80 micras gotitas que contienen las soluciones de 4,3. Para cada tipo de muestra acuosa, utilice un dispositivo dropmaker fresca para eliminar la contaminación cruzada. Recoger ~ 200 l de emulsión de cada combinación de medio de contraste en una jeringa vacía.
  6. Después de los 4 tipos de las gotitas se han recogido en una sola jeringa colección, mezclar la emulsión por repetidamente la rotación de la jeringa.
  7. Repetir los pasos 4.2 a 4.6 con las soluciones acuosas que contienen 0,1, 1, 10, y 100 nM FITC en PBS.

5. La inserción de fibra óptica

  1. Coloque el chip de microfluidos fabricado en el paso 2 en el escenario de un microscopio invertido, junto con una cámara digital capaz de <100 microsegundos velocidades de obturación.
  2. Trabajar con cuidado desde el lado, inseta la fibra acoplado al láser 473 nm en el canal 120 micras más alejado aguas arriba, teniendo cuidado de no perforar a través de al canal de flujo principal.
  3. Insertar la fibra acoplado al láser 405 nm en el canal micras alta lado más alejado aguas abajo 120, proporcionando espaciamiento fibra de 300 micras.
  4. Insertar la fibra acoplado a PMT en el canal de altura 220 micras normal a las dos fibras de excitación láser.

6. Detección de la fluorescencia de las emulsiones mixtas

  1. Montar una jeringa de 5 ml lleno de HFE 7500 con tensioactivo fluorado iónico 2% a la entrada de aceite espaciador del dispositivo de detección con PE-2 tubos.
  2. Montar la jeringa que contiene la emulsión mixta / CB FITC en una bomba de jeringa orientada verticalmente y la pareja a la entrada de gotas de reinyección del dispositivo mediante PE-2 tubos. Conectar un tramo de tubo PE-2 de la salida de dispositivo a un recipiente de residuos.
  3. El primer dispositivo mediante la ejecución de cada una de las bombas a 1.000 l / h hasta tantoaceite y las gotitas se observa que son la combinación de regularidad en el dispositivo y que fluye aguas abajo.
  4. Ajustar los caudales de tal manera que el aceite espaciador ejecuta a 6.000 l / hr y las gotas en 100 l / h, proporcionando separación significativa entre las gotas que viajan a través de la región de detección.
  5. Encienda el láser, inicie el programa de adquisición de datos, y ajustar la ganancia del PMT para proporcionar señales que son más de 100 veces el ruido de la línea de base. Ajustar la potencia del láser de modo que todos los picos doblete son claramente visibles en un solo timetrace, linealmente a escala.
  6. Adquirir 60 seg de la timetrace voltaje PMT en al menos 20 kHz. Importar los datos en el programa de computación tales como Matlab y medir las alturas de los picos de los dobletes grabados utilizando la secuencia de comandos del programa de computación personalizado.
    NOTA: Esto se proporciona como información complementaria.
  7. Repita los pasos 6.2 a 6.7 utilizando la única FITC-emulsión mixta creada en 4.7, con el láser de 405 nm apagado.

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Representative Results

La fabricación de un dispositivo de PDMS que permite la inserción de fibras ópticas requiere un procedimiento de fotolitografía de varios pasos para crear canales de altura variable (Figura 1). En primer lugar, un 80 micras de altura de capa de SU-8 se hace girar sobre una oblea de silicio y se modela usando una máscara para crear la geometría de manejo de fluidos. A continuación, un 40 micras capa adicional de SU-8 se hace girar sobre la oblea, y se modela mediante una segunda máscara para crear características que formarán 120 micras canales de inserción de fibra de altura láser. Por último, 100 m más SU-8 se hace girar sobre la oblea, y se modela para dar 220 micras canales de inserción de fibra de detección de altura. El maestro se desarrolla y se utiliza para moldear un dispositivo de PDMS, que a su vez está unido a un portaobjetos de vidrio. La fabricación final contiene 80 micras geometría de flujo alto, accede a través de agujeros perforados en la parte superior del dispositivo y 120 micras y 220 micras canales altos de fibra óptica con acceso por el lado de ladispositivo.

La geometría del dispositivo utilizado para la detección se muestra en la Figura 2. Generada externamente 80 micras emulsiones se vuelven a inyectar en un orificio de caída de reinyección y espaciados por aceite espaciador antes de que el flujo en un canal de detección en forma de L. Dos fibras de láser acoplados se insertan en 120 micras canales altos proporcionan excitación a localizaciones espaciales discretas en el canal de flujo. Debido a que las fibras multimodo insertadas en estos canales tienen un diámetro externo 125 micras y un diámetro de núcleo 105 micras, toda la sección transversal del canal de flujo está iluminado por la luz láser. En nuestro dispositivo de detección del canal de flujo hace un brusco giro de 90 grados después de la última zona de excitación de láser para crear acceso óptico cerca de una fibra OD 225 micras utilizado para detectar la fluorescencia emitida. La fibra más grande se utiliza debido a su alta apertura numérica (NA = 0,39), que es similar a un objetivo de microscopio estándar.

Una gotita fluye a través del canal de detección se encuentra con regiones discretas de excitación en frente de cada una de las fibras ópticas de láser acoplada (Figura 3A). El único PMT acoplado a los registros de fibra de detección de fluorescencia emitida con un desplazamiento temporal de los mapas de la fuente de excitación. Para una gotita que contiene tintes que excitan a 473 nm (región "1" en la Figura 3A) y a 405 nm (región "2" en la figura 3B), la señal PMT resultante contiene un doblete señal con una separación de picos que se correlaciona con la tiempo que tarda una gotita para pasar de una zona de excitación a la siguiente. Mediante la codificación temporal de datos espectrales de esta manera, se elimina la necesidad de una mayor filtración de la luz y la PMT separados para cada color fluoróforo. Figura 3B muestra dobletes de señal para un tren de 4 gotas con diferentes combinaciones de colorantes. El primer pico en el doble correspondens para la fluorescencia emitida tras la excitación por el láser 473 nm en la región de "1", y el segundo pico corresponde a la fluorescencia emitida tras la excitación por el láser 405 nm en la región "2".

La eficacia del esquema de detección se puso a prueba mediante la detección de una emulsión mixta de gotitas que contienen colorantes que excitan a 405 nm (dextrano conjugado con azul, CB) y en 473 nm (fluoresceína, FITC). Las gotitas se hicieron fluir a través de las regiones de detección en aproximadamente 50 Hz y se registraron los datos durante 60 segundos, a continuación, post-procesado con una secuencia de comandos del programa de computación. Los datos se representan en la Figura 4 y muestra una clara separación entre los cuatro tipos de gotas reinyectado. Debido a que el sistema de detección no distingue entre los diferentes colores de la luz emitida, cada gota es descrito por su fluorescencia total máxima después de ser excitado en la región "1" (pico 1) y en la región 2 (pico 2).

(Figura 5). Los datos muestran la capacidad de detectar la concentración de colorante que intervalo de 0,1 a 100 nM FITC en un solo detector con la misma configuración de detección.

Figura 1
Figura 1. fotolitografía de múltiples capas. El dispositivo de microfluidos se fabrica mediante la creación de un maestro con tres alturas diferentes características. En primer lugar, una capa de altura 80 m de SU-8 se hace girar en y se modela usando una máscara para los canales de fluido. A continuación, 40 micras más SU-8 se hace girar en 120 micras y características de altura se modelan con una máscara a través tanto de los SU-8 capas para producir la geometría para dar cabida a 125 micras fibras ópticas de alto. Después de esto, 100 micras más SU-8 se hace girar sobre y se modela con una máscara de para producir 225 micras características de alto. Después de desarrollar, moldeado PDMS, y la unión de plasma para el vidrio, el dispositivo resultante contiene grandes canales accesibles desde el lado de inserción de fibras, además de canales de fluido cerrados estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Dispositivo de diseño y el diseño óptico. Las porciones de fluidos del dispositivo están compuestos de un reinyector gotitas y un separador de aceite, junto a un canal en forma de L. Fibras acoplados a los láseres individuales se insertan normal a la dirección del flujo. Una fibra de detección se inserta perpendicular a las fibras de láser con el fin de recoger la luz fluorescente. Esta luz se filtra a través abandpass filtro, antes de ser detectado por un único PMT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. codificación temporal de la información multicolor. Las gotitas (A) fluyen a través de las regiones de excitación "1" y "2" en diferentes momentos, proporcionando desplazamiento en el tiempo que permita la identificación de la luz emitida. (B) Los datos de un tren de 4 gotas de diferentes fluyen a través del canal de detección. El primer pico de cada doblete corresponde a la fluorescencia emitida tras la excitación en la región de "1", y el segundo pico en cada doble corresponde a la fluorescencia emitida tras la excitación en la región "2". La altura de los picos de las gotitas son proporcionales la cantidad de colorante excitado en unadado longitud de onda, excepto cuando purga espectral se produce debido a la utilización de colorantes con la superposición de los espectros de excitación. La anchura de los picos se determina por la cantidad de tiempo que tarda una gota de atravesar una zona de excitación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Detección Multicolor de una población de gotitas mixto. Diagrama de dispersión que muestra las intensidades máximas de gota para una población de gotitas mixto después de excitación y de emisión por un 473 nm láser (pico 1) y un láser de 405 nm (pico 2). Las gotas contienen combinaciones de fluoresceína (FITC) y azul cascada (CB) en concentraciones nM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.

Figura 5
Figura 5. Detección de un solo color en la población de gotitas muy variada. Histograma de las emisiones por una población mixta de gotitas que contienen 0,1-100 nM de fluoresceína después de la excitación por un láser de 473 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

detección de fibra óptica requiere la alineación de las fibras ópticas con respecto a los canales de fluido. Debido a que nuestro dispositivo utiliza canales de guía fabricados con múltiples capas de fotolitografía, la colocación de máscaras con respecto a la otra es de gran importancia. Si los canales de guía de la fibra son demasiado cerca del canal de fluido, existe un potencial de fugas de fluido; Si los canales de guía se encuentran demasiado lejos o mal alineados, la señal de fluorescencia recogida por la fibra de detección puede ser disminuida significativamente. La alineación apropiada puede ser ayudada por el diseño de marcas de alineación, como círculos concéntricos en máscaras que se co-localizados durante la foto del patrón. Además, la inserción manual de la fibra óptica en el dispositivo es un proceso delicado con el potencial de romper las puntas de las fibras dentro del dispositivo, haciéndolos inservibles. Restricción de fibra contra el portaobjetos de vidrio unido al dispositivo de PDMS y la inserción de las fibras lentamente mientras se observa con el microscopio son claves para succinserción de fibras essful. Por último, la reinyección de emulsiones preformadas debe producirse con un mínimo de manipulación. Idealmente, una vez que la emulsión se hace y se deposita directamente en una jeringa vacía, no debe ser transferida hasta que se utiliza para la reinyección de las gotitas.

detección multicolor requiere que los picos en un doblete de señal sean distintos unos de otros y que las señales de gotitas consecutivos no se solapan. La configuración de la detección que usamos aquí utiliza un par de 125 micras fibras ópticas separadas a una distancia de centro a centro de 300 micras, proporcionando una región no iluminada de ~ 175 micras entre las regiones de excitación. Esto permite que una gotita de 80 micras a ser excitado por una sola fuente de luz a la vez y se asegura de que cada uno de los picos en un doblete es únicamente un resultado de un tipo de excitación láser. Diseños en los que la separación entre las regiones de excitación es similar al diámetro de las gotitas dan señales problemáticos con la superposición de dobletes pico de emisión. Tque la anchura de una señal de doblete se correlaciona con el tiempo que toma para que el borde de ataque de una gota para introducir las primeras regiones de excitación a la vez que el borde de salida de la gotita a abandonar la región de excitación final, una distancia de ~ 500 micras en el dispositivo describimos. A fin de mantener la distinción de las gotitas detectados adyacentes, dobletes de señal necesitan ser separados por una región de señal baja al menos tan ancho como el doblete de la señal. Para la configuración descrita aquí, a 80 micras gotas están separados al menos 1 mm.

Aunque la detección multi-color con un único fotodetector permite ahorros significativos en términos de coste y la complejidad en comparación con las técnicas estándar, hay alguna pérdida de solidez porque la luz emitida no es filtrada por longitud de onda. Esto puede ser problemático cuando la detección de gotas que contienen múltiples fluoróforos que excitan a las mismas longitudes de onda, ya que la fuente de fluorescencia es indistinguible. Estas limitaciones pueden ser overcome mediante la realización de experimentos con perfiles de excitación que no se superponen, o mediante el diseño de experimentos en los que sangran durante espectral no se produce en un "canal" en donde se está realizando un ensayo sensible. Esto es compatible con aplicaciones de detección de microfluidos muchos gotita, donde se utiliza un colorante de fondo brillante para indicar la presencia de una gota, y un segundo fluoróforo se utiliza para informar del resultado de un ensayo de la biología molecular 10,11.

En comparación con las técnicas estándar, nuestro enfoque tiene dos ventajas principales: 1) regiones de excitación espacialmente registrados eliminan la necesidad de luz que se filtra complicado, y 2) el uso de la fibra óptica elimina la necesidad de un microscopio óptico y el hardware a la luz directa. Debido a que nos dirigimos a las preocupaciones técnicas comunes con los sistemas de detección de microfluidos, los anteriores investigadores han desarrollado métodos para tratar las preocupaciones similares. Por ejemplo, Martini et al. Fluorescencia frecuencia a codificar multicolor registrópor un único detector mediante la proyección de una fuente de excitación a través de "código de barras" con dibujos de forma única los filtros 12. Nuestro uso de una matriz de fibra óptica permite la utilización de un esquema de codificación temporal similar usando estándar, fuera de los componentes de la plataforma. La literatura muestra numerosas técnicas de acoplamiento ópticos ópticos que están más controladas que la inserción de fibra simple que describimos. La dicha y col. Utilizar guías de ondas ópticas rellenas de líquido para la entrega controlada cuidadosamente y la recogida de la luz desde ubicaciones microcanales específicos 13, Martínez Vásquez et al. Utilizar guías de onda láser de grabado en sustratos de sílice fundida para suministrar luz de excitación 14, y Vishnubhatla et al. Son capaz de fabricar con precisión los canales de inserción de fibra utilizando una combinación de irradiación láser y el grabado químico 15. Cada una de estas técnicas requieren pasos adicionales más allá de los que se utilizan para fabricar la base de la arquitectura de fluidos de un microflviruta uidic. Mientras que estos procedimientos de fabricación pueden ser necesarios para las aplicaciones de detección de alta sensibilidad, se ha encontrado que la inserción de la fibra en un canal de PDMS moldeado es adecuado para la mayoría de las aplicaciones de uso diario en nuestro laboratorio. El sistema de detección fue capaz de detectar concentraciones de FITC a 100 pM en 80 micras gotitas, más o menos equivalente a la detección de ~ 17.000 moléculas de fluoróforo. Esta sensibilidad es adecuada para la mayoría de aplicaciones de detección en nuestro laboratorio que utilizan actualmente un sistema basado en epifluorescencia, el más común de los cuales está PCR-clasificación de células activadas de las gotitas de positivos de ensayo que contiene el equivalente de 10 6 moléculas de fluoróforo 11. La sensibilidad de detección también se compara favorablemente con informó recientemente sensibilidades de otros sistemas basados ​​en fibra óptica - por ejemplo, es 200x más sensible que el límite de detección de 20 nM de Alexa Fluor 488 se informa en> 100 micras gotitas 7.

We han presentado un esquema de detección multi-color de microfluidos gota compacto y modular como una alternativa a los sistemas basados ​​en microscopio de epifluorescencia más costosas, complejas y voluminosas. Los componentes de detección necesarios utilizados aquí (láseres, fibras, adaptadores de fibra, filtrar y PMT) se pueden comprar por <$ 10,000, haciendo la detección de gotas multicolor accesible a un gran número de investigadores, y permite a los investigadores individuales para proporcionar múltiples estaciones de detección en un laboratorio. El sistema también eliminar algunas barreras basadas en conocimientos a la entrada, ya que se requiere un grado de familiaridad para alinear los sistemas ópticos de espacio libre en conjunción con un microscopio de epifluorescencia. Además, el pequeño tamaño de la configuración de las detecciones hace que sea ideal para aplicaciones portátiles y de diagnóstico.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

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References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
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